RL 1066培养基，Glasgow MEM培养基，改良的MEM锌选项培养基(Improved MEM Zinc Opt1n medium)，IMDM培养基，Medium 199培养基，Eagle MEM培养基，αΜΕΜ培养基，DMEM培养基，ham培养基，Ham’s F-12培养基，RPMI 1640培养基，Fischer’s培养基，其混合的培养基等。
[0123]为了避免对诱导多能干细胞向眼前段组织或其部分结构或其前体组织分化的不利影响，用于悬浮培养聚集体的培养基优选是无血清培养基。
[0124]用于悬浮培养聚集体的培养基可以包含血清替代品。例如，所述血清替代品可以是适当地包含清蛋白、运铁蛋白、脂肪酸、胶原蛋白前体、痕量元素、2-巯基乙醇或3’-硫代甘油或它们的等价物等的替代品。这样的血清替代品可以例如通过W098/30679中所述的方法制备。为了促使本发明的方法更容易实施，可以使用商购的血清替代品。所述商购血清替代品的实例包括敲除血清替代物(KSR)(由Invitrogen制备)，化学成分确定的浓缩脂质(由Gibco Company制备)和Glutamax(由Gibco Company制备)。
[0125]用于悬浮培养聚集体的培养基可以包含其他添加剂，只要没有对多能干细胞向眼前段组织或其部分结构、或其前体组织的分化的诱导施加不利的影响即可。所述添加剂的实例包括，但不限于，胰岛素、铁源(例如，运铁蛋白等)、矿物质(例如，砸酸钠等)、糖(例如，葡萄糖等)、有机酸(例如，丙酮酸，乳酸等)、血清蛋白(例如，清蛋白等)、氨基酸(例如，L-谷氨酰胺等)、还原剂(例如，2-巯基乙醇等)、维生素(例如，抗坏血酸，d-生物素等)、抗生素(例如，链霉素，青霉素，庆大霉素等)、缓冲剂(例如，HEPES等)等。
[0126]在一个实施方案中，为了避免对诱导多能干细胞向眼前段组织或其部分结构、或其前体组织分化的不利影响，用于悬浮培养聚集体的培养基优选是添加有血清替代品(KSR等)的不含生长因子的化学成分确定的培养基(gfCDM)。此处，“生长因子”包括模式形成因子(pattern format1n factor)(不包括骨形态发生因子信号转导途径激活物质)如Fgf，Wnt，Nodal，Notch，Shh等;胰岛素和富脂质清蛋白。不含生长因子的化学成分确定的培养基的实例包括Wataya等人，Proc Natl Acad Sci USA，105(33): 11796-11801，2008中公开的gfCDMCDM是IMDM与Ham’s F-12的1:1混合培养基，其包含Ix化学成分确定的脂质浓缩物，单硫代甘油(450μΜ)，纯化的BSA和人脱铁运铁蛋白(终浓度150yg/ml)。
[0127]用于悬浮培养聚集体的培养容器没有特别限制。所述培养容器包括，例如，烧瓶、组织培养瓶、平皿、培养皿、组织培养皿、多重平皿、微量板、微孔板、微孔、多重板、多孔板、室载玻片、培养皿、管、托盘、培养袋和旋转瓶。为了允许在非粘附条件下培养，培养容器优选是非细胞粘附的。可用的非细胞粘附的培养容器包括表面被人工处理成为细胞不粘附的培养容器、表面没有进行用于改善细胞粘附性的人工处理(例如，利用胞外基质的包被处理等)的培养容器等。
[0128]聚集体的悬浮培养可以在存在或不存在饲养细胞的条件下进行，只要自多能干细胞向眼前段组织或其部分结构、或其前体组织的分化诱导是可能的即可。为了避免不确定因素的污染，聚集体的悬浮培养优选在不存在饲养细胞的条件下进行。
[0129]可以适当地设定用于悬浮培养聚集体的其他培养条件，如培养温度，CO2浓度和O2浓度。培养温度没有特别的限制，并且例如，是约30-40°C，优选约37°C<X02浓度例如是约1-10%，优选约5%。02浓度例如是约20-40%。
[0130]在优选的实施方案中，将多能干细胞聚集体的质量均一的群体在包含骨形态发生因子信号转导途径激活物质(BMP4等)的培养基中悬浮培养。使用多能干细胞聚集体的质量均一的群体，可以将聚集体之间向眼前段组织或其部分结构、或其前体组织的分化水平的差异抑制至最小程度，并且可以提高目标分化诱导的效率。多能干细胞聚集体的质量均一的群体的悬浮培养包括以下实施方案:
[0131](I)准备多个培养隔室，并且接种多能干细胞聚集体的质量均一的群体，以使在一个培养隔室中包含一个多能干细胞聚集体(例如，在96孔板的每个孔中放置一个多能干细胞聚集体)。在每个培养隔室中，将一个多能干细胞聚集体在包含骨形态发生因子信号转导途径激活物质(BMP4等)的培养基中悬浮培养。
[0132](2)接种多能干细胞聚集体的质量均一的群体，以使在一个培养隔室中包含多个多能干细胞聚集体(例如，在1cm的平皿中放置多个多能干细胞聚集体)。在所述培养隔室中，将多个多能干细胞聚集体在包含骨形态发生因子信号转导途径激活物质(BMP4等)的培养基中悬浮培养。
[0133]可以将实施方案(I)和(2)中任一个用于本发明的方法，并且在培养过程中可以改变实施方案(从实施方案(I)到实施方案(2)，或从实施方案(2)到实施方案(I))。为了避免聚集体之间的相互作用并且实现稳定的分化诱导，实施方案(I)是优选的。
[0134]如以上提及的，因为在本发明的方法中在细胞聚集体中诱导眼前段组织的自组织，所述细胞聚集体中包含的眼前段组织或其部分结构、或其前体组织的分化阶段随着时间进程而进展。因此，优选地按照目标眼前段组织或其部分结构、或其前体组织适当地调节培养时间和培养条件。在以下(5)-(11)中，按时间顺序来说明本发明的一个实施方案，其是本发明的示例，而不限制本发明。
[0135](5)神经视网膜组织的诱导
[0136]当在包含骨形态发生因子信号转导途径激活物质(BMP4等)的培养基中悬浮培养多能干细胞聚集体时，神经视网膜组织在所述聚集体内部被诱导。神经视网膜组织的诱导可以使用神经视网膜组织标记物(例如，Rx，ChxlO)的表达或神经上皮样结构(假复层柱状上皮)的形成作为指标进行验证。诱导神经视网膜组织所需要的时间取决于培养条件和所述多能干细胞所来源于的哺乳动物的种类而变化，并且作一般性限定。然而，当使用人多能干细胞时，神经视网膜组织在例如自开始悬浮培养所述多能干细胞聚集体起的8，9，10，11，12，13，14或15天内在所述聚集体内部被诱导。
[0137](6)角膜上皮前体组织和/或晶状体基板的诱导
[0138]当在包含骨形态发生因子信号转导途径激活物质(BMP4等)的培养基中连续地悬浮培养在上述(5)中获得的在内部包含神经视网膜组织的聚集体时，在所述神经视网膜组织的外部形成外胚层上皮细胞层，并且所述神经视网膜组织诱导外胚层上皮细胞层向角膜上皮前体组织和/或晶状体基板分化，从而在所述细胞聚集体的表层形成角膜上皮前体组织和/或晶状体基板。在所述聚集体中，角膜上皮前体组织和/或晶状体基板构成所述细胞聚集体的表层，神经视网膜组织被包含在所述细胞聚集体的内部，并且角膜上皮前体组织和/或晶状体基板与神经视网膜组织邻接。角膜上皮前体组织和/或晶状体基板的诱导可以使用角膜上皮前体组织标记物(例如，广谱细胞角蛋白、E-钙黏着蛋白)和晶状体基板标记物(例如，L-Maf)的表达或增厚的上皮细胞层的形成作为指标进行验证。诱导角膜上皮前体组织和/或晶状体基板所需要的时间取决于培养条件和所述多能干细胞所来源的哺乳动物的种类而变化，并且不能被一般性指定。然而，当使用人多能干细胞时，角膜上皮前体组织和/或晶状体基板在例如自开始悬浮培养所述多能干细胞聚集体起的10，12，14，16，18，20，22，24，26或28天内在所述细胞聚集体的表层中形成。通过选择证实已经由培养的多个细胞聚集体形成角膜上皮前体组织和/或晶状体基板的细胞聚集体，可以获得包含角膜上皮前体组织和/或晶状体基板、以及神经视网膜组织的细胞聚集体，其中，角膜上皮前体组织和/或晶状体基板构成所述细胞聚集体的表层，神经视网膜组织被包含在所述细胞聚集体的内部，并且角膜上皮前体组织和/或晶状体基板与神经视网膜组织邻接。如以上提及的，可以以例如不小于60%、优选不小于70%、更优选不小于80%的效率形成包含角膜前体组织的细胞聚集体群体，并且可以以例如不小于10%、优选不小于15%、更优选不小于20%的效率获得包含晶状体前体组织的细胞聚集体群体。
[0139](7)角膜上皮的诱导
[0140]在包含骨形态发生因子信号转导途径激活物质(BMP4等)的培养基中进一步悬浮培养在上述(6)中获得的包含角膜上皮前体组织和神经视网膜组织的细胞聚集体(其中所述角膜上皮前体组织构成所述细胞聚集体的表层，所述神经视网膜组织被包含在所述细胞聚集体的内部，并且所述角膜上皮前体组织与所述神经视网膜组织邻接)，由此诱导所述角膜上皮前体组织向角膜上皮的进一步分化。结果，可以形成包含角膜上皮和神经视网膜组织的细胞聚集体，其中所述角膜上皮构成所述细胞聚集体的表层，所述神经视网膜组织被包含在所述细胞聚集体的内部，并且所述角膜上皮与所述神经视网膜组织邻接。角膜上皮的诱导可以使用角膜上皮标记物(例如，细胞角蛋白3，细胞角蛋白12，细胞角蛋白14，p63，Z0-1)和角膜上皮干细胞标记物(例如，细胞角蛋白15)的表达作为指标进行验证。诱导角膜上皮所需要的时间取决于培养条件和所述多能干细胞所来源的哺乳动物的种类而变化，并且不能一般性指定。然而，当使用人多能干细胞时，角膜上皮在例如自开始悬浮培养多能干细胞聚集体起的20，25，30，35，40，45，50，55，60，65或70天内在所述细胞聚集体的表层中形成。通过选择证实已经由培养的多个细胞聚集体形成角膜上皮的细胞聚集体，可以获得包含角膜上皮和神经视网膜组织的细胞聚集体，其中所述角膜上皮构成所述细胞聚集体的表层，所述神经视网膜组织被包含在所述细胞聚集体内部，并且所述角膜上皮与所述神经视网膜组织邻接。
[0141]作为用于进一步悬浮培养以诱导角膜上皮前体组织向角膜上皮进一步分化的培养基，可以继续使用上述(4)中所述的用于悬浮培养多能干细胞聚集体的培养基。作为基础培养基，可以采用被改良以适于培养角膜上皮和表皮上皮的细胞的培养基。所述培养基的实例包括，但不限于，CnT-30培养基(由CELLnTEC制备)，成分确定的K-SFM培养基(由Gibco/Invitrogen 制备)等。
[0142](8)角膜上皮的分层
[0143]在包含骨形态发生因子信号转导途径激活物质(BMP4等)的培养基中进一步悬浮培养在上述(7)中获得的包含角膜上皮和神经视网膜组织的细胞聚集体(其中所述角膜上皮构成所述细胞聚集体的表层，所述神经视网膜组织被包含在所述细胞聚集体的内部，并且所述角膜上皮与所述神经视网膜组织邻接)，由此诱导角膜上皮分层。结果，可以形成包含分层的角膜上皮和神经视网膜组织的细胞聚集体，其中所述角膜上皮构成所述细胞聚集体的表层，并且所述神经视网膜组织被包含在所述细胞聚集体的内部。角膜上皮的分层可以通过显微镜观察成熟的角膜特有的上皮分层结构而证实，其中表层是鳞状上皮，并且深层是立方上皮。角膜上皮分层所需要的时间取决于培养条件和所述多能干细胞所来源的哺乳动物的种类而变化，并且不能一般性指定。然而，当使用人多能干细胞时，分层的角膜上皮在例如自开始悬浮培养所述多能干细胞聚集体起的75，80，84，90或95天内在所述细胞聚集体的表层中形成。通过选择证实已经由培养的多个细胞聚集体形成分层的角膜上皮的细胞聚集体，可以获得包含分层的角膜上皮和神经视网膜组织的细胞聚集体，其中所述角膜上皮构成所述细胞聚集体的表层，并且所述神经视网膜组织被包含在所述细胞聚集体的内部。
[0144]作为用于进一步悬浮培养以诱导角膜上皮分层的培养基，可以继续使用上述(4)中所述的用于悬浮培养多能干细胞聚集体的培养基。作为基础培养基，可以采用被改良以适于培养角膜上皮和表皮上皮的细胞的培养基。所述培养基的实例包括，但不限于，CnT-30培养基(由CELLnTEC制备)，成分确定的K-SFM培养基(由Gibco/Invitrogen制备)等。
[0145]用于进一步悬浮培养的培养基可以包含成纤维细胞生长因子。即，在本发明方