流感病毒疫苗及其应用的制作方法

流感病毒疫苗及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供的是流感血细胞凝集素多肽，包括嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽和包含修饰的糖基化位点和非天然的糖基化位点的流感血细胞凝集素多肽，包含它们的组合物，包含它们的疫苗及它们的使用方法。
【专利说明】流感病毒疫苗及其应用
[0001]本申请要求美国临时申请号61/536,924(申请日为2011年9月20日)、美国临时申请号61/565,899(申请日为2011年12月I日)、美国临时申请号61/607，526(申请日为2012年3月6日)、美国临时申请号61/648,525(申请日为2012年5月17日)、美国临时申请号61/670，108 (申请日为2012年7月10日)和美国临时申请号61/684，481 (申请日为2012年8月17日)的优先权权益，所述美国临时申请以其整体并入本文作为参考。
[0002]本发明是在政府资助下完成的，资助号为A1070469、A1086061和HHSN266200700010C，资助奖金由美国国家卫生研究院(the Nat1nal Institutes ofHealth)提供。美国政府在本发明中具有一定的权利。
[0003]1.引言
[0004]本文提供的是流感血细胞凝集素多肽(flu hemagglutinin polypeptides),例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽，和包含它们的组合物、包含它们的疫苗及其使用方法。
[0005]2.背景
[0006]流感病毒流感病毒是有包膜的RNA病毒，属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(Palese 和 Shaw(2007)Orthomyxoviridae:The Viruses and Their Replicat1n (正粘病毒科:病毒及其复制)，第5版，Fields’ Virology,由B.N.Fields, D.M.Knipe和P.M.Howley 编著，Wolters Kluwer Health/Lippincott ffilliams&ffilkins, Philadelphia，USA，pl647-1689)。甲型流感病毒的天然宿主主要是禽类，但是甲型流感病毒(包括禽类来源的那些)也可以在人类和其它动物宿主(蝙蝠、犬、猪、马、海洋哺乳动物和鼬科动物)中感染并引起疾病。例如，在亚洲流行的H5N1禽类甲型流感病毒已经在中国和印度尼西亚的猪中发现，并将其宿主范围扩展至包括猫、豹和虎，猫、豹和虎通常被认为对甲型流感不敏感(CIDRAP-Avian Influenza:Agricultural and Wildlife Considerat1ns)。动物中流感病毒感染的发生可以潜在地产生人类大流行性流感毒株。
[0007]甲型流感病毒和乙型流感病毒是主要的人类病原体，引起呼吸系统疾病，严重范围从亚临床感染到可能导致死亡的原发性病毒性肺炎。感染的临床效果由于流感毒株的毒力和宿主的暴露情况、病史、年龄和免疫状况而不同。由于相对高的攻击率，季节性流感引起的累计发病率和死亡率是相当高的。在正常的季节里，在全球范围内，流感可以引起300万到500万病例的严重疾病和高达500，000例死亡(World HealthOrganizat1n (2003) Inf luenza: Overview ；March2003 (世界卫生组织(2003)流感:综述；2003年3月))。在美国，流感病毒每年感染估计10-15%的人口(Glezen和Couch RB(1978)Interpandemic influenza in the Houston area, 1974-76 (1974-76 年休斯顿地区大流行间的流感).Ν Engl J Med298:587-592 ;Fox 等人(1982) Influenza virus infect1nsin Seattle families, 1975-1979.11.Pattern of infect1n in invaded householdsand relat1n of age and pr1r antibody to occurrence of infect1n and relatedillneSS(1975-1979年西雅图家庭中的流感病毒感染。I1.侵入家庭的感染模式及年龄和现有抗体与发生感染和相关疾病的关系).Am J Epidem1l 116:228-242)并与每年大约 30，OOO 例死亡有关(Thompson Wff 等人(2003)Mortality Associated with Influenzaand Respiratory Syncytial Virus in the United States (在美国与流感病毒和呼吸道合胞病毒相关的死亡率).JAMA289:179-186 ；Belshe (2007) Translat1nal researchon vaccines:1nfluenza as an example (对疫苗的翻译研究:用流感作为实例).ClinPharmacol Ther82:745-749)。
[0008]除了每年的流行病以外，流感病毒还是罕见的大流行的起因。例如，甲型流感病毒可以引起大流行，例如在1918年、1957年、1968年和2009年发生的大流行。由于缺乏预先形成的针对主要病毒抗原血细胞凝集素(hemagglutinin, HA)的免疫力，因此大流行的流感可以在一年内影响超过50%的人口并经常引起比流行性流感更严重的疾病。一个经典型的实例是1918年的大流行，在1918年估计有5千万到I亿人死亡(Johnson和Mueller (2002)Updating the Accounts:Global Mortality of thel918_1920 “Spanish”InfluenzaPandemic Bulletin of the History of Medicine76:105-115)。由于 1990 年代后期高致病性禽类H5N1 流感病毒的出现(Claas等人(1998)Human influenza A H5Nlvirus relatedto a highly pathogenic avian influenza virus (与高致病性禽流感病毒相关的人类甲型流感病毒H5N1).Lancet351:472-7)，因此人们担心它可能是下一个引起大流行的病毒。再者，H7和H9毒株均是新的大流行的候选毒株，因为这些毒株偶尔会感染人类。
[0009]免受流感病毒感染的一种有效方式是通过免疫接种；然而，当前的免疫接种方法依赖于实现流行毒株与包含在疫苗中的分离毒株之间的良好匹配。由于多种因素的组合，这样一种匹配常常是很难达到的。首先，流感病毒持续地发生变化:每3-5年甲型流感病毒的优势毒株就会被经历了充分的抗原性漂移(antigenic drift)以逃避现有的抗体应答的变异毒株所代替。因此，疫苗制剂中包含的分离毒株必须基于世界卫生组织(WHO)协作中心的密切监视结果而每年进行筛选。其次，为了使得疫苗生产和分布具有足够的时间，毒株必须在流感季节来临之前大约六个月进行筛选。疫苗毒株筛选委员会(the vaccinestrain select1n committee)的预报经常是不准确的,这导致疫苗接种效果明显降低。
[0010]甲型流感病毒的新亚型进入人群的可能性也显示了对当前疫苗接种策略的重大挑战。由于预报流感病毒的哪种亚型和毒株将会引起下一次大流行是不可能的，因此目前的毒株特异性方法不能用于制备大流行性流感疫苗。
[0011]3.概沭
[0012]本文提供的是诱导针对流感病毒的保守的HA干结构域(stem domain)(本文中有时称之为“茎”结构域(“stalk” domain))的交叉保护性免疫应答的流感血细胞凝集素(HA)多肽。在一个方面，本发明涉及具有展示对所述茎是异源的球状HA头的稳定HA茎的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽(即本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)的设计和构建体。设计用来进行接种的HA免疫原共享所述HA茎区域但在其球状头有高度多样性。这样的构建体经工程改造成为诱发针对保守HA茎的高度强效和广泛中和抗体的疫苗制剂，例如活的流感病毒、杀死的流感病毒、病毒/病毒样颗粒(“VLPs”)、亚单位疫苗、裂解疫苗等。这样的“通用”疫苗可用于诱导和/或加强流感病毒亚型间的交叉保护性免疫应答。
[0013]作为背景，针对流感病毒的中和抗体靶向HA糖蛋白并且阻止参与病毒进入的结合步骤或融合步骤。中和抗体的两个基础亚组(subset)由暴露于流感病毒激发:针对毒株-特异性球状头(在流感病毒的各种不同毒株和亚型间是非保守的结构域)的那些和针对HA糖蛋白的高度保守的干的那些。非保守的HA球状头携带免疫优势表位(immunodominant epitope)。虽然不受理论的束缚,但是一般认为毒株-特异性抗球状头抗体比抗干抗体更强效，因此解释了用目前疫苗感染所赋予的大部分毒株-特异性免疫力。
[0014]本发明部分地基于发明人的关于激发针对HA干的高度强效和广泛中和抗体的流感病毒疫苗的合理设计策略。在这一方面，设计出嵌合HA免疫原来共享来自先前暴露/接种的相对非常保守的茎结构域，但含有异源HA球状头一优选对预定接种是原初的(naive)HA球状头。对这种构建体的暴露应当主要是加强针对保守HA干的抗体。用这种保守的HA干和变化的球状头重复免疫应当诱导稳固的针对HA的共同干区域的交叉中和抗体。
[0015]当设计嵌合的HA构建体时,应当小心维护所得蛋白的稳定性。在这一方面,建议使在图1中标识为Ap和Aq的半胱氨酸残基得以维持，由于它们对HA茎的稳定性有贡献，如下文第5.1节更详细论述的。对于最佳稳定性，优选HA球状结构域作为整体(介于Ap和Aq半胱氨酸残基之间，如图1所示)进行“调换(swap) ”，因为所得构象将与天然结构最密切。换句话说，在第5.1.2节中提及的“接头(linker)”可以是异源HA的整个球状头结构域。
[0016]代之以“调换出(swapping out) ”HA茎的天然球状头，所述球状头可以通过改变对HA球状头表位有贡献的环(loops)而制成对保守的茎是异源的。这种方法对于产生针对保守茎的所需免疫应答也可能不起作用，除非改变的球状头被设计成与天然球状HA头有巨大不同一尤其是当使用群体被暴露的HA。尽管如此，这样的改变可以例如通过改变对HA球状头表位有贡献的五个环中的大部分来完成。在一个有用的方法中，所有的五个环均可以被改变。可选地，或另外，五个环中的表位可以通过将糖基化位点引入到球状头结构域中而遮蔽。
[0017]用于疫苗接种的构建体可以有利地被设计成用于待接种疫苗的特殊对象/群体。有三种流感亚型在有人类生活的今天已暴露:亚型H1、H2和H3。H2亚型的流感病毒已在1968年从人群中消失，而Hl和H3亚型的流感病毒直到今天持续在人群中存在。结果，在1968年之前出生的活到今天的成人很可能已暴露了 H1、H2和H3亚型中的每一种。相反，在1968年之后出生的活到今天的成人很可能仅暴露于Hl和H3亚型。
[0018]因此，在对成人实施接种疫苗的多个优选的实施方案中，所述嵌合的流感血细胞凝集素多肽不具有来自亚型Hl、H2或H3的流感病毒的HA的球状头结构域，但是的确具有来自这三种亚型之一的HA的干结构域。所述异源球状头可选自任何非Hl、非H2或非H3亚型的HA。另外，使用H1/H2干在一个方面和H3干在另一个方面制备的分开的嵌合构建体可能有益地用于疫苗接种程序一HI和H2亚型是共享保守茎结构域的组IHA亚型(GrouplHAsubtype);而H3是其莖结构域在结构上不同于组I莖的组2亚型(Group2subtype)。Hl和H3构建体的应用将会确保产生/加强针对每一种干结构域的免疫应答。用这样的嵌合的流感血细胞凝集素多肽免疫成人对象将加强所述对象的记忆免疫应答，导致有交叉反应性的广泛中和抗干结构域抗体的大规模产生，从而在所述对象中提供对流感病毒的长期持续的免疫力。
[0019]尚未暴露的婴儿对所有的流感病毒亚型当然是原初的(丨iai've).,结果，可以构建各式各样的HA干/球状头组合用于婴儿的疫苗中。在一个优选的实施方案中，可以给原初婴儿接种用组I (HI或H2)或组2(H3)毒株的HA茎和来自异源毒株(即非H1、非取和/或非H3毒株)的球状头制备的构建体。对于各HA莖的三种不同的嵌合HA构建体可以有利地用于三次序贯疫苗接种以诱导交叉保护性应答。
[0020]用于疫苗接种的嵌合的流感血细胞凝集素多肽也可以有利地设计成在对象中有效地激发针对HA干结构域的高度强效和广泛中和抗体，即在这些多肽中添加或修饰糖基化位点。相信所述HA球状头结构域和干结构域的糖基化可以遮蔽抗原性位点，从而允许流感病毒逃避对象体内的免疫应答。在流感病毒HA多肽的上下文中，然而，所述嵌合的流感血细胞凝集素多肽的干结构域里面的糖基化可以阻碍或防止针对这个因糖基化而被屏蔽的结构域里面的抗原性区域的所需免疫应答。因此，在某些优选的实施方案中，所述嵌合的流感血细胞凝集素多肽包含破坏聚糖与干结构域结合的一个或多个修饰的糖基化位点，从而使用于激发免疫应答的干结构域更可及。为了进一步增加干结构域的免疫原性，所述构建体可以在所述球状头结构域中还包含非天然存在的糖基化位点，当被糖基化时，屏蔽了在球状头结构域中发现的免疫优势抗原性区域免于激发免疫应答。非天然存在的糖基化位点的一个实例是将糖基化位点添加到一种亚型的流感病毒HA的球状头结构域上，其中所述糖基化位点天然存在于另一种亚型的流感病毒HA的球状头结构域中。非天然存在的糖基化位点的另一个实例是将糖基化位点添加到来自一种毒株的流感病毒HA的球状头结构域上，其中所述糖基化位点天然存在于来自流感病毒的另一种毒株的HA的球状头中。非天然存在的糖基化位点的又一个实例是将糖基化位点添加到来自一种毒株的HA的球状头上，其中所述糖基化位点并不天然存在于来自流感病毒的另一种亚型或毒株的HA的球状头中。尽管不受任何具体操作理论的束缚，但是相信在球状头结构域中的额外糖基化将增加对保守干结构域的免疫应答，同时减少对球状头结构域的免疫应答。
[0021]应当理解，本文描述的嵌合的流感血细胞凝集素多肽的应用是有利的，因为(i)所述多肽是十分稳定的(鉴于具有完整的球状头结构域)和(ii)给予所述多肽的对象的免疫系统先前未曾暴露于所述嵌合的流感血细胞凝集素的球状头结构域，但是已暴露于所述嵌合的流感血细胞凝集素的干结构域的保守表位。
[0022]在另一个方面，本文提供的是包含干结构域的流感HA多肽(例如，流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽和非嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)，所述干结构域包含破坏聚糖与干结构域结合的一个或多个修饰的糖基化位点。
[0023]在另一个方面，本文提供的是包含球状头结构域的流感HA多肽(例如，流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽和非嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)，所述球状头结构域包含一个或多个非天然存在的糖基化位点。
[0024]在又一个方面，本文提供的是包含(I)干结构域和⑵球状头结构域的流感HA多肽(例如，流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽和非嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)，所述干结构域包含破坏聚糖与干结构域结合的一个或多个修饰的糖基化位点，所述球状头结构域包含一个或多个非天然存在的糖基化位点。
[0025]在一个具体的实施方案中，本文提供的是包含HA干结构域和HA球状头结构域的嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽，其中:(I)所述HA球状头结构域对所述HA干结构域是异源的；和(2)所述HA干结构域包含一个或多个修饰的糖基化位点，其中所述修饰的糖基化位点包含对破坏/干扰聚糖与干结构域中的糖基化位点结合的糖基化位点的修饰。在多个具体的实施方案中，所述修饰的糖基化位点包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位点的修饰，和其中Xaa是任意氨基酸。在某些实施方案中，所述HA球状头结构域还包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的一个或多个非天然存在的糖基化位点，其中Xaa是任意氨基酸。
[0026]在另一个实施方案中，本文提供的是包含HA干结构域和HA球状头结构域的非嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽，其中:(I)所述HA球状头结构域与所述HA干结构域同源，和(2)所述HA干结构域包含一个或多个修饰的糖基化位点，其中所述修饰的糖基化位点包含对破坏/干扰聚糖与所述干结构域中的糖基化位点结合的糖基化位点的修饰。在多个具体的实施方案中，所述修饰的糖基化位点包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位点的修饰，其中所述修饰破坏聚糖附着到所述修饰的糖基化位点的能力，其中Xaa是任意氨基酸。
[0027]在另一个实施方案中，本文提供的是包含流感血细胞凝集素HAl结构域的流感病毒血细胞凝集素(HA)干结构域多肽，所述HAl结构域包含按以下顺序连接的各成分:HAlN-端干区段共价连接于1-50个异源残基的接头，所述接头又共价连接于HAlC-端短干区段(HAlC-terminal short stem segment);所述HAl结构域与流感血细胞凝集素HA2结构域以三级或四级缔合(tertiary or quaternary associat1n),其中所述流感病毒HA干结构域多肽结构域还包含一个或多个修饰的糖基化位点，其中所述修饰的糖基化位点包含对破坏/干扰聚糖与所述干结构域中的糖基化位点结合的糖基化位点的修饰。在多个具体的实施方案中，所述修饰的糖基化位点包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位点的修饰，其中所述修饰破坏聚糖附着到所述修饰的糖基化位点的能力，和其中Xaa是任意氨基酸。
[0028]在另一个实施方案中，本文提供的是包含流感血细胞凝集素HAl结构域的流感病毒血细胞凝集素(HA)干结构域多肽，所述HAl结构域包含按以下顺序连接的各成分:HAlN-端长干区段(HAlN-terminal long stem segment)共价连接于1-50个异源残基的接头，所述接头又共价连接于HAlC-端长干区段；所述HAl结构域与流感血细胞凝集素HA2结构域以三级或四级缔合，其中所述流感病毒HA干结构域多肽结构域还包含一个或多个修饰的糖基化位点，其中所述修饰的糖基化位点包含对破坏/干扰聚糖与所述干结构域中的糖基化位点结合的糖基化位点的修饰。在多个具体的实施方案中，所述修饰的糖基化位点包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位点的修饰,其中所述修饰破坏聚糖附着到所述修饰的糖基化位点的能力，和其中Xaa是任意氨基酸。
[0029]在另一个实施方案中，本文提供的是包含流感血细胞凝集素HAl结构域的流感病毒血细胞凝集素(HA)干结构域多肽，所述HAl结构域包含按以下顺序连接的各成分:HAlN-端干区段共价连接于1-50个异源残基的接头，所述接头又共价连接于HAlC-端干区段；所述HAl结构域与流感血细胞凝集素HA2结构域以三级或四级缔合，其中所述流感病毒HA干结构域多肽结构域还包含一个或多个修饰的糖基化位点，其中所述修饰的糖基化位点包含对破坏/干扰聚糖与所述干结构域中的糖基化位点结合的糖基化位点的修饰。在多个具体的实施方案中，所述修饰的糖基化位点包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位点的修饰，其中所述修饰破坏聚糖附着到所述修饰的糖基化位点的能力，和其中Xaa是任意氨基酸。
[0030]在另一个实施方案中，本文提供的是包含流感血细胞凝集素HAl结构域的流感病毒血细胞凝集素(HA)干结构域多肽，所述HAl结构域包含按以下顺序连接的各成分:HAlN-端干区段、1-50个异源残基的第一接头、HAl中间干区段、1-50个异源残基的第二接头和HAlC-端干区段；所述HAl结构域与流感血细胞凝集素HA2结构域以三级或四级缔合，其中所述流感病毒血细胞凝集素(HA)干结构域多肽结构域还包含一个或多个修饰的糖基化位点，其中所述修饰的糖基化位点包含对破坏/干扰聚糖与所述干结构域中的糖基化位点结合的糖基化位点的修饰。在多个具体的实施方案中，所述修饰的糖基化位点包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位点的修饰,其中所述修饰破坏聚糖附着到所述修饰的糖基化位点的能力，和其中Xaa是任意氨基酸。
[0031]本发明通过工作实施例(例如，第6节，实施例)予以举例说明，这些工作实施例尤其证明了包含HA干并展示异源HA头的嵌合流感HA多肽的构建，及来自这种与抗干结构域和头结构域二者的抗体起交叉反应的多肽的稳定的嵌合的HA蛋白的产生。这些工作实施例也举例说明了这样的构建体在产生在对象中针对流感病毒的多种不同毒株和亚型的保护性免疫应答中的应用，即，所述实施例证明了本文描述的嵌合的流感HA多肽可以用作通用流感疫苗。另外，这些工作实施例(例如，第6.11节，实施例11)证明了包含具有一个或多个修饰的糖基化位点的HA干结构域和/或具有一个或多个非天然存在的糖基化位点的HA球状头结构域的流感HA多肽的构建，其中所述修饰的糖基化位点是对破坏聚糖附着到糖基化位点的能力的一个或多个天然存在的糖基化位点的修饰。这些工作实施例(参见第6.11节，实施例11)也证明了这些流感HA多肽激发对流感病毒的保守茎结构域的免疫应答增加的能力。
[0032]3.1 术语
[0033]术语“约(about) ”或“近似(approximate) ”，当参照氨基酸位置使用时是指序列中的特定氨基酸位置或在该氨基酸位置的五、四、三、二或一个残基以内的任意氨基酸，或以N-端方向或以C-端方向。
[0034]如本文所用的，术语“约”或“近似地”当与数字连用时是指参考数值的1%、5%或10 %以内的任意数值。在某些实施方案中，术语“约”包括所记载的准确数值。
[0035]术语“氨基酸序列同一性”是指一对比对的氨基酸序列之间的同一性或相似性的程度，通常用百分数表示。百分比同一性是候选序列中的这样的氨基酸残基的百分比，所述氨基酸残基在序列比对并且如果需要的话引入空位(gap)以实现最大百分比序列同源性之后，与肽中的对应氨基酸残基是相同的(即，在比对中给定位置的氨基酸残基是相同的残基)或相似的(即，在比对中给定位置的氨基酸取代是保守性取代，如下文所论述)。序列同源性，包括序列同一性和相似性百分比，可以利用本领域公知的序列比对技术来确定，优选为该目的设计的计算机算法，用所述计算机算法的默认参数或包含它们的软件包。计算机算法和掺入这样的算法的软件包的非限制性实例包括以下。BLAST家族的程序例举了一个特别的，非限制性的用于比较两个序列的数学算法的实例(例如，Karlin&Altschul, 1990, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:2264-2268 (修改为 Karlin&Altschul, 1993, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-5877)，Altschul等人，1990，J.Mol.B1l.215:403-410，(描述了 NBLAST 和 XBLAST)，Altschul 等人，1997，Nucleic Acids Res.25:3389-3402 (描述了 Gapped BLAST 和 PS1-Blast)。另一个特别的实例是Myers和Miller的算法(1988CAB10S4:11-17)，该算法掺入到ALIGN程序(2.0版本)并且可作为GCG序列比对软件包的组成部分获得。另一个特别的实例是FASTA程序(Pearson ff.R.和 Lipman D.J., Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 85:2444-2448, 1988)，可作为威斯康辛序列分析包(the Wisconsin Sequence Analysis Package)的组成部分获得。另外的实例包括BESTFIT，BESTFIT使用Smith和Waterman的“局部同源性(localhomology) ” 算法(Advances in Applied Mathematics, 2:482-489，1981)以找出两个序列间的相似性最佳单个区域，在待比较的两个序列长度不同时更优选；和GAP，GAP将两个序列根据Neddleman和Wunsch的算法(J.Mol.B1l.48:443-354，1970)找到“最大相似性(maximum similarity) ”来进行比对,并且当这两个序列长度大概相同并且被期望在整个长度内比对时更优选。
[0036]“保守取代”是指某一类的一个氨基酸被同一类的另一个氨基酸置换。在多个特别的实施方案中，保守取代不改变多肽的结构或功能或者它们二者。以保守取代为目的的氨基酸种类包括疏水性氨基酸(Met、Ala、Val、Leu、Ile)、中性亲水性氨基酸(Cys、Ser、Thr)、酸性氨基酸(Asp、Glu)、碱性氨基酸(Asn、Gln、His、Lys、Arg)、构象破坏者(conformat1ndisrupters) (Gly> Pro)和芳族氨基酸(Trp、Tyr、Phe)。
[0037]如本文所用的，术语“片段(fragment) ”在核酸序列的上下文中是指包含来自母本序列(parent sequence)的连续核苷酸的一部分的核苷酸序列。在一个具体的实施方案中，该术语是指来自母本序列的5至15、5至25、10至30、15至30、10至60、25至100、150至300个或更多个连续核苷酸的核苷酸序列。在另一个实施方案中，该术语是指母本序列的至少 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、150、175、200、250、275、300、325、350、375、400、425、450 或 475 个连续核苷酸的核苷酸序列。
[0038]如本文所用的，术语“片段”在氨基酸序列的上下文中是指包含来自母本序列的连续氨基酸残基的一部分的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，该术语是指来自母本序列的2至30、5至30、10至60、25至100、150至300个或更多个连续氨基酸残基的氨基酸序列。在另一个实施方案中，该术语是指母本序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、
55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、150、175 或 200 个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0039]如本文所用的，术语“疾病(disease) ”和“紊乱(disorder) ”可互换使用，是指对象的病症(condit1n)。在有些实施方案中，所述病症是病毒性感染。在多个具体的实施方案中，术语“疾病”是指细胞或对象中由于病毒的存在所致的病理学状态，或者细胞或对象被病毒侵袭所致的病理学状态。在某些实施方案中，所述病症是对象的疾病，其严重程度因给予免疫原性组合物而在对象体内诱导免疫应答而降低。
[0040]如本文所用的，术语“有效量”在将某种疗法给予对象的上下文中是指具有预防效果和/或治疗效果的疗法的量。在某些实施方案中，“有效量”在将某种疗法给予对象的上下文中是指足以实现下述效果中的一、二、三、四个或四个以上的疗法的量:(i)减轻或缓解流感病毒感染、疾病或与其相关的症状的严重程度；(ii)缩短流感病毒感染、疾病或与其相关的症状的持续时间；(iii)阻止流感病毒感染、疾病或与其相关的症状的进程；(iv)引起流感病毒感染、疾病或与其相关的症状的消退；(V)防止流感病毒感染、疾病或与其相关的症状的发展或发作；(vi)防止流感病毒感染、疾病或与其相关的症状的复发；(vii)减少或防止流感病毒从一个细胞到另一个细胞、从一个组织到另一个组织或者从一个器官到另一个器官的传播；(ix)防止或减少流感病毒从一个对象到另一个对象的传播；(χ)减少与流感病毒感染相关的器官衰竭；(Xi)减少对象住院；(xii)缩短住院的时间；(xiii)增加患有流感病毒感染或与其相关的疾病的生存时间；(xiv)消除流感病毒感染或与其相关的疾病；(XV)抑制或减少流感病毒复制；(xvi)抑制或减少流感病毒进入宿主细胞；(xviii)抑制或减少流感病毒基因组的复制；(xix)抑制或减少流感病毒蛋白的合成；(XX)抑制或减少流感病毒颗粒的装配；(xxi)抑制或减少流感病毒颗粒从宿主细胞中的释放；(xxii)降低流感病毒滴度；和/或(xxiii)增强或提高另一种疗法的预防效果或治疗效果。
[0041]在某些实施方案中，所述有效量并不导致完全保护免于患上流感病毒疾病，但是可以导致与未治疗的对象相比，流感病毒的滴度降低或数量减少。在某些实施方案中，所述有效量导致相对于未治疗的对象，流感病毒的滴度有0.5倍、I倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、15 倍、20 倍、25 倍、50 倍、75 倍、100 倍、125 倍、150 倍、175 倍、200 倍、300 倍、400 倍、500倍、750倍或1，000倍或更高倍数的减少。在有些实施方案中，所述有效量导致流感病毒的滴度相对于未治疗的对象减少近似Ilog或更高、近似21ogs或更高、近似31ogs或更高、近似41ogs或更高、近似51ogs或更高、近似61ogs或更高、近似71ogs或更高、近似81ogs或更高、近似91ogs或更高、近似1logs或更高，I至31ogs、l至51ogs、l至81ogs、I 至 91ogs、2 至 101ogs、2 至 51ogs、2 至 71ogs、21ogs 至 81ogs、2 至 91ogs、2 至 101ogs3 至51ogs、3 至 71ogs、3 至 81ogs、3 至 91ogs、4 至 61ogs、4 至 81ogs、4 至 91ogs、5 至 61ogs、5至 71ogs、5 至 81ogs、5 至 91ogs、6 至 71ogs、6 至 81ogs、6 至 91ogs、7 至 81ogs、7 至 91ogs或8至91ogs。降低流感病毒的滴度、数量或总负担的益处包括但不限于感染症状的严重性更低、感染症状更少和与感染相关的疾病的病程缩短。
[0042]如本文所用的，术语“流感血细胞凝集素多肽(flu hemagglutininpolypeptide) ”和“流感HA多肽(flu HA polypeptide) ”是指(i)本文公开的嵌合的流感血细胞凝集素(HA)多肽；和(ii)本文公开的包含流感病毒血细胞凝集素头结构域和/或流感病毒血细胞凝集素干结构域的多肽或其片段中的任一个，其中任一个所述流感病毒血细胞凝集素干结构域包含一个或多个修饰的糖基化位点；所述流感病毒血细胞凝集素头结构域包含一个或多个非天然存在的糖基化位点；或它们二者。流感HA多肽包括但不限于嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽、非嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽、流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽和流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽。在一个具体的实施方案中，所述流感HA多肽是嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽，其包含在所述流感病毒血细胞凝集素干结构域中破坏聚糖与干结构域结合的任何一个或多个修饰的糖基化位点；包含一个或多个非天然存在的糖基化位点的流感病毒血细胞凝集素球状头结构域；或它们二者。在另一个实施方案中，所述流感HA多肽是(流感病毒的任何毒株、亚型或型的或来自流感病毒的任何毒株、亚型或型的)流感血细胞凝集素多肽，其包含在所述流感病毒血细胞凝集素干结构域中破坏聚糖与干结构域结合的一个或多个修饰的糖基化位点，包含一个或多个非天然存在的糖基化位点的流感病毒血细胞凝集素球状头结构域；或它们二者。参见例如，实施例11，参见下文关于这样的流感多肽。
[0043]“血细胞凝集素(Hemagglutinin) ”和“HA”是指本领域技术人员已知的任何血细胞凝集素。在某些实施方案中，所述血细胞凝集素是流感血细胞凝集素，例如甲型流感血细胞凝集素、乙型流感血细胞凝集素或丙型流感血细胞凝集素。典型的血细胞凝集素包含本领域技术人员已知的结构域，包括信号肽(本文中任选的)、干结构域、球状头结构域、胞腔结构域(luminal domain)(本文中任选的)、跨膜结构域(本文中任选的)和细胞质结构域(本文中任选的)。在某些实施方案中，血细胞凝集素由一条多肽链组成，例如HA0。在某些实施方案中，血细胞凝集素由超过一条多肽链呈四级缔合组成，例如HAl和HA2。本领域技术人员将认识到，未成熟的HAO可能被切割以释放信号肽(近似20个氨基酸)得到成熟的血细胞凝集素ΗΑ0。血细胞凝集素HAO可能在另一个位点被切割以得到HAl多肽(近似320个氨基酸，包括球状头结构域和一部分干结构域)和HA2多肽(近似220个氨基酸，包括干结构域的剩余部分、胞腔结构域、跨膜结构域和细胞质结构域)。在某些实施方案中，血细胞凝集素包含信号肽、跨膜结构域和细胞质结构域。在某些实施方案中，血细胞凝集素缺少信号肽，也就是说，所述血细胞凝集素是成熟的血细胞凝集素。在某些实施方案中，血细胞凝集素缺少跨膜结构域或细胞质结构域或它们二者。如本文所用的，术语“血细胞凝集素”和“HA”包括经翻译后加工修饰的血细胞凝集素多肽，所述翻译后加工例如信号肽切除、二硫键形成、糖基化(例如N-连接的糖基化)、蛋白酶切割和脂质修饰(例如S-棕榈酰化)。
[0044]如本文所用的，术语“嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽(chimeric influenzavirus hemagglutinin polypeptide) ”、“嵌合的流感病毒HA多肽”、“嵌合的血细胞凝集素多肽”和“嵌合的流感血细胞凝集素多肽”是指包含流感病毒血细胞凝集素干结构域和流感病毒血细胞凝集素头结构域的流感血细胞凝集素，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域来说是异源的。在某些实施方案中，所述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的流感病毒血细胞凝集素头结构域是来自与所述流感病毒血细胞凝集素干结构域不同的流感病毒的毒株或亚型。在某些实施方案中，在本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的上下文中，异源流感病毒血细胞凝集素头结构域是指与同源头(即，在正常情况下与所述嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的干结构域缔合的头结构域)有至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少5_10%、至少10-15%、至少10-20%、至少15-20%或至少20-25%不相同的流感病毒血细胞凝集素头。本领域技术人员将认识到，这样一种差异可以使用本领域已知的和本文描述的方法来测量，例如，比较头结构域的序列同一性或序列同源性。在某些实施方案中，在本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的上下文中，异源流感病毒血细胞凝集素头结构域是指这样的流感病毒血细胞凝集素头:在血细胞凝集抑制测定中，导致产生相对于针对同源头(即，在正常情况下将与所述嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的干结构域缔合的头结构域)产生的抗血清的血细胞凝集抑制滴度，血细胞凝集抑制滴度有至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少6倍减少的抗血清。本领域技术人员将认识到，这样一种差异可以使用本领域已知的和本文描述的方法来测量(参见例如，第5.14节，参见下文)。
[0045]“HA1N-端干区段(HAlN-terminal stem segment) ”是指对应于流感血细胞凝集素HAl多肽的干结构域的氨基端部分的多肽区段。在某些实施方案中，HAlN-端干区段由大致对应于HAl结构域的氨基酸HA I 直到Ap的氨基酸残基组成。HAI N-Ui是HAl的N-端氨基酸，正如本领域技术人员所知晓的。Ap是HAlN-端干区段中的半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基与HAlC-端干区段中的半胱氨酸残基形成或能够形成二硫键。残基Ap在图1中在甲型流感血细胞凝集素多肽中被标识出来。本文描述了示例性的HAlN-端干区段。在某些实施方案中，HAlN-端干区段由大致对应于来自H3血细胞凝集素的HAl的1_52位氨基酸的氨基酸残基组成。需要注意的是，在这个编号系统中，I指的是成熟的HAO蛋白的N-端氨基酸，其中信号肽已经被移除。本领域技术人员将能够容易地识别出对应于其它流感HA多肽的HAlN-端干区段的氨基酸残基，例如对应于来自Hl血细胞凝集素的HAl的HAlN-端干区段的氨基酸残基(参见例如图1)。
[0046]"HAlC-端干区段”是指对应于流感血细胞凝集素HAl多肽的干结构域的羧基端部分的多肽区段。在某些实施方案中，HAlC-端干区段由大致对应于HAl结构域的氨基酸Aq直到HAI 的氨基酸残基组成。HAI Cl是HAl结构域的C-端氨基酸，正如本领域技术人员所知晓的。残基Aq在图1中在甲型流感血细胞凝集素多肽中被标识出来。本文描述了示例性的HAlC-端干区段。在某些实施方案中，HAlC-端干区段由大致对应于来自H3血细胞凝集素的HAl的277-346位氨基酸的氨基酸残基组成。需要注意的是，在这个编号系统中，I指的是成熟的HAO蛋白的N-端氨基酸，其中信号肽已经被移除。本领域技术人员将能够容易地识别出对应于其它流感HA多肽的HAlC-端干区段的氨基酸残基，例如对应于来自Hl血细胞凝集素的HAl的HAlC-端干区段的氨基酸残基(参见例如图1)。
[0047]"HAlC-端短干区段”是指对应于流感血细胞凝集素HAl多肽的干结构域的羧基端部分的多肽区段。在某些实施方案中，HAlC-端短干区段由大致对应于HAl结构域的氨基酸Bq直到HAlc,的氨基酸残基组成。残基Bq在图1中在甲型流感血细胞凝集素多肽中被标识出来。本文描述了示例性的HAlC-端短干区段。在某些实施方案中，HAlC-端短干区段由大致对应于来自H3血细胞凝集素的HAl的305-346位氨基酸的氨基酸残基组成。需要注意的是，在这个编号系统中，I指的是成熟的HAO蛋白的N-端氨基酸，其中信号肽已经被移除。
[0048]"HAlN-端长干区段”是指对应于流感血细胞凝集素HAl多肽的干结构域的氨基端部分的多肽区段。在某些实施方案中，HAlN-端长干区段由大致对应于HAl结构域的氨基酸HAI N:-:.;:.直到Cp的氨基酸残基组成。Cp是HAlN-端长干区段中的半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基连接到或能够连接到HAlC-端长干区段中的丙氨酸残基上。残基Cp在图1中在甲型流感血细胞凝集素多肽中被标识出来。本文描述了示例性的HAlN-端长干区段。在某些实施方案中，HAlN-端长干区段由大致对应于来自H3血细胞凝集素的HAl的1_97位氨基酸的氨基酸残基组成。需要注意的是，在这个编号系统中，I指的是成熟的HAO蛋白的N-端氨基酸，其中信号肽已经被移除。
[0049]“HA1C-端长干区段(HAlC-terminal long stem segment) ” 是指对应于流感血细胞凝集素HAl多肽的干结构域的羧基端部分的多肽区段。在某些实施方案中，HAlC-端长干区段由大致对应于HAl结构域的氨基酸Cq直到HAlc,的氨基酸残基组成。Cq是HAlC-端长干区段中的丙氨酸残基，该丙氨酸残基连接到或能够连接到HAlN-端长干区段中的胱氨酸残基上。残基Cq在图1在甲型流感血细胞凝集素多肽中被标识出来。本文描述了示例性的HAlC-端长干区段。在某些实施方案中，HAlC-端长干区段由大致对应于来自H3血细胞凝集素的HAl的252-346位氨基酸的氨基酸残基组成。需要注意的是，在这个编号系统中，I指的是成熟的HAO蛋白的N-端氨基酸，其中信号肽已经被移除。
[0050]“HA2”是指对应于本领域技术人员已知的流感血细胞凝集素多肽的HA2结构域的多肽结构域。在某些实施方案中，HA2由干结构域、胞腔结构域、跨膜结构域和细胞质结构域组成(参见例如，Scheiffle等人，2007，EMBO J.16(18):5501-5508,其全部内容以引用方式结合于本文作为参考)。在某些实施方案中，HA2由干结构域、胞腔结构域和跨膜结构域组成。在某些实施方案中，HA2由干结构域和胞腔结构域组成；在这样的实施方案中，所述HA2可能是可溶的。在某些实施方案中，HA2由干结构域组成；在这样的实施方案中，所述HA2可能是可溶的。
[0051 ] 如本文所用的，术语“异源的”在多肽、核酸或病毒的上下文中分别是指这样的多肽、核酸或病毒:在正常情况下在自然界中不存在或在正常情况下在自然界中并不与感兴趣的多肽、核酸或病毒天然相关联。例如，“异源多肽”可以指来源于不同病毒的多肽，例如，不同的流感毒株或亚型或无亲缘关系的(unrelated)病毒或不同的种。在多个具体的实施方案中，当在本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素的球状头结构域的上下文中，术语异源是指与流感HA干结构域缔合的流感HA球状头结构域，已发现在正常情况下流感HA干结构域并不与之缔合(例如，HA的头结构域和干结构域在一起的情况在自然界中并不存在)。如上所述的，在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素的异源的流感HA球状头结构域与所述血细胞凝集素的同源性头(即，在正常情况下与所述嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的干结构域缔合的头结构域)有至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少5-10%、至少10-15%、至少10-20%、至少15-20%或至少20-25%不相同。
[0052]如本文所用的，术语“组合”在将两种或两种以上的疗法给予对象的上下文中是指使用超过一种疗法(例如，超过一种预防剂和/或治疗剂)。术语“组合”的使用并不限制将疗法给予对象的顺序。例如，第一疗法(例如，第一预防剂或治疗剂)可以在将第二疗法给予对象之前(例如，之前5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、I小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、I周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时或之后(例如，之后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、I小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、I周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)给予。
[0053]如本文所用的，术语“感染”意指细胞或对象被病毒侵袭，病毒在细胞或对象中的繁殖和/或存在。在一个实施方案中，感染是“活动性”感染，即其中病毒正在细胞或对象中复制的感染。这样一种感染以病毒已从被病毒最初感染的细胞、组织和/或器官扩散到其它的细胞、组织和/或器官为特征。感染也可以是潜伏感染，即其中病毒不复制的感染。在某些实施方案中，感染是指在细胞或对象中由于病毒的存在或者由于细胞或对象被病毒侵袭所致的病理学状态。
[0054]如本文所用的，术语“流感病毒疾病”是指在细胞或对象中由于流感病毒(例如甲型流感病毒或乙型流感病毒)的存在或者由于细胞或对象被流感病毒侵袭所致的病理学状态。在多个具体的实施方案中，该术语是指由流感病毒引起的呼吸性疾患。
[0055]如本文所用的，短语“ IFN缺陷型系统”或“ IFN-缺陷型底物”是指这样的细胞、细胞系和动物(例如猪、小鼠、鸡、火鸡、兔、大鼠等)等系统:其不产生IFN或产生低水平的IFN(即，在相同的条件下，当与能产生IFN(IFN-competent)的系统相比时，IFN表达降低 5-10%、10-2020-30 30-4040-5050-6060-70 70-8080-90%或更多)，对IFN不应答或以较低效率应答和/或在由IFN诱导的一个或多个抗病毒基因的活性中是有缺陷的。
[0056]如本文所用的，数字术语“log”是指logl。。
[0057]如本文所用的，术语“修饰的糖基化位点”是指在流感病毒血细胞凝集素多肽中已通过一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失而修饰的天然存在的糖基化位点。在某些实施方案中，所述修饰的糖基化位点不能够结合聚糖。在某些实施方案中，所述修饰的糖基化位点破坏或干扰修饰的糖基化位点上的糖基化。在某些实施方案中，所述修饰的糖基化位点不干扰本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒HA多肽)的正确折叠。在某些实施方案中，所述修饰的糖基化位点包含具有氨基酸基序(motif)Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位点的修饰，其中Xaa是任意氨基酸。在多个特别的实施方案中，所述修饰的糖基化位点包含在具有氨基酸基序Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位点中的一个或多个氨基酸取代，其中Xaa是任意氨基酸。
[0058]如本文所用的，短语“感染复数(multiplicity of infect1n) ”或“MOI ”是每个被感染的细胞中感染性病毒颗粒的平均数。把相加的感染性病毒颗粒数((加起来的ml)xPFU/ml)除以相加的细胞数((加起来的ml) χ细胞/ml)得出Μ0Ι。
[0059]如本文所用的，术语“非嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽”是指这样的流感病毒血细胞凝集素多肽:其包含来自相同的亚型或毒株的HA干结构域和HA头结构域，和其中所述多肽包含一个或多个非天然存在的糖基化位点(如在第5.4.2节中所论述，参见下文)和/或一个或多个修饰的糖基化位点(如在第5.4.1节中所论述，参见下文)。在某些实施方案中，所述非嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽包含来自相同的流感病毒亚型的HA干结构域和HA球状头结构域。在多个具体的实施方案中，所述流感病毒亚型是Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16 或 H17 亚型。在某些实施方案中，所述非嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽包含来自相同的流感病毒毒株的HA干结构域和HA球状头结构域。在某些实施方案中，所述流感病毒毒株是A/Netherlands/602/2009。
[0060]如本文所用的，术语“非天然存在的糖基化位点”是指位于特殊的球状头结构域里面任何氨基酸位置上的糖基化位点，其中相对于特殊的HA亚型或毒株，天然存在的糖基化位点是不存在的。非天然存在的糖基化位点的一个实例是糖基化位点添加到一种亚型的流感病毒血细胞凝集素的球状头结构域，其中所述糖基化天然存在于来自另一种亚型的流感病毒血细胞凝集素的球状头结构域。非天然存在的糖基化的另一个实例是糖基化位点添加到来自一种毒株的流感病毒血细胞凝集素的球状头结构域，其中所述糖基化位点天然存在于来自另一种流感病毒毒株的血细胞凝集素的球状头。非天然存在的糖基化位点的又一个实例是糖基化位点添加到来自一种毒株的流感病毒血细胞凝集素的球状头结构域，其中所述糖基化位点并不天然存在于来自流感病毒的另一种亚型或毒株的血细胞凝集素的球状头。在多个优选的实施方案中，所述非天然存在的糖基化位点具有氨基酸基序Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys，其中Xaa是任意氨基酸，或者，在某些实施方案中，其中Xaa是Pro除外的任意氨基酸。
[0061]如本文所用的，术语“核酸”意在包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)和DNA的类似物或使用核苷酸类似物产生的RNA。所述核酸可以是单链或双链的。
[0062]“多肽”是指氨基酸通过酰胺键连接而成的多聚体，正如本领域技术人员所知晓的。如本文所用的，该术语可以指通过共价酰胺键连接而成的单条多肽链。该术语也可以指通过非共价相互作用例如离子接触、氢键、范德华接触(Van der Waals contacts)和疏水接触缔合而成的多条多肽链。本领域技术人员将认识到，该术语包括已被修饰过的多肽，例如通过翻译后加工，例如信号肽切除、二硫键形成、糖基化(例如N-连接的糖基化)、蛋白酶切割和脂质修饰(例如S-棕榈酰化)。
[0063]如本文所用的，术语“预防”在将一种或多种疗法给予对象以预防流感病毒疾病的上下文中是指由于给予一种疗法或多种疗法的组合所导致的预防效果/有益效果中的一种或多种。在一个具体的实施方案中，术语“预防”在将一种或多种疗法给予对象以预防流感病毒疾病的上下文中是指由于给予一种疗法或多种疗法的组合所导致的下述效果中的一种或多种:(i)抑制流感病毒疾病或其症状的发展或发作；(ii)抑制流感病毒疾病或与其相关的症状的复发；和(iii)减少或抑制流感病毒感染和/或复制。
[0064]如本文所用的，术语“纯化的”和“分离的”当在从天然来源例如细胞中获得的多肽(包括抗体)的上下文中使用时是指这样的多肽:其基本上不含来自天然来源的污染物质，例如土壤颗粒、矿物质、来自环境的化学物质和/或来自天然来源的细胞材料，例如但不限于细胞中存在的细胞碎片、细胞壁物质、细胞膜、细胞器、大团核酸、碳水化合物、蛋白质和/或脂质。因此，被分离出来的多肽包括具有小于约30%、20%、10%、5%、2%或1% (以干重计)的细胞材料和/或污染物质的多肽制备物。如本文所用的，术语“纯化的”和“分离的”当在经化学合成获得的多肽(包括抗体)的上下文中使用时是指这样的多肽:其基本上不含化学前体或合成多肽所涉及的其它化学物质。在一个具体的实施方案中，流感HA多肽(例如，流感血细胞凝集素干结构域多肽、流感血细胞凝集素头结构域多肽、嵌合的流感血细胞凝集素多肽和/或非嵌合的流感血细胞凝集素多肽)是化学合成的。在另一个具体的实施方案中，流感血细胞凝集素干结构域多肽、流感血细胞凝集素头结构域多肽和/或嵌合的流感血细胞凝集素多肽是分离的。
[0065]如本文所用的，术语“复制”、“病毒的复制”和“病毒复制”在病毒的上下文中是指病毒生命周期的一个或多个阶段、或全部阶段，其导致病毒的繁殖。病毒生命周期的步骤包括但不限于病毒附着到宿主细胞表面、穿透或进入宿主细胞(例如，通过受体介导的细胞内吞或膜融合)、脱壳(其中病毒衣壳被病毒酶或宿主酶脱去并降解从而释放病毒基因组核酸的过程)、基因组复制、合成病毒信使RNA(mRNA)、病毒蛋白合成和用于基因组复制的病毒核糖核蛋白复合体的装配、病毒颗粒的装配、病毒蛋白的翻译后修饰以及从宿主细胞中通过细胞裂解或出芽而释放，以及获取含有包埋的病毒糖蛋白的磷脂包膜。在有些实施方案中，术语“复制”、“病毒的复制”和“病毒复制”是指病毒基因组的复制。在其它的实施方案中，术语“复制”、“病毒的复制”和“病毒复制”是指病毒蛋白的合成。
[0066]如本文所用的，术语“干结构域多肽”和“流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽”是指血细胞凝集素多肽的衍生物，例如工程衍生物，其包含一个或多个构成血细胞凝集素的干结构域的多肽链。干结构域多肽可以是单条多肽链、两条多肽链或更多条多肽链。典型地，干结构域多肽是单条多肽链(即，对应于血细胞凝集素HAO多肽的干结构域)或两条多肽链(即，对应于与血细胞凝集素HA2多肽缔合的血细胞凝集素HAl多肽的干结构域)。在某些实施方案中，干结构域多肽来源于流感血细胞凝集素。在多个具体的实施方案中，干结构域多肽来源于Hl或H3流感病毒血细胞凝集素。工程干结构域多肽可包含如下所述的一个或多个接头。
[0067]如本文所用的，术语“流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽”、“流感病毒血细胞凝集素头结构域”、“HA球状头结构域”和“HA头结构域”是指流感血细胞凝集素多肽的球状头结构域。流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽或流感病毒血细胞凝集素头结构域可包含已知的(例如野生型)流感病毒血细胞凝集素头结构域或由其组成或者可包含已知的(例如野生型)流感病毒血细胞凝集素头结构域的衍生物(例如工程衍生物)或由其组成。
[0068]如本文所用的，术语“对象(subject)”或“患者(patient) ”可互换使用，是指动物(例如，鸟类、爬行动物和哺乳动物)。在一个具体的实施方案中，对象是鸟类。在另一个实施方案中，对象是哺乳动物，包括非灵长类动物(例如，骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类动物(例如，猴、黑猩猩和人)。在某些实施方案中，对象是非人动物。在有些实施方案中，对象是农场动物或宠物。在另一个实施方案中，对象是人。在另一个实施方案中，对象是人类婴儿。在另一个实施方案中，对象是人类儿童。在另一个实施方案中，对象是人类成人。在另一个实施方案中，对象是老年人。在另一个实施方案中，对象是早产的人类婴儿。
[0069]如本文所用的，术语“早产的人类婴儿”是指在少于37周的妊娠期出生的人类婴儿。
[0070]如本文所用的，术语“人类婴儿”是指刚出生的到I周岁的人。
[0071]如本文所用的，术语“人类儿童”是指I周岁到18周岁的人。
[0072]如本文所用的，术语“人类成人”是指18岁或18岁以上的人。
[0073]如本文所用的，术语“老年人”是指65岁或65岁以上的人。
[0074]术语“三级结构”和“四级结构”具有本领域技术人员所理解的含义。三级结构是指单条多肽链的三维结构。四级结构是指具有多条多肽链的多肽的三维结构。
[0075]如本文所用的，术语“季节性流感病毒毒株(seasonal influenza virusstrain) ”是指以季节为基础被暴露的对象群体的流感病毒的毒株。在多个具体的实施方案中，术语季节性流感病毒毒株是指甲型流感病毒的毒株。在多个具体的实施方案中，术语季节性流感病毒毒株是指属于Hl或H3亚型(S卩，目前在人对象群体中持续存在的两种亚型)的流感病毒的毒株。在其它的实施方案中，术语季节性流感病毒毒株是指乙型流感病毒的毒株。
[0076]如本文所用的，术语“疗法”可以指可用于预防或治疗病毒性感染或与其相关的疾病或症状的任选方案、方法、化合物、组合物、制剂和/或药剂(agent(s))。在某些实施方案中，术语“疗法”可以指可用于治疗或预防本领域技术人员已知的病毒性感染或与其相关的疾病或症状的生物学疗法、支持性疗法和/或其它疗法。在有些实施方案中，术语“疗法”是指(i)编码流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)的核酸，(ii)流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)，或(iii)包含编码流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)的核酸或包含流感HA多肽的载体或组合物。在有些实施方案中，术语“疗法”是指与嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽特异性结合的抗体。
[0077]如本文所用的，术语“治疗”是指将一种或多种疗法给予对象以治疗流感病毒疾病或感染而获得一种疗法或多种疗法的组合的有益效果或治疗效果的情况。在多个具体的实施方案中，这样的术语是指由于给予一种疗法或多种疗法的组合所导致的下述效果中的一、二、三、四、五种或五种以上:(i)减轻或缓解流感病毒感染或与其相关的疾病或症状的严重程度；(ii)缩短流感病毒感染或与其相关的疾病或症状的持续时间；(iii)引起流感病毒感染或与其相关的疾病或症状的消退；(iv)降低流感病毒的滴度；(V)减少与流感病毒感染或与其相关的疾病相关的器官裳竭；(vi)减少对象住院；(vii)缩短住院的时间；(viii)增加对象的生存时间；(ix)消除流感病毒感染或与其相关的疾病或症状；(χ)抑制流感病毒感染或与其相关的疾病或症状的进程；(Xi)防止流感病毒从一个细胞、组织、器官或对象到另一个细胞、组织、器官或对象的传播；(Xii)抑制或减少流感病毒进入宿主细胞；(xiii)抑制或减少流感病毒基因组的复制；(xiv)抑制或减少流感病毒蛋白的合成；(xv)抑制或减少流感病毒颗粒从宿主细胞中的释放；和/或(xvi)增强或提高另一种疗法的治疗效果。
[0078]如本文所用的，在有些实施方案中，短语“野生型”在病毒的上下文中是指疾病的大流行(prevalent)、自然地流行和产生典型爆发的病毒类型。在其它的实施方案中，术语“野生型”在病毒的上下文中是指亲代病毒。
[0079]4.附图简沭
[0080]图1表示甲型流感病毒血细胞凝集素的16种亚型的代表性序列(分别为SEQ IDN0S: 1-16)通过CLUSTALW进行的序列比对。称为Ap的残基是HAlN-端干区段的半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基与HAlC-端干区段中的称为Aq的残基一半胱氨酸残基形成或能够形成二硫键。称为B,的残基代表本文描述的HAlC-端短干区段的近似N-端氨基酸。称为Cq的残基代表本文描述的HAlC-端长干区段的近似N-端氨基酸。称为Cp的残基代表本文描述的HAlN-端长干区段的近似C-端氨基酸。
[0081]图2 表示与甲型流感 HK68-H3N2(SEQ ID NO: 3)和 PR8-H1N1 (SEQ ID NO:1)血细胞凝集素比对的乙型流感病毒血细胞凝集素(SEQ ID NO:558)的代表性序列通过CLUSTALW进行的序列比对。
[0082]图3表示乙型流感病毒血细胞凝集素(SEQ ID NO: 17)的序列表，标注了构成多种本文描述的N-端和C-端干区段和中间干区段的边界的氨基酸。
[0083]图4提供甲型流感HA干结构域多肽的推定结构，基于HK68-H3N2血细胞凝集素蛋白。图4A提供甲型流感HA干结构域多肽的推定结构，基于HK68-H3N2血细胞凝集素蛋白、HAlN-端干区段SEQ ID NO: 36和C-端干区段SEQ ID NO: 52。图4B提供甲型流感HA短干结构域多肽的推定结构，基于HK68-H3N2血细胞凝集素蛋白、HAlN-端干区段SEQ ID NO: 36和C-端短干区段SEQ ID N0:352。图4C提供甲型流感HA长干结构域多肽的推定结构，基于HK68-H3N2血细胞凝集素蛋白、HAlN-端长干区段SEQ ID NO:417和C-端长干区段SEQID NO:433。
[0084]图5提供甲型流感HA干结构域多肽的推定结构，基于PR8-H1N1血细胞凝集素蛋白。图5A提供甲型流感HA干结构域多肽的推定结构，基于PR8-H1N1血细胞凝集素蛋白、HAlN-端干区段SEQ ID NO: 18和C-端干区段SEQ ID N0:34。图5B提供甲型流感HA短干结构域多肽的推定结构，基于HAlN-端干区段SEQ ID NO: 18和C-端短干区段SEQ IDNO: 350。图5C提供甲型流感HA长干结构域多肽的推定结构，基于PR8-H1N1血细胞凝集素蛋白、HAlN-端长干区段SEQ ID NO:414和C-端长干区段SEQ ID NO:430。
[0085]图6提供乙型流感HA干结构域多肽的推定结构。图6A提供基于B/HongKong/8/73血细胞凝集素蛋白的部分无头的HA分子，其中HA的HAl结构域的前94个氨基酸被保留(SEQ ID NO: 550)，并且其中Cys94通过接头桥的方式直接连接到HAl结构域的Cysl43上(SEQ ID N0:553)。图6B描绘基于B/Hong Kong/8/73血细胞凝集素蛋白的部分无头的HA分子，其中HA的HAl结构域的前178个氨基酸被保留(SEQ ID NO: 551)，并且其中Cysl78通过接头桥的方式直接连接到HAl结构域的Cys272上(SEQ ID NO: 554)。图6C描绘基于B/Hong Kong/8/73血细胞凝集素蛋白的无头的HA分子，其中HA的HAl结构域的前94个氨基酸被保留(SEQ ID NO: 555)，并且其中Cys94通过接头桥的方式直接连接到HAl结构域的Cysl43上。而且，HAl结构域的氨基酸143至178也被保留(SEQ ID NO:556)，并且Cysl78通过接头桥的方式直接连接到HAl结构域的Cys272上(SEQ ID NO: 557)。图6D描绘基于B/Hong Kong/8/73血细胞凝集素蛋白的无头的HA分子，其中HA的HAl结构域的前54个氨基酸被保留(SEQ ID NO: 552)，并且其中Cys54通过接头桥的方式直接连接到HAl 结构域的 Cys272 上(SEQ ID NO:554)。
[0086]图7提供具有保守的Hl茎结构域和来自截然不同的亚型HAs的不同球状头结构域的嵌合HAs的示意图。
[0087]图8提供一种新的流感疫苗和诊断工具平台以诱导和分析抗体和反应性血清。A)嵌合HAs的表达。由A/PR8/34HA的茎结构域和A/California/4/09的球状头结构域组成的嵌合HAs (嵌合的HA)以及野生型HAs (PR8-HA和CAL09-HA)和GFP对照在293T细胞中被表达。顶上的蛋白质印迹用PR8-特异性抗体(PY102)探测，而下面的印迹用对Cal09有特异性的抗体(39C2)探测。B)在A中表达的HA构建体的示意图。嵌合的HA由A/PR/8/34HA茎结构域和2009A/California/04/09球状头结构域组成。
[0088]图9提供嵌合HAs的示意图。A)嵌合HA的基础结构。球状头可以方便地在二硫键Cys52-Cys277发生交换。B)序贯给予由完全保守的茎结构域和变化的球状头结构域组成的嵌合HAs的致敏一加强方案。
[0089]图10描述了具有HlHA的茎和H3HA的球状头的嵌合HA的产生。由A/PR8/34HA的茎结构域和HK/68的球状头结构域组成的嵌合HA (嵌合的H3)以及野生型HAs (PR8-HA和HK68HA)在293T细胞中被表达。顶上的蛋白质印迹用PR8-特异性抗体探测，而下面的印迹用对H3有特异性的抗体探测。
[0090]图 11 描绘 A/Hong Kong/1/1968 (H3)、A/Perth/16/2009 (H3)、A/PR/8/34 (HI)、A/Cal/4/09(Hl)、A/Viet Nam/1203/04 (H5)和 A/mallard/Alberta/24/01 (H7)的血细胞凝集素蛋白序列的序列比较。Cys52和Cys272氨基酸残基是特化的(基于H3编号)。黑色阴影部分表示保守的氨基酸。黑色波浪线代表HAs的球状头区域。标出了 HAl和HA2的起始点。
[0091]图12描绘嵌合的血细胞凝集素的示意图。(A)嵌合的PR8-CH1HA的构建图。嵌合的HA通过调换位于A/PR/8/34 (HI) HA的Cys52和Cys277之间的球状头结构域与A/California/4/09 (HI)HA的球状头结构域来构建。所得的嵌合的HA具有A/PR8/34(H1)HA的茎区域与A/California/4/09 (Hl)HA的球状头结构域，命名为PR8-cHl。(B)不同的野生型和嵌合的HAs的折叠结构的示意图，例如野生型PR8HA、嵌合的PR8_cHlHA、嵌合的PR8-cH5HA、野生型Perth HA和嵌合的Perth_cH7HA (从左到右)。全长HA结构从蛋白质数据库(PDB)下载:PR8HA(PDB ID1RU7)和 Perth HA (由 HK68HA 表示，PDB ID1MQN)。最终的图像用 PyMol (Delano Scientific)产生。
[0092]图13描绘嵌合的HA构建体的表面表达和功能性分析。㈧嵌合的HA构建体的表面表达在瞬时转染的细胞中进行了评估。在转染后24小时时，293T细胞用胰蛋白酶消化，嵌合的HA蛋白的细胞表面表达通过流式细胞术(flow cytometry)进行分析。在顶上的图中，将模拟转染的细胞(左边有阴影的区域)与用PR8HA(右边)转染的细胞或用PR8-CH1 (右边)或PR8-cH5(右边)转染的细胞进行比较。在底下的图中，将模拟转染的细胞(左边有阴影的区域)与用Perth和Perth-CH7构建体(右边)转染的细胞进行比较。
(B)用表达嵌合HAs的编码萤光素酶的假-颗粒来感染MDCK细胞。在萤光素酶测定中产生的相对光单位(relative light unit, RLU)表示表达嵌合HAs的假-颗粒能够进入细胞。
[0093]图14描述了携带嵌合血细胞凝集素的重组病毒的产生。(A)重组病毒的蛋白质印迹分析。制备出来自模拟感染的MDCK细胞或用指定病毒以MOI为2感染的MDCK细胞的提取物(16hpi)并用以下抗体探测:抗A/PR8/HA(H1) (PY102)、抗A/Cal/09/HA (HI)(29C1)、抗 A/VN/HA(H5) (M08)、抗 H3/HA (12D1)、抗 H7 (NR-3125)、抗 A/NP (HT103)和作为内部上样对照的抗GAPDH。(B)用重组病毒感染的MDCK细胞的免疫荧光分析，使用以下抗体:抗 A/NP (HT103)、抗 A/H1HA (6F12)、抗 A/PR8/HA (PY102)、抗 A/Cal/09/HA (29C1)、抗 A/VN/HA(M08)、抗 H3/HA(12D1)和抗 A/H7 病毒(NR-3152)。
[0094]图15描述了重组病毒的生长动力学和空斑表型。(A)1日龄含胚鸡蛋用野生型病毒或重组病毒以每只蛋10pfu感染，感染后监测病毒生长达72小时。(B)重组病毒的空斑表型通过空斑测定进行了评价。MDCK细胞用野生型病毒或重组病毒感染并在感染后48小时进行免疫染色以揭示出使用针对A/NP(HT103)的抗体空斑表型。
[0095]图16描绘用嵌合的H6血细胞凝集素转染的细胞的免疫荧光分析。293T细胞用I μ g的表达嵌合的H6血细胞凝集素的PCAGGS质粒转染。将来自接受DNA(A)、Cal/09感染(B)、DNA和Cal/09感染(C)或Cal/09裂解疫苗(D)的动物的血清加入到被转染的细胞中并在与Alexa Fluor594_缀合的抗小鼠IgG孵育之后通过突光显微镜术来显现。
[0096]图17证明DNA致敏(prime)和嵌合的病毒加强对用致死性流感病毒攻击来攻击的动物赋予保护作用。动物或用单独的DNA、单独的嵌合的H9病毒、DNA致敏和嵌合的H9病毒加强或用灭活PR8病毒进行处理。然后，小鼠用5x104PFU的PR8病毒攻击,鼻内滴注，监测动物的体重达14天。
[0097]图18证明如ELISA确定的茎特异性抗体与抗cH6蛋白的反应性。
[0098]图19描绘具有干结构域和球状头结构域的A/PR/8/34H1血细胞凝集素三聚体的结构。所述血细胞凝集素三聚体被描述为无聚糖(A)，呈野生型形式，有聚糖结构(B)和呈突变体形式，其中聚糖结构从茎结构域中取出再添加到球状头结构域上(C)。
[0099]图20描绘A/PR/8/34(PR8)和A/HK/1/68 (HK68)血细胞凝集素(HA)的序列。构成干结构域的氨基酸加框。构成茎结构域和球状头结构域之间的边界的半胱氨酸(“C”)是在构成干结构域的氨基酸的第一个盒子之后且在构成干结构域的氨基酸的第二个盒子之前显示的那些。剩余的氨基酸(非盒子内的氨基酸，不包括在构成干结构域的氨基酸的第一个盒子之后且在构成干结构域的氨基酸的第二个盒子之前存在的半胱氨酸)是构成球状头结构域的那些。天然存在的糖基化位点用对应于球状头结构域的氨基酸段中的加深的字体表示。跨膜结构域和胞外结构域由在各序列末端氨基酸突出序列段表示。标出了为了破坏聚糖与干结构域结合而突变的糖基化位点；这些包括下列序列:NNST、NVT、NSS、NGT (在 HA PR8 中)和 NST、NGT、NAT、NGS、NGT (在 HA HK68 中)。
[0100]图21描绘画出流感血细胞凝集素(Hl)的单体的球状头结构域上免疫优势抗原性位点的示意图(A)。将非天然存在的糖基化位点引入到A/Pr/8/34Hl血细胞凝集素的抗原性位点中的示例性突变(B)。这些非天然存在的糖基化位点由氨基酸基序N-Xaa-S/T表示，其中Xaa可以是任意氨基酸。
[0101]图22描绘在人Hl亚型的HA中随时间获取糖基化位点(至多且包括2009H1N1病毒和其它2009流感病毒)。自1918年起和在2009年HlNl大流行的病毒新出现之前在人类中流行的季节性HlNl毒株的HAl中的抗原性位点的氨基酸比对⑷。为了简便，用选择出的原型的(prototypical)参考毒株和从流感研究数据库(the Influenza ResearchDatabase)和流感病毒资源数据库(the Influenza Virus Resource Database)(登录号在方法中列出)获得的疫苗毒株作了比对。对应于该年度缺少分离株序列或者由于可获得的序列很少引起的不清楚的原型(prototype)序列的年份没有显示。有阴影的区域描绘在顶上列出的已知抗原性位点。在命名为1、2和3的区域中的加框的内容代表保守的糖基化；在命名为4、5、6和7的区域中的加框的内容代表随时间出现的糖基化。时间线描绘获取HA蛋白的球状头中的糖基化的年份(B)。编号表示最下面显示的特定年份出现的糖基化位点的氨基酸位置。箭头指示整个时间一直存在的糖基化位点，而圆圈代表消失的特定糖基化位点。不连续的线显示在HlNl在人类中没有流行期间的时间周期。各糖基化的特定位置的结构表示，因为它们从1918年到2009ρΗ1Ν1病毒新出现而随时间出现(C)。HA表示为构成HA三聚体分子的带(ribbons)。位置指的是Hl命名(71、142、144、172和177分别对应于 H3 编号 58、128、130、158 和 163)。
[0102]图23描绘HA糖基化突变型2009ρΗ1Ν1病毒的表型表征。在MDCK细胞中拯救的A/Netherlands/602/2009HA糖基化突变型病毒的空斑大小表型(A)。从以MOI为5感染12小时的MDCK细胞中获得的全细胞裂解物的蛋白质印迹分析(B)。裂解液在非还原条件下电泳，并用针对缺少Hl的PR8病毒产生的兔多克隆抗体3851来检测印迹，其已通过酸和DTT处理去除。以MOI为0.001感染的分化人气管支气管上皮细胞中被拯救病毒的生长动力学
(C)。在MDCK细胞中，通过标准空斑测定显示的对各时间点进行了病毒滴定。
[0103]图24显示在HA中具有额外糖基化的2009ρΗ1Ν1病毒在小鼠和雪貂中是减毒的。(A - E)9周龄C57B/6雌性小鼠用Neth/09糖基化突变病毒感染。每种重组病毒η = 5小鼠的组用指定病毒剂量经鼻内(1.n.)感染。体重代表各组的平均值，误差棒表示各时间点上的标准偏差(s.d.)。(F)来自用各突变型病毒IXlO3Pfu感染的小鼠的肺的滴度在感染后(p.1.)第2天(圆圈)、第3天(方块)和第7天(三角)获得，如所显示的。黑色棒表示与rNeth/09WT病毒相比，在各时间点每个组2只(箭头)或3只小鼠的平均病毒滴度。(G)在用指定病毒感染的雪貂(每组η = 3)中的体重变化。重量表示为平均值，而误差棒代表各时间点的标准偏差(s.d.)。(H)每隔一天从(G)中显示的雪貂中获得的鼻洗涤液中的病毒滴度。(I)来自在用指定病毒感染后第3天(3p.1.)的雪貂(η = 3)的组织中的病毒负荷。数值如在(F)中表示。雪貂的体重的统计学上的显著性差异用威氏配对检验(ffilcoxon-matched pairs test)来估算(G)。
[0104]图25描绘在Tx/91的HA中含有糖基化缺失的病毒表现出在小鼠中的毒力增加并且对2009ρΗ1Ν1毒株有交叉保护作用。携带野生型或糖基化缺失突变型A/Texas/36/1991HAs的重组甲型流感病毒和来自PR8 (病毒是rPR87: 1Τχ/91ΗΑ)的剩余7个基因的表型表征。(A)从用相应糖基化缺失突变型病毒以MOI为5感染12小时的MDCK细胞获得的裂解液的蛋白质印迹分析。裂解液在非还原条件下电泳，并用多克隆3951抗体来检测印迹。(B)用显示的各病毒IXlO4Pfu感染的8周龄C57B/6雌性小鼠。小鼠每组η = 5的平均体重。而误差棒代表各时间点的标准偏差(s.d.)。(C)允许在(B)中感染的小鼠发生血清转化27天，在此时它们用100LD50的Neth/09攻击。体重代表具有其相应标准偏差(s.d.)的各组的平均值。(D)百分存活率对于小鼠在(C)中显示。运用斯图登氏t-检验(student’ s t_test)来确定体重减轻方面的显著性,并运用对数秩检验(log-rank test)来评价存活率结果的显著性(*P〈0.05)。
[0105]图26描绘嵌合的HA(cHA)蛋白(A)和在MDCK细胞中的cHA表达⑶的示意图表示。嵌合的HA(cHA)蛋白和重组嵌合的病毒。(A)cHAs的示意图表示。球状头结构域被定义为介于残基C52和C277 (H3编号)之间的间插氨基酸序列。使用这个二硫键作为头和茎之间的划界，在异源茎的顶上引入外部(exotic)HA头。茎结构域被定义为HAl和HA2亚单位的剩余部分。CT，细胞质尾；SP，信号肽；TM，跨膜结构域。全长HA结构从蛋白质数据库(PDB)下载:PR8 (HI) HA (PDB ID1RU7)和 A/guinea fowl/Hong Kong/WF10/99HA[由 A/swine/Hong Kong/9/98 (H9 ；PDB ID1JSD)表不]。最后的图像用 PyMol (Delano Scientific)产生。因为H6HA的结构没有被公开，所以，对于cH6/l构建体使用PR8HA的头折叠的图像。(B)用免疫荧光证实cHA的表达。MDCK细胞用WT PR8或CH9/1N3病毒感染，或者对它们进行模拟感染。用对PR8病毒的头和茎有特异性的抗体以及具有H9反应性的抗体来证实cHA表达。(放大倍数比例尺:40X)。
[0106]图27显示用大流行的HlNl病毒感染的成人患者具有对HA茎具有反应性的中和抗体的高滴度。PHlNl感染的成人(η = 9)、未用ρΗΙΝΙ感染的儿童(η = 5)和未用ρΗΙΝΙ病毒感染的成人(η = 11)的血清与cH6/l蛋白的反应性，㈧，cH9/l蛋白；(B)，用ΗΑ2蛋白的LAH (抗LAH抗体用作阳性对照);(C)，Η5ΗΑ蛋白(针对Η5ΗΑ产生的小鼠多克隆血清用作阳性对照和pan-H3抗体12D1用作阴性对照)；⑶(13)或H3HA蛋白(12D1用作阳性对照和用针对H5HA产生的小鼠多克隆血清用作阴性对照)；(E)。所有结果通过ELISA来评价；数据点代表具有SE的平均滴度或合并样品的反应性。
[0107]图28显示用大流行的HlNl病毒感染的成人患者具有对HA茎有特异性的中和抗体的高滴度(A和B)。来自ρΗΙΝΙ感染的成人(η = 14)的血清和未用ρΗΙΝΙ感染的成人(η = 5)的血清独立地合并，将来自两个合并物的总IgG纯化。使用CH9/1N3病毒用空斑减少测定评价茎抗体的中和能力。数据点代表两个实验的平均值和SE。空斑用抗Η9抗体G1-26进行免疫染色。(B)显示连同顶上一起显示的血清的四个稀释度的空斑减少。(C)假型颗粒中和测定测量人纯化的IgG制剂的中和抗体活性(来自ρΗΙΝΙ感染的成人的血清和未用ρΗΙΝΙ感染的成人的血清)。总的IgG浓度为50、10和2 μ g/mL。作为阳性对照，使用茎-特异性单克隆抗体6F12。
[0108]图29显示CH6/1和cH9/l蛋白的表达和功能。A) 2 μ g cH6/l和cH9/l蛋白的考马斯蓝凝胶(Coomasie gel)。Μ,分子量标记蛋白。(B)表达cHA蛋白的杆状病毒的蛋白质印迹分析。第I泳道，cH6/l蛋白；第2泳道，cH9/l蛋白；第3泳道，WT PR8HA ;第4泳道，WT H3HA。用已知与PR8病毒(兔多克隆抗HA2)或H3病毒(小鼠mAbl2Dl)的茎和H6 (山羊多克隆抗H6)或H9病毒(小鼠mAb G1-26)的球状头有反应的抗体对印迹进行探测来证实表达cHAs的杆状病毒的身份。mAbl2Dl与HAO和HA2 二者起反应(H3蛋白制剂是经切割的，导致有两条截然不同的条带)。(C) CH9/1N3重配病毒(reassortant virus)的空斑测定。重配的CH9/1N3病毒空斑表型与由WT PR8病毒产生的空斑类似。空斑用PY102和抗H9抗体G1-26进行免疫染色。
[0109]图30显示针对流感病毒HA的茎的单克隆抗体结合并中和cHAs。(A)用茎抗体C179来通过ELISA测试对cH6/l杆状病毒表达的蛋白的反应性。C179以剂量依赖性方式与cH9/l反应。(B)用茎抗体C179来通过ELISA测试对cH9/l杆状病毒表达的蛋白的反应性。C179以剂量依赖性方式与cH9/l反应(C和D)。抗体6F12中和CH9/1N3病毒复制。用6F12来通过空斑减少测定评价茎-特异性单克隆抗体中和CH9/1N3病毒的能力。D显示使用mAb6F12的五个稀释度(100、20、4、0.8和0.16 μ g/mL)，cH9/lN3病毒的空斑减少。空斑用抗H9抗体G1-26进行免疫染色。
[0110]图31描绘嵌合的血细胞凝集素的示意图。图31A显示野生型和cHl/Ι病毒的示意图。嵌合的HA通过调换位于PR8 (Hl)HA的Cys52和Cys277之间的球状头结构域及A/California/4/09 (HI) HA的球状头结构域来构建。所得到的嵌合的HA具有A/PR8/34(H1)HA的茎区域与A/California/4/09 (Hl)HA的球状头结构域并被命名为cHl/1。图31B显示不同的野生型和嵌合的HAs的折叠结构的理论示意图。从左到右:野生型PR8HA，嵌合的cHl/lHA，嵌合的 CH5/1HA，野生型 Perth HA，嵌合的 cH7/3HA，和嵌合的 cH5/3HA。
[0111]图32描绘比较在这项研究中使用的在H1、H3、H5和H7HAS之间的氨基酸同一性。运用ClustalW计算氨基酸同一性百分比(不包括信号肽)。对于全长HA以及球状头结构域和茎结构域，将氨基酸同一性百分比进行比较。灰色棒表示100%同一性。
[0112]图33显示嵌合的HA构建体的表面表达。嵌合的HA构建体的表面表达在瞬时转染的细胞或被感染的细胞中进行了评估。在转染后48时，293T细胞用胰蛋白酶消化，通过流式细胞术分析嵌合的HA蛋白的细胞表面表达。在顶上的图中，将模拟转染的细胞(灰色)与用PR8HA转染的细胞(黑色线)或用cHl/Ι (黑色线)或cH5/l (黑色线)转染的细胞进行比较。在位于中心的图中，将模拟转染的细胞(灰色)与用Perth/09、cH7/3(黑色线)和cH5/3构建体(黑色线)转染的细胞进行比较。在底下的图中，MDCK细胞用表达Perth/09、cH7/3和cH5/3的重组病毒感染。在感染后12小时，使用流式细胞术分析不同HAs的细胞表面表达。
[0113]图34证明嵌合的HAs进入MDCK细胞的能力。用编码萤光素酶的表达嵌合的HAs的假颗粒来转导MDCK细胞。在萤光素酶测定中产生的相对光单位(RLU)表示表达嵌合的HAs的假颗粒能够进入细胞。
[0114]图35显示用表达重组cHA的病毒感染的细胞的蛋白质印迹分析。制备来自模拟感染或用指定病毒以MOI为2感染的MDCK细胞的提取物并在感染后16小时(16hpi)时用抗体探测:抗 A/PR8/HA(H1) (PY102)、抗 A/Cal/09/HA (HI) (29E3)、抗 A/VN/HA (H5) (mAb#8)、抗 H3/HA (12D1)、抗 H7 (NR-3152)、抗 A/NP (HT103)和作为上样对照的抗 GAPDH。
[0115]图36描绘使用以下抗体的用重组病毒感染的MDCK细胞的免疫荧光分析:抗A/NP(HT103)、抗 A/H1HA(6F12)、抗 A/PR8/HA(PY102)、抗 A/Cal/09/HA(29E3)、抗 A/VN/HA(mAb#8)、抗H3/HA(12Dl)和抗 A/H7 病毒(NR-3152)。
[0116]图37描绘野生型和重组病毒的生长动力学和空斑表型。(A)1日龄含胚鸡蛋用每只蛋10pfu的野生型或重组病毒感染，感染后监测病毒生长达72小时。数据点代表实验重复的平均值和标准偏差。(B)重组病毒的空斑表型通过空斑测定来评价。MDCK细胞用野生型或重组病毒感染。在感染后48小时将细胞固定并进行免疫染色以揭示出使用针对A/NP(HT103)的抗体的空斑表型。
[0117]图38描绘茎-特异性单克隆抗体中和表达cHA的病毒和假型颗粒。mAb (KB2)中和表达cHA的病毒或假型颗粒的能力通过空斑减少测定或假型颗粒抑制测定来评价。MDCK细胞用表达cHA的病毒或假型颗粒在指定量(ug/mL)的mAb存在下或无抗体的情况下进行感染或转导。用空斑形成或萤光素酶活性作为读出数(readout)以确定被mAb抑制的程度。mAb以剂量依赖性方式中和cHl/Ι (黑色框)和cH5/l (黑色三角形)病毒复制，在浓度高过100ug/mL时有100%抑制。数据点代表实验重复的平均值和标准偏差。(B)mAb也以剂量依赖性方式抑制cHl/Ι (黑色框)和CH5/1 (黑色三角形)假型颗粒的进入，高过4ug/mL时有完全抑制。数据点代表实验重复的平均值和标准偏差。假型抑制测定独立地进行。
[0118]图39证明NJ/76疫苗接受者在Cal/09接种之前升高抗HA茎抗体。对来自NJ/76疫苗接种者(η = 20)和年龄匹配的对照对象(η = 15)的血清的系列稀释液通过ELISA测试其对A) CH6/1HA或B)NC/99HA的反应性，并计算出IgG终点效价。由于可获得血清的数量有限，对于合并的NJ/76疫苗接种者(N = 5)和对照对象(η = 7)，测定了针对C)cH6/l和D)NC/99的Cal/09接种前的IgG终点效价。各合并物由来自各组的所有个体组成，这些个体的Cal/09接种前后样品均可获得。进行了不成对斯图登T检验(Unpaired Student1^^〖8)，双尾？-值〈0.05被认为有统计学显著性。N.D.=未检测。N.S=没有显著性。*统计学显著性。
[0119]图40证明NJ/76疫苗接受者在Cal/09接种之前升高针对Cal/09的HAI效价。A)对于来自针对Cal/09和France/76的NJ/76疫苗接种者(η = 5)和对照对象(η = 7)的Cal/09接种前合并的血清样品，使用cRBCs测定了 HAI效价。B)也用对应于在各合并物中的个体对象的血清样品进行了针对Cal/09的HAI测定，以便确保合并的结果对作为一个整体的组有代表性。进行了不成对斯图登T检验，双尾P-值〈0.05被认为有统计学显著性。N.D.=未检测。*统计学显著性。
[0120]图41证明NJ/76和Cal/09疫苗加强广泛-中和抗体。使用经过TPCK-胰蛋白酶处理的、在Cal/09接种前后从NJ/76疫苗接种者(η = 5)和对照对象(η = 7)采集的合并血清样品，在针对A)cH5/lN3和B) Cal/09病毒的MDCK上进行了微中和测定。感染后，细胞用抗NP抗体和HRP-缀合的第二抗体染色。中和效价被定义为导致特殊信号有至少50%减少的最低的血清稀释度。
[0121]图42证明用cHA构建体序贯接种激发HA茎-特异性抗体并提供保护免于致死性攻击。小鼠用20yg的cH9/l蛋白加上佐剂鼻内和腹膜内给予来致敏。三周后，小鼠用20yg cH6/l蛋白加上佐剂鼻内和腹膜内给予来加强。作为对照，使用BSA或给定的灭活FMl病毒(肌内)使小鼠以类似的方式致敏和加强。在最后一次用5LD50的A/FortMonmouth/1/1947 (FMl)病毒接种后三周，将动物放血和攻击。(A)ELISA板用CH5/1N1病毒包被以评价通过接种疫苗激发的茎反应性的程度。(B)每天给小鼠称重达14天以评价免于攻击的保护作用。(C)描绘攻击后存活率的Kaplan Meier曲线。接种过cH9/l+cH6/l疫苗的小鼠在统计学上其存活率高于BSA对照(P =.0003)。
[0122]图43证明用CH6/1接种激发介导保护免于CH9/1N1病毒攻击的茎-特异性免疫力。给动物接种YAM-HA病毒以便模拟用流感病毒的先前感染或接种疫苗抵抗流感病毒。三周后，给动物经鼻内和腹膜内接种含有佐剂的CH6/1或BSA。给对照动物接种野生型B/Yamagata/16/1988和以类似的方式接种BSA或给定的灭活CH9/1N1病毒(肌内)。接种后三周，给动物放血后用250LD5(icH9/1N1病毒攻击。(A)给动物称重达8天以评价免于攻击的保护作用。在第3-5天，YAM-HA+CH6/1动物证明了与YAM-HA+BSA群组(cohort)相比，在统计学上有较少的体重减轻(p〈.05)。(B)描绘存活率的Kaplan Meier曲线。统计学上有差异的存活率在YAM-HA+CH6/1组与YAM-HA+BSA群组(p =.038)以及原初的动物和WTYAM+BSA动物(p〈.0001)相比时见到了。YAM-HA+BSA群组的存活率与WT-YAM+BSA群组的存活率没有统计学差异(P = 0.058)。(C) ELISA板用CH5/1N1病毒包被以评价通过接种疫苗激发的茎反应性的程度。(D)描绘了使用CH5/1病毒进行空斑减少测定的结果。(E)给动物接种疫苗、放血和收获总的IgG进行基于H5的假颗粒进入抑制测定。评价抑制百分比作为与对照相比萤光素酶表达的减少。
[0123]图44证明用cH6/l接种保护小鼠免于致死性H5流感病毒攻击。给动物接种YAM-HA病毒以便模拟用流感病毒的先前感染或接种疫苗抵抗流感病毒。三周后，给动物经鼻内和腹膜内接种含有佐剂的cH6/l或BSA。给对照动物接种野生型B/Yamagata/16/1988和以类似的方式接种BSA或给定灭活CH5/1N1病毒(肌内)。给动物放血后用1LD5tl的在PR8背景中的2:6H5重配子攻击(参见例如，Steel等人，2009，J Virol83:1742-1753)。(A)描绘存活率的Kaplan Meier曲线。当比较YAM_HA+cH6/l组与YAM-HA+BSA群组时，存活率中的差异接近有统计学显著性(P =.06)。(B)存活时间的长度在接种YAM-HA和接种cH6/l的动物中平均长于接种BSA(P = 0.037)的动物以及原初的动物和WT YAM/BS对照(p〈0.001)。(C)ELISA板用CH5/1N1病毒包被以便评价通过接种疫苗激发的茎反应性的程度。将1:50血清稀释度对％最大体重减轻作图。有一个值被确定为异常值并从分析中略去。对于线性回归，R2 = 0.56和P =.02。
[0124]图45证明接种cHA激发介导免于HlNl病毒攻击的保护作用的茎-特异性免疫力。(A-F)动物用编码cH9/l的DNA致敏，然后接种cH6/l，再用cH5/l可溶性蛋白(η =10)或BSA(η = 5)加强，同时阳性对照小鼠接受灭活病毒(肌内)(η = 5)。㈧给动物接种FMl病毒并用其攻击；每天给小鼠称重，随时间的体重减轻表示为初始体重的百分比的变化。(B)描述在(A)中被攻击小鼠存活率的曲线。(C)给动物接种ρΗΙΝΙ病毒并用其攻击；每天给小鼠称重，随时间的体重减轻表示为初始体重的百分比的变化。(D)描述在(C)中被攻击小鼠存活率的曲线。(E)给动物接种PR8病毒并用其攻击；每天给小鼠称重，随时间的体重减轻表示为初始体重的百分比的变化。(F)描述在(E)中被攻击小鼠存活率的曲线。(G)对来自如以上在A-F中和以下在H-1中所述接种的和用5LD5(i的A/FM/1/1947(A、B)、1LD50 的 A/Netherland/602/2009 (C, D)或 5LD50 的 A/PR/8/1934 (E、F、H、I)攻击的动物的血清的HlHA的反应性。(H)给动物如以上在A-F(方块，η = 4)中所述接种或是原初的(三角形，η = 3),同时阳性对照小鼠接受灭活PR8病毒(肌内)(X标记，η = 5)。⑶8Τ细胞在用PR8病毒攻击之前被耗竭。每天给小鼠称重，随时间的体重减轻表示为初始体重的百分比的变化。(I)描述在(H)中被攻击小鼠存活率的曲线。(J)给动物如对A-F所述接种。总的IgG纯化出来用于基于Η2的假颗粒进入抑制测定。评价抑制百分比作为与对照相比萤光素酶表达的减少。用Fab片段CR6261作为阳性对照。
[0125]图46证明血细胞凝集素茎抗体在重复感染后产生。动物用14PFU的A/California/04/09 (Cal09)、A/New Caledonia/20/99 (NC99)或 A/SolomonIslands/3/06 (S106)病毒感染。感染后四周从小鼠收获血清，并使用cH6/l蛋白，通过ELISA测定血细胞凝集素茎-特异性抗体。
[0126]图47证明血细胞凝集素茎抗体在对流感病毒第二次暴露之后被加强。动物用14PFU的NC99感染，然后四周后用15或16PFU的S106病毒或13或14PFU的Cal09病毒加强。第二次感染后四周从小鼠收获血清，并使用CH6/1蛋白，通过ELISA测定血细胞凝集素茎-特异性抗体。包括了图46中显示的对于仅接受NC99病毒一次接种的动物的数值用作比较。
[0127]图48证明来自序贯感染的小鼠的血清保护原初动物免于致死性H5病毒攻击。动物用14PFU的NC99感染，然后四周后用16PFU的S106或14PFU的Cal09病毒加强。从这些动物收集的血清经腹膜内转移到用致死剂量的重组H5病毒攻击过的原初动物中。来自仅经历一次NC99感染的动物的血清的动物对攻击没有保护作用并且死亡，其动力学类似于对照。来自暴露于NC99和S106病毒的动物的血清对60 %的被攻击动物有保护作用，而来自用NC99和Cal09病毒感染的动物的血清对80 %的被攻击小鼠有保护作用免于死亡。NC99-S106组和NC99-Cal09组之间的存活率是类似的(P = 0.575)，而与仅NC99的组相比的存活率中的差异有统计学显著性(NC99-S106对NC99p = 0.018，NC99_Cal09对NC99p =0.0023)。
[0128]图49证明流感病毒糖基化突变体被表达和被适当糖基化。293T细胞用野生型A/PR/8/34HA病毒(PR8)或具有在PR8头结构域中引入的糖基化位点的和/或通过突变从PR8茎结构域去除的糖基化位点的PR8构建体转染。用NR-4539抗甲型流感病毒HA2抗体进行蛋白质印迹分析并用抗小鼠辣根过氧化物酶缀合的第二抗体来显现。具有引入的糖基化位点的突变型病毒蛋白相对于野生型PR8以较高分子量迁移；具有消除的糖基化位点的突变型病毒蛋白相对于野生型PR8以较低分子量迁移。所有突变型病毒蛋白均以预期分子量迁移，表明聚糖已在有关糖基化位点上在体外被成功添加或消除。对于突变体42-1、42-4和42-5指出了弓丨入的糖基化位点的位点。
[0129]图50证明在PR8中糖基化位点的添加和糖基化位点的消除对病毒蛋白的表达或它们折叠成正确构象的能力无影响。293T细胞用野生型PR8或PR8或cH5/l血细胞凝集素的糖基化突变体转染。转染后24小时，将细胞固定，用适当的抗头结构域(PY102)或抗茎结构域(KB2、C179和6F12)抗体染色，并与荧光驴抗小鼠抗体一起孵育。荧光反应性用倒置荧光显微镜来显现。(A)在PR8的头结构域中引入糖基化位点不影响病毒蛋白表达或茎抗体(6F12)结合。(B)其中糖基化位点已被引入到头结构域中的病毒蛋白的免疫荧光染色降低了抗头抗体结合，表明头结构域的过度糖基化遮蔽了抗体结合位点。在结合茎结构域的构象表位的抗茎结构域抗体的结合中没有变化，表明病毒突变体被正确折叠。(C)使用抗头和抗茎特异性抗体，具有引入到头结构域中的糖基化位点和从茎结构域中消除糖基化位点的PR8病毒突变体的免疫荧光证明了所述蛋白被表达且被正确折叠。观察到与野生型PR8相比，抗茎抗体与突变构建体的茎结构域结合的能力没有差异，在所述突变构建体中糖基化位点被引入到头结构域(42-1、42-4和42-5)中和从茎结构域(Λ 33/289)中去除。
[0130]图51证明可结合唾液酸化(sialylated)受体的病毒糖基化突变体和有活力的突变型病毒拯救。将被转染细胞与神经氨酸酶(唾液酸酶)一起于37°C孵育I小时，然后与2%鸡红细胞悬液一起孵育。将贴壁的红细胞裂解，在540nm下测量裂解液的吸光度。为了拯救甲型流感突变型病毒，293T细胞用8种pDZ PR8拯救质粒各I μ g共转染。转染后24小时，将含病毒的上清液接种到8日龄含胚鸡蛋中。在37°C孵育2天之后收获尿囊液，通过鸡红细胞的血细胞凝集和通过在MDCK细胞中的空斑形成测定病毒的存在。结合鸡红细胞的甲型流感茎病毒突变体Λ 289、Λ 483和Λ 33/289能够被拯救。
[0131]图52.野生型HA和表达构建体的示意图。(A)未裂解的全长流感病毒血细胞凝集素。信号肽是最左边的组分，HA胞外结构域是中间的组分，跨膜结构域和胞内结构域是最右边的组分。(B)具有三聚化结构域的表达构建体。跨膜结构域和胞内结构域用凝血酶切割位点(自左边起的第三种组分)、Τ4三聚化结构域(自左边起的第四种组分)和六组氨酸标签^xhis标签，自左边起的第五种组分)在位置V503(H3编号)调换。(C)无三聚化结构域的表达构建体。跨膜结构域和胞内结构域用六组氨酸标签(6xhis标签，最右边的组分)分别在氨基酸位置509 (H1、H2和H5)或508 (H3) (H3编号)调换。
[0132]图53.三聚化结构域的引入影响重组HAs中寡聚体的稳定性和形成。(A)通过还原性、变性SDS-PAGE分析有无三聚化结构域的重组HAs。被表达的有三聚化结构域的重组HAs (+)显示比被表达的无三聚化结构域的HAs (-)的稳定性高。未裂解的HA(HAO)和裂解产物(HAl/降解产物；HA2)用箭头指出。(B)交联HAs的还原性、变性SDS-PAGE分析。HA的不同种(species)在印迹中标出。高分子多聚体用H表示,三聚体用T表示,二聚体用D表示，单体用M表示。(C)左图(框1-4):来自用抗六组氨酸-标签抗体探测的B的被还原、被变性和被交联的组IHAs的蛋白质印迹分析。右图(最右边的框):在SDS-PAGE上分析的对照(IgG)用BS3交联。不同的种(完全抗体、重链、轻链)用箭头指出。标记分子条带的分子量在各图的左边标出。
[0133]图54.茎-反应性抗体与重组PR8 (Hl)和Cal09 (Hl)HAs的结合。(A)茎-反应性抗体C179、CR6261和6F12和头-反应性抗体PY102和PR8抗血清与无(无T4三聚化结构域,黑色线)或有(有T4三聚化结构域，红色线)三聚化结构域的重组可溶性PR8HA的结合。(B)茎-反应性抗体C179、CR6261和6F12和头-反应性抗体7B2和Cal09抗血清与无(无T4三聚化结构域，黑色线)或有(有T4三聚化结构域，红色线)三聚化结构域的重组可溶性Cal09HA的结合。
[0134]图55.茎-反应性抗体与重组JAP57(H2)和VN04(H5)HAs的结合。(A)茎-反应性抗体C179和CR6261和头-反应性抗体8F8和H2抗血清与无(无T4三聚化结构域，黑色线)或有(有T4三聚化结构域，红色线)三聚化结构域的重组可溶性JAP57HA的结合。(B)茎-反应性抗体C179和CR6261和头-反应性抗体mAb#8和H5抗血清与无(无T4三聚化结构域，黑色线)或有(有T4三聚化结构域，红色线)三聚化结构域的重组可溶性VN04HA的结合。
[0135]图56.茎-反应性抗体与组2HAs的结合。(A)茎-反应性抗体12D1和CR8020和头-反应性抗体XY102和H3抗血清与无(无T4三聚化结构域、黑色线)或有(有T4三聚化结构域，红色线)三聚化结构域的重组可溶性HK68HA的结合。(B)茎-反应性抗体12D1和CR8020和H3抗血清与无(无T4三聚化结构域，黑色线)或有(有T4三聚化结构域，红色线)三聚化结构域的重组可溶性Wisc05HA的结合。
[0136]5.详述
[0137]本发明涉及流感血细胞凝集素(HA)病毒免疫原(即，流感HA多肽)，其诱导针对流感病毒的保守HA干结构域(本文中有时称之为“茎(stalk)”结构域)的交叉保护性免疫应答。
[0138]在一个方面，本文提供的是嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽。这样的嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽包含HA干结构域，HA干结构域展示出对所述干结构域异源的球状HA头结构域。设计用于疫苗接种的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽共享HA相同干结构域但在其球状头有高度多样性。这样的构建体经工程改造成为诱发针对保守HA干的高度强效和广泛中和抗体的疫苗制剂，例如活的流感病毒、杀死的流感病毒、病毒样颗粒(“VLPs”)、亚单位疫苗、裂解疫苗等。这样的“通用”疫苗可用于诱导和/或加强流感病毒亚型间的交叉保护性免疫应答。
[0139]作为背景，针对流感病毒的中和抗体靶向HA糖蛋白并且阻止参与病毒进入的结合步骤或融合步骤。中和抗体的两个基础亚组由暴露于流感病毒激发:针对毒株-特异性球状头(在流感病毒的各种不同毒株和亚型间是非保守的结构域)的那些和针对HA糖蛋白的高度保守的干的那些。非保守的HA球状头携带免疫优势表位-毒株-特异性抗球状头抗体一般被认为比抗干抗体特异性更强效，因此解释了用目前疫苗感染所赋予的大部分毒株-特异性免疫力。
[0140]本文公开的嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽部分地基于发明人的关于激发针对HA干的高度强效和广泛中和抗体的流感病毒疫苗的合理设计策略。在这一方面，设计出嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽共享来自先前暴露/接种的相对非常保守的干结构域，但含有异源HA球状头结构域一优选对预定接种是原初的HA球状头结构域。对这种构建体的暴露应当主要是加强针对保守HA干的抗体。用这种保守的HA干和变化的球状头重复免疫应当诱导稳固的针对HA的共同干区域的交叉中和抗体。
[0141]当设计嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽时，应当小心维护所得蛋白的稳定性。在这一方面，建议使在图1中标识为Ap和Aq的半胱氨酸残基得以维持，因为它们对HA莖的稳定性有贡献,如下文第5.1节更详细论述的。对于最佳稳定性，优选HA球状结构域作为整体(介于Ap和Aq半胱氨酸残基之间，如图1所示)进行“调换(swap)”，由于所得构象将与天然结构最密切。换句话说，在第5.1.2节中提及的“接头”可以是异源HA的整个球状头结构域。
[0142]代之以“调换出(swapping out) ”HA茎的天然球状头，所述球状头可以通过改变对HA球状头表位有贡献的环而制成对保守的茎是异源的。这种方法对于产生针对保守茎的所需免疫应答也可能不起作用，除非改变的球状头被设计成与天然球状HA头有巨大不同一尤其是当使用群体被暴露的HA。尽管如此，这样的改变可以例如通过改变对HA球状头表位有贡献的五个环中的大部分来完成。在一个有用的方法中，所有的五个环均可以被改变。
[0143]用于疫苗接种的构建体可以有利地被设计成用于待接种疫苗的特殊对象/群体。有三种流感亚型在有人类生活的今天已暴露:亚型H1、H2和H3。H2亚型的流感病毒已在1968年从人群中消失，而Hl和H3亚型的流感病毒直到今天持续在人群中存在。结果，在1968年之前出生的活到今天的成人很可能已暴露了 H1、H2和H3亚型中的每一种。相反，在1968年之后出生的活到今天的成人仅暴露于Hl和H3亚型。
[0144]因此，在对成人实施接种疫苗的多个优选的实施方案中，所述嵌合的流感血细胞凝集素多肽不具有来自亚型Hl、H2或H3的流感病毒的HA的球状头结构域，但是的确具有来自这三种亚型之一的HA的干结构域。所述异源球状头可选自任何非Hl、非H2或非H3亚型的HA。另外，使用H1/H2干在一个方面和H3在另一个方面制备的分开的嵌合构建体干可有益地用于疫苗接种程序一HI和H2亚型是共享保守茎结构域的组IHA亚型；而H3在结构上不同于组I茎的组2亚型。Hl和H3构建体的应用将会确保产生/加强针对每一种干结构域的免疫应答。用这样的嵌合的流感血细胞凝集素多肽免疫成人对象将加强所述对象的记忆免疫应答，导致有交叉反应性的广泛中和抗干结构域抗体的大规模产生，从而在所述对象中提供对流感病毒的长期持续的免疫力。
[0145]尚未暴露的婴儿对所有的流感病毒亚型当然是原初的。结果，可以构建各式各样的HA干/球状头组合用于婴儿的疫苗中。在一个优选的实施方案中，可以给原初婴儿接种用组I (Hl或H2)或组2(H3)毒株的HA茎和来自异源毒株(即非H1、非H2和/或非H3毒株)的球状头制备的构建体。对于各HA莖的三种不同的嵌合HA构建体可以有利地用于三次序贯疫苗接种以诱导交叉保护性应答。
[0146]应当理解，本文描述的嵌合的流感血细胞凝集素多肽的应用是有利的，因为(i)所述多肽是十分稳定的(鉴于具有完整的球状头结构域)和(ii)给予所述多肽的对象的免疫系统先前未曾暴露于所述嵌合的流感血细胞凝集素的球状头结构域，但是已暴露于所述嵌合的流感血细胞凝集素的干结构域的保守表位。
[0147]所述嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽通过工作实施例(例如，第6.2节)予以举例说明，这些工作实施例证明了包含HA干和展示异源HA头的嵌合的流感HA多肽的构建，及来自这种与抗所述干结构域和所述头结构域二者的抗体起交叉反应的多肽的稳定的嵌合的HA蛋白的产生。
[0148]在一个方面，本文提供的是包含流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽和流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的(例如，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽和所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽均来源于不同的流感病毒血细胞凝集素亚型)。本文提供的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽可以通过将流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽(参见第5.2节)与流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽(第5.3节)组合来产生。也就是说，利用本发明的原理，本文描述的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽(参见第5.1.1节，参见下文)和本文描述的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽(第5.1.2节，参见下文)可以进行混合并匹配从而产生嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽。
[0149]在另一个方面，本文提供的是包含一个或多个修饰的糖基化位点和/或一个或多个非天然存在的糖基化位点的流感血细胞凝集素(HA)多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽，流感病毒血细胞凝集素(HA)干结构域多肽)。如图20A和图20B所示，野生型血细胞凝集素的糖基化发生在球状头结构域和干结构域二者之中。相信在这些结构域里面的糖基化可以遮蔽抗原性区域，从而允许流感病毒逃避宿主免疫系统应答。例如，已知季节性流感病毒毒株(例如,HlNl和H3N2)在球状头结构域的免疫优势抗原性区域中随时间获得额外的糖基化位点。在本文描述的流感病毒HA多肽的上下文中，然而，所述多肽的干结构域里面的糖基化可以阻碍或防止针对在这个结构域中发现的保守抗原性区域的所需免疫应答。参见图19C。在一个实施方案中，本文提供的是包含具有至少一个修饰的糖基化位点的干结构域的流感HA多肽，其中所述修饰的糖基化位点，其中所述修饰破坏聚糖附着到所述修饰的糖基化位点的能力。在另一个实施方案中，本文提供的是包含HA球状头结构域的流感HA多肽，其中所述HA球状头结构域包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的至少一个非天然存在的糖基化位点,和其中Xaa是任意氨基酸。在另一个实施方案中，所述流感HA多肽包含(I)包含一个或多个修饰的糖基化位点的干结构域，其中所述修饰的糖基化位点包含天然存在的糖基化位点的修饰，其中所述修饰破坏聚糖附着到所述修饰的糖基化位点的能力；和(2)包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的一个或多个非天然存在的糖基化位点的HA球状头结构域，其中Xaa是任意氨基酸。在多个具体的实施方案中，所述流感HA多肽的干结构域中的修饰的糖基化位点包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位点的修饰,其中Xaa是任意氨基酸。
[0150]虽然不受任何具体操作理论的束缚，但是相信针对本文提供的流感病毒HA多肽的干结构域里面的保守抗原性区域的免疫应答可以通过以在该位点上破坏糖基化(即，聚糖的附着)的方式修饰干结构域里面的一个或多个糖基化位点来增加。另外，还相信通过在这些免疫优势区域中添加一个或多个非天然存在的糖基化位点来遮蔽HA球状头结构域的免疫优势抗原性区域也可以增加在干结构域里面保守的亚免疫优势抗原性区域的免疫原性。
[0151]在另一个方面，本文提供的是使用本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)预防和/或治疗和/或免疫针对对象的流感病毒疾病和/或感染的方法，即，所述流感HA多肽可用于给对象实施接种以抵抗流感病毒疾病或感染或治疗罹患流感病毒疾病或感染的对象。在一个实施方案中，使用所述流感HA多肽的方法是用于预防对象的流感病毒疾病，包括给予对象有效量的流感HA多肽。在另一个实施方案中，使用所述流感HA多肽的方法是用于治疗对象的流感病毒疾病和/或感染，包括给予对象有效量的流感HA多肽。在又一个实施方案中，使用所述流感HA多肽的方法是用于免疫以抵抗对象的流感病毒疾病和/或感染。
[0152]在一个实施方案中，本文提供的是经工程改造以表达本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)中的一种或多种的流感病毒。这样的病毒可以用作针对流感病毒的疫苗，例如，表达本文的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽)中的一种或多种的本文提供的流感病毒可以用于亚单位疫苗、裂解疫苗、灭活疫苗和/或活的减毒病毒疫苗。
[0153]在某些实施方案中，经工程改造以表达本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽)中的一种或多种的流感病毒包含神经氨酸酶(neuraminidase, NA)或其片段,所述神经氨酸酶(NA)或其片段来自与流感HA多肽的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽来源相同的来源(例如，流感病毒毒株或亚型)。在某些实施方案中，经工程改造以表达所述流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽)中的一种或多种的流感病毒包含来自与所述流感HA多肽的球状头结构域和/或干结构域不同的流感病毒毒株的神经氨酸酶。在某些实施方案中，经工程改造以表达所述流感HA多肽中的一种或多种的流感病毒包含相对于由经工程改造以表达所述流感HA多肽中的一种或多种的流感病毒编码的其它蛋白，来自不同的流感病毒的神经氨酸酶。
[0154]在一个实施方案中，本文提供的是编码本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)的核酸(参见例如，第5.5节，参见下文)。
[0155]在另一个实施方案中，本文提供的是含有编码本文描述的流感HA多肽的核酸的载体，例如表达载体(参见例如，第5.6节,参见下文)。在一个具体的实施方案中,所述载体是质粒载体。在另一个具体的实施方案中，所述载体是病毒载体(参见例如，第5.7和5.8节，参见下文)，例如流感病毒载体，其中已将本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽)掺入到包含经工程改造以表达嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的基因组的病毒体(vir1ns)或流感病毒载体中。在另一个具体的实施方案中，所述载体是细菌载体(参见例如，第5.10节，参见下文)。在另一个具体的实施方案中，所述载体是杆状病毒。本文提供的载体可以被设计成使用原核细胞(例如，细菌)或真核细胞(例如，昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞、藻类细胞和哺乳动物细胞)表达嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽。因此，本文也提供的是包含本文提供的载体并且能够产生本文描述的一种或多种流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)的细胞(即，原核细胞和真核细胞)。
[0156]在另一个实施方案中，本文提供的是其中掺入了本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)的病毒样颗粒(VLPs)和病毒体(参见第5.9节，参见下文)。
[0157]在另一个实施方案中，本文提供的是包含本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)中的一种或多种和/或本文描述的核酸、载体、VLPs、细菌或病毒体中的一种或多种的组合物(参见例如，第5.14节)。在一个具体的实施方案中，本文提供的组合物包含本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)。在另一个具体的实施方案中，本文提供的组合物包含编码本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)的核酸。在另一个具体的实施方案中，本文提供的组合物包含表达载体，所述表达载体包含编码本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)的核酸。在另一个具体的实施方案中，本文提供的组合物包含具有经工程改造以表达本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)的基因组的流感病毒或非流感病毒。
[0158]在某些实施方案中，将一种或多种本文描述的流感HA多肽(参见例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽，第5.1节，参见下文)或其组合物和/或本文描述的核酸、载体、VLPs或病毒体中的一种或多种给予对象以给对象实施免疫以抵抗流感病毒的多种毒株或亚型。在一个具体的实施方案中，所述给药足以在所述个体中产生针对任何一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、1、十二、十三、十四、十五、十六或十七种已知的甲型流感血细胞凝集素亚型或以后鉴定的甲型流感血细胞凝集素亚型的宿主免疫应答。在另一个具体的实施方案中，所述给药足以在所述个体中产生针对现在已知的以后鉴定的任何乙型流感血细胞凝集素亚型的宿主免疫应答。
[0159]在某些实施方案中，将一种或多种本文描述的流感HA多肽(参见例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽，参见第5.1节，参见下文)或其组合物和/或本文描述的核酸、载体、VLPs或病毒体中的一种或多种作为单次剂量给予对象一次。在一个具体的实施方案中，所述对象是人类儿童。在另一个具体的实施方案中，所述对象是人类成人。在另一个具体的实施方案中，所述对象是老年人。在某些实施方案中，首先将本文描述的流感HA多肽或本文描述的组合物核酸、载体、VLP、或病毒体作为单次剂量给予对象，然后，在3到6周后，第二次给予本文描述的流感HA多肽或本文描述的组合物核酸、载体、VLP或病毒体。
[0160]在某些实施方案中，将一种或多种本文描述的流感HA多肽(参见例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)或其组合物和/或本文描述的核酸、载体、VLPs或病毒体中的一种或多种作为单次剂量给予对象，然后，在3到6周后，给予第二次剂量。其中第一次剂量中使用的所述流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)的流感病毒血细胞凝集素头结构域是来自与第二次剂量中使用的所述流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)的流感病毒血细胞凝集素头结构域不同的毒株或亚型。在某些实施方案中，可以在第二次接种之后按6到12个月间隔时间给予对象多次加强接种。在某些实施方案中，加强接种中使用的所述流感HA多肽的流感病毒血细胞凝集素头结构域是来自与第一次和第二次剂量中使用的所述流感HA多肽的流感病毒血细胞凝集素头结构域不同的毒株或亚型。在一个具体的实施方案中，所述对象是人类儿童。在另一个具体的实施方案中，所述对象是人类成人。在另一个具体的实施方案中，所述对象是老年人。
[0161]在一个具体的实施方案中，对于对人类婴儿的给药，将本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)(参见例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽，第5.1节，参见下文)或其组合物和/或本文描述的核酸、载体、VLPs或病毒体中的一种或多种的两次剂量给予婴儿，其中第一次剂量中使用的所述流感HA多肽的流感病毒血细胞凝集素头结构域是来自与第二次剂量中使用的所述流感HA多肽的流感病毒血细胞凝集素头结构域不同的毒株或亚型。
[0162]在一个具体的实施方案中，对于对人类婴儿的给药，将流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽，第5.1节，参见下文)或其组合物和/或本文描述的核酸、载体、VLPs或病毒体中的一种或多种的三次剂量给予婴儿，其中第一次、第二次和第三次剂量中使用的所述流感HA多肽的流感病毒血细胞凝集素头结构域是来自流感病毒的不同的毒株或亚型。
[0163]在另一个方面，本文提供的是给对象实施免疫以抵抗流感病毒疾病或感染的方法，包括使所述对象暴露于对象对其是原初的流感病毒的血细胞凝集素，即，所述对象之前未曾暴露于所述流感病毒和/或所述流感病毒的血细胞凝集素。在一个具体的实施方案中，所述血细胞凝集素是本文描述的流感HA多肽。在一个具体的实施方案中，所述血细胞凝集素是嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽。
[0164]在一个实施方案中，本文提供的是给对象实施免疫以抵抗流感病毒疾病或感染的方法，包括给予所述对象一种或多种流感病毒，其中所述一种或多种流感病毒中的每一种都包含对象对其是原初的血细胞凝集素多肽，即，所述对象之前未曾暴露于所述的一种或多种流感病毒。在一个具体的实施方案中，所述的一种或多种流感病毒是亚型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、HlU H12、H13、H14、H15、H16 和 / 或 H17 的流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述方法包括⑴亚型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 或 H17 的流感病毒的第一次给药和(ii)亚型 H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16或H17的流感病毒的第二次给药，其中第一次给药的流感病毒属于与第二次给药的流感病毒不同的亚型。在另一个具体的实施方案中，所述方法包括(i)亚型 H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16 或 H17 的流感病毒的第一次给药；(ii) MMH2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16*H17 的流感病毒的第二次给药；和(iii)亚型 H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16或H17的流感病毒的第三次给药，其中第一次、第二次和第三次给药的流感病毒属于不同的亚型。
[0165]在另一个实施方案中，本文提供的是给对象实施免疫以抵抗流感病毒疾病或感染的方法，包括给予所述对象对象对其是原初的一种或多种流感病毒血细胞凝集素多肽，即，所述对象之前未曾暴露于所述的一种或多种流感病毒血细胞凝集素多肽。在某些实施方案中，对象对其是原初的所述一种或多种流感病毒血细胞凝集素多肽是在组合物(例如，包含疫苗的组合物)中。在某些实施方案中，对象对其是原初的一种或多种流感病毒血细胞凝集素多肽是在载体(例如流感病毒载体)中。在某些实施方案中，对象对其是原初的一种或多种流感病毒血细胞凝集素多肽是在VLP中。在某些实施方案中，对象对其是原初的一种或多种流感病毒血细胞凝集素多肽是在病毒体中。在一个具体的实施方案中，所述一种或多种流感病毒血细胞凝集素多肽是来自亚型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16和/或H17的流感病毒的流感病毒血细胞凝集素多肽。在另一个具体的实施方案中，所述方法包括⑴亚型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的流感病毒血细胞凝集素多肽的第一次给药和(ii)亚型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的流感病毒血细胞凝集素多肽的第二次给药，其中第一次给药的所述流感病毒血细胞凝集素多肽属于与第二次给药的所述流感病毒血细胞凝集素多肽不同的亚型。在另一个具体的实施方案中，所述方法包括(i)亚型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16 或 H17 的流感病毒血细胞凝集素多肽的第一次给药；(ii) MMH2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16 或H17的流感病毒血细胞凝集素多肽的第二次给药；和(iii)亚型!12、!14、册、册、!17、!18、!19、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16*H17的流感病毒血细胞凝集素多肽的第三次给药，其中第一次、第二次和第三次给药的所述流感病毒血细胞凝集素多肽是来自不同的流感病毒亚型。
[0166]在另一个实施方案中，本文提供的是给对象实施免疫以抵抗流感病毒疾病或感染的方法，包括(i)使所述对象致敏，即通过给予所述对象来自某种流感亚型(例如，Hl血细胞凝集素)的流感病毒血细胞凝集素多肽(或编码所述血细胞凝集素多肽的核酸、表达所述血细胞凝集素多肽的病毒、表达所述血细胞凝集素多肽的VLP，等等)，再过一段时间周期后，和(ii)所述对象用本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)(或编码所述流感HA多肽的核酸、表达所述流感HA多肽的病毒、表达所述流感HA多肽的VLP，等等)来加强。在一个具体的实施方案中，所述流感HA多肽是嵌合的流感病毒血细胞凝集素HA多肽，其包含对象对其是原初的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽(或其部分)和与在步骤(i)的致敏过程中使用的血细胞凝集素多肽中的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽相同或相似(例如，来自相同的流感病毒毒株或亚型)的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽(或其部分)。在某些实施方案中，所述对象可以给予第二次加强接种，包括相同或不同的本文描述的流感HA多肽(polypetpide)(或编码所述流感HA多肽的核酸、表达所述流感HA多肽的病毒、表达所述流感HA多肽的VLP，等等)的第二次给药。在某些实施方案中，所述对象可以给予第三次加强接种，包括本文描述的相同或不同的流感HA多肽(或编码所述流感HA多肽的核酸、表达所述流感HA多肽的病毒、表达所述流感HA多肽的VLP，等等)的第三次给药。在某些实施方案中，在所述对象的致敏和加强之间或在多次加强之间(如果给予超过一次加强接种的话)的时间周期可以例如是I周、2周、3周、4周、I个月、2个月、3个月或更长时间。在某些实施方案中，在所述对象的致敏和加强之间(或在第一次和第二次加强之间)的时间周期可以例如范围为3-5天、7-10天、7-14天、14-21天、14-28天、21-28天、21天至I个月、I个月至2个月、I个月至3个月、2个月至3个月、2个月至4个月或4个月至6个月。
[0167]在另一个实施方案中，本文提供的是给对象实施免疫以抵抗流感病毒疾病或感染的方法，包括(i)使所述对象致敏，即通过给予所述对象来自某种流感亚型(例如，Hl血细胞凝集素)的无头的流感病毒血细胞凝集素多肽(即流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽或编码所述血细胞凝集素多肽的核酸、表达所述血细胞凝集素多肽的病毒、表达所述血细胞凝集素多肽的VLP，等等)(例如本文描述的那些)，再过一段时间周期后，和(ii)所述对象用本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)(或编码所述流感HA多肽的核酸、表达所述流感HA多肽的病毒、表达所述流感HA多肽的VLP，等等)加强接种。在一个具体的实施方案中，所述流感HA多肽是嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽，其包含对象对其是原初的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽(或其部分)和与在步骤
(i)的致敏过程中使用的无头的血细胞凝集素多肽(即流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽)中的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽相同或相似(例如，来自相同的流感病毒毒株或亚型)的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽(或其部分)。在某些实施方案中，所述对象可以给予第二次加强接种，包括相同或不同的本文描述的流感HA多肽(或编码所述流感HA多肽的核酸、表达所述流感HA多肽的病毒、表达所述流感HA多肽的VLP，等等)的第二次给药。在某些实施方案中，所述对象可以给予第三次加强接种，包括相同或不同的本文描述的流感HA多肽(或编码所述流感HA多肽的核酸、表达所述流感HA多肽的病毒、表达所述流感HA多肽的VLP，等等)的第三次给药。在多个具体的实施方案中，第二次和/或第三次加强接种中使用的流感HA多肽(其在多个具体的实施方案中是嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)包含与无头的HA的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽相同或相似的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽并且可以包含或不包含不同的头。在某些实施方案中，在所述对象的致敏和加强之间或在多次加强之间(如果给予超过一次加强接种的话)的时间周期可以例如是I周、2周、3周、4周、I个月、2个月、3个月或更长时间。在某些实施方案中，在所述对象的致敏和加强之间(或在第一次和第二次加强之间)的时间周期可以例如范围为3-5天、7-10天、7-14天、14-21天、14-28天、21-28天、21天至I个月、I个月至2个月、I个月至3个月、2个月至3个月、2个月至4个月或4个月至6个月。
[0168]在另一个实施方案中，本文提供的是给对象实施免疫以抵抗流感病毒疾病或感染的方法，包括(i)使所述对象致敏，即通过给予所述对象第一种本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)(或编码所述流感HA多肽的核酸、表达所述流感HA多肽的病毒、表达所述流感HA多肽的VLP，等等)，再过一段时间周期后，和(ii)所述对象用第二种本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)(或编码所述流感HA多肽的核酸、表达所述流感HA多肽的病毒、表达所述流感HA多肽的VLP，等等)来加强。在一个具体的实施方案中，所述第二种流感HA多肽是嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽，其包含对象对其是原初的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽(或其部分)和与在步骤(i)的致敏过程中使用的第一种嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽相同或相似(例如，来自相同的流感病毒毒株或亚型)的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽(或其部分)。在某些实施方案中，所述对象可以给予第二次加强接种，包括第一种或第二种本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)或不同的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)(或编码所述流感HA多肽的核酸、表达所述流感HA多肽的病毒、表达所述流感HA多肽的VLP，等等)的第二次给药。在某些实施方案中，所述对象可以给予第三次加强接种，包括与之前给予相同的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)或本文描述的不同的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)(或编码所述流感HA多肽的核酸、表达所述流感HA多肽的病毒、表达所述流感HA多肽的VLP，等等)中的一种的给药。在多个具体的实施方案中，第二次和/或第三次加强接种中使用的流感HA多肽是嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽，其包含与第一种流感HA多肽(其在多个具体的实施方案中是嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽相同或相似的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽并且可以包含或不包含不同的头。在某些实施方案中，在所述对象的致敏和加强之间或在多次加强之间(如果给予超过一次加强接种的话)的时间周期可以例如是I周、2周、3周、4周、I个月、2个月、3个月或更长时间。在某些实施方案中，在所述对象的致敏和加强之间(或在第一次和第二次加强之间)的时间周期可以例如范围为3-5天、7-10天、7-14天、14-21天、14-28天、21-28天、21天至I个月、I个月至2个月、I个月至3个月、2个月至3个月、2个月至4个月或4个月至6个月。
[0169]5.1嵌合的流感病毒血■细胞凝集素多肽
[0170]本文提供的是包含流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽和流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽或由其组成的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的(例如，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽和所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来源于不同的流感病毒血细胞凝集素亚型)。在下文第5.2节中描述了流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽。在下文第5.3节中描述了能够形成稳定的无头的干结构域的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽。
[0171]全长的流感血细胞凝集素典型地包含HAl结构域和HA2结构域。所述干结构域由HAl结构域的两个区段和HA2结构域的大部分或全部形成。HAl结构域的两个区段在一级序列中被球状头结构域(参见例如，在图1中命名为Ap和Aq的残基之间的氨基酸残基)分隔开。在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽维持这样一种结构。也就是说，在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽包含由HAl结构域和HA2结构域组成的稳定的干结构和将HAl结构域的两个区段分隔开的球状头结构域(在一级序列中)。其中所述球状头结构域对由HAl结构域和HA2结构域的其它区段形成的干结构域是异源的。
[0172]在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽包含(i)和(ii)或由(i)和(ii)组成:(i)本文描述的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽(参见例如，第5.1.2节，参见下文)或来自流感病毒的任何已知的毒株或亚型的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽(例如，任何野生型流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽，例如下文第
5.4节描述的流感病毒的血细胞凝集素的干结构域)和(ii)本文描述的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽(参见例如，第5.2和5.4.2节，参见下文)或来自流感病毒的任何已知的毒株或亚型的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽(例如，任何野生型流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽)，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的，和其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是甲型流感病毒亚型Hl或H3的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽。
[0173]在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽包含(i)和(ii)或由(i)和(ii)组成:(i)本文描述的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽(参见例如，第5.3和5.4.1节，参见下文)或来自流感病毒的任何已知的毒株或亚型的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽(例如，任何野生型流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽)和(ii)本文描述的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽(参见例如，第5.2和5.4.2节，参见下文)或来自流感病毒的任何已知的毒株或亚型的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽(例如，任何野生型流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽)，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的，和其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是甲型流感病毒亚型H2的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽。
[0174]在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽包含(i)和(ii)或由(i)和(ii)组成:(i)本文描述的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽(参见例如，第5.3和5.4.1节，参见下文)或来自流感病毒的任何已知的毒株或亚型的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽(例如，任何野生型流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽)和(ii)本文描述的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽(参见例如，第5.2和5.4.2节，参见下文)或来自流感病毒的任何已知的毒株或亚型的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽(例如，任何野生型流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽)，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的，和其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是甲型流感病毒亚型H5的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽。
[0175]在一个具体的实施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)组成的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽:(i)本文描述的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽(参见例如，第5.3和5.4.1节，参见下文)或来自流感病毒的任何已知的毒株或亚型的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽(例如，任何野生型流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽)和(ii)来自甲型流感病毒亚型111、!12、!13、!14、册、册、!17、!18、!19、!110、!111、!112、!113、H14、H15、H16或H17的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的。
[0176]在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)组成的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽:(i)本文描述的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽(参见例如，第5.3和5.4.1节，参见下文)或来自流感病毒的任何已知的毒株或亚型的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽(例如，任何野生型流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽)和(?)来自甲型流感病毒亚型財，册、!17、!18、!19、!110、!111、!112、!113、!114、!115、H16或H17的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的。
[0177]在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)组成的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽:(i)本文描述的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽(参见例如，第5.3和5.4.1节，参见下文)或来自流感病毒的任何已知的毒株或亚型的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽(例如，任何野生型流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽)和(ii)来自禽流感病毒亚型Hl、H2或H3的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的。
[0178]在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)组成的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽:(i)本文描述的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽(参见例如，第5.3和5.4.1节，参见下文)或来自流感病毒的任何已知的毒株或亚型的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽(例如，任何野生型流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽)和(ii)来自马流感病毒亚型H3的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的。
[0179]在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)组成的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽:(i)来自亚型Hl的甲型流感病毒的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽和Qi)来自亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16或H17的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型Hl、H2或H3的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H5的甲型流感病毒。
[0180]在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含(i)和(ii)或由(i)和(ii)组成的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽:(i)来自亚型H3的甲型流感病毒的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽和Qi)来自亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型H4、H7、H10、H14或H15的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H1、H2或H3的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H5的甲型流感病毒。
[0181]在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含(i)和(ii)或由(i)和(ii)组成的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽:(i)来自亚型H2的甲型流感病毒的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽和Qi)来自亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H1、H2或H3的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H5的甲型流感病毒。
[0182]在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)组成的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽:(i)来自亚型111、!12、!13、!14、册、册、!17、!18、!19、!110、Hl1、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽和(ii)来自乙型流感病毒的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的。
[0183]在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含(i)和(ii)或由(i)和(ii)组成的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽:(i)来自乙型流感病毒的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽和 Qi)来自亚型 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16 或 H17 的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型Hl、H2或H3的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H5的甲型流感病毒。
[0184]在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含(i)和(ii)或由(i)和(ii)组成的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽:(i)来自乙型流感病毒的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽和(ii)来自乙型流感病毒的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的。
[0185]在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)组成的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽:(i)来自甲型流感病毒A/California/7/2009 (HI)的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽和(ii)来自亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型H5、H6、H8、H9、Hll、H12、H13或H16的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型Hl的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H2的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H3的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H5的甲型流感病毒。
[0186]在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)组成的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽:(i)来自甲型流感病毒A/California/7/2009 (HI)的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽和(ii)来自亚型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hl1、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型H4的甲型流感病毒。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型H5的甲型流感病毒。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型H6的甲型流感病毒。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型H7的甲型流感病毒。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型HS的甲型流感病毒。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型H9的甲型流感病毒。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型HlO的甲型流感病毒。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型Hll的甲型流感病毒。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型H12的甲型流感病毒。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型H13的甲型流感病毒。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型H14的甲型流感病毒。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型H15的甲型流感病毒。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型H16的甲型流感病毒。
[0187]在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)组成的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽:(i)来自甲型流感病毒A/Brisbane/59/2007-like (Hl)的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽和(ii)来自亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 或 H17 的甲型流感病毒的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型H5、H6、H8、H9、Hll、H12、H13或H16的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型Hl的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H2的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H3的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H5的甲型流感病毒。
[0188]在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和
(ii)组成的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽:(i)来自甲型流感病毒A/SouthCarolina/1918 (HI)的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽和(ii)来自亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 或 H17 的甲型流感病毒的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型H5、H6、H8、H9、Hll、H12、H13或H16的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型Hl的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H2的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H3的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H5的甲型流感病毒。
[0189]在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)组成的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽:(i)来自甲型流感病毒A/USSR/92/1977(Hl)的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽和(ii)来自亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型册、册、!18、!19、!111、!112、!113或!116的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型Hl的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H2的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H3的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H5的甲型流感病毒。
[0190]在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)组成的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽:(i)来自甲型流感病毒A/California/04/2009 (HI)的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽和(ii)来自亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型册、册、!18、!19、!111、!112、!113或!116的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型Hl的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H2的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H3的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H5的甲型流感病毒。
[0191]在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含(i)和(ii)或由(i)和(ii)组成的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽:(i)来自甲型流感病毒A/Perth/16/2009 (H3)的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽和(ii)来自亚型!11、!12、!13、!14、册、册、!17、!18、!19、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型財、!17、!110、!114或!115的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽(polyp tide)是来自亚型H5的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽(polyp tide)是来自A/Viet Nam/1203/04(H5)。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型H7的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽(polyp tide)是来自A/Alberta/24/01 (H7)。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型Hl的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H2的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H3的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H5的甲型流感病毒。
[0192]在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)组成的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽:(i)来自甲型流感病毒A/Brisbane/10/2007-like (H3)的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽和(ii)来自亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 或 H17 的甲型流感病毒的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型H4、H7、H10、H14或H15的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型Hl的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H2的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H3的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H5的甲型流感病毒。
[0193]在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含(i)和(ii)或由(i)和(ii)组成的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽:(i)来自甲型流感病毒A/Hong Kong/1/1968 (H3)的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽和(ii)来自亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型財、!17、!110、!114或!115的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型Hl的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H2的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H3的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H5的甲型流感病毒。
[0194]在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)组成的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽:(i)来自甲型流感病毒A/California/1/1988 (H3)的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽和(ii)来自亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型財、!17、!110、!114或!115的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型Hl的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H2的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H3的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H5的甲型流感病毒。
[0195]在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含(i)和(ii)或由(i)和(ii)组成的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽:(i)来自甲型流感病毒A/Ann Arbor/6/60 (H2)的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽和(ii)来自亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型財、!17、!110、!114或!115的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型Hl的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H2的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H3的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H5的甲型流感病毒。
[0196]在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)组成的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽:(i)来自甲型流感病毒A/Puerto Rico/8/1934 (HI)的流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽和(ii)来自亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的。在一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型H1、H2、H4、H5、H6、H7、H9、H10、H14或H15的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型Hl、H2、H5、H6或H9的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型Hl的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H2的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H3的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽不是来自亚型H5的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型H5的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽(polyptide)是来自A/Viet Nam/1203/04(H5)。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型H6的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自A/mallard/Sweden/81/02 (H6)。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自亚型H9的甲型流感病毒。在另一个具体的实施方案中，所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽是来自A/guineafowl/Hong Kong/ffF10/99(H9)。
[0197]在某些实施方案中，本文提供的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽包含流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽和流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽，其中所述流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽对所述流感病毒血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的，和其中所述嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽具有呈以下顺序的一级结构=HAlN-端干区段、流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽、HAlC-端干区段和HA2。本文提供的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的一级序列可以由单条多肽构成，或者它可以由多条多肽构成。典型地，单条多肽通过本领域技术人员认为合适的任何技术来表达。
[0198]在某些实施方案中，本文提供的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽是单体的。在某些实施方案中，本文提供的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽是多聚体的。在某些实施方案中，本文提供的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽是三聚体的。
[0199]在某些实施方案中，本文提供的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽包含信号肽。典型地，信号肽在多肽表达和翻译期间或之后被切除以产生成熟的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽。在某些实施方案中，本文也提供的是缺少信号肽的成熟的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽。在其中本文提供的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽包含信号肽的多个实施方案中，所述信号肽可基于本领域技术人员已知的任何流感病毒信号肽。在某些实施方案中，所述信号肽基于甲型流感信号肽。在某些实施方案中，所述信号肽基于选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 和 H17 的甲型流感血细胞凝集素的信号肽。在某些实施方案中，所述信号肽可以是本领域技术人员认为有用的任何信号肽。在某些实施方案中，所述信号肽选自SEQ ID N0S: 18-33。
[0200]在某些实施方案中，本文提供的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽包含胞腔结构域。在其中本文提供的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽包含胞腔结构域的多个实施方案中，所述胞腔结构域可基于本领域技术人员已知的任何流感胞腔结构域。在某些实施方案中，所述胞腔结构域基于甲型流感胞腔结构域。在某些实施方案中，所述胞腔结构域基于选自 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16 和 H17 的甲型流感血细胞凝集素的胞腔结构域。在某些实施方案中，所述胞腔结构域可以是本领域技术人员认为有用的任何胞腔结构域。在某些实施方案中，所述胞腔结构域选自SEQ ID N0S:98-113。在某些实施方案中，所述胞腔结构域是来自与所述干结构域相同的血细胞凝集素。在某些实施方案中，所述胞腔结构域是来自与所述干结构域HA2亚单位相同的流感病毒毒株或亚型。
[0201]在某些实施方案中，本文提供的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽包含跨膜结构域。在其中本文提供的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽包含跨膜结构域的多个实施方案中，所述跨膜结构域可基于本领域技术人员已知的任何流感跨膜结构域。在某些实施方案中，所述跨膜结构域基于甲型流感跨膜结构域。在某些实施方案中，所述跨膜结构域基于选自 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16 和 H17 的甲型流感血细胞凝集素的跨膜结构域。在某些实施方案中，所述跨膜结构域可以是本领域技术人员认为有用的任何跨膜结构域。在某些实施方案中，所述跨膜结构域选自SEQ ID N0S: 114-129.在某些实施方案中，所述跨膜结构域是来自与所述干结构域相同的血细胞凝集素。在某些实施方案中，所述跨膜结构域是来自与所述干结构域HA2亚单位相同的流感病毒毒株或亚型。
[0202]在某些实施方案中，本文提供的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽包含细胞质结构域。在其中本文提供的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽包含细胞质结构域的多个实施方案中，所述细胞质结构域可基于本领域技术人员已知的任何流感细胞质结构域。在某些实施方案中，所述细胞质结构域基于甲型流感细胞质结构域。在某些实施方案中，所述细胞质结构域基于选自 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 和H17的甲型流感血细胞凝集素的细胞质结构域。在某些实施方案中，所述细胞质结构域可以是本领域技术人员认为有用的任何细胞质结构域。在某些实施方案中，所述细胞质结构域选自SEQ ID N0S: 130-145。在某些实施方案中，所述细胞质结构域是来自与所述干结构域相同的血细胞凝集素。在某些实施方案中，所述细胞质结构域是来自与所述干结构域HA2亚单位相同的流感病毒毒株或亚型。
[0203]在某些实施方案中，本文提供的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽中的一个或多个糖基化位点是修饰的(例如，通过氨基酸添加、缺失或取代)。在多个具体的实施方案中，所述一个或多个糖基化位点是修饰的使得这些位点上的糖基化在多肽的加工和成熟期间将不会发生。本领域技术人员将认识到，流感HA典型地包含一个或多个糖基化位点(例如Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys,其中Xaa是任意氨基酸或Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys,或者,在某些实施方案中，其中Xaa是Pro除外的任意氨基酸)。在某些实施方案中，所述修饰的糖基化位点位于所述嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的干结构域。在某些实施方案中，在糖基化位点中的一个或多个氨基酸残基用破坏所述糖基化位点的氨基酸残基保守取代。在某些实施方案中，在糖基化位点中的一个或多个氨基酸残基用破坏所述糖基化位点的任意氨基酸残基取代。在某些实施方案中，在糖基化位点中的一个或多个天冬酰胺残基用丙氨酸取代。在一个特别的实施方案中，H3血细胞凝集素的位置38上的天冬酰胺被改变成丙氨酸。在某些实施方案中，所述嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽在其球状头结构域中包含一个或多个非天然存在的糖基化位点。在某些实施方案中，所述嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽包含一个或多个修饰的糖基化位点和/或非天然存在的糖基化位点，如在第5.4节中所论述的，参见下文。
[0204]在某些实施方案中，本文提供的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽能够形成与天然流感血细胞凝集素的三维结构类似的三维结构。结构的相似性可基于本领域技术人员认为合适的任何技术来评估。举例来说，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽与识别天然流感血细胞凝集素的中和抗体或抗血清例如在非变性条件下的反应可表明结构相似性。有用的中和抗体或抗血清描述于例如Sui等人，2009, Nat.Struct.Mol.B1l.16 (3):265-273, Ekiert 等人,February26, 2009, Science[D01:10.1126/science.1171491]，和 Kashyap 等人，2008，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA105 (16): 5986-5991，其文本内容以其整体并入本文作为参考。在某些实施方案中，所述抗体或抗血清是与由血细胞凝集素的三级或四级结构形成的非连续表位(即，在一级序列中是不连续)反应的抗体或抗血清。
[0205]在某些实施方案中，本文提供的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽还包含一个或多个多肽结构域。有用的多肽结构域包括促进多肽的纯化、折叠和部分多肽切除的结构域。例如，His 标签(His-His-His-His-His-His, SEQ ID NO: 166)、FLAG 表位或其它纯化标签可以促进本文提供的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的纯化。在有些实施方案中，所述His 标签具有序列(His)n，其中 η 为 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大。来自噬菌体T4fibritin的折叠结构域或三聚化结构域可促进本文提供的多肽的三聚化。在有些实施方案中，所述三聚化结构域包含野生型GCMpII三聚化七个重复或修饰的GCMpII三聚化七个重复,允许形成三聚体的或四聚体的卷曲螺旋,参见例如，Weldon等人，2010，PLoS0NE5(9):el2466。所述折叠结构域可以具有本领域技术人员已知的任何折叠序列(参见例如，Papanikolopoulou 等人,2004, J.B1l.Chem.279 (10): 8991-8998,其文本以其整体并入本文作为参考。实例包括GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ IDNO: 167)。折叠结构域可用于促进本文提供的可溶性多肽的三聚化。切割位点可以用于促进一部分多肽的裂解，例如纯化标签或折叠结构域或它们二者的裂解。有用的切割位点包括凝血酶切割位点，例如具有序列LVPRGSP (SEQ ID NO: 168)的位点。在某些实施方案中，所述切割位点是被烟草蚀斑病毒(TEV)蛋白酶识别的切割位点(例如，氨基酸序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser))。
[0206]在某些实施方案中，所述嵌合的流感血细胞凝集素血细胞凝集素多肽是可溶性多肽，例如在下文实施例6和9中描述的那些。
[0207]在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的流感血细胞凝集素干结构域多肽维持在图1中在流感血细胞凝集素多肽中被标识为Ap和Aq的半胱氨酸残基，即在图1中在流感血细胞凝集素多肽中被标识为A1^P Aq的半胱氨酸残基在本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽中被保留下来。因此，在某些实施方案中，在本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的一级序列中:(i)流感血细胞凝集素干结构域多肽的N-端区段结束于在图1中标识为Ap的半胱氨酸残基，(ii)流感血细胞凝集素干结构域多肽的C-端区段起始于在图1中标识为Aq的半胱氨酸残基；和(iii)流感血细胞凝集素头结构域多肽(其对所述流感血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的)是介于流感血细胞凝集素干结构域多肽的N-端区段和C-端区段之间。流感血细胞凝集素干结构域多肽在下文第5.1.2节有详细描述。
[0208]在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的HAlN-端干区段并不精确地结束于Ap (例如，来自H3血细胞凝集素的HAl亚单位的Cys52),但是结束于在序列和结构靠近Ap的残基。例如，在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的 HAlN-端干区段结束于 A"、Ap_2、Ap_3、Ap_4、Ap_5、Ap_6、Ap_7、Ap_8、Ap_9、Ap_1(1、Ap-11、Ap_12> Ap_13> Ap_14> Ap_15> Ap_16> Ap_17> Ap_18> Ap_19> Ap_2o > Ap_21、Ap_22 > Ap_23、Ap_23> Ap_24、Ap_25 > Ap_26、Ap-27、Ap_28、Ap_29、Ap_3(i。在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的HAlN-端干区段在Alri至

Ap-3、Ap-3 至 Ap-5、Ap_5 至 Ap—8、Ap—8 至



Ap-1O、Ap-1o MAp
-15、Ap-15 至 V20、
Ap_20至Ap_3。、Ap_30至Ap_4。的范围内结束。例如，在AP_1C)结束的HAlN-端干区段将结束于H3血细胞凝集素的Lys42。在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的 HAlN- ?而干区段结束于 Αρ+1、Αρ+2 λ Αρ+3λ Αρ+4λ Αρ+5、Αρ+6、Αρ+7、Αρ+8、Αρ+9、Αρ+1。、Αρ+11、Αρ+12 λ Αρ+13、Αρ+?4、Αρ+15、Αρ+16、Αρ+17λ Αρ+18、Αρ+19、Αρ+20、Αρ+21、Αρ+22、Αρ+23、Αρ+24、Αρ+25、Αρ+26、Αρ+27、Αρ+28、Αρ+29、Αρ+30、Αρ+3?、Αρ+32、Αρ+33、Αρ+34 λ Αρ+35、Αρ+36 λ Αρ+37 λ Αρ+38、Αρ+39 λ Αρ+4ο ο 在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的HAlN-端干区段在Αρ+1至Αρ+5、Αρ+5至ΑΡ+1(Ι、ΑΡ+1(Ι至ΑΡ+15、ΑΡ+15至 Ap+20、Ap+20 Αρ+25、Αρ+25 Αρ+30、Αρ+30 Αρ+35、Αρ+35


至αρ+4(ι或αρ+4(ι至αρ+5(ι的范围内结束。例如，在Αρ+38结束的HAlN-端干区段将结束于Η3血细胞凝集素的Arg90。HAlN-端干区段的末端应当结合HAlC-端干区段和流感血细胞凝集素头结构域多肽的末端进行选择使得所得嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽能够形成与野生型流感血细胞凝集素类似的三维结构。在这样的实施方案中，流感血细胞凝集素头结构域多肽(其对所述流感血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的)在一级序列中位于流感血细胞凝集素干结构域多肽的N-端区段和C-端区段之间。
[0209]在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的HAlC-端干区段不起始于Aq (例如，来自H3血细胞凝集素的HAl亚单位的Cys277)，而是起始于在序列和结构靠近Aq的残基。例如，在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多妝的 HAlC- ?而干区段起$口于约 Atrl'Atr2'Atr3'Atr4'Atr5'Atr6'Atr7'Atr8'Atr9'Atric^ Atrll'Atrl2'Aq-13、Atrl4、Atrl5、Atr20、Atr25、Atr30、Atr35、Aq_40 > Aq_45> Aq_50> Atr55、Atr6cu Atr65、Aq_70 > Atr75 5? Atr8c^某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的HAlC-端干区段在Atrl
至 \-5、\-5 至 Aq-10、Aq-10 Aq-15、Aq-! 5 Aq-20、Aq-20 Aq-25、Aq-25 Aq-30、Aq-30
Aq-35、Aq-35 至
Aq-40、Aq-40 ^-q-45 Λ ^-q-45 ^-q-50 Λ ^-q-50 ^-q-55 Λ ^-q-55 ^-q-60 Λ ^-q-60 ^-q-65 Λ ^-q-65 ^-q-70 Λ ^-q-75 ^-q-80
的范围内开始。例如，在Aq_77结束的HAlC-端干区段将起始于H3血细胞凝集素的Gly200 ；和在Acrici结束的HAlC-端干区段将起始于H3血细胞凝集素的异亮氨酸262。在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的HAlC-端干区段起始于Aq+1、Aq+2、^q+3、Aq+4、Aq+5、Aq+6、Aq+7、Aq+8、Aq+9、Aq+10、Aq+11、Aq+12、Aq+13、Aq+14、Aq+15、Aq+16、Aq+17、Aq+18、Aq+19、Aq+20、Aq+21、Aq+22、\+23、Aq+24、\+25、Aq+26、\+27、Aq+28、^-q+29 Λ ^-q+30 ° 在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的HAlC-端干区段在Aq+1至AqfAf3至\+5、k的至Aq+8、Aq+8至Aq+10> Aq+10至Aq+15或Aq+15至Aq+2(l的范围内开始。HAlN-端干区段的末端应当结合HAlC-端干区段和流感血细胞凝集素头结构域多肽的起点进行选择使得所得嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽能够形成与野生型流感血细胞凝集素类似的三维结构。在这样的实施方案中，流感血细胞凝集素头结构域多肽(其对所述流感血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的)在一级序列中位于流感血细胞凝集素干结构域多肽的N-端区段和C-端区段之间。
[0210]在一个实例中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的HAlN-端干区段可结束于血细胞凝集素氨基酸位置45-48(采用H3编号)中的任意一个，而所述嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的HAlC-端干区段可起始于血细胞凝集素氨基酸位置285-290 (米用H3编号)中的任意一个；和所述异源的头结构域可起始于氨基酸位置46-49中的任意一个且结束于氨基酸位置284-289(采用H3编号)中的任意一个。在另一个实例中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的HAlN-端干区段结束于血细胞凝集素氨基酸位置90 (采用H3编号)且所述嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的HAlC-端干区段起始于血细胞凝集素氨基酸位置200 (采用H3编号)；和所述异源的头结构域起始于氨基酸位置91且结束于氨基酸位置199 (采用H3编号)。
[0211]在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的N-端干区段的末尾是Alri，且本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的C-端干区段的起点是A,+在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的N-端干区段的末尾是Ap_2，且本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的C-端干区段的起点是Aq_2。在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的N-端干区段的末尾是Ap_3，且本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的C-端干区段的起点是Aq_3。在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的N-端干区段的末尾是V4,且本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的C-端干区段的起点是Ar4。在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的N-端干区段的末尾是Ap_5，且本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的C-端干区段的起点是Aq_5。在这样的实施方案中，流感血细胞凝集素头结构域多肽(其对所述流感血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的)在一级序列中位于所述流感血细胞凝集素干结构域多肽的N-端区段和C-端区段之间。
[0212]在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的N-端干区段的末尾是Αρ+1，且本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的C-端干区段的起点是Aq+1。在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的N-端干区段的末尾是Ap+2，且本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的C-端干区段的起点是Aq+2。在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的N-端干区段的末尾是Ap+3，且本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的C-端干区段的起点是Aq+3。在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的N-端干区段的末尾是Ap+4，且本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的C-端干区段的起点是Aq+4。在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的N-端干区段的末尾是Ap+5，且本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的C-端干区段的起点是Aq+5。在这样的实施方案中，流感血细胞凝集素头结构域多肽(其对所述流感血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的)在一级序列中位于所述流感血细胞凝集素干结构域多肽的N-端区段和C-端区段之间。
[0213]在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的N-端干区段的末尾是Alri，且本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的C-端干区段的起点是Aq+1。在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的N-端干区段的末尾是Ap_2，且本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的C-端干区段的起点是Aq+2。在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的N-端干区段的末尾是Ap_3，且本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的C-端干区段的起点是Aq+3。在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的N-端干区段的末尾是V4,且本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的C-端干区段的起点是Aq+4。在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的N-端干区段的末尾是Ap_5，且本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的C-端干区段的起点是Aq+5。在这样的实施方案中，流感血细胞凝集素头结构域多肽(其对所述流感血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的)在一级序列中位于所述流感血细胞凝集素干结构域多肽的N-端区段和C-端区段之间。
[0214]在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的N-端干区段的末尾是Ap+1，且本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的C-端干区段的起点是A,+在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的N-端干区段的末尾是Ap+2，且本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的C-端干区段的起点是Aq_2。在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的N-端干区段的末尾是Ap+3，且本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的C-端干区段的起点是Aq_3。在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的N-端干区段的末尾是Ap+4，且本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的C-端干区段的起点是Ar4。在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的N-端干区段的末尾是Ap+5，且本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的C-端干区段的起点是Aq_5。在这样的实施方案中，流感血细胞凝集素头结构域多肽(其对所述流感血细胞凝集素干结构域多肽来说是异源的)在一级序列中位于所述流感血细胞凝集素干结构域多肽的N-端区段和C-端区段之间。
[0215]本文也提供的是包含ΗΑ2亚单位和嵌合的HAl亚单位的嵌合的流感血细胞凝集素多肽。在某些实施方案中，所述嵌合的HAl亚单位包含第一种流感病毒毒株或亚型的HAl亚单位的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、60、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、75、75、76、77、78、79或80个氨基酸，而所述嵌合的HAl亚单位的剩余氨基酸是来自第二种流感病毒毒株或亚型。在某些实施方案中，所述嵌合的HAl亚单位包含第一种流感病毒毒株或亚型的HAl 亚单位的 1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90 或 90-100 个氨基酸，而所述嵌合的HAl亚单位的剩余氨基酸是来自第二种流感病毒毒株或亚型。在某些实施方案中，来自第一种流感病毒毒株或亚型的氨基酸可以是连续的，或者可以代表嵌合的HAl结构域的N-端和/或C-端的某些部分。在多个具体的实施方案中，所述嵌合的HAl亚单位包含流感病毒血细胞凝集素头结构域多肽，其包含流感病毒的两种或两种以上不同的亚型或毒株的氨基酸。在多个具体的实施方案中，所述嵌合的HAl亚单位包含具有流感病毒的两种或两种以上不同的亚型或毒株的氨基酸的球状头。
[0216]本领域技术人员应当理解，本文提供的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽可以根据为本领域技术人员所知并且本领域技术人员认为是合适的任何技术(包括本文描述的技术)来制备。在某些实施方案中，所述嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽是分离的。
[0217]5.2流感血■细胞凝集素头结构域多肽
[0218]本文提供的是用于产生流感HA多肽(包括本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)的流感血细胞凝集素头结构域多肽。
[0219]一般而言，本文提供的流感血细胞凝集素头结构域多肽是包含流感血细胞凝集素多肽的球状头结构域或基本上由其组成的多肽。流感血细胞凝集素多肽的头结构域是为本领域技术人员所公知的头结构域。
[0220]在某些实施方案中，本文提供的流感血细胞凝集素头结构域多肽包含与本领域技术人员已知的流感血细胞凝集素头结构域具有至少70 %、75 %、80%、85%、90 %、95 %、96%、98%或99%氨基酸序列同一性的流感血细胞凝集素头结构域。
[0221]本文也提供的是包含来自流感病毒的两种或两种以上毒株或亚型的氨基酸的流感血细胞凝集素头结构域多肽。在某些实施方案中，嵌合的HAl亚单位包含第一种流感病毒毒株或亚型的 HAl 亚单位的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、60、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、75、75、76、77、78、79或80个氨基酸，而所述嵌合的HAl亚单位的剩余氨基酸是来自第二种流感病毒毒株或亚型。在某些实施方案中，嵌合的HAl亚单位包含第一种流感病毒毒株或亚型的 HAl 亚单位的 1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100个氨基酸，而所述嵌合的HAl亚单位的剩余氨基酸是来自第二种流感病毒毒株或亚型。在某些实施方案中，来自第一种流感病毒毒株或亚型的氨基酸可以是连续的和/或可以代表嵌合的HAl结构域的N-端和/或C-端的多个部分。
[0222]本文也提供的是包含缺失形式的已知流感血细胞凝集素头结构域的流感血细胞凝集素头结构域多肽，其中至多约 150、145、140、135、130、125、120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 I 个氨基酸残基从头结构域中缺失。本文也提供的是包含缺失形式的已知流感血细胞凝集素头结构域的流感血细胞凝集素头结构域多肽，其中约1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140 或 140-150 个氨基酸残基从头结构域中缺失。本文进一步提供的是包含改变形式的已知流感血细胞凝集素头结构域的流感血细胞凝集素头结构域多肽，其中所述头结构域的至多约80、75、7065、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或I个氨基酸残基用其它氨基酸取代(例如，保守取代)。本文也提供的是包含改变形式的已知流感血细胞凝集素头结构域的流感血细胞凝集素头结构域多肽，其中所述头结构域的至多约1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100个氨基酸残基用其它氨基酸取代(例如，保守取代)。在某些实施方案中，至多50、60或更多个氨基酸从流感血细胞凝集素头结构域的N-末端缺失(根据一级氨基酸序列评定的)和至多70、80或更多个氨基酸从流感血细胞凝集素头结构域的C-末端缺失(根据一级氨基酸序列评定的)。
[0223]本文也提供的是包含与流感血细胞凝集素头结构域缔合的抗原性区域(例如，已知包含表位或由表位组成的头结构域的区域)中的一个或多个的缺失的流感血细胞凝集素头结构域多肽(例如，抗原性位点A、B、C和D，其中所述头结构域是来自亚型H3 ;或抗原性位点Sa、Sb、Ca和Cb，其中所述头结构域是来自亚型Hl)。在一个具体的实施方案中，本文提供的是包含一个抗原性区域(例如，已知包含表位或由表位组成的头结构域的一个区域)的缺失的流感血细胞凝集素头结构域多肽。在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含两个抗原性区域(例如，已知包含表位或由表位组成的头结构域的两个区域)的缺失的流感血细胞凝集素头结构域多肽。在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含三个抗原性区域(例如，已知包含表位或由表位组成的头结构域的三个区域)的缺失的流感血细胞凝集素头结构域多肽。在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含四个抗原性区域(例如，已知包含表位或由表位组成的头结构域的四个区域)的缺失的流感血细胞凝集素头结构域多肽。在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含五个抗原性区域(例如，已知包含表位或由表位组成的头结构域的五个区域)的缺失的流感血细胞凝集素头结构域多肽。本领域技术人员可以容易地确定本领域已知的或使用本领域技术人员已知的和本文描述的技术后来鉴定的流感头结构域的抗原性区域(例如，表位)。
[0224]在某些实施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽的流感血细胞凝集素头结构域多肽包含(i)来自与干结构域同源的流感血细胞凝集素头结构域多肽的一、二、三个或三个以上的抗原性区域(即，来源于相同的流感病毒毒株或亚型)和(ii)来自与干结构域异源的流感血细胞凝集素头结构域多肽的一、二、三个或三个以上的抗原性区域(即，来源于不同的流感病毒毒株或亚型)。在一个具体的实施方案中，所述头结构域的C抗原性位点/区域与所述干结构域同源(S卩，来源于相同的流感病毒毒株或亚型)。在另一个具体的实施方案中，所述头结构域的D抗原性位点/区域与所述干结构域同源(即，来源于相同的流感病毒毒株或亚型)。在另一个具体的实施方案中，所述头结构域的C和D抗原性位点/区域与所述干结构域同源(即，来源于相同的流感病毒毒株或亚型。在又一个具体的实施方案中，所述头结构域的Ca和/或Cb抗原性位点/区域与所述干结构域同源(即，来源于相同的流感病毒毒株或亚型)。
[0225]本文也提供的是包含与流感血细胞凝集素头结构域缔合的抗原性区域(例如，已知包含表位或由表位组成的头结构域的区域)中的一个或多个被非抗原性多肽序列(例如，已知不诱导免疫应答或已知产生对流感没有特异性的免疫应答的多肽序列)置换的流感血细胞凝集素头结构域多肽。在一个具体的实施方案中，本文提供的是包含一个抗原性区域(例如，已知包含表位或由表位组成的头结构域的一个区域)被非抗原性多肽序列(例如，已知不诱导免疫应答或已知产生对流感没有特异性的免疫应答的多肽序列)置换的流感血细胞凝集素头结构域多肽。在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含两个抗原性区域(例如，已知包含表位或由表位组成的头结构域的两个区域)被非抗原性多肽序列(例如，已知不诱导免疫应答或已知产生对流感没有特异性的免疫应答的多肽序列)置换的流感血细胞凝集素头结构域多肽。在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含三个抗原性区域(例如，已知包含表位或由表位组成的头结构域的三个区域)被非抗原性多肽序列(例如，已知不诱导免疫应答或已知产生对流感没有特异性的免疫应答的多肽序列)置换的流感血细胞凝集素头结构域多肽。在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含四个抗原性区域(例如，已知包含表位或由表位组成的头结构域的四个区域)被非抗原性多肽序列(例如，已知不诱导免疫应答或已知产生对流感没有特异性的免疫应答的多肽序列)置换的流感血细胞凝集素头结构域多肽。在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含五个抗原性区域(例如，已知包含表位或由表位组成的头结构域的五个区域)被非抗原性多肽序列(例如，已知不诱导免疫应答或已知产生对流感没有特异性的免疫应答的多肽序列)置换的流感血细胞凝集素头结构域多肽。本领域技术人员可以容易地确定本领域已知的或使用本领域技术人员已知的和本文描述的技术后来鉴定的流感头结构域的抗原性区域(例如，表位)。
[0226]在另一个具体的实施方案中，本文提供的是包含一、二、三个或三个以上异源抗原性区域(即，来自不同流感病毒毒株或亚型(例如，对于全部或部分群体是原初的流感病毒毒株或亚型)的血细胞凝集素的一、二、三个或三个以上的抗原性区域)的流感血细胞凝集素头结构域多肽。在另一个具体的实施方案中，所述流感血细胞凝集素头结构域多肽的异源抗原性区域包含一个或多个非天然存在的糖基化位点，如下文在第5.4.2节中论述的。虽然不受任何具体操作理论的束缚，但是相信在干结构域中的保守亚免疫优势抗原性区域的免疫原性将通过在所述流感血细胞凝集素头结构域中的这些免疫优势区域中添加一个或多个非天然存在的糖基化位点而增加。在多个具体的实施方案中，所述流感血细胞凝集素头结构域多肽包含一、二、三个或三个以上的异源抗原性区域，其中所述异源抗原性区域包含一个或多个非天然存在的糖基化位点。
[0227]本文提供的流感血细胞凝集素头结构域多肽可基于技术人员已知的或后来发现的任何流感血细胞凝集素的头结构域(即，可具有序列同一性)。在某些实施方案中，流感血细胞凝集素头结构域多肽基于甲型流感血细胞凝集素的头结构域(例如，在下文第5.4节中描述的甲型流感病毒的血细胞凝集素的头结构域)。在某些实施方案中，所述流感血细胞凝集素头结构域多肽基于选自 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16和H17的甲型流感血细胞凝集素的头结构域。在某些实施方案中，流感血细胞凝集素头结构域多肽基于乙型流感血细胞凝集素的头结构域(例如，在下文第5.4节中描述的乙型流感病毒的血细胞凝集素的头结构域)。在有些实施方案中，所述流感血细胞凝集素头结构域多肽基于B/Seal/Netherlands/1/99的头结构域。在一个具体的实施方案中，所述流感血细胞凝集素头结构域多肽基于选自H5、H6和/或H9组的甲型流感血细胞凝集素的头结构域。在另一个具体的实施方案中，所述流感血细胞凝集素头结构域多肽基于选自H5、H7和/或H9组的甲型流感血细胞凝集素的头结构域。
[0228]5.3流感血■细胞凝集素干结构域多肽
[0229]本文提供的是用于产生流感血细胞凝集素多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)的流感血细胞凝集素干结构域多肽。尽管不受任何具体操作理论的束缚，但是相信在本文提供的流感血细胞凝集素多肽(例如，嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽)的上下文中，所述流感血细胞凝集素干结构域多肽可用于将一个或多个相对保守的抗原性区域呈递至宿主免疫系统以便产生能够与多种流感毒株交叉反应的免疫应答。由于一个或多个抗原性区域在流感血细胞凝集素亚型间是十分保守的，因此这样一种免疫应答可能与全长流感血细胞凝集素多肽的若干亚型交叉反应。
[0230]一般而言，本文提供的流感血细胞凝集素干结构域多肽是包含流感血细胞凝集素多肽的干结构域或基本上由其组成的多肽。流感血细胞凝集素多肽的干结构域是为本领域技术人员所公知的干结构域。
[0231]在某些实施方案中，本文提供的流感血细胞凝集素干结构域多肽很少包含或不包含流感血细胞凝集素多肽的球状头结构域。在某些实施方案中，流感血细胞凝集素干结构域多肽是通过本领域技术人员认为合适的任何技术缺失其球状头结构域的流感血细胞凝集素。
[0232]在某些实施方案中，本文描述的流感血细胞凝集素干结构域多肽保留了在图1中在流感血细胞凝集素多肽中标识为Ap和Aq的半胱氨酸残基。在某些实施方案中，本文描述的流感血细胞凝集素干结构域多肽在低于野生型流感病毒的血细胞凝集素的pH(例如，pH小于 5.2、小于 5.1、小于 5.0 或小于 4.9，例如 4.8,4.7,4.6,4.5,4.4.、4.3,4.2,4.1,4.0、3.9、3.8等)下具有更高的稳定性。在多个特别的实施方案中，本文描述的流感血细胞凝集素干结构域多肽在低于野生型流感病毒的血细胞凝集素的PH下经历了从融合前构象到融合构象的构象变化。在有些实施方案中，本文描述的流感血细胞凝集素干结构域多肽包含在低pH(例如，介于4.9至5.2,4.5至3.5,3.5至2.5,2.5至1.5、1.5至0.5之间的pH)下增加多肽稳定性的一个或多个氨基酸取代，例如HA1H17Y(H3编号)。流感血细胞凝集素干结构域多肽的稳定性可以采用本领域已知的技术来评价，例如所述血细胞凝集素分子对胰蛋白酶消化的敏感性，如描述于例如Thoennes等人，2008，Virology370:403-414。
[0233]所述流感血细胞凝集素干结构域多肽可以根据本领域技术人员认为合适的任何技术(包括以下描述的技术)来制备。在某些实施方案中，所述干结构域多肽是分离的。
[0234]在有些实施方案中，流感血细胞凝集素干结构域多肽的一级结构按下列顺序包含:HA1N-端干区段、接头、HAlC-端干区段和HA2。在有些实施方案中，流感血细胞凝集素干结构域多肽的一级结构按下列顺序包含=HAlN-端干区段、接头、HAlC-端短干区段和HA2。在有些实施方案中，流感血细胞凝集素干结构域多肽的一级结构按下列顺序包含:HAlN-端长干区段、接头、HAlC-端长干区段和HA2。在有些实施方案中，所述流感血细胞凝集素干结构域多肽按下列顺序包含=HAlN-端干区段、接头、HAl中间干区段、第二接头、HAlC-端干区段和HA2。
[0235]一级序列可以由单条多肽构成，或者它可以由多条多肽构成。典型地，单条多肽通过本领域技术人员认为合适的任何技术来表达。在单条多肽的多个实施方案中，所述HAl区段和所述HA2是呈三级缔合。正如本领域技术人员所知晓的，单一 HA多肽可以被切割，例如在适当的表达条件下被蛋白酶切割得到呈四级缔合的两条多肽。该切割典型地在所述HAlC-端干区段和所述HA2之间。在某些实施方案中，本文提供的是多条多肽，例如两条多肽，流感血细胞凝集素干结构域。在多条多肽的多个实施方案中，所述HAl区段和HA2是呈四级缔合。
[0236]在某些实施方案中，本文提供的流感血细胞凝集素干结构域多肽是单体的。在某些实施方案中，本文提供的流感血细胞凝集素干结构域多肽是多聚体的。在某些实施方案中，本文提供的流感血细胞凝集素干结构域多肽是三聚体的。本领域技术人员将认识到，天然流感血细胞凝集素多肽能够在体内三聚化并且本文提供的某些流感血细胞凝集素干结构域多肽能够三聚化。在以下描述的特别的实施方案中，本文提供的流感血细胞凝集素干结构域多肽包含三聚化结构域以促进三聚化。
[0237]在某些实施方案中，流感血细胞凝集素干结构域多肽包含信号肽。典型地，信号肽在多肽表达和翻译期间或之后被切除以产生成熟的流感血细胞凝集素干结构域多肽。信号肽对于所述流感血细胞凝集素干结构域多肽的表达可能是有利的。在某些实施方案中，本文也提供的是缺少信号肽的成熟的流感血细胞凝集素干结构域多肽。
[0238]流感血细胞凝集素HA2典型地包含干结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。在某些实施方案中，本文提供的是包含HA2干结构域、HA2胞腔结构域、HA2跨膜结构域和HA2细胞质结构域的流感血细胞凝集素干结构域多肽。这样的流感血细胞凝集素干结构域多肽可被表达为膜结合的抗原。在某些实施方案中，本文提供的是包含HA2干结构域、HA2胞腔结构域和HA2跨膜结构域但缺少一些或全部的典型细胞质结构域的流感血细胞凝集素干结构域多肽。这样的流感血细胞凝集素干结构域多肽可被表达为膜结合的抗原。在某些实施方案中，本文提供的是包含HA2干结构域和HA2胞腔结构域但缺少HA2跨膜结构域和HA2细胞质结构域二者的流感血细胞凝集素干结构域多肽。这样的流感血细胞凝集素干结构域多肽可有利地被表达为可溶性多肽。在某些实施方案中，本文提供的是包含HA2干结构域但缺少HA2胞腔结构域、HA2跨膜结构域和HA2细胞质结构域的流感血细胞凝集素干结构域多肽。这样的流感血细胞凝集素干结构域多肽可有利地被表达为可溶性多肽。在某些实施方案中，所述流感血细胞凝集素干结构域多肽包含与本领域技术人员已知的流感HA2干结构域具有至少70 %、75%、80 %、85%、90 %、95%、96 %或98%氨基酸序列同一性的HA2干结构域。来自已知的甲型流感和乙型流感血细胞凝集素的示例性的已知HA2干结构域在下文的表中提供。
[0239]本文也提供的是包含缺失形式的HA2干结构域的流感血细胞凝集素干结构域多肽，其中至多 100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、
5、4、3、2或I个氨基酸残基从HA2干结构域的任一个或两个末端缺失。本文进一步提供的是包含改变形式的HA2干结构域的流感血细胞凝集素干结构域多肽，其中至多100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 I 个氨基酸残基用其它氨基酸保守取代。进一步提供的是包含缺失的和改变的HA2干结构域的流感血细胞凝集素干结构域多肽。在某些实施方案中，所述流感血细胞凝集素干结构域多肽包含包含一个或多个修饰的糖基化位点的HA2干结构域，其中所述修饰的糖基化位点包含破坏聚糖附着到修饰的糖基化位点的能力的天然存在的糖基化位点的修饰，如描述于第5.4.1节，参见下文。虽然不受任何具体操作理论的束缚，但是相信在所述干结构域里面的免疫原性和可及性(accessibility)抗原性区域可通过以在该位点破坏糖基化(即，聚糖的附着)的方式修饰所述干结构域里面的一个或多个糖基化位点而增加。
[0240]在有些实施方案中，流感血细胞凝集素干结构域多肽的一级结构按下列顺序包含:HA1N-端干区段、接头、HAlC-端干区段和HA2。所述HAlN-端干区段可以是由本领域技术人员基于本文提供的定义而认识的任何HAlN-端干区段。典型地，HAlN-端干区段对应于由成熟的HAl (即缺少信号肽的HAl)的N-端氨基酸直到位于HAl的序列中大约第52号残基的半胱氨酸残基组成的多肽。这个半胱氨酸残基，在本文中称SAp，一般能够与HAl的C-端干区段中的半胱氨酸残基形成二硫桥。在图1中显示了 16种代表性的甲型流感血细胞凝集素的序列，其中残基Ap分别作了标注。
[0241]在某些实施方案中，所述HAlN-端干区段不精确地结束于Ap(例如，来自H3血细胞凝集素的HAl亚单位的Cys52)，但是结束于在序列和结构靠近Ap的残基。例如，在某些实施方案中，所述HAlN-端干区段结束于A"、



Ap-2、Ap-3、Ap-4、Ap-5、Ap 一 6、Ap_7、Ap_8、Ap_9、Ap_10、Ar^1 x、Ap-12、Ap-! 3 λ Αρ_14λ Ap 一 15、Αρ_16λ Αρ_17λ Ap 一 18、Αρ_19λ Ap 一 20、Ap 一 21、Ap 一 22、Ap 一 23、Ap 一 23、Ap 一 24、Ap 一 25、Ap 一 26、Ap 一 27、Αρ—28、ΑΡ—29、ΑΡ—3。。在某些实施方案中，本文描述的流感血细胞凝集素多肽的HAlN-端干区段^ Ap-1 S Αρ—3、_Αρ—3 M Αρ_5Λ Αρ_5 M Αρ_8 Λ Αρ_8 M Αρ_10Λ Αρ_10 S Αρ—15、Αρ—15 至 Αρ—20、Αρ—20 至
Αρ—30、Αρ—30
至Αρ_4(ι的范围内结束。在其它的实施方案中，所述HAlN-端干区段结束于Αρ+1、Αρ+2、Αρ+3、Ap+4、Ap+5 > Ap+6 > Ap+7 > Ap+8 > Ap+9> Ap+10> Ap+11、Ap+12> Ap+13> Ap+14> Ap+15> Ap+16> Ap+17> Ap+18> Ap+19> Ap+20> Ap+21>
Ap+22、Ap+23、Ap+24 > Ap+25 > Ap+26> Ap+27 > Ap+28 > Ap+29> Ap+30 > Ap+31 > Ap+32 > Ap+33 > Ap+34 > Ap+35> Ap+36 > Ap+37 > Ap+38 >
Ap+39、Ap+4(i。在某些实施方案中，本文描述的流感血细胞凝集素多肽的HAlN-端干区段在Αρ+ι
Ap+5、^p+5 Ap+1、Αρ+ι。Ap+i5、^p+15 ^ρ+20Λ +2 O Αρ+25、^ρ+2^ ^ρ+30Λ ^ρ+30 ^ρ+35 Λ ^ρ+35
AP+4Q或Αρ+4(ι至Αρ+5(ι的范围内结束。HAlN-端干区段的末端应当结合所述HAlC-端干区段的末端和所述接头进行选择使得所得的连接的HAl干结构域能够形成如下所述与流感血细胞凝集素干结构域类似的三维结构。
[0242]在某些实施方案中，所述流感血细胞凝集素干结构域多肽包含与本领域技术人员已知的流感HAlN-端干区段具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%或98%氨基酸序列同一性的HAlN-端干区段。示例性的已知HAlN-端干区段在下文的表中提供。
[0243]本文也提供的是包含缺失形式的HAlN-端干区段的流感血细胞凝集素干结构域多肽，其中至多 100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、
6、5、4、3、2或I个氨基酸残基从所述HAlN-端干区段的任一个或两个末端缺失。本文也提供的是包含缺失形式的已知流感血细胞凝集素干结构域的流感血细胞凝集素干结构域多肽，其中约 1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100 个氨基酸残基从所述干结构域中缺失。在某些实施方案中，本文提供的是包含扩展形式的HAlN-端干区段的流感血细胞凝集素干结构域多肽，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个残基被添加到所述HAlN-端干区段的C-末端；这些添加的残基可来源于与HAlN-端干区段毗邻的球状头结构域的氨基酸序列。本文进一步提供的是包含改变形式的HAlN-端干区段的流感血细胞凝集素干结构域多肽，其中至多80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或I个氨基酸残基用其它氨基酸保守取代。本文也提供的是包含改变形式的已知流感血细胞凝集素干结构域的流感血细胞凝集素干结构域多肽，其中所述干结构域的至多约 1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90 或 90-100 个氨基酸残基用其它氨基酸取代(例如，保守取代)。进一步提供的是包含缺失的和改变的HAlN-端干区段的流感血细胞凝集素干结构域多肽。在某些实施方案中，至多50、60或更多个氨基酸从流感血细胞凝集素干结构域的N-末端缺失(根据一级氨基酸序列评定的)和至多70、80或更多个氨基酸从流感血细胞凝集素干结构域的C-末端缺失(根据一级氨基酸序列评定的)。
[0244]所述HAlC-端干区段可以是由本领域技术人员基于本文提供的定义而认识的任何HAlC-端干区段。典型地，HAlC-端干区段对应于由位于HAl的序列中大约第277号残基(采用H3编号)的半胱氨酸残基直到HAl的C-端氨基酸组成的多肽。这个半胱氨酸残基，在本文中称为Aq，一般能够与HAl的N-端干区段中的半胱氨酸残基Ap形成二硫桥。在图1中显示了 17种代表性的甲型流感血细胞凝集素的序列，其中残基Aq分别作了标注。
[0245]在某些实施方案中，所述HAlC-端干区段不起始于Aq (例如，来自H3血细胞凝集素的HAl亚单位的Cys277)，而是起始于在序列和结构靠近Aq的残基。例如，在某些实施方案中，所述 HAlC- ?而干区段起$口于约 Atrl'Atr2、Atr3、Atr4、Atr5、Atr6、Atr7、AtJfAtr9、Atrltl、Atrl丨、Atrl2、Aq-13、Aq-14、Atrl5、Aq_2o、\-25、^q-30、^q-35、^q-40、\_45、^q-50、Aq-55、Aq_g0、Aq_g5、Aq_70、Aq_75 5? Aq_g0。
某些实施方案中，所述HAlC-端干区段在Atrl至Aq_5、Ar5至Α,_1(ι、Atrltl至Aq_15、Atrl5至Aq_2。、
Aq-20 Aq-25、Aq-25 Aq-30、Aq-30 Aq-35、Aq-35 S Aq—40、Aq_40 S Aq-45、Aq-45 Aq-50、Aq-50
Aq—55、
Aq—55 Aq—60、Aq—60 Aq-65、Aq-65 Aq—70、Aq—75 至Atr8ci的范围内开始。在其它的实施方案中，所述 HAlC-端干区段起始于 Aq+1、Aq+2、Aq+3、Aq+4、Aq+5、Aq+6、Aq+7、Aq+8、Aq+9 或 Aq+1(l。在某些实施方案中，本文描述的流感血细胞凝集素多肽的HAlC-端干区段在Aq+1至Aq+3、Aq+3至AfpAf5至Aq+8> Aq+8至Aq+1(l、Aq+10至Aq+15或Aq+15至Aq+2(l的范围内开始。HAlN-端干区段的末端应当结合所述HAlC-端干区段的起点和所述接头进行选择使得所得的HAl干结构域能够形成如下所述与流感血细胞凝集素类似的三维结构。
[0246]在某些实施方案中，所述流感血细胞凝集素干结构域多肽包含与本领域技术人员已知的流感HAlC-端干区段具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%或98%氨基酸序列同一性的HAlC-端干区段。示例性的已知HAlC-端干区段在下文的表中提供。
[0247]在某些实施方案中，所述N-端干区段的末尾是Alri，且所述C-端干区段的起点是A,+在某些实施方案中，所述N-端干区段的末尾是Ap_2，且所述C-端干区段的起点是Aq_2。在某些实施方案中，所述N-端干区段的末尾是Ap_3，且所述C-端干区段的起点是Atr3t5在某些实施方案中，所述N-端干区段的末尾是Ap_4，且所述C-端干区段的起点是Atr4t5在某些实施方案中，所述N-端干区段的末尾是Ap_5，且所述C-端干区段的起点是Ar50
[0248]在某些实施方案中，所述N-端干区段的末尾是Ap+1，且所述C-端干区段的起点是Aq+1。在某些实施方案中，所述N-端干区段的末尾是Ap+2，且所述C-端干区段的起点是Aq+2。在某些实施方案中，所述N-端干区段的末尾是Ap+3，且所述C-端干区段的起点是Aq+3。在某些实施方案中，所述N-端干区段的末尾是Ap+4，且所述C-端干区段的起点是Aq+4。在某些实施方案中，所述N-端干区段的末尾是Ap+5，且所述C-端干区段的起点是Aq+5。
[0249]在某些实施方案中，所述N-端干区段的末尾是Alri，且所述C-端干区段的起点是Aq+1。在某些实施方案中，所述N-端干区段的末尾是Ap_2，且所述C-端干区段的起点是Aq+2。在某些实施方案中，所述N-端干区段的末尾是Ap_3，且所述C-端干区段的起点是Aq+3。在某些实施方案中，所述N-端干区段的末尾是Ap_4，且所述C-端干区段的起点是Aq+4。在某些实施方案中，所述N-端干区段的末尾是Ap_5，且所述C-端干区段的起点是Aq+5。
[0250]在某些实施方案中，所述N-端干区段的末尾是Ap+1，且所述C-端干区段的起点是A,+在某些实施方案中，所述N-端干区段的末尾是Ap+2，且所述C-端干区段的起点是Aq_2。在某些实施方案中，所述N-端干区段的末尾是Ap+3，且所述C-端干区段的起点是Atr3t5在某些实施方案中，所述N-端干区段的末尾是Ap+4，且所述C-端干区段的起点是Atr4t5在某些实施方案中，所述N-端干区段的末尾是Ap+5，且所述C-端干区段的起点是Ar50
[0251]本文也提供的是包含缺失形式的HAlC-端干区段的流感血细胞凝集素干结构域多肽，其中至多 100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、
6、5、4、3、2或I个氨基酸残基从所述HAlC-端干区段的任一个或两个末端缺失。本文也提供的是包含缺失形式的已知流感血细胞凝集素干结构域的流感血细胞凝集素干结构域多肽，其中约 1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90 或 90-100 个氨基酸残基从所述干结构域中缺失。在某些实施方案中，本文提供的是包含扩展形式的HAlC-端干区段的流感血细胞凝集素干结构域多肽，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个残基被添加到所述HAlC-端干区段的N-末端；这些添加的残基可来源于与HAlC-端干区段毗邻的球状头结构域的氨基酸序列。在多个特别的实施方案中，如果一个残基被添加到所述C-端干区段，那么一个残基被添加到所述N-端干区段；如果两个残基被添加到所述C-端干区段，那么两个残基被添加到所述N-端干区段；如果三个残基被添加到所述C-端干区段，那么三个残基被添加到所述N-端干区段。本文进一步提供的是包含改变形式的HAlC-端干区段的流感血细胞凝集素干结构域多肽，其中至多约80、75、7065、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或I个氨基酸残基用其它氨基酸保守取代。本文也提供的是包含改变形式的HAlC-端干区段的流感血细胞凝集素干结构域多肽，其中所述HAlC-端干区段的至多约 1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90 或 90-100 个氨基酸残基用其它氨基酸取代(例如，保守取代)。进一步提供的是包含缺失的和改变的HAlC-端干区段的流感血细胞凝集素干结构域多肽。在某些实施方案中，所述C-端干区段包含或多个(or more)修饰的糖基化位点。在某些实施方案中,所述N-端干区段包含或多个(or more)修饰的糖基化位点。在其它的实施方案中，所述C-端干区段和N-端干区段包含一个或多个修饰的糖基化位点。
[0252]在某些实施方案中，本文提供的流感血细胞凝集素干结构域多肽包含HAl亚单位的干结构域的嵌合体/杂合体。HAl亚单位的干结构域的嵌合体可包含第一种流感病毒毒株或亚型的 HAl 亚单位的干结构域的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、60、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、75、75、76、77、78、79或80个氨基酸，而所述HAl亚单位的干结构域的嵌合体的剩余氨基酸可来自第二种流感病毒毒株或亚型。在某些实施方案中，所述HAl亚单位的干结构域的嵌合体包含第一种流感病毒毒株或亚型的HAl亚单位的干结构域的1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90 或 90-100 个氨基酸，而所述 HAl 亚单位的干结构域的嵌合体的剩余氨基酸是来自第二种流感病毒毒株或亚型。在某些实施方案中，本文提供的流感血细胞凝集素干结构域多肽包含HA2亚单位和HAl亚单位的干结构域的嵌合体。在某些实施方案中，所述流感血细胞凝集素干结构域多肽包含HAl亚单位的干结构域的嵌合体/杂合体，其中一个或多个天然存在的糖基化位点已被修饰使得该修饰破坏聚糖附着到所述修饰的糖基化位点的能力，如描述于第5.4.1节，参见下文。虽然不受任何具体操作理论的束缚，但是相信在所述干结构域里面的免疫原性和可及性抗原性区域可通过以在该位点破坏糖基化(即，聚糖的附着)的方式修饰所述干结构域里面的一个或多个糖基化位点而增加。
[0253]所述流感血细胞凝集素干结构域多肽可基于技术人员已知的或后来发现的任何流感血细胞凝集素(即，可具有序列同一性，如上所述)。在某些实施方案中，流感血细胞凝集素干结构域多肽基于甲型流感血细胞凝集素。在某些实施方案中，所述流感血细胞凝集素干结构域多肽基于选自 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16和H17的甲型流感血细胞凝集素。在某些实施方案中，流感血细胞凝集素干结构域多肽基于乙型流感血细胞凝集素，如下文详细描述的。
[0254]所述HAlN-端干区段可基于技术人员已知的或后来发现的任何HAlN-端干区段(即，可具有序列同一性，如上所述)。在某些实施方案中，所述HAlN-端干区段基于甲型流感HAlN-端干区段。在某些实施方案中，所述HAlN-端干区段基于选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 和 H17 的甲型流感血细胞凝集素。在某些实施方案中，所述HAlN-端干区段选自SEQ ID N0S:34-490在某些实施方案中，所述HAlN-端干区段选自SEQ ID N0S: 34-49，各自具有一个氨基酸从其C-末端缺失。在某些实施方案中，所述HAlN-端干区段选自SEQ ID NOS: 34-49，各自具有两个氨基酸从其C-末端缺失。在某些实施方案中，所述HAlN-端干区段选自SEQ ID N0S: 34-49，各自具有三个氨基酸从其C-末端缺失。在某些实施方案中，所述HAlN-端干区段选自SEQ ID NOS:34-49,各自具有四个氨基酸从其C-末端缺失。在某些实施方案中，所述HAlN-端干区段选自SEQID N0S: 34-49，各自具有五个氨基酸从其C-末端缺失。在某些实施方案中，所述HAlN-端干区段选自SEQ ID N0S:177-224。在某些实施方案中，所述HAlN-端干区段是或基于AnnArbor/6/60> A/Puerto Rico/8/34 或 A/Perth/16/2009 流感病毒的 HA-1N-端干区段。
[0255]所述HAlC-端干区段可基于技术人员已知的或后来发现的任何HAlC-端干区段(即，可具有序列同一性，如上所述)。在某些实施方案中，所述HAlC-端干区段基于甲型流感HAlC-端干区段。在某些实施方案中，所述HAlC-端干区段基于选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 和 H17 的甲型流感血细胞凝集素。在某些实施方案中，所述HAlC-端干区段选自SEQ ID NOS:50-650在某些实施方案中，所述HAlC-端干区段选自SEQ ID N0S: 50-65，各自具有一个氨基酸从其N-末端缺失。在某些实施方案中，所述HAlC-端干区段选自SEQ ID N0S: 50-65，各自具有两个氨基酸从其N-末端缺失。在某些实施方案中，所述HAlC-端干区段选自SEQ ID N0S: 50-65，各自具有三个氨基酸从其N-末端缺失。在某些实施方案中，所述HAlC-端干区段选自SEQ ID NOS:50-65,各自具有四个氨基酸从其N-末端缺失。在某些实施方案中，所述HAlC-端干区段选自SEQID N0S: 50-65，各自具有五个氨基酸从其N-末端缺失。在某些实施方案中，所述HAlC-端干区段选自SEQ ID N0S:226-2730在某些实施方案中，所述HAlC-端干区段是或基于AnnArbor/6/60> A/Puerto Rico/8/34 或 A/Perth/16/2009 流感病毒的 HA-1N-端干区段。
[0256]所述HA2干结构域可基于技术人员已知的或后来发现的任何HA2干结构域(即，可具有序列同一性，如上所述)。在某些实施方案中，所述HA2干结构域基于甲型流感HA2干结构域。在某些实施方案中，所述HA2干结构域基于选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16和H17的甲型流感血细胞凝集素。在某些实施方案中，所述HA2干结构域选自SEQ ID N0S:66-970在某些实施方案中，所述HA2干结构域是或基于 A/Ann Arbor/6/60-1 ike>A/Puerto Rico/8/1934-1 ike>A/Perth/16/2009-1 ike>A/Cali fornia/07/2009-1 ike > A/Brisbane/59/07-1 ike > A/New Cal edoni a/20/1999-1 ike 或A/Victoria/361/201-like流感病毒的HA干结构域。在某些实施方案中，所述HA2干结构域是或基于后来发现的HA2干结构域。
[0257]在某些实施方案中，所述HA2干结构域是来自与所述HAl亚单位的干结构域相同的流感病毒毒株或亚型。
[0258]在包含信号肽的多个实施方案中，所述信号肽可基于本领域技术人员已知的任何流感病毒信号肽。在某些实施方案中，所述信号肽基于甲型流感信号肽。在某些实施方案中，所述信号肽基于选自 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 和H16的甲型流感血细胞凝集素。在某些实施方案中，所述信号肽可以是本领域技术人员认为有用的任何信号肽。在某些实施方案中，所述信号肽选自SEQ ID N0S: 18-33。
[0259]在包含胞腔结构域的多个实施方案中，所述胞腔结构域可基于本领域技术人员已知的任何流感胞腔结构域。在某些实施方案中，所述胞腔结构域基于甲型流感胞腔结构域。在某些实施方案中，所述HA2胞腔结构域基于选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16和H17的甲型流感血细胞凝集素。在某些实施方案中，所述胞腔结构域可以是本领域技术人员认为有用的任何胞腔结构域。在某些实施方案中，所述胞腔结构域选自SEQ ID N0S:98-113。在某些实施方案中，所述胞腔结构域是来自与所述HA2亚单位的干结构域相同的流感病毒毒株或亚型。
[0260]在某些实施方案中，所述细胞质结构域、跨膜结构域和胞腔结构域是来自与所述HA2亚单位的干结构域相同的流感病毒毒株或亚型。在其它的实施方案中，所述细胞质结构域和跨膜结构域是来自与所述HA2亚单位的干结构域相同的流感病毒毒株或亚型。在某些实施方案中，所述细胞质结构域和胞腔结构域是来自与所述HA2亚单位的干结构域相同的流感病毒毒株或亚型。
[0261]在包含跨膜结构域的多个实施方案中，所述跨膜结构域可基于本领域技术人员已知的任何流感跨膜结构域。在某些实施方案中，所述跨膜结构域基于甲型流感跨膜结构域。在某些实施方案中，所述HA2跨膜结构域基于选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16和H17的甲型流感血细胞凝集素。在某些实施方案中，所述跨膜结构域可以是本领域技术人员认为有用的任何跨膜结构域。在某些实施方案中，所述跨膜结构域选自SEQ ID NOS: 114-129。在某些实施方案中，所述跨膜结构域是来自与所述HA2亚单位的干结构域相同的流感病毒毒株或亚型。
[0262]在包含细胞质结构域的多个实施方案中，所述细胞质结构域可基于本领域技术人员已知的任何流感细胞质结构域。在某些实施方案中，所述细胞质结构域基于甲型流感细胞质结构域。在某些实施方案中，所述HA2细胞质结构域基于选自Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16和H17的甲型流感血细胞凝集素。在某些实施方案中，所述细胞质结构域可以是本领域技术人员认为有用的任何细胞质结构域。在某些实施方案中，所述细胞质结构域选自SEQ ID N0S: 130-145。在某些实施方案中，所述细胞质结构域是来自与所述HA2亚单位的干结构域相同的流感病毒毒株或亚型。
[0263]在某些实施方案中，所述血细胞凝集素干结构域的糖基化位点中的一个或多个被修饰(例如，通过氨基酸添加、缺失或取代)使得这些位点上的糖基化在多肽的加工和成熟期间将不会发生。本领域技术人员将认识到，流感HA典型地包含一个或多个糖基化位点(例如Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys，其中Xaa是任意氨基酸，或者，在某些实施方案中，其中Xaa是Pro除外的任意氨基酸)。在某些实施方案中，糖基化位点中的一个或多个氨基酸残基用破坏所述糖基化位点的氨基酸残基保守取代。在某些实施方案中，糖基化位点中的一个或多个氨基酸残基用破坏所述糖基化位点的任意氨基酸残基取代。在某些实施方案中，糖基化序列中的一个或多个天冬酰胺残基用丙氨酸取代。在一个特别的实施方案中，H3血细胞凝集素的位置38的天冬酰胺被改变成丙氨酸。在某些实施方案中，所述血细胞凝集素干结构域包含一个或多个修饰的糖基化位点，如在下文第5.4.1节所论述的。
[0264]下面的表I标识了甲型流感血细胞凝集素多肽的信号肽、HAlN-端干区段、HAlC-端干区段和HA2结构域。这些信号肽、干区段和结构域均可用于本文描述的多肽和方法中。
[0265]表1.示例性的甲型流感血细胞凝集素序列
[0266] HA亚型信号肽 HAl N-端千& HAI C-端干U HA2结构域
(Genbank段段
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[SEQ ID NO;68]
[0268]
【权利要求】
1.嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽，包含HA干结构域和HA球状头结构域，其中所述HA球状头结构域对所述HA干结构域是异源的。
2.嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽，包含季节性流感病毒毒株的HA干结构域和异源流感病毒毒株的HA球状头结构域。
3.权利要求1或2的嵌合的流感病毒HA多肽，其中所述HA干结构域维持在图1中命名为Ap和Aq的半胱氨酸残基。
4.权利要求1或2的嵌合的流感病毒HA多肽，其中所述HA干结构域是亚型Hl的流感病毒的HA干结构域。
5.权利要求1或2的嵌合的流感病毒HA多肽，其中所述HA干结构域是亚型H3的流感病毒的HA干结构域。
6.权利要求4的嵌合的流感病毒HA多肽，其中所述HA球状头结构域是亚型H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hl1、H12、H13、H14、H15、H16 或 H17 的流感病毒的 HA 球状头结构域。
7.权利要求5的嵌合的流感病毒HA多肽，其中所述HA球状头结构域是亚型H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 或 H17 的流感病毒的 HA 球状头结构域。
8.权利要求6的嵌合的流感病毒HA多肽，其中所述HA球状头结构域是亚型H5、H6、H8、H9、Hll、H12、H13或H16的流感病毒的HA球状头结构域。
9.权利要求7的嵌合的流感病毒HA多肽，其中所述HA球状头结构域是亚型H4、H7、H10、H14或H15的流感病毒的HA球状头结构域。
10.核酸，其编码权利要求1-9中任一项的多肽。
11.细胞，其表达权利要求10的核酸。
12.病毒，其包含经工程改造以表达权利要求10的核酸的基因组。
13.病毒，其包含权利要求1-9中任一项的多肽。
14.权利要求12的病毒，其中所述病毒是流感病毒。
15.权利要求13的病毒，其中所述病毒是流感病毒。
16.权利要求14的病毒，它是灭活的或裂解的。
17.权利要求15的病毒，它是灭活的或裂解的。
18.病毒样颗粒，包含权利要求1-9中任一项的多肽。
19.免疫原性组合物，包含权利要求1-9中任一项的多肽。
20.免疫原性组合物，包含权利要求12的病毒。
21.免疫原性组合物，包含权利要求13的病毒。
22.免疫原性组合物，包含权利要求14的病毒。
23.免疫原性组合物，包含权利要求15的病毒。
24.免疫原性组合物，包含权利要求18的病毒样颗粒。
25.给对象实施免疫的方法，包括给予所述对象有效量的权利要求19的免疫原性组合物。
26.给对象实施免疫的方法，包括给予所述对象有效量的权利要求20的免疫原性组合物。
27.给对象实施免疫的方法，包括给予所述对象有效量的权利要求21的免疫原性组合物。
28.给对象实施免疫的方法，包括给予所述对象有效量的权利要求22的免疫原性组合物。
29.给对象实施免疫的方法，包括给予所述对象有效量的权利要求23的免疫原性组合物。
30.给对象实施免疫的方法，包括给予所述对象有效量的权利要求24的免疫原性组合物。
31.权利要求25的方法，其中所述对象是人。
32.权利要求26的方法，其中所述对象是人。
33.权利要求27的方法，其中所述对象是人。
34.权利要求28的方法，其中所述对象是人。
35.权利要求29的方法，其中所述对象是人。
36.权利要求30的方法，其中所述对象是人。
37.权利要求25的方法，其中所述免疫原性组合物经肌内或鼻内给予所述对象。
38.预防流感病毒疾病的方法，包括给予对象有效量的权利要求25的免疫原性组合物。
39.治疗流感病毒感染或流感病毒疾病的方法，包括给予对象有效量的权利要求25的免疫原性组合物。
40.预防流感病毒疾病的方法，包括给予对象有效量的权利要求25的免疫原性组合物。
41.预防流感病毒疾病的方法，包括给予对象有效量的权利要求25的免疫原性组合物。
42.权利要求26的方法，其中所述免疫原性组合物经肌内或鼻内给予所述对象。
43.预防流感病毒疾病的方法，包括给予对象有效量的权利要求26的免疫原性组合物。
44.治疗流感病毒感染或流感病毒疾病的方法，包括给予对象有效量的权利要求26的免疫原性组合物。
45.预防流感病毒疾病的方法，包括给予对象有效量的权利要求26的免疫原性组合物。
46.预防流感病毒疾病的方法，包括给予对象有效量的权利要求26的免疫原性组合物。
47.预防对象的流感病毒疾病或感染的方法，包括给予所述对象流感病毒血细胞凝集素多肽，该对象对于所述多肽来说是原初的。
48.权利要求47的方法，其中所述流感病毒血细胞凝集素多肽是来自亚型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 和 / 或 H17 的流感病毒。
49.权利要求48的方法，包括给予所述对象第二种流感病毒血细胞凝集素多肽，该对象对于所述多肽来说是原初的，其中所述第二种流感病毒血细胞凝集素多肽是来自亚型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16 和 / 或 H17 的流感病毒，和其中第一次和第二次给药的所述流感病毒血细胞凝集素多肽是来自不同的流感病毒亚型。
50.权利要求49的方法，包括给予所述对象第三种流感病毒血细胞凝集素多肽，该对象对于所述多肽来说是原初的，其中所述第三种流感病毒血细胞凝集素多肽是来自亚型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 和 / 或 H17 的流感病毒，和其中第一次、第二次和第三次给药的所述流感病毒血细胞凝集素多肽是来自不同的流感病毒亚型。
51.预防对象的流感病毒疾病或感染的方法，包括给予所述对象流感病毒，其中所述流感病毒包含血细胞凝集素多肽，该对象对于所述多肽来说是原初的。
52.权利要求51的方法，其中所述流感病毒血细胞凝集素多肽是来自亚型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 和 / 或 H17 的流感病毒。
53.权利要求52的方法，包括给予所述对象第二种流感病毒，其中所述第二种流感病毒包含血细胞凝集素多肽，该对象对于所述多肽来说是原初的；其中所述第二种流感病毒的所述血细胞凝集素多肽是来自亚型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、HlU H12、H13、H14、H15、H16和/或H17的流感病毒；和其中第一次和第二次给药的所述流感病毒血细胞凝集素多肽是来自不同的流感病毒亚型。
54.权利要求53的方法，包括给予所述对象第三种流感病毒，其中所述第三种流感病毒包含血细胞凝集素多肽，该对象对于所述多肽来说是原初的；其中所述第三种流感病毒的血细胞凝集素多肽是来自亚型 H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16和/或H17的流感病毒；和其中第一次、第二次和第三次给药的所述流感病毒血细胞凝集素多肽是来自不同的流感病毒亚型。
55.嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽，包含HA干结构域和HA球状头结构域，其中所述HA球状头结构域对所述HA干结构域是异源的，其中所述HA干结构域包含至少一个修饰的糖基化位点，其中所述修饰的糖基化位点包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位点的修饰，和其中所述修饰破坏聚糖附着到所述修饰的糖基化位点的能力，和其中Xaa是任意氨基酸。
56.权利要求55的嵌合的流感病毒HA多肽，其中所述修饰包含所述天然存在的糖基化位点中的一个或多个氨基酸取代。
57.权利要求55的嵌合的流感病毒HA多肽，其中根据H3编号系统，所述修饰的糖基化位点位于选自氨基酸位置 20-22、21-23、33-35、46-48、289-291、290-292、296-298 和481-483的氨基酸位置，其中所述撤干结构域是来自亚型!11、!12、册、册、!18、!19、!111、!112、H13和H16的流感病毒的HA干结构域。
58.权利要求55的嵌合的流感病毒HA多肽，其中根据H3编号系统，所述修饰的糖基化位点位于选自氨基酸位置8-10、22-24、38-40、46-48、296-298、410-412和481-483的氨基酸位置，其中所述HA干结构域是来自亚型H3、H4、H7、H10、H14或H15的流感病毒的HA干结构域。
59.权利要求55-58中任一项的嵌合的流感病毒HA多肽，其中所述HA球状头结构域还包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的一个或多个非天然存在的糖基化位点,其中Xaa是任意氨基酸。
60.权利要求59的嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽，其中所述HA球状头结构域是流感病毒Hl亚型的HA球状头结构域和其中所述非天然存在的糖基化位点位于Sa、Sb、Ca或Cb抗原性位点中；或其中所述HA球状头结构域是流感病毒H3亚型和其中所述非天然存在的糖基化位点位于A、B、C或D抗原性位点中。
61.权利要求59的嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽，其中根据H3编号，所述非天然存在的糖基化位点是在血细胞凝集素氨基酸位置59-61、129-131、158-160或165-167上。
62.嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽，包含HA干结构域和HA球状头结构域，其中所述HA球状头结构域对所述HA干结构域是异源的，和其中所述HA球状头结构域包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的一个或多个非天然存在的糖基化位点,和其中Xaa是任意氨基酸。
63.非嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽，包含HA干结构域和HA球状头结构域，其中所述HA球状头结构域与所述HA干结构域同源，其中所述HA干结构域包含一个或多个修饰的糖基化位点，其中所述修饰的糖基化位点包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位点的修饰，和其中所述修饰破坏聚糖附着到所述修饰的糖基化位点的能力，其中Xaa是任意氨基酸。
64.权利要求63的非嵌合的流感病毒HA多肽，其中所述HA球状头结构域还包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的一个或多个非天然存在的糖基化位点,其中Xaa是任意氨基酸。
65.权利要求64的非嵌合的流感病毒血细胞凝集素多肽，其中所述HA球状头结构域是流感病毒Hl亚型的HA球状头结构域和其中所述非天然存在的糖基化位点位于Sa、Sb、Ca或Cb抗原性位点中；或其中所述HA球状头结构域是流感病毒H3亚型和其中所述非天然存在的糖基化位点位于A、B、C或D抗原性位点中。
66.权利要求64或65的非嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽，其中根据H3编号，所述非天然存在的糖基化位点是在血细胞凝集素氨基酸位置59-61、81-83、129-131、143-145、158-160 和 / 或 165-167、170-172、187-189、193-195、197_199、208_210 上。
67.流感病毒血细胞凝集素(HA)干结构域多肽，包含: a.流感血细胞凝集素HAl结构域，其包含HAlN-端干区段共价连接于1_50个异源残基的接头，所述接头又共价连接于HAl C-端短干区段；所述HAl结构域与 b.流感血细胞凝集素HA2结构域以三级或四级缔合， 其中所述流感病毒HA干结构域多肽结构域还包含一个或多个修饰的糖基化位点，其中所述修饰的糖基化位点包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位点的修饰，其中所述修饰破坏聚糖附着到所述修饰的糖基化位点的能力，和其中Xaa是任意氨基酸。
68.流感病毒血细胞凝集素(HA)干结构域多肽，包含: a.流感血细胞凝集素HAl结构域，其包含HAlN-端长干区段共价连接于1_50个异源残基的接头，所述接头又共价连接于HAl C-端长干区段；所述HAl结构域与 b.流感血细胞凝集素HA2结构域以三级或四级缔合， 其中所述流感病毒HA干结构域多肽结构域还包含一个或多个修饰的糖基化位点，其中所述修饰的糖基化位点包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位点的修饰，其中所述修饰破坏聚糖附着到所述修饰的糖基化位点的能力，和其中Xaa是任意氨基酸。
69.流感病毒血细胞凝集素(HA)干结构域多肽，包含: a.流感血细胞凝集素HAl结构域，其包含HAlN-端干区段共价连接于1_50个异源残基的接头，所述接头又共价连接于HAl C-端干区段；所述HAl结构域与 b.流感血细胞凝集素HA2结构域以三级或四级缔合， 其中所述流感病毒HA干结构域多肽结构域还包含一个或多个修饰的糖基化位点，其中所述修饰的糖基化位点包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位点的修饰，其中所述修饰破坏聚糖附着到所述修饰的糖基化位点的能力，和其中Xaa是任意氨基酸。
70.流感病毒血细胞凝集素(HA)干结构域多肽，包含: a.流感血细胞凝集素HAl结构域，其包含按顺序连接的HAlN-端干区段、1_50个异源残基的第一接头、HAl中间干区段、1-50个异源残基的第二接头和HAl C-端干区段；所述HAl结构域与 b.流感血细胞凝集素HA2结构域以三级或四级缔合， 其中所述流感病毒血细胞凝集素(HA)干结构域多肽结构域还包含一个或多个修饰的糖基化位点，其中所述修饰的糖基化位点包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位点的修饰，其中所述修饰破坏聚糖附着到所述修饰的糖基化位点的能力，和其中Xaa是任意氨基酸。
71.权利要求68-71中任一项的流感病毒血细胞凝集素(HA)干结构域多肽，其中根据H3编号系统，所述修饰的糖基化位点位于选自氨基酸位置20-22、21-23、33-35、46-48、289-291,290-292,296-298和481-483的氨基酸位置，其中所述HA干结构域是来自亚型H1、H2、H5、H6、H8、H9、Hll、H12、H13 和 H16 的流感病毒的 HA 干结构域。
72.权利要求68-71中任一项的流感病毒血细胞凝集素(HA)干结构域多肽，其中根据H3编号系统，所述修饰的糖基化位点位于选自氨基酸位置8-10、22-24、38-40、46-48、296-298,410-412和481-483的氨基酸位置，其中所述HA干结构域是来自亚型H3、H4、H7、H10、H14、H15的流感病毒的HA干结构域。
73.权利要求1-9或55-72中任一项的HA多肽，其中所述多肽是可溶的。
74.核酸，其编码权利要求55-62中任一项的多肽。
75.核酸,其编码权利要求63-66中任一项的多肽。
76.细胞，其表达权利要求74的核酸。
77.细胞，其表达权利要求75的核酸。
78.病毒,其包含权利要求55-62中任一项的嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽。
79.病毒,其包含权利要求63-66中任一项的嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽。
80.免疫原性组合物，包含权利要求55-62中任一项的嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽。
81.免疫原性组合物，包含权利要求63-66中任一项的嵌合的流感病毒血细胞凝集素(HA)多肽。
82.给对象实施免疫的方法，包括给予所述对象有效量的权利要求80的免疫原性组合物。
83.给对象实施免疫的方法，包括给予所述对象有效量的权利要求81的免疫原性组合物。
84.权利要求82的方法，其中所述对象是人。
85.权利要求83的方法，其中所述对象是人。
【文档编号】A61K39/145GK104185476SQ201280057023
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2012年9月19日 优先权日:2011年9月20日
【发明者】阿道夫·加西亚-塞斯特, 彼得·帕雷斯, 佛罗莱恩·克拉默, 纳塔利·皮卡, 德克·艾根克, 拉法尔·A·麦迪纳-席尔瓦, 海容 申请人:西奈山医学院