座子中的DNA。通常，该载体的选择将取决于被引入到其 中的载体与宿主细胞的载体的相容性。在本情况下，优选地，载体是在干细胞中能够行使功 能的，如质粒。该载体可W包括报告基因，如绿色巧光蛋白（GFP)，其既可W在框中融合到一 个或多个编码的多肤，也可W独立表达。该载体还可W包括选择标记，如抗生素抗性基因， 其可W用于选择合适的转化体。
[0067] 术语"野生型"是指，从自然产生的基因中分离出来的基因或者基因产物。一个野 生型的基因或基因产物(如一段多肤)是在野生群体中观察到的最高频率的表型，因此也是 在"正常"或"野生型"的基因形式中任意定义的。
[006引示例性实施方案
[0069] 本发明的实施方案设及一种基因修饰细胞，所述基因修饰细胞包含血型抗原 (BGA)生物合成或运输路径的一个或多个基因的完全或部分基因缺失。
[0070] 本发明的实施方案还设及一种产生基因修饰细胞的方法。所述方法可W包括在培 养基中培养修饰干细胞，所述修饰干细胞包含血型抗原(BGA)生物合成和运输路径的一个 或多个基因的完全或部分基因缺失。
[0071] 本发明的实施方案还设及一种产生血液替代品的方法。所述方法可W包括在培养 基中培养修饰干细胞，所述修饰干细胞含有血型抗原(BGA)生物合成和运输路径的一个或 多个基因的完全或部分基因缺失。然后可W使所述修饰干细胞分化，W产生相比于相应的 野生型细胞血型抗原的量减少的修饰血细胞。
[0072] 在一些实施方案中，所述修饰细胞可W包括基因修饰的造血干细胞或基因修饰的 红系祖细胞。在某些实施方案中，修饰细胞可W包括基因修饰的干细胞。在具体的实施方案 中，所述修饰细胞可W包括基因修饰的胚胎干细胞或基因修饰的诱导多能干细胞。
[0073] 在一些实施方案中，可W通过多种技术来实现一个或多个基因的完全或部分基因 缺失，例如，与转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)相关的技术。TALEN是一种融合蛋白， 并且可W包括黄单胞菌属的TAL和化kKTAL(转录激活因子样)是由按一定顺序排列W识别 相应序列的若干模块组成，保证了精确分裂(见表巧日表2) dTALEN可W用在不同物种中进行 基因编辑，如斑马鱼、猪、牛、小鼠、大鼠和人的细胞。人类胚胎干细胞化ESC)可W通过TALEN 技术进行基因编辑。例如，对于血型分类来说关键的基因可W通过TALEN技术在人类胚胎干 细胞中失效，然后在没有表达对血型分类必要的抗原的情况下，将其分化成红细胞。运可W 使得相应血液制品适应许多血型的受血者。人类胚胎的增殖和扩张的特点可W解决资源问 题。同时，胚胎干细胞分化的生产方法可W避免或减轻与病原体污染相关的风险。
[0074] 在一些实施方案中，所述修饰细胞可W分化成血细胞。在某些实施方案中，相比于 对应的野生型血细胞，所述血细胞可W具有量减少的血型抗原。在具体的实施方案中，相比 于对应的野生型血细胞，所述血细胞可W具有血型抗原生物合成或运输路径的一个或多个 基因的减少表达。例如，相比于对应的野生型血细胞，所述血细胞在修饰细胞中积聚的血型 抗原的量减少。例如，相比于对应的野生型血细胞，所述血细胞在修饰细胞上具有的血型抗 原的量减少。例如，相比于对应的野生型血细胞，所述血细胞具有的与修饰细胞的膜相关的 血型抗原的量减少。
[0075]
[0078] 表 2
[0079] 在一些实施方案中，相比于对应的野生型细胞，来源于修饰细胞的红细胞具有响 应于输血的降低的免疫原性。在某些实施方案中，相比于对应的野生型细胞，所述降低的免 疫原性包括由修饰细胞诱导的降低的免疫应答水平。例如，由修饰干细胞诱导的免疫应答 水平基本上小于由对应的野生型细胞诱导的免疫应答水平。在某些实施方案中，在修饰细 胞的注入开始后的特定时间测定由修饰干细胞诱导的免疫应答水平。
[0080] 在一些实施方案中，所述血型抗原包括加血型抗原或AB0血型抗原。位于红细胞 中/上或由红细胞分泌的不同类型的抗原可W决定人类血型的几个系统(见表3)。不同血型 的人之间的输血可能引起严重的后果，如溶血。AB0和化血型系统是两种普遍公认的血型系 统。AB0血型系统可包括4、日、4日、0型和罕见的孟买型。运些类型基于位于红血细胞和血小板 中的抗原而不同。例如，红细胞中的A抗原、B抗原W及运两种的组合的测定分别表示A、B和 AB型血。Η抗原为用于A和B抗原合成的前体，W及Η抗原的保留产生0型血。对于罕见的孟买 型，Η抗原没有合成。
[0081 ] 化系统包含畑-和化+型，通过化D抗原在血细胞中的存在得W区分。应在输血期间 严格遵守配型原则。否则，来自捐助者的血细胞中的不同类型的抗原或抗体会导致抗体与 抗原间的免疫反应，W溶血甚至受血者的死亡告终。RH-在美国和亚洲的频率为1%或者更 低，而孟买型的比率小于0.0004%。
[0082] 在一些实施方案中，所述血型抗原包括与MNSsU、Pl、Lutheran、Kell、Lewis、 Duffy、Kidd、Diego、Cartwright、Dombrock、Colton、Scianna、Xga、I/i、Augustine、Cromer、 Ena、Gerbich、Gregory、Holley、Jacobs、Joseph、Lngereis、0ka、Vel、Chido、Rodgers、Cost-Stir1ing、York、Knops-HeIgeson、McCoy、JohnMilton、Hagen、Ahonen、Batty、Biles、 Bishop、Box、Chra、Dantu、Froese、Good、Griffiths、Heibel、Hey、Hov、Hunt、Jensen、Jna、 Lewis II、Livesey、Mitchel、Moen、Orriss、Peters、Radin、Redelberger、Reid、 Rosennlund、Swann、Torkiidsen、Traversu、Wet)b、Wright、Wulfsberg 或 Bg 相关的至少一种 或多种抗原。
[0083] 可W组合上述各种实施方案W提供更进一步的实施方案。如果需要使用各专利、 申请和公开的概念W提供其它实施方案，可对各实施方案的特征进行修改。
[0084]
[0085] 表 3
[0086] 可W根据上述具体描述对运些实施方案作出运些和其它改变。通常，在随后的权 利要求中，所使用的术语应当不被视为将权利要求限于本说明书和权利要求书所公开的具 体实施方案，而是应当被视为包含全部可能的实施方案，连同运些权利要求所具有的等价 方案的全部范围。因此，权利要求不受本公开内容的限制。
[0087] 实施例 [00则实施例1
[0089] 人类胚胎干细胞化ESC)的获取和基因打祀
[0090] 获得并稳定扩增hESC。进行相关分析和检测(胚胎干细胞和多能标记物、染色体组 型、碱性憐酸酶等）W确保人胚胎干细胞的适当状态。
[0091] TALEN质粒祀向基因 Η设计为与2个左结合序列与3个右结合配对，如表4所示。
[0092]
[OOW]表 4
[0094]在将结合序列转换成对应的氨基酸模块和DNA测序编码氨基酸模块后(见表1和表 2)。然后，TALEN质粒被组装并转染到293T细胞中W验证配对化1R1、L1R2、L1R3、L2R1、L2R2、 L2R3)的活性。LlRl配对引起相当高效率的突变，因而LlRl用于hESC中的祀向基因。
[00巧]实施例2
[00%] 基因 Η敲除hESC稳定细胞株的制备
[0097] L1R1质粒通过相关试剂被转染到hESC中。嚷岭霉素用于筛选用于L1质粒中存在嚷 岭霉素抗性基因的转染细胞。筛选之后，从hESC的培养基中提取嚷岭霉素进行恢复生长。然 后收集细胞混合物W制备基因组DNA。基因组DNA的PCR测序潜在区域可W验证基因 Η的打祀 是否成功。通过TALEN产生的突变可能导致测序色谱图中的"峰叠峰"，表明含有不同基因组 组成的细胞混合物（图2)。然后将细胞混合物消化成单一细胞并接种到96孔板中。在单细胞 生长到克隆后，收集足够的样本再次进行PCR测序W确认成功的基因 Η敲除克隆。扩增并保 存所选的hESC克隆。
[009引实施例3
[0099] 基因 Η敲除hESC分化为红细胞^及红细胞的鉴定
[0100] 基因修饰hESC是非粘连W形成胚状体化B)的培养物。然后结合细胞因子培养邸W 分化成造血祖细胞并最终分化成红细胞。FACS分析能够检测到红细胞表面上的Η抗原的无 效表达，并且〇、Α、Β、ΑΒ型血的血清不能凝集运些红细胞，表明源自基因修饰hESC的红细胞 能够适应0、A、B、AB型，甚至孟买型化抗原缺失)血的受血者。
【主权项】
1. 一种基因修饰细胞，其包括血型抗原(BGA)生物合成或运输路径的一个或多个基因 的完全或部分基因缺失。2. 根据权利要求1所述的基因修饰细胞，其中所述基因修饰细胞包括基因修饰的造血 干细胞。3. 根据权利要求1所述的基因修饰细胞，其中所述基因修饰细胞包括基因修饰的红系 祖细胞。4. 根据权利要求1所述的基因修饰细胞，其中所述基因修饰细胞包括基因修饰的干细 胞。5. 根据权利要求1所述的基因修饰细胞，其中所述基因修饰细胞包括基因修饰的胚胎 干细胞。6. 根据权利要求1所述的基因修饰细胞，其中所述基因修饰细胞包括基因修饰的诱导 多能干细胞。7. 根据权利要求1所述的基因修饰细胞，其中相比于对应的野生型血细胞，来源于所述 基因修饰细胞的血细胞具有量减少的血型抗原。8. 根据权利要求1所述的基因修饰细胞，其中相比于对应的野生型血细胞，来源于所述 基因修饰细胞的血细胞具有血型抗原生物合成或运输路径的一个或多个基因的减少的表 达。9. 根据权利要求1所述的基因修饰细胞，其中相比于对应的野生型细胞，来源于所述基 因修饰细胞的血细胞在所述修饰细胞中积聚的血型抗原的量减少。10. 根据权利要求1所述的基因修饰细胞，其中相比于对应的野生型细胞，来源于所述 基因修饰细胞的血细胞在所述修饰细胞上的血型抗原的量减少。11. 根据权利要求1所述的基因修饰细胞，其中相比于对应的野生型细胞，来源于所述 基因修饰细胞的血细胞具有的与所述修饰细胞的膜相关的血型抗原的量减少。12. 根据权利要求1所述的基因修饰细胞，其中所述完全或部分基因缺失被引入所述基 因修饰细胞的基因组中。13. 根据权利要求1所述的基因修饰细胞，其中所述血型抗原包括Rh血型抗原或ABO血 型抗原。14. 根据权利要求1所述的基因修饰细胞，其中所述血型抗原包括与MNSsU、Pl、 Lutheran、Kel1、Lewis、Duffy、Kidd、Diego、Cartwright、Dombr