法的一个实施方案中，细胞聚集体的悬浮培养完全或部分地在存在成纤维细胞生长因子的条件下进行。作为成纤维细胞生长因子，可以使用具有使成纤维细胞生长的活性的任意物质。成纤维细胞生长因子的实例包括bFGF。尽管在下文中主要描述了bFGF，但是本发明中所用的成纤维细胞生长因子不限于bFGF。加入成纤维细胞生长因子(bFGF等)促进角膜上皮的分层。
[0146]bFGF是已知的细胞因子，并且其氨基酸序列也是已知的。用于本发明的bFGF是哺乳动物bFGF。哺乳动物的实例包括实验动物，如啮齿动物，包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等，兔等;家养动物，如猪、牛、山羊、马、绵羊等;陪伴动物，如狗、猫等;和灵长类动物，如人、猴、猩猩、黑猩猩等。bFGF优选是啮齿动物(小鼠，大鼠等)或灵长类动物(人等)的bFGF，最优选是人bFGF。人bFGF的代表性氨基酸序列的实例包括NCBI登记号NP_001997.5(2013年7月7日更亲万)等。
[0147]当使用bFGF作为成纤维细胞生长因子时，bFGF在用于角膜上皮分层的培养基中的浓度没有特别限制，只要其促进角膜上皮的分层即可。然而，其通常为约0.1-1000ng/ml，优选约0.5-500ng/ml，更优选约2_200ng/ml。
[0148](9)间充质组织的诱导
[0149]在包含骨形态发生因子信号转导途径激活物质(BMP4等)的培养基中进一步悬浮培养在上述(6)或(7)中获得的包含角膜上皮或其前体组织以及神经视网膜组织的细胞聚集体(其中所述角膜上皮或其前体组织构成所述细胞聚集体的表层，所述神经视网膜组织被包含在所述细胞聚集体的内部，并且所述角膜上皮或其前体组织与所述神经视网膜组织邻接)，由此在所述角膜上皮或其前体组织与所述神经视网膜组织之间形成间充质组织。所述间充质组织表现出层形态，其中间充质细胞密实地聚集。已知成人角膜从表面到内部包含三层:上皮、基质和内皮，并且基质和内皮是由间充质细胞而不是表面外胚层发育而来。即，本发明可以在细胞聚集体中重现体内胚胎内的角膜基质和角膜内皮的发育。按照进一步培养的结果，所得到的细胞聚集体包含角膜上皮(优选是分层的角膜上皮)或其前体组织，间充质组织，和神经视网膜组织，其中所述角膜上皮(优选是分层的角膜上皮)或其前体组织、间充质组织和神经视网膜组织从所述细胞聚集体表层到内部以角膜上皮(优选是分层的角膜上皮)或其前体组织、间充质组织和神经视网膜组织的次序按层排列。
[0150]在一个实施方案中，在角膜上皮或其前体组织与神经视网膜组织之间形成的间充质组织可以是角膜基质或其前体组织和角膜内皮或其前体组织。在该实施方案中，由进一步培养获得的细胞聚集体包含角膜上皮(优选是分层的角膜上皮)或其前体组织、角膜基质或其前体组织、角膜内皮或其前体组织和神经视网膜组织，其中这些从所述细胞聚集体表层到内部以角膜上皮(优选是分层的角膜上皮)或其前体组织、角膜基质或其前体组织、角膜内皮或其前体组织和神经视网膜组织的次序按层排列。即，在所述细胞聚集体中，邻近神经视网膜组织并且在其外部形成包含角膜上皮(优选是分层的角膜上皮)或其前体组织、角膜基质或其前体组织和角膜内皮或其前体组织的角膜或其前体组织(角膜样组织)。
[0151]间充质组织或角膜基质或其前体组织以及角膜内皮或其前体组织的诱导可以使用角膜基质、角膜内皮或其前体组织的标记物(包括H)GFR-a，Pi tx2，ABCG2等)的表达或形态特征(形成间充质细胞在其中密实地聚集的层)作为指标进行验证。此外，由于角膜内皮具有如上皮化内皮细胞层的形态，所以可能通过使用此种形态特征作为指标来区分角膜基质(或其前体组织)与角膜内皮(或其前体组织)或者证实角膜内皮或其前体组织的诱导。
[0152]诱导间充质组织(角膜基质或其前体组织，以及角膜内皮或其前体组织)所需要的时间取决于培养条件和所述多能干细胞所来源的哺乳动物种类而变化，并且不能一般性指定。然而，当使用人多能干细胞时，间充质组织(角膜基质或其前体组织，以及角膜内皮或其前体组织)在例如自开始悬浮培养所述多能干细胞聚集体起的20，25，30，35，40，45，50，55，60，65或70天内在角膜上皮或其前体组织与神经视网膜组织之间形成。通过选择证实已经形成间充质组织(角膜基质或其前体组织，以及角膜内皮或其前体组织)的细胞聚集体，在上述实施方案中，可以获得包含角膜上皮(优选是分层的角膜上皮)或其前体组织、间充质组织(角膜基质或其前体组织，以及角膜内皮或其前体组织)和神经视网膜组织的细胞聚集体。
[0153]作为用于进一步悬浮培养以诱导间充质组织的培养基，可以继续使用上述(4)中所述的用于悬浮培养多能干细胞聚集体的培养基。作为基础培养基，可以采用被改良以适于培养角膜上皮和表皮上皮的细胞的培养基。所述培养基的实例包括，但不限于，CnT-30培养基(由CELLnTEC制备)，成分确定的K-SFM培养基(由Gibco/Invitrogen制备)等。
[0154]当需要形成上述实施方案中的包含分层的角膜上皮、间充质组织(角膜基质或其前体组织，以及角膜内皮或其前体组织)和神经视网膜组织的细胞聚集体时，用于进一步悬浮培养的培养基可以包含成纤维细胞生长因子(bFGF等)。
[0155]当使用bFGF作为成纤维细胞生长因子时，bFGF在用于进一步悬浮培养的培养基中的浓度没有特别限制，只要其促进角膜上皮的分层即可。然而，其通常为约0.1-1000ng/ml，优选约0.5- 500ng/ml，更优选约2- 200ng/ml。
[0156](1)晶状体泡的诱导
[0157]在包含骨形态发生因子信号转导途径激活物质(BMP4等)的培养基中进一步悬浮培养在上述(6)中获得的包含晶状体基板和神经视网膜组织的细胞聚集体(其中所述晶状体基板构成所述细胞聚集体的表层，所述神经视网膜组织被包含在所述细胞聚集体的内部，并且所述晶状体基板邻接所述神经视网膜组织)，由此诱导晶状体基板的内陷，并且形成晶状体泡。结果，可以形成包含晶状体泡和神经视网膜组织的细胞聚集体。晶状体泡的形成可以使用作为晶状体前体组织标记物(例如，L-Maf)阳性的囊泡的形态特征作为指标进行验证。形成晶状体泡所需要的时间取决于培养条件和所述多能干细胞所来源的哺乳动物种类而变化，并且不能一般性指定。然而，当使用人多能干细胞时，晶状体泡在例如自开始悬浮培养所述多能干细胞聚集体起的20，25，30，35，40，45，50，55，60，65或70天内形成。通过选择证实已经由培养的多个细胞聚集体形成晶状体泡的细胞聚集体，可以获得包含晶状体泡和细胞聚集体神经视网膜组织的细胞聚集体。
[0158]作为用于进一步悬浮培养的培养基，可以使用添加有成纤维细胞生长因子的上述
(4)中所述的用于悬浮培养多能干细胞聚集体的培养基。即，在本发明方法的一个实施方案中，细胞聚集体的悬浮培养完全或部分地在存在成纤维细胞生长因子的条件下进行。作为成纤维细胞生长因子，可以使用具有使成纤维细胞生长的活性的任意物质。成纤维细胞生长因子的实例包括bFGF。尽管在下文中主要描述了bFGF，但是本发明中所用的成纤维细胞生长因子不限于bFGF。通过加入成纤维细胞生长因子(bFGF等)，形成的晶状体泡开始表现出与在体内晶状体发育中观察到的形态极性一致的形态极性，即，其在前-后轴之前的部分是薄的，并且在前-后轴之后的部分是厚的。尽管通过继续使用未添加成纤维细胞生长因子(bFGF等)的上述(4)中所述的用于浮游培养多能干细胞聚集体的培养基也可以诱导晶状体基板的内陷和晶状体泡的形成，但是没有清楚地出现上述组织极性。
[0159]当使用bFGF作为成纤维细胞生长因子时，bFGF在用于诱导晶状体泡形成的培养基中的浓度没有特别限制，只要其能够给予晶状体泡前述形态极性即可。然而，其通常为约
0.l-1000ng/ml，优选约0.5-500ng/ml，更优选约2_200ng/ml。
[0160](11)制备眼前段组织或其部分结构、或其前体组织
[0161]在另一方面，可以从如上文提及获得的细胞聚集体分离眼前段组织或其部分结构、或其前体组织。在一个实施方案中，眼前段组织或其部分结构、或其前体组织可以与神经视网膜组织一起分离。此外，本发明提供通过上述方法获得的细胞聚集体、眼前段组织或其部分结构、或其前体组织。例如，可以从包含角膜或其前体组织和神经视网膜组织的细胞聚集体(其中所述角膜或其前体组织构成所述细胞聚集体的表层，所述神经视网膜组织被包含在所述细胞聚集体的内部，并且所述角膜或其前体组织邻接所述神经视网膜组织)分离包含角膜或其前体组织的表层。在上述(8)中获得的细胞聚集体中，由于所述角膜或其前体组织在所述聚集体的表层形成可手工分离的层，所以所述角膜或其前体组织能够被容易地分离，而无需酶处理等。此外，通过用酶等分散所获得的角膜或其前体组织，甚至在不使用FACS等的情况下也可以以高纯度分离角膜细胞和角膜祖细胞。这样获得的角膜或其前体组织可以用于按其原样或以培养物薄片的形式移植。
[0162]以这种方式，通过本发明获得的眼前段组织或其部分结构、或其前体组织可以用于移植。例如，通过本发明获得的眼前段组织或其部分结构、或其前体组织可以用作治疗药物用于由眼前段组织的病症导致的疾病，或用于损伤的眼前段组织的补充组织。通过向具有由眼前段组织的病症导致的疾病或受损的眼前段组织的患者移植通过本发明获得的眼前段组织或其部分结构、或其前体组织，所述由眼前段组织的病症导致的疾病或对眼前段组织的损伤可以得到治疗。由眼前段组织的病症导致的疾病的实例包括由角膜病症导致的疾病(圆锥角膜，大泡性角膜病变(bullous keratopathy)，角膜白斑(corneal leukoma)，疱疹角膜(herpescornea)，角膜营养不良(corneal dystrophy)，由近视激光手术(如L A S E K、P R K等)失败导致的角膜损伤)，由晶状体病症导致的疾病(例如，先天性白内障(congenital cataract)，后天性白内障(acquired cataract))等。
[0163]在移植治疗中，由于组织相容性抗原的差异导致的移植排斥通常是成问题的，然而，该问题可以通过使用从移植接受者的体细胞建立的多能干细胞(例如，诱导的多能干细胞)得到解决。即，在优选的实施方案中，使用从接受者的体细胞建立的多能干细胞(例如，诱导的多能干细胞)作为本发明的方法中的多能干细胞，并且，制备对于所述接受者来说在免疫学上是自体的眼前段组织或其部分结构、或其前体组织并将其移植到所述接受者。
[0164]此外，通过本发明获得的眼前段组织或其部分结构、或其前体组织可以用于筛选和评估药物。具体地，由于通过本发明获得的眼前段组织或其部分结构、或其前体组织具有与活生物体中的眼前段组织或其前体组织的结构极其相似的高等结构(如由视网膜、晶状体和角膜以及具有层形式的角膜上皮(优选是分层的角膜上皮)、角膜基质和角膜内皮的各前体组织的角膜前体组织的邻接的立体形成所证实的)，其可以用于筛选用于以下的治疗药物:由眼前段组织的病症导致的疾病，和受损的眼前段组织，药物产品和化妆品的副作用和毒性测试(例如，角膜刺激测试的替代测试)，以及开发用于眼前段组织的疾病的新的治疗方法等。
[0165]在下文中通过参考以下实施例更详细地解释本发明，所述实施例仅是示例性的，并不限制本发明的范围。
实施例
[0166]实施例1:通过人ES细胞的悬浮聚集物培养的晶状体和角膜前体组织的自组织
[0167](方法)
[0168]通过胰蛋白酶处理，将人ES细胞(KhES-1;视网膜特异性基因Rx中敲入荧光蛋白基因Venus)分散为单个细胞，并且按照SFEBq方法(Nakano等人，Cell StemCell，10(6): 771-785，2012)，形成聚集体，并且在存在5%0)2的条件下在37°(3进行悬浮聚集体培养，用于分化诱导。将分散的5000个人ES细胞接种在涂敷有低细胞吸附性表面涂层的V底96孔板的每个孔中，并且使用添加有5%KSR(Knockout Serum Replacement)的不含生长因子的化学合成的培养基(不含生长因子的化学成