制备眼前段组织的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及用于在体外诱导多能干细胞分化成眼前段组织的技术。
【背景技术】
[0002]迄今为止，本发明人使用SFEBq方法(专利文件I)通过在不含血清的培养基中悬浮培养多能干细胞聚集体，并且通过体外自组织形成视杯(其是眼原基)(专利文件2，非专利文件I和2)已经成功地开发了包含来自多能干细胞的神经视网膜组织和视网膜色素上皮组织的视网膜前体组织。然而，通过体外悬浮培养由多能干细胞诱导与视网膜一起组成眼球的眼前段组织(如角膜、晶状体等)还未见报道。
[0003]非专利文件3报道了通过在PA6饲养层上贴壁培养人iPS细胞而诱导角膜上皮细胞。然而，在饲养细胞存在下的培养不是优选的，因为应当避免不确定因素的污染。另外，角膜等的立体结构还未被构建。该文件中所述的方法需要12周的长时期来诱导角膜上皮细胞。该文件还描述了BMP4处理抑制iPS细胞分化为角膜上皮细胞。
[0004]非专利文件4描述了通过在BMP4、BMP7和FGF2存在下贴壁培养人ES细胞来诱导晶状体前体细胞。非专利文件5描述了通过在PA6饲养层上贴壁培养小鼠iPS细胞而诱导角膜上皮。非专利文件6描述了通过在饲养细胞存在下贴壁培养人ES细胞而诱导角膜基质细胞。非专利文件7描述了通过贴壁培养将人ES细胞诱导为角膜样细胞。然而，这些文件无一公开悬浮培养多能干细胞来在空间上形成眼前段组织，如角膜、晶状体等。
[0005][文件列表]
[0006]专利文件
[0007]专利文件1:W0 2009/148170
[0008]专利文件2:WO2011/055855
[0009][非专利文件]
[0010]非专利文件I=Nakano等人，Cell Stem Cell ,10(6):771-785,2012[0011 ]非专利文件2:Eiraku等人，Nature，472(7341): 51-56，2011
[0012]非专利文件3:Hayashi等人，PLOSONE,7(9):e45435,2012
[0013]非专利文件4:Yang等人，FASEBJ.,24:3274-3283,2010
[0014]非专利文件5:Yoshida等人，PLOSONE,6(12):e28856,2011
[0015]非专利文件6:Chan等人，PLOSONE,8(2):e56831,2013
[0016]非专利文件7:Ahmad等人，StemCells,25:1145-1155,2007
[0017]发明概述
[0018]发明要解决的问题
[0019]本发明的一个目的是开发用于诱导多能干细胞选择性分化为眼前段组织或其前体组织的高度实用的方法。
[0020]解决问题的方式
[0021]本发明人已经进行了大量研究，并且发现通过在悬浮培养下用BMP4处理人多能干细胞的聚集体可以诱导眼前段组织(晶状体和角膜)的自组织，并且有效地进行角膜和晶状体的立体形成。通过在由本发明人开发的诱导立体视网膜自组织的方法(SFEBq法)的初始过程中实施BMP4处理，其已经成功地在聚集体中形成的视网膜上皮组织聚集体的表面上以自组织的方式形成表面外胚层，并且自发地引起可见于活体胚胎的“通过视网膜的表面外胚层向眼前段前体组织(晶状体基板和角膜基板)的分化诱导”。结果，可以立体地形成自组织的视网膜在内部，并且增厚的晶状体和角膜上皮前体组织在表面中的悬浮的聚集体。
[0022]他们还通过连续培养所述悬浮的聚集体而成功地使所述聚集体内的晶状体基板自发内陷，并且形成晶状体泡。
[0023]成年人的角膜从表面到内部由三层组成:上皮、间质和内皮。通过长期培养上述聚集体，他们还成功地允许聚集体表达多种在成人角膜上皮中观察到的标记蛋白。尽管已知间质和内皮由来源于神经嵴细胞的间充质细胞发育而来，而不是由表面外胚层而来，当长期培养上述聚集体时，除了视网膜组织和角膜上皮组织之外，间充质细胞也可以在所述聚集体中发育，其结果是，他们发现，可以形成具有联合的角膜上皮层和间充质细胞层(对应于间质和内皮)的立体角膜。
[0024]本发明人基于上述发现进行了进一步的研究并且完成了本发明。
[0025]因此，本发明如下:
[0026][I]包含眼前段组织或其部分结构或其前体组织的制备方法，所述方法包括在骨形态发生因子信号转导途径激活物质存在下，悬浮培养多能干细胞的聚集体。
[0027][2][1]的方法，其中在所述在骨形态发生因子信号转导途径激活物质存在下的悬浮培养之前，在不存在骨形态发生因子信号转导途径激活物质的情况下悬浮培养所述多能干细胞的聚集体。
[0028][3][1]或[2]的方法，其中所述骨形态发生因子信号转导途径激活物质是BMP4。
[0029][ 4 ] [ 3 ]的方法，其中BMP4具有卜5nM的浓度。
[0030][5][1]_[4]中任一项的制备方法，其中所述悬浮培养完全或部分地在成纤维细胞生长因子存在下进行。
[0031][6][1]_[5]中任一项的方法，其中所述多能干细胞是胚胎干细胞或诱导的多能干细胞。
[0032][7][1]_[6]中任一项的方法，其中所述多能干细胞来源于人。
[0033][8] [1]_[7]中任一项的方法，其中所述悬浮培养在不存在饲养细胞的情况下进行。
[0034][9][1]_[8]中任一项的方法，其中所述细胞聚集体还包含神经视网膜组织。
[0035][10][1]_[9]中任一项的方法，其中所述眼前段组织是角膜和/或晶状体。
[0036][11][1]-[10]中任一项的方法，其中所述细胞聚集体包含作为所述眼前段组织的部分结构的角膜上皮，并且还包含间充质组织或来源于其的胶膜间质和/或角膜内皮。
[0037][ 12] [ 11 ]的方法，其中所述角膜上皮是分层的。
[0038][13][1]_[12]中任一项的方法，所述方法还包括从所述细胞聚集体分离所述眼前段组织或其部分结构或其前体组织。
[0039][14][13]的方法，其中所述眼前段组织或其部分结构或其前体组织与神经视网膜组织一起分离。
[0040][ 15 ]通过[I ] _[ 12 ]中任一项的方法获得的细胞聚集体。
[0041][16]眼前段组织或其部分结构或其前体组织，其是由[13]或[14]的方法获得的。
[0042]发明效果
[0043]按照本发明，可以在能够提供高通量的悬浮培养下立体形成眼前段组织(如晶状体、角膜等)或其部分结构、或其前体组织。
[0044]按照本发明，能够以常规方法难以达到的高的效率由多能干细胞诱导眼前段组织(如晶状体、角膜等)或其部分结构、或其前体组织。在一个在具有相当小的体积的培养隔室(如96孔板)中形成聚集体的实施方案中，可以以不低于80%的效率形成包含角膜前体组织的聚集体，并且可以以不低于20%的效率获得包含晶状体前体组织的细胞聚集体。
[0045]按照本发明，可以在“短时间”内由多能干细胞诱导眼前段组织(如晶状体、角膜等)或其部分结构、或其前体组织，而这是常规方法难以达到的。在根据本发明的一个实施方案中，能够在自分化培养开始起约3周内由多能干细胞诱导晶状体和角膜上皮，而这在常规上至少需要两倍长的时间。
[0046]按照本发明，能够由多能干细胞邻接地立体形成在活体的眼中共存的视网膜、晶状体和角膜。因此，可以复制与体内相似的非人工组织发育培养环境。
[0047]按照本发明，角膜上皮和与其邻接的神经嵴来源的间充质组织(其形成角膜内皮和角膜间质)可以在聚集体中同时形成，从而产生层状的具有上皮、间质和内皮的前体组织的角膜前体组织。
[0048]按照本发明，可以形成角膜上皮，所述角膜上皮具有成熟角膜所特有的层状上皮结构，包括作为表层的鳞状上皮和作为深层的立方上皮。
[0049]按照本发明，可以在聚集体的表层上选择性地形成角膜前体组织，并且，甚至在不使用FACS等的情况下，就能够以高纯度分离角膜祖细胞。
[0050]附图简述
[0051 ][图1A]图1A显示在添加BMP4的条件下，在由SFEBq方法获得的人ES细胞聚集体(第14天)的表层中形成不同于神经视网膜的Rx::venus阴性的、E-钙黏着蛋白阳性的上皮细胞层。
[0052][图1B]图1B显示在添加BMP4的条件下在由SFEBq方法获得的人ES细胞聚集体(第24天)的表层中形成的上皮细胞层是广谱细胞角蛋白(pancytokeratin)阳性的。
[0053][图1C]图1C显示在添加BMP4的条件下在由SFEBq方法获得的人ES细胞聚集体(第24天)的表层中形成L-Maf阳性的晶状体基板样组织，其中上皮细胞层增厚。
[0054][图2]图2显示在添加BMP4的条件下由SFEBq方法获得的人ES细胞聚集体(第55天)的表层中形成的上皮组织表达角膜上皮特有的细胞角蛋白3(CK3)、细胞角蛋白12(CK12)和细胞角蛋白14(CK14)。
[0055][图3A]图3A显示在添加BMP4的条件下由SFEBq方法获得的人ES细胞聚集体(第33天)的表层中的增厚的角膜上皮与神经视网膜组织之间的间充质细胞聚集体层中的TOGFR-α的表达。
[0056][图3Β]图3Β显示在添加ΒΜΡ4的条件下由SFEBq方法获得的人ES细胞聚集体(第53天)的表层中的增厚的角膜上皮与神经视网膜组织之间的间充质细胞聚集体层中的Pitx2和ABCG2的表达。
[0057][图3C]图3C显示间充质细胞聚集体层的最内部中形成的上皮化的内皮细胞层(epithelized endothelial cell layer)的形态学。
[0058][图4A]图4A显示在添加bFGF的组中观察到的晶状体泡样囊泡，其中观察到具有沿前-后轴的形态极性(在前部薄，在后部厚)的晶状体组织的形成，这是体内晶状体发育中可见的。
[0059][图4B]图4B显示在不添加bFGF的组中观察到的晶状体泡样囊泡。在添加bFGF的组中观察到的组织极性是不清楚的。
[0060][图5A]图5A显示CK3在分层的角膜上皮中的表达。
[0061 ][图5B]图5B显示CK12在分层的角膜上皮中的表达。
[0062][图5C]图5C显示CK15在分层的角膜上皮中的表达。
[0063][图图显示Na-KATP酶在分层的角膜上皮中的表达。
[0064]实施方案描述
[0065]本发明提供包含眼前段组织或其部分结构、或其前体组织和神经视网膜组织的细胞聚集体的制备方法，所述方法包括在骨形态发生因子信号转导途径激活物质存在下悬浮培养多能干细胞的聚集体。
[0066]在下文中详细地阐释本发明。
[0067](I)多能干细胞
[0068]“多能干细胞”是指具有分化成组成身体的所有细胞的潜能(分化多能性)和经由细胞分裂产生具有相同的分化能力的子细胞的潜能(自我复制能力)的细胞。
[0069]分化多能性可以通过将评价靶标的细胞移植到裸鼠中并且检测是否存在包含三个胚层(外胚层、中胚层、内胚层)的每种细胞的畸胎瘤的形成来评价。
[0070]多能干细胞的实例包括胚胎干细胞(ES细胞)，胚胎生殖细胞(EG细胞)，诱导的多能干细胞(iPS细胞)等，并且多能干细胞没有限制，只要其具有分化多能性和自我复制能力二者即可。在本发明中，优选使用胚胎干细胞或诱导的多能干细胞。
[0071]例如，胚胎干细胞(ES细胞)可以通过培养预植入的早期胚胎、构成早期胚胎的内细胞团、单个卵裂球等而建立(Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual(操作小鼠胚胎实验室手册)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(19