用于血细胞产生的修饰细胞的制作方法
【专利说明】用于血细胞产生的修饰细胞
【背景技术】
[0001] 输血疗法通常设及移植血红细胞(RBC)、血小板等。虽然输血可W使用自己的血 (自体输血），但更常见的是使用他人的血(异体(allogeneic)或同源化omologous)输血）。 使用另一个人的血W献血开始，而且最常见的是血液作为全血经由静脉捐献并用抗凝血剂 收集该血液。然而，使用他人的血可能具有不可预知的不良结果，其中许多不良结果可W分 为免疫反应或传染性反应。例如，免疫反应可W包括急性溶血反应、迟发溶血反应、非溶血 性发热反应等。此外，捐献的全血可能包含有害的病毒或航病毒，对此难W进行彻底的预 防。因此，本领域需要减少或防止与输血有关的不可预知的不良结果的方法和技术。
【发明内容】
[0002] 本发明的实施方案设及一种基因修饰细胞，所述基因修饰细胞含有血型抗原 (BGA)生物合成或运输路径的一个或多个基因的完全或部分基因缺失。
[0003] 本发明的实施方案还设及一种产生基因修饰细胞的方法。所述方法可W包含在培 养基中培养修饰干细胞，所述修饰干细胞含有血型抗原(BGA)生物合成或运输路径的一个 或多个基因的完全或部分基因缺失。
[0004] 本发明的实施方案还设及一种产生血液替代品的方法。所述方法可W包含在培养 基中培养修饰干细胞，所述修饰干细胞含有血型抗原(BGA)生物合成或运输路径的一个或 多个基因的完全或部分基因缺失。然后可W使所述修饰干细胞分化，W产生相比于对应的 野生型细胞血型抗原的量减少的修饰血细胞。
[0005] 在本发明的方法和/或组合物的一些实施方案中，所述修饰细胞可W包含基因修 饰的造血干细胞或基因修饰的红系祖细胞。在某些实施方案中，所述修饰细胞可W包括基 因修饰的干细胞。在具体的实施方案中，所述修饰细胞可W包括基因修饰的胚胎干细胞或 基因修饰的诱导多能干细胞。
[0006] 在本发明的方法和/或组合物的一些实施方案中，所述修饰细胞可W分化成血细 胞。在某些实施方案中，相比于对应的野生型血细胞，所述血细胞可W具有量减少的血型抗 原。在具体的实施方案中，相比于对应的野生型血细胞，所述血细胞可W具有血型抗原生物 合成或运输路径的一个或多个基因的减少的表达。例如，相比于对应的野生型血细胞，所述 血细胞在修饰细胞中积聚的血型抗原的量减少。例如，相比于对应的野生型血细胞，所述血 细胞在修饰细胞上具有的血型抗原的量减少。例如，相比于对应的野生型血细胞，所述血细 胞具有的与修饰细胞的膜相关的血型抗原的量减少。
[0007] 在本发明的方法和/或组合物的一些实施方案中，相比于对应的野生型细胞，来源 于所述修饰细胞的红细胞响应于输血的免疫原性降低。在某些实施方案中，所述降低的免 疫原性包括相比于对应的野生型细胞由修饰细胞诱导的降低的免疫应答水平。例如，由修 饰干细胞诱导的免疫应答水平基本上小于由对应的野生型细胞诱导的免疫应答水平。在某 些实施方案中，在修饰细胞的注入开始后的特定时间测定由修饰干细胞诱导的免疫应答水 平。
[000引在本发明的方法和/或组合物的一些实施方案中，所述血型抗原包括化血型抗原 或AB0血型抗原。在一些实施方案中，所述血型抗原包括与MNSsU、Pl、Lutheran、Kell、 Lewis、Duffy、Kidd、Diego、Cartwright、Dombrock、Colton、Scianna、Xga、I/i、Augustine、 Cromer、Ena、Gerbich、Gregory、Holley、Jacobs Joseph、Lngereis、0ka、Vel、Chido、 Rodgers、Cost-Stirling、York、Knops-Helgeson、McCoy、John Milton Hagen、Ahonen、 Batty、Biles、Bishop、Box、Chra、Dantu、Froese、Good、Griffiths、Heibel、Hey、Hov、Hunt、 Jensen、Jna、Lewis II、Livesey、Mitche1、Moen、0rriss、Peters、Radin、RedeIberger、 Reid、Rosennlund、Swann、Torkiidsen、Traversu、Webb、W;ri曲t、Wulfsberg或Bg相关的至少 一种或多种抗原。
[0009] 本
【发明内容】
用于W简化的形式引入所选择的概念，W下在【具体实施方式】中进一步 描述所述概念。本
【发明内容】
并非旨在确定要求保护的主题的关键特征或必要特征，亦非旨 在用于限制要求保护的主题的范围。
【附图说明】
[0010] 图巧出了采用转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)的修饰细胞。第一行是标准 序列，而其他行是突变序列。虚线代替了由突变引起的缺失。
[0011] 图2示出了测序结果的色谱图。黑色直线的右侧的峰彼此重叠，表明由移码突变引 起的基因组序列的异质性。
【具体实施方式】
[0012] 莖述
[0013] 明的实施方案公开了一种设及使用基因修饰干细胞作为生产血液替代品的 资源的方法，如红细胞(RBC)、血浆、血清等。本发明部分设及证明诸如胚胎干细胞、诱导多 能干细胞等的干细胞可被基因修饰并分化为血液替代品，如红细胞、白细胞等。例如，如随 附的示例所示，基因修饰细胞可W被修饰成含有血型抗原(BGA)生物合成或运输路径的一 个或多个基因的完全或部分基因缺失。血型抗原的例子可包括化血型抗原或AB0血型抗原。
[0014] 相关定义
[0015] 除非另行定义，文中所使用的所有科技术语与本发明所属技术领域的普通技术人 员所知晓的意义相同。虽然任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明 的实施或测试中，优选的方法和材料如本文所描述。为了本发明的目的，下述术语定义如 下。
[0016] 文中所用的术语"一"是指"一"或"多于一"（即"至少一"）个/种本文的语法对象。 例如，"一个/种元素"指一个/种元素或多于一个/种元素。
[0017] 术语"大约/錄'是指总数、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或 长度与参照总数、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度相比变化达 30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。
[001引术语"生物活性片段"，用于参照多核巧酸或多肤序列的片段，指的是一个片段，其 具有至少约 0.1、0.5、1、2、5、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、 65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100、110、120、150、200、300、400、500、600、700、800、 900、1000%或更高的参照序列活性。术语"参照序列"通常是指用于与另一个序列比较的核 酸编码序列或者氨基酸序列。序列表中所提供的全部序列也被列入作为参照序列。
[0019] 术语"生物活性变体"，用于参照多核巧酸或多肤序列的变体，指的是一种变体，其 具有至少约 0.1、0.5、1、2、5、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、 65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100、110、120、150、200、300、400、500、600、700、800、 900、1000%或更高的参照序列活性(例如酶活性）。术语"参照序列"通常是指用于与另一个 序列比较的核酸编码序列或者氨基酸序列。术语"变体"包括生物活性变体，其也可W称作 功能变体。
[0020] 本发明的范围包含的生物活性片段长度至少为约18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、 320、340、360、380、400、500、600或更多的连续的核巧酸或氨基酸残基，包括在中间的所有 整数，其包括或编码具有参照多核巧酸或多肤的活性的多肤。典型的生物活性片段和变体 通常参与相互作用，例如，分子内或分子间的相互作用。分子间的相互作用可W是特异性结 合的相互作用或酶的相互作用。酶的相互作用或活性的示例包括但不限于糖基转移酶活 性、岩藻糖基转移酶活性、W及在本文中描述的其他酶活性。
[0021] 术语"血细胞"指的是红细胞(RBC)、白细胞、血小板、或其他血细胞中的至少一种。 例如，红细胞是通过循环系统的血液流动将氧气(〇2)输送到身体组织的血细胞。白细胞是 免疫系统的细胞，其参与保护身体免受传染性疾病和外来物质的损害。血小板是参与止血 的细胞，其导致形成血凝块。
[0022] 术语"血液替代品"指的是一种组合物，其可用于实施、模拟和/或实现红细胞 (RBC)、血浆、血清、或生物血的其他成分中的至少一种的一种或多种机能。在一些实施方案 中，血液替代品可来源于干细胞。例如，胚胎干细胞可分化为造血干细胞，其可进一步分化 为红系祖细胞、骨髓细胞、B细胞谱系等，例如，其可用于在体外产生红细胞。运些在体外产 生的红细胞可作为血液替代品用于输血。
[0023] 术语"血型抗原"是指可附接至红细胞膜中各种组分的物质（如糖、蛋白质等）。在 一些实施方案中，血型抗原可包括存在于红细胞表面上的蛋白质或多肤抗原。例如，化血型 抗原可包括D抗原、C抗原、C抗原、E抗原、e抗原或任何其他相关的化抗原。在一些实施方案 中，血型抗原可包括由一系列反应产生的糖抗原(如多糖或碳水化合物），在运些反应中，酶 催化相应糖单元的转移。例如，AB0血型抗原可包括A抗原、B抗原、A1抗原，或任何其他相关 的AB0抗原。
[0024] 术语"抗(血型抗原)抗体"是指一种抗体，其可特异性地识别并结合至存在于红细 胞表面上的抗原。例如，抗Rh抗体可包括抗D抗体、抗讨亢体、抗C抗体、抗E抗体、抗e抗体，或 任何其他相关的加抗体。例如，抗AB0抗体可包括抗A、抗B、抗A1，或任何其他相关的AB0抗 体。
[00巧]除了所述的两种主要的血型系统（即AB0和化)之外，还已知W下的血型抗原系统， 其也被视为包含在本发明的范围内：MNSsU、Pl、Lutheran、Kell、Lewis、Duffy、Kidd、Diego、 Cartwright、Dombrock、CoIton、Scianna、Xga、I/i、Augustine、Cromer、Ena、Gerbich、 Gregory、Holley、Jacobs、Joseph