一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法和培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及细胞培养技术领域，尤其设及一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制 备方法，W及使用该培养液培养猪卵母细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 卵母细胞体外培养成熟是胚胎生物技术的基础和关键环节。目前，胚胎技术已极 大地推畜牧业和医学的进程，如品种改良、转基因抗病品种培育、人类疾病模型的制备、动 物生物反应器药用蛋白的生产及发育机理的探究等。
[0003] 猪的体细胞克隆及疾病模型制备等都需要大量具有发育潜能的卵母细胞，但目前 的猪卵母细胞体外成熟率不够理想。
[0004] 目前，猪的卵母细胞培养有W下几种体外培养基础液，如北卡罗来纳州立大学 研制的培养液（Nodh Carolina state University (NCSU23/NCSU37)、PZM 系列（PZM-3/ PZM-4/PZM-5)培养液和TCM-199。其中TCM-199是公认的最成功的培养基础液，基本能满 足猪卵母细胞体外发育代谢和营养需要。然而运些经体外培养猪卵母细胞表明，其成熟率 很低，我们还需要对体外培养液进行改进，W提高猪卵母细胞体外培养的成熟率。
【发明内容】
[0005] 发明人经研究，在TCM-199基础液基础上，通过添加激素和营养物质，显著提高猪 卵母细胞体外培养的成熟率。与现有报道的猪卵母细胞体外成熟培养液相比，本发明的培 养液在卵母细胞采集之后，经42-44h成熟培养后极体率可稳定在80 %，整个成熟培养过程 中无需更换培养液，操作简单。
[0006] 基于此，本发明提供一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法，W及使用该 培养液培养猪卵母细胞的方法。
[0007] 根据本发明的第一方面，本发明提供一种猪卵母细胞体外成熟培养液，包括 TCM-199基础培养基和添加的猪卵泡液、胎牛血清、eCG、hCG、EGF和IGF-1。
[0008] 在本发明的一个优选实施方案中，按体积百分含量计，含有10%的猪卵泡液和 10%的胎牛血清，并含有10-15IU/mL的eCG、10-15IU/ml的hCG、低于lOOng/mL的EGF和低 于 40ng/mL 的 IGF-1。
[0009] 在本发明的一个优选实施方案中，还包括谷氨酷胺和庆大霉素。
[0010] 在本发明的一个优选实施方案中，包括如下组分：
[0011] 谷氨醜胺 0.05-0.20mg/n^; 庆大霉素 0.〇2-0.10mg/m^ 猪卵浩液 10%(v/v); 胎牛血清 10% (v/v)； eCG 10-15IU/mL^; hCG 10-15IU/ml; EGF 50ng/mL; IGF-1 lOng/r^; TCM-199 余量。
[0012] 根据本发明的第二方面，本发明提供一种制备第一方面所述的猪卵母细胞体外成 熟培养液的方法，该方法将猪卵泡液、胎牛血清、eCG、hCG、EGF和IGF-1添加到TCM-199基 础培养基中，任选地，加入谷氨酷胺和庆大霉素，制得上述培养液。
[0013] 在本发明的一个优选实施方案中，上述培养液包括如下组分：
[0014] 奋氨醜胺 0.05-0.2()mg/'ni; 庆欠霉素 0.02-0. lOmg/ni; 猪卵泡液 10% (v/v); 胎牛血清 10% (v/v); eCG 10-15IU/mL; 放:巧 10-1尉秘地1; EGF 50ng/nU-; IGF-l 10'1巧/〇止； TCM-1每梦 余量。
[0015] 根据本发明的第Ξ方面，本发明提供一种猪卵母细胞体外成熟培养方法，该方法 包括将猪卵母细胞置于第一方面所述的培养液中培养。
[0016] 在本发明的一个优选实施方案中，上述培养液置于5 % C〇2饱和湿度的培养箱至少 平衡6小时再用于培养所述猪卵母细胞。
[0017] 在本发明的一个优选实施方案中，上述猪卵母细胞从4-7mm的卵泡挑取。
[0018] 在本发明的一个优选实施方案中，上述猪卵母细胞在38. 5°C、5% C〇2饱和湿度的 培养箱中培养42-44小时。
[0019] 本发明的猪卵母细胞体外成熟培养液能够显著地提高猪卵母细胞体外培养的成 熟率。实验证实，本发明的培养液在卵母细胞采集之后，经42-44h成熟培养后极体率可稳 定在80%，孤雌胚胎发育率可达85%，整个成熟培养过程中无需更换培养液，操作简单。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明一个实施例中使用TCM-199基础液添加 eCG和hCG激素 W及EGF和 IGF-1对猪卵母细胞体外成熟效果。
【具体实施方式】
[0021] 下面通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0022] 提高猪卵母细胞体外培养的成熟率，对于获取大量具有发育潜能的卵母细胞具有 重要意义，从而为猪的体细胞克隆及疾病模型制备准备材料。然而，目前的猪卵母细胞体外 培养使用的培养液还不能使猪卵母细胞体外培养的成熟率达到理想的水平。
[0023] 本发明人在目前常用的TCM-199基础培养基的基础上，通过添加猪卵泡液（PFF)、 胎牛血清（FB巧、eCG、hCG、EGF和IGF-1，制得了一种能够显著地提高猪卵母细胞体外培养 的成熟率的培养液。
[0024] 本发明一个实施方案的培养液，包括TCM-199基础培养基和添加的猪卵泡液、胎 牛血清、eCG、hCG、EGF和IGF-1。其中，TCM-199基础培养基是一种经典的细胞体外培养系 统，用其作为母液安全、可靠。TCM-199基础培养基可W从商业渠道购得，如Gibco公司或 Sigma公司。
[00巧]猪卵泡液（PFF)，可W获取自体外卵母细胞收集时离屯、所得。其作用是提供卵母细 胞发育所需的必须因子。
[0026] 胎牛血清（FB巧是多种体外培养液中的成分之一，已经证明其作为体外培养用的 培养液成分之一的有效性和安全性。
[0027] eCG，又称孕马血清促性腺激素，即 PMSG (Pre即ant Mare Serum Gonadotropin)， 也称为马绒毛膜促性腺激素。它是在怀孕母马血清中发现的一种激素。并已知在妊娠马属 动物（驴、斑马等）都有产生，所W目前通常称为马属动物绒毛膜促性腺激素（eCG)。
[0028] hCG，即人绒毛膜促性腺激素，是由胎盘的滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，它是由 α和β二聚体的糖蛋白组成。
[0029] EGF，即表皮生长因子，是一种小肤，由53个氨基酸残基组成，是类EGF大家族的一 个成员，是一种多功能的生长因子，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。
[0030] IGF-1，即膜岛素样生长因子1，也被称为生长调节素 Csomatomedin C，是一个由人 类基因 IGF1编码的蛋白质。
[0031] 本发明中，PFF、FBS、eCG、hCG、EGF和IGF-1在TCM-199基础培养基中协同作用， 共同提高猪卵母细胞体外培养的成熟率。
[0032] 本发明的一个优选实施方案中，按体积百分含量计，含有10%的猪卵泡液和10% 的胎牛血清，并含有 10-15IU/mL 的 eCG、10-15IU/ml 的 hCG、50ng/mL 的 EGF 和 lOng/mL 的 IGF-1。IU表示国际单位。
[003引发明人已经证实，EGF的含量在l(K)ng/mL W下均能取得预期效果，并且在此范围 内其效果随着EGF含量的增加有增加的趋势，然而EGF含量超出l(K)ng/mL并没有显示效果 进一步提高，因此从经济和实用的角度考虑，选择EGF的含量在l(K)ng/mL W下；IGF-1的含 量在40ng/mL W下均能取得预期效果，并且在此范围内其效果随着IGF-1含量的增加有增 加的趋势，然而IGF-1含量超出40ng/血并没有显示效果进一步提高，因此从经济和实用的 角度考虑，选择IGF-1的含量在40ng/mL W下。
[0034] 本发明一个优选的实施方案中，为了给猪卵母细胞提供额外的能量底物，可W添 加谷氨酷胺，保证猪卵母细胞所需的能量足够。
[0035] 本发明一个优选的实施方案中，为了赋予培养液抗菌性能，可W添加庆大霉素，它 抑制细菌等外源性污染的同时不影响猪卵母细胞的正常生长和成熟。
[0036] 因此，本发明的一个更优选实施方案中，包括如下组分：
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