生产具有靶向基因组修饰的卵母细胞或卵的体外方法

专利名称：：生产具有靶向基因组修饰的卵母细胞或卵的体外方法生产具有靶向基因组修饰的卵母细胞或卵的体外方法
技术领域：
：本发明涉及在卵母细胞或卵中引入靶向基因组修饰(modificationg紐omiquecibl6e)的体外方法以及在宿主细胞基因组中进行随机插入的方法。转基因是一种分子遗传学技术，采用这种技术将外源DNA引入到多细胞生物的基因组中，并传递给其后代。这种传递给后代使所述DNA稳定整合在该胚胎的基因组中，并且在发育早熟期(stadepr6coce)也如此。目前，采用最多的其中一种转基因技术是在哺乳动物卵中微量注射裸DNA的技术，该技术在许多情况下导致一部分微量注射的DNA分子整合在该卵基因组中。一些其它技术可用于转基因，特别是在活细胞中引入外源DNA的技术，这些技术是本领域技术人员熟知的，具体地是电穿孔，借助磷酸钙沉淀、脂质体或修饰脂质例如lipofectamine⑧(INVITROGEN)的转染。在外源DNA靶向整合在基因组中的情况中，需要利用同源重组机制。在这种情况下，外源DNA应该具有与在该基因组中耙向整合位点存在的核酸序列同源的核酸序列。因此这些同源重组机制在大多数生物体内是在极低的频率下进行的。最近，使用在"内含子归巢"机制中酵母内所涉及的核酸内切酶(它们属于"大范围核酸酶(m6ganucl6ase)"家族)允许在细胞培养中，尤其在哺乳动物胚胎千细胞中大大提高这些同源重组的频率(COHEN-TANNOUDJI等人，Mol.Cell.Biol.，vol.18(3)，第1444-1448页，1998)。在这些细胞中，诱导外源大范围核酸酶的表达引起在大尺寸特异核酸序列(大范围核酸酶/-5^/的18个碱基对)处基因组DNA双链断开，接着在外源DNA分子序列与围绕这个断开位点的同源序列之间发生同源重组。因此，这些大范围核酸酶能够使该基因组DNA中的感兴趣的序列置换或缺失，或把外源序列引入到该基因组DNA中，并且以"耙向(dbl6e)"方式引入。令人惊奇地，本发明人已证明，在卵中引入外源核酸序列和大范围核酸酶/-5^/时，应在其基因组中有一个被与外源核酸序列同源的序列围绕的/-&"位点，以得到具有靶向基因组修饰的卵，这种修饰相应于在基因组/-&"位点通过同源重组插入外源核酸序列。本发明人的发现能够证明，如果在体内可以实施用大范围核酸酶的同源重组机制，所述机制也可以足够的效率直接在卵母细胞或卵中进行，不影响所述生物体发育的程序进行时也如此。因此，本发明的方法能够得到具有靶向基因组修饰的卵或卵母细胞，并且可能直接得到遗传修饰的成熟生物，它具有一个这样的靶向基因组修饰，并且其全部细胞都如此。所述靶向基因组修饰这时可能相应于缺失或插入，特别地插入与野生序列相比突变的序列。卵或卵母细胞的细胞与正常细胞相比含有大量的细胞质，这样使得难以进入含有遗传物质的核中。另外，特别是用于保护卵的卵周围的膜(卵黄膜)和绒毛膜的存在制约进入该细胞。这些障碍物一般需要采用特别的技术，如直接注射细胞。可采用技术的复杂性制约了可能通过实验在几百个卵中进行处理的卵数量。在卵或卵母细胞中靶向基因组修饰方法的可行性因此需要诱导靶向基因组修饰进行的频率足以使本领域技术人员能够在实施这样一种方法时有获得成功的合理期望。显然，这样一种合理的成功期望在采用本发明的方法之前是不存在的。事实上，没有大范围核酸酶时，同源重组机制在卵中是一种非常稀少的遗传过程。这样一种同源重组频率很可能低于或等于在胚胎干细胞中观察的同源重组频率，即每百万细胞约一次事件。使用提高同源重组频率的大范围核酸酶，特别是在胚胎干细胞中(ES;COHEN-TANNOUDJI等人，1998，同前)，不再能使本领域技术人员实现合理的成功期望。事实上，即使在这种情况下提高同源重组频率，该频率至多达到频率6x10—6，这非常明显地使所述技术不可用于卵。相反，COHEN-TANNOUDJI等人的文章(1998,同前)建议本领域技术人员采用基于培养物中胚胎干细胞的同源重组方法，这些细胞的优势在于能够大量获得，并且在往胚泡期胚胎中注射获得靶向基因组修饰的稀少细胞后有可能得到转基因动物。因而，如果得到的转基因生物同时有由开始胚胎衍生的细胞和注射的遗传修饰的胚胎干细胞，这种转基因生物就称之"嵌合(mosaique)"。这时需要在这些所得动物之间进行杂交，以便得到所有细胞都是遗传修饰的动物。本发明的方法能够直接得到转基因动物，它们所有细胞都具有靶向基因组修饰。另外，在没有分离出胚胎干细胞的任何品系(lign6e)的生物的情况下，现有技术建议本领域技术人员分离这样一些细胞，并且本发明的方法决不能由这样一些生物的卵直接获得转基因动物。SEGAL和CAROLL的文章(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.92，第806-810页，1995)描述了在大范围核酸酶/-&6/存在下在x6nope卵母细胞中的同源重组机制。然而，在有/nSce-J位点而在基因组DNA中没有任何所述大范围核酸酶的位点的环形质粒中进行所述同源重组。另外，如果这篇文章证明在所述质粒获得同源重组，也不能预言应用基因组DNA机制的足够效率。与大范围核酸酶同时注射非常大量的这种质粒，该大范围核酸酶/-^^/没有固定在其位点时是不太稳定的。这个大量/-&"位点与这种共注射有利于该大范围核酸酶的稳定，但不能够在任何情况下预测在稀少位点存在下获得的同源重组频率，因为至多定位在该基因组DNA的几个拷贝中，并且因该基因组DNA紧密结构而增加了接近困难。能够合理地知道，染色质的结构和位点稀有性不能让大范围核酸酶在其没有降解之前到达其中一个位点。因此，本发明的第一个目的相应于生产具有耙向基因组修饰的非人脊椎动物卵母细胞或卵的体外方法，该方法包括a)核酸内切酶在卵母细胞或卵核中的表达步骤，其特征在于所述核酸内切酶以外源方式引入，其特征还在于所述卵或卵母细胞的基因组DNA具有至少一个所述核酸内切酶的识别位点，该识别位点相应于具有至少12个碱基对的特异核酸序列，因此允许(i)核酸内切酶特异序列固定在上述的识别位点；(ii)在所述的识别位点或在邻近区，优选地在所述识别位点的100个碱基对以下的区域内，通过所述核酸内切酶连续诱导在基因组DNA中的双链断开，然后(iii)通过同源重组机制修复所述双链断开；以及b)鉴定具有所需的靶向基因组修饰的卵或卵母细胞的步骤。卵应该理解是雄配子使雌配子授精而得到的单个细胞，并且它们包含了形成新生物所需要的全部潜力。更简单地，这种卵相应于细胞期的胚胎。卵母细胞应该理解是卵子发生(ovoger^se)成熟期时所得到的雌胚芽细胞。优选地，本发明的方法是生产具有靶向基因组修饰的非人脊椎动物卵的体外方法。作为在本发明方法中可以使用卵或卵母细胞的非人脊椎动物实例，可以列举哺乳动物，如啮齿类动物、羊、牛或非人灵长类动物，爬行动物；两栖动物，如x6nope;禽类，如母鸡；昆虫，如苍蝇，以及鱼，如斑马鱼或青鏘鱼(M6daka)。优选地，在本发明方法中使用的卵或卵母细胞是鱼的卵或卵母细胞，所述鱼如鲑鱼、鳟鱼、金枪鱼、庸鲽、鲶鱼、斑马鱼、青鲻鱼、鲤鱼、剌鱼、astyanax、罗非鱼、金鱼、狼舻、鲟鱼或鳕鱼。特别优选地，使用的卵或卵母细胞是斑马鱼(/^m'o^n》)或青鏘鱼(Oiz/o/a^as)的卵或卵母细胞。本发明的方法还毫无困难地应用于其它水生种类，如蛙、x6nope、虾、海胆。识别位点应该理解是一种特异核酸序列，它长度为至少12个碱基对，所述核酸内切酶特异性地固定在其上，并且在该核酸内切酶固定在所述序列后能够通过所述核酸内切酶诱导该DNA中的双链断开。优选所述识别位点相应于至少16个碱基对、特别优选至少18个碱基对的特异核酸序列。特异核酸序列应该理解是DNA序列，优选是双链DNA序列。可以采用本领域技术人员熟知的技术实施该鉴定步骤。作为实例，这个鉴定步骤可以釆用对从获得的卵或卵母细胞中分离的基因组DNA进行鉴定的Southern或PCR技术，这些技术分别采用探针或特异引物。在所述靶向基因组修饰相应于插入包含报告基因的外源核酸序列的情况下，所述鉴定步骤可以采用检测所述报告基因活性的技术。这样一些检测技术是随使用的报告基因而改变的，并且是本领域技术人员熟知的。在所述靶向基因组修饰相应于插入包含选择基因的外源核酸序列的情况下，所述鉴定步骤相应于所述卵或卵母细胞在合适培养基中的培养步骤。这样一个步骤的培养条件是随使用的选择基因而改变的，并且是本领域技术人员熟知的。根据一个特别实施方式，所述核酸内切酶的所述特异核酸序列相应于所述核酸内切酶确定的固定共有序列，或相应于由所述共有序列衍生的序列。事实上，某些核酸内切酶能被固定在一些序列上，而这些序列与其共有序列没有完全的相同性，并且在这种固定后能在其共有序列或邻近区发生双链断开。有利地，所述特异序列与所述共有序列具有90%以上的相同性，优选具有95%以上、特别优选具有98%以上的相同性。相同性百分比应该理解是在所述特异序列与所述核酸内切酶确定的所述固定共有序列之间具有相同性质与位置的核酸百分数。根据使用的核酸内切酶，或者在所述特异识别位点，或者在所述识别位点的邻近序列中，优选地在所述识别位点的100个碱基对以下，优选地在50个碱基对以下，特别优选地在20pb以下的邻近序列中，有可能在DNA中获得的双链断开。有利地，由核酸内切酶诱发的双链断幵位于该基因组DNA中的识别位点。所述识别位点可以存在于野生个体的基因组DNA中，或者通过转基因可以引入到所述基因组DNA中。根据本发明的优选实施方式，通过转基因将所述识别位点引入所述卵或卵母细胞的基因组DNA中。能够以靶向方式或随机方式将这个识别位点引入该基因组DNA中。有利地，或者在本发明方法中使用的所述卵母细胞或卵中，或者在能发育为性成熟的生物且来自于本发明方法使用的卵母细胞或卵的卵母细胞、卵或细胞中，进行通过转基因的所述引入。根据所述优选实施方式的一个特别实施方式，以靶向方式进行所述识别位点的引入。可以根据本领域技术人员熟知的技术通过同源重组进行这样一种靶向引入。作为实例，COHEN-TANNOUDJI等人(1998，同上)描述了在核中注射含有选择基因和大范围核酸酶的识别位点的载体，它们被与该基因组DNA的靶序列同源的核酸序列围绕。在选择已稳定整合该构建体的细胞后，特别地在使用合适的培养基时，鉴定在该基因组DNA中在期望的位置整合这种构建体的这些细胞，尤其采用Southern印迹法或采用PCR法。由于在这些条件下重组率低，所以具有靶向插入的细胞数也极低。有利地，通过同源重组将所述核酸内切酶的识别位点靶向引入该基因组DNA中。根据所述优选实施方式的第二个特别实施方式，以随机方式进行所述识别位点的引入。为此，可以采用不同的技术。作为实例，CHOULIKA等人(1998'《Mol.Cell.Biol.》，15(4)，第1968-1973页，1995年)描述了使用逆转录病毒载体将大范围核酸酶/-&6/的识别位点整合在基因组DNA中。PCT申请WO03/025183描述了另一种方法，将大范围核酸酶的识别位点通过同时在其核中微量注射大范围核酸酶和具有被两个/-^^/识别位点围绕的报告基因的DNA片段而随机整合在鱼卵基因组DNA中。还可能采用在这些实施例中描述的本发明核酸序列随机整合方法。有利地，采用在专利申请WO03/025183中描述的核酸序列随机整合方法或者采用在实施例中描述的核酸序列随机整合方法，将所述核酸内切酶的识别位点随机引入基因组DNA中。许多核酸内切酶能与具有至少12个碱基对的特异序列连接，接连地在所述特异序列中或在其邻近区诱导DNA双链断开，最后通过同源重组机制修复所述双链断开，这些核酸内切酶是本领域技术人员已知的。作为这样一些核酸内切酶实例，可以列举大范围核酸酶。大范围核酸酶组成一个酶家族，这些酶以非常低的频率使该DNA的双链断开。事实上，所述大范围核酸酶具有12-40个碱基对的识别位点，而通常的限制酶具有一般约4-8个碱基对的识别位点。在该基因组DNA中，这样一个识别位点的存在概率因此是极低的。这些大范围核酸酶还能从结构和机制观点充分进行表征。根据保守氨基酸基序可将这些大范围核酸酶分成四个不同的家族。十二肽家族(dod6camSre、DOD、DOD、Dl-D2、LAGLI6DADG、Pl-P2)是最重要的家族，有150个以上的序列，这些序列按照它们具有十二个氨基酸保守基序(十二肽)的一个拷贝(Z-Cew/、/-Oe/)或两个拷贝(/-C/iw/、/-Csm/、/-Dwo/、/-尸朋/、/-&e/、/-&e//、7-5be///、/-&eiy、F-&e/、尸/-如/、尸/-如/、P/-Cew/、尸/-Cz>/、尸/國CVW、尸/-Dra/、P/H尸/-耀/、尸/-Mgo/、尸/,a/、iV-緣oT、尸/-Me/、iV-Mh//、户/者淑、尸/-尸淑/、户/-尸/w/、户/画/Vzo/、iY-尸Ao/、尸/-/、户/-/附"/、尸/U、户/-鄉/、尸/-，/、尸/-窗、尸/-77///、尸/,/、iV-7Jp//、尸/-~/、尸/H尸/-攀/、尸/-Mga/、尸/-Mgfl//、尸/H尸/-MmaT、P/H尸/-Myw//、iY-Mf/z/,P/-r"g/、尸/-77^/7)再分组。具有一个十二肽的大范围核酸酶具有约20kDa的分子量，并且以同型二聚体形式起作用。具有两个十二肽的大范围核酸酶具有约25-50kDa的分子量，其中在这两个基序之间有70-150个残基，并且它们是单体形式活性的。GIG家族具有完全保守基序KSGIY-X1()m-YTGS(/-A/cT/、/-A^r//、/朋//、/-7^7)或部分保守基序(/-7^/7)，并且这个家族的酶将该DNA在与其识别位点不同的位点切割。HC家族具有富含组氨酸和半胱氨酸的序列(/^o;/、/-1^>/、/-/^"/、/-//mW/i)，一般还有大致相应于"SHLC-G-G-H-C"的保守序列。这个家族表征最好的大范围核酸酶是酶/-/^0/。HNH家族具有在35个残基窗(fen§trede35residues)中的共有序列"HH-N-H-H"与DNA切割的特别性质(/-7^//7)。然而，还曾鉴定不能并入这四个家族的不同大范围核酸酶。迄今，这些大范围核酸酶总共五个，相应于F&e/、i^ce//(7/0、F-5W/、F-rev/禾口FU。然而，所有这些大范围核酸酶都能在具有识别位点的DNA中诱导双链断开，在其中或在其邻近区中特别如此。另外，许多大范围核酸酶具有核定位信号(NLS)。这种蛋白序列能够有利于所述大范围核酸酶进入核，因此由其介导同源重组。大范围核酸酶/-5^/是这样一种大范围核酸酶的实例。然而，在野生大范围核酸酶没有这样一种核定位信号的情况下，本领域技术人员可以构建具有这样一种信号的衍生的大范围核酸酶，可以根据生产重组蛋白的熟知的分子生物学技术进行。根据本发明方法的第二个优选实施方式，使用的核酸内切酶是一种大范围核酸酶或由这样一种大范围核酸酶衍生的酶，其可以是合成的。作为大范围核酸酶的实例，可以列举大范围核酸酶/-(^"/、/-CVe/、/-C7m/、/-C《w/、/國Z)mo/、/-尸""/、/-Sce/、/-5^//、7-5fce///、7-&e/K、F-&e/、F-&e//、尸/-如/、户/如/、尸/-Cew/、户/-0/、尸J-ar/、尸/-"ra/、/Y-Mn7"、尸/-単/、iV-Mgo/、尸/-攀/、尸/-廳/、尸/-她/、尸嵐w/、iV-Mfwffl、尸/"P/w/、iY-尸/zo/、尸/-/W、尸/却/、尸/-肠/、尸/-5^/、尸/-5^/、iV-^fw/、/Y-7W、iY-打氾、P/-Kp/、尸/-7^//、i^-^p/、/YHW-,a/、iV-Mga/、iV-Mg"//、尸/H尸/-M廳/、尸/HiY-Myw//、iV-M/2/、尸/-rag/、尸/-772_y//、/-Mr/、/-H/-服、/-尸op/、/-A>/、/-//mw/、/-Www//、/-rev//、/-7fev///、F-5be/、f/f0、F-S"v/、尸-7^//#^-7^//或由其中一种衍生的大范围核酸酶。这些不同大范围核酸酶的识别位点与特异性是本领域技术人员熟知的，并且特别地在http://rebase.neb.com中描述。优选地，所述大范围核酸酶是在专利US6,238,924中描述的大范围核酸酶/-5^/。衍生的大范围核酸酶或由大范围核酸酶衍生的酶应理解是一种重组蛋白，其具有野生大范围核酸酶序列并且能识别与所述野生大范围核酸酶不同的识别位点和/或在不同部位或者根据与所述野生大范围核酸酶不同的机制使DNA双链断开。所述衍生的大范围核酸酶还能够通过同源重组机制修复所述双链断开。作为这样衍生的大范围核酸酶的实例，特别地可以列举重组大范围核酸酶，其与DNA连接的结构域衍生自与该DNA连接的其它蛋白，如IIS型的限制核酸内切酶或转录因子。作为这样衍生的大范围核酸酶的实例，还可以列举重组大范围核酸酶，其具有一或多个其衍生自的野生大范围核酸酶没有的核定位位点。该核酸内切酶能够以外源方式以不同形式，即以蛋白形式或以能够在卵或卵母细胞中表达所述核酸内切酶的核酸序列形式引入所述卵或卵母细胞中。根据本发明方法的第三个优选实施方式，核酸内切酶以蛋白形式引入卵或卵母细胞中。能够以蛋白形式引入这样一种核酸内切酶的技术是本领域技术人员熟知的。作为这样一些技术的实例，特别地可以列举微量注射法。有利地，以外源方式引入的所述核酸内切酶的浓度是每微升每个卵或卵母细胞为0.1-5单位，优选地每微升0.5-2.5单位，特别优选地每微升l-2单位。每个卵或卵母细胞注射的体积是本领域技术人员一般知识的一部分，是其体积的约10%。作为实例，能注射到斑马鱼或青鏘鱼的卵或卵母细胞中的体积是300pl至lnl。因此每卵或卵母细胞引入核酸的量是0.3xl0"至5xl0一3单位，优选地是1.5xl0—"至2.5xl0—单位，特别优选地是0.3xl0—s至2xl0_3单位。根据本发明方法的第四个优选实施方式，以能够在所述卵或卵母细胞中表达核酸内切酶的核酸分子的形式引入所述核酸内切酶。所述核酸分子因此包括能在所述卵或卵母细胞中表达所述核酸内切酶的调节序列控制下的编码核酸内切酶的开放读框。核酸分子应该理解是DNA、RNA分子与DNA/RNA杂合分子，其可以是单链或双链形式。作为可用于本发明方法的核酸分子的实例，可以列举编码核酸内切酶的mRNA分子或含有编码所述核酸内切酶的开放读框的表达载体。表达载体应该理解是一种核酸分子，其能输送并能表达以可操纵方式与其连接的感兴趣的核酸序歹lj。这样一种表达载体含有能在卵或卵母细胞中表达所述核酸内切酶的启动子序列。作为这样启动子的实例，特别地可以列举on-微管蛋白或a-肌动蛋白的启动子，或本领域技术人员熟知的强组成型启动子，例如巨细胞病毒启动子(CMV)。所述表达载体还能含有其它的调节序列，其相应于复制起点、核糖体固定位点、一或多个插入位点、多腺苷酸化位点或转录终止位点。在本发明方法中可使用的表达载体可以非限制性地相应于YAC(人工酵母染色体)、BAC(人工细菌染色体)、病毒载体、质粒载体、噬菌粒、粘粒、RNA载体、由杆状病毒、噬菌体、转座子或线'性或环状RNA或DNA分子衍生的载体。这样的载体是本领域技术人员熟知的。作为病毒载体的实例，特别地可以列举逆转录病毒、腺病毒、细小病毒、冠状病毒、正黏病毒、弹状病毒、副粘病毒、小RNA病毒、甲病毒属、腺病毒、疱疹病毒、痘病毒。优选地，使用的表达载体是质粒载体。在卵或卵母细胞中引入核酸分子的技术是本领域技术人员熟知的。作为这样技术的实例，可以列举微量注射、电穿孔、借助脂质体或修饰的脂质的转染，例如lipofectamine⑧(INVITROGEN)或借助磷酸钙沉淀的转染。优选地，采用微量注射进行这种引入。在同源重组之后在DNA的双链断开位点处引入的靶向基因组修饰可以是在断开位点两侧的两个基因组DNA的同源序列之间进行重组的情况下的基因组序列缺失，或者是在外源核酸序列与基因组DNA之间在同源区进行重组的情况下的插入。根据本发明方法的第五个优选实施方式，所述方法还包括在卵母细胞或卵中引入外源核酸序列的步骤，该序列与位于基因组DNA中的核酸内切酶的识别位点上下游的核酸序列具有同源性。外源核酸序列应该理解是引入卵或卵母细胞中的双链DNA序列，该序列可以为线性或环状形式。优选地，所述外源核酸序列为环状形式。有利地，给予每个卵或卵母细胞的核酸序列浓度是每微升l-50ng，优选地每微升5-40ng，特别优选地每微升10-30ng。如前所述，注射每个卵或卵母细胞的体积是本领域技术人员的一般知识的一部分，是其体积的约10%。作为实例，在斑马鱼或青鏘鱼的卵或卵母细胞中能注射的体积是300pl至lnl。因此每个卵或卵母细胞引入的核酸量是0.3-50pg，优选地1.5-40pg，特别优选地3-30pg。根据所述优选实施方式的特别实施方式，所述外源核酸序列衍生自基因组序列，特别是所述基因组序列的突变形式或来自其它个体或其它生物的所述基因组序列的同种型。在这种情况下，同源重组机制引起外源核酸序列插入，这与"取代"基因组序列类似。根据所述优选实施方式的第二个特别实施方式，所述外源核酸序列包括感兴趣的核酸序列，其被两个不同核酸序列围绕，这些核酸与分别定位于基因组DNA中核酸内切酶识别位点上下游的核酸序列具有同源性。所述感兴趣的核酸序列可能相应于基因或调节序列(如启动子或激活剂)，希望采用本发明方法测定得到的转基因脊椎动物中其相关活性和/或表型。该感兴趣的核酸序列可以包括报告基因，如p-半乳糖苷酶、GFP(绿色荧光蛋白)、RFP(红色荧光蛋白)或对潮霉素磷酸转移酶、组氨醇脱氢酶或胸腺嘧啶核苷激酶的选择基因，如新霉素磷酸转移酶。使用这样一种选择报告基因可能有利于鉴定具有寻求的靶向基因组修饰的卵或卵母细胞。优选地，所述报告基因或选择基因不包括相关启动子序列，以便鉴定具有相应于寻求的靶向基因组修饰的期望表达谱的卵或卵母细胞。有利地，这种或这些核酸序列与位于核酸内切酶的识别位点上下游的核酸序列具有同源性，它们的长度是至少50个碱基对，优选地至少100个碱基对，特别优选地至少250个碱基对。所述这些序列可以有较大的尺寸，然而IOOO个碱基对以上的尺寸并不能提高同源重组的效率。还有利地，所述同源核酸序列与位于基因组DNA中的核酸内切酶识别位点上下游的核酸序列具有至少80%的序列相同性，优选地至少90%的相同性，特别优选地至少95%的相同性。两个核酸序列之间的相同性相应于位于两个核酸序列之间相同位置的相同核苷酸的百分数。许多程序或算法都能够计算相同性百分数，其中包括FASTA或BLAST。这些程序特别地从NCBI(国家生物技术信息中心；http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得。优选地，采用BLAST程序确定这种同源性，特别优选地采用使用BLOSUM62矩阵的BLAST程序确定这种同源性。有利地，所述外源核酸序列是一种载体。载体应该理解是一种能转运一种与其连接的感兴趣核酸序列的核酸序列。作为本发明方法可使用的载体实例，非限制性地可以列举YAC(人工酵母染色体)、BAC(人工细菌染色体)、合适的病毒载体例如腺病毒、质粒载体、噬菌粒或粘粒。优选地，使用的载体是质粒载体。有利地，所述外源核酸序列没有该核酸内切酶的任何识别位点。核酸序列引入卵或卵母细胞中的技术是本领域技术人员熟知的。作为这样技术的实例，可以列举微量注射法、电穿孔法、借助脂质体或修饰脂质的转染，例如lipofectamine(INVITROGEN)，或借助磷酸钙沉淀的转染。优选地，采用微量注射技术进行这种引入。相对于核酸内切酶序列或与有可能表达所述核酸内切酶的核酸分子，可以不同或同时引入所述外源核酸序列。优选地，它们的引入是同时的。根据本发明方法的第六个优选实施方式，本发明的方法还包括在适当条件下培养具有靶向基因组修饰的预先授精的卵母细胞或卵以便能使非人脊椎动物发育的步骤。有利地，采用的培养条件能使非人脊椎动物发育。这些培养条件以及卵母细胞授精技术是本领域技术人员熟知的，并且随本发明方法中使用的生物而改变。作为实例，对于斑马鱼或青贿鱼卵，这个培养步骤相应于在温度约28'C(高或低1或2"C)下温育这些卵。根据本发明方法的第七个优选实施方式，所述方法还包括在培育步骤前的一个步骤，该步骤相应于在低于该培育温度5-2(TC、优选地低于10-15'C的温度下温育这种卵，期间能够保持卵的成活力(即达到直到孵化的卵数)高于5%，优选地高于10%，特别优选地高于15%。本领域技术人员可以很简单地确定这些卵或卵母细胞能保持的最长时间，而这个时间随使用卵或卵母细胞在所述温度的耐受而改变。有利地，进行这样一种温育的时间是1-24小时，优选地1-20小时，特别优选地1-10小时。作为实例，在青鏘鱼卵的情况下，这个预先步骤相应于在温度10-25°C，优选地12-19"C，特别优选地13-18X:下温育。有利地，使用授精后所述卵或卵母细胞发育时得到的非人脊椎生物的细胞，优选地使用来自成熟的非人脊椎生物的细胞，进行具有寻求的靶向基因组修饰的卵或卵母细胞的鉴定步骤。通过下面的实施例将体会到本发明的其它优点与特征。实施例l:在青鏘鱼的基因组中随机插入I-SceI位点npqTI-EGFP-I构建体已通过在质粒pa!TI-EGFP中(Goldman等人，《TransgenicRes.》，10(1)，第21-33页，2001年；HIEBER等人，《J.Neurobiol.》，37(3)，第429-440页，1998年))，在斑马鱼的a-微管蛋白启动子与EGFP(增强型绿色荧光蛋白)的报告基因之间插入大范围核酸酶的识别位点得到构建体paiTI-GFP-I。在第一个步骤，用酶加Aw/Z/(BIOLABS)消化构建体paJI-EGFP,然后纯化该消化的构建体。用S"m/Z/消化的构建体paiTI-EGFP再进行脱磷酸化，然后再进行纯化。最后，在用万a附H/消化并脱磷酸化的构建体pa,TI-EGFP与含有位点/-&6/(以黑体字表示)的双链寡核苷酸以及与消化位点相容的粘性自由末端之间进行连接反应(有义寡核苷酸(SEQIDNO:1):5'画GATCATAGGGATAACAGGGTAATA-3';反义寡核苷酸(SEQIDNO:2):5'-GATCTATTACCCTGTTATCCCTAT-3')。通过测序证实了在a,微管蛋白的启动子序列与EGFP的开放读框序列之间5aw/f/位点的的识别位点的插入和定向以及与读框的一致性。2)pact-GFPI2构建体如THERMES等人所述(《MechanismsofDevelopment,第118巻，第91-98页，2002年)得到了构建体pact-GFPI2。已通过测序证实了分别在斑马鱼的a-肌动蛋白启动子上游与GFP(绿色荧光蛋白)的报告基因下游的大范围核酸酶的两个功能识别位点的插入和定向。3)构建体pqTI-EGFP-I和pact-GFPI2的线性化:用酶Wo/和力//(810!^68)消化构建体pa!TI-EGFP-I已得到线性化形式的转基因a,TI-EGFP-I。然后用柱QIAEXII⑧(QIAGEN)纯化了含有该转基因的片段XhoI-AflII，再用柱Elutip-D(SCHLEICHERANDSCHUELL)过滤。用大范围核酸酶(ROCHEDIAGNOSTICS)消化构建体pact-GFPI2得到了线性化形式的转基因act-GFPI2。含有该转基因的片段I-scel-I-Scel再如前所述进行纯化。4)微量注射转基因和大范围核酸酶/-&6/根据Thermes等人(2002，同前)描述的方案，在有或没有大范围核酸酶的情况下，将不同的DNA注射到细胞期的青鏘鱼卵中。在进行的这些实验中，注射了线性化形式(片段XhoI-AflII)的转基因a,TI-EGFP-I以及线性化形式(片段Iscel-I-Scel)或环状形式(pact-GFPI2)的转基因act-GFPI2。5)转基因在卵(FO)中的表达:为了跟踪转基因在这些微量注射卵中的表达，在配备紫外灯(在370-420nm激发)与GFP的455nm发射滤光片的放大镜LEICAMZFLIII下观察了胚胎的荧光。在预备实验中，其中在细胞期的卵中微量注射了仅仅环状形式的质粒paiTI-EGFP,结果表明在神经发生期间并且直到孵化(授精后9天，st,39)在SNC中可检测GFP的荧光。更确切地，构建体pa,TI-EGFP的瞬时表达实验揭示了在青鏘鱼中，主要在增殖过程的细胞中，斑马鱼的on-微管蛋白启动子在中枢神经系统被激活。该构建体的比活性因此显示出与GOLDMAN等人(20(U，同前)描述的斑马鱼中的比活性类似。对于转基因a!TI-EGFP-I，结果表明与卵中构建体pa,TI-EGFP类似的表达谱。转基因act-GFPI2表达谱本身与THERMES等人(2002，同前)观察到的类似。在不同微量注射实验中表达这些转基因的胚胎比例列于下表I中。表I<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>没有大范围核酸酶时，观察到在微量注射后还存活的近50°/。胚胎没有显示出荧光。相反地，在大范围核酸酶存在下微量注射这些不同转基因时，观察到表达GFP的胚胎比例有很大的增加。因此，这些结果表明在大范围核酸酶存在下，转基因ct,TI-EGFP-I表达的阴性胚胎是所有注射胚胎的约10%(12%，n=116)，即低于使用转基因act-GFPI2达到的比例(16%)。通过共注射该大范围核酸酶大大改善了F0代的转基因的瞬时表达。6)转基因传递给后代:选择表达所述转基因的FO代鱼作为可能的起始生物(fondateur)。饲养这些起始生物直到它们性成熟，这时与野生伙伴杂交。分析后代(F1)胚胎的转基因表达。结果列于下表II中。表II<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>这些结果表明，在对照注射的情况下(没有与/-See/共注射)，大多数试验鱼的GFP不是阳性的。这意味着在F0生殖品系(lign6egerminale)的细胞中没有所述转基因。在被两个/-5^/识别位点围绕的转基因act-GFPI2的情况下，观察到近30%个体稳定地将该转基因整合在其基因组中。提出的机制相应于THERMES等人(2002，同前)描述的机制，根据这个机制，所述大范围核酸酶能够将被两个其识别位点围绕的转基因整合在基因组中。按照提出的模型，该转基因会被大范围核酸酶切除，该大范围核酸酶保护自由末端，然后还能将切除的转基因随机整合在基因组中。令人惊奇地观察到，在与转基因^TI-EGFP-I和ASbe/共注射的并试验传递的19个胚胎中，4个(即21%，n二19)产生了表达GFP的后代。因此似乎THERMES等人(2002，同前)提出的模型没有考虑在大范围核酸酶存在下转基因的插入机制，因为没有位于这些末端的立即末端(proximit6imm6diate)的唯一一个识别位点的存在还能以很高频率将该转基因稳定整合在该基因组中。通过转基因a,TI-EGFP-I整合得到的4个起始生物个体称之F0.191、F0.25I、F0.34I和F0.36L来自这些起始生物的Fl个体在SNC中有均匀的绿色荧光，而该绿色荧光在早神经胚期从神经发生开始也是可观察到的(25hpf,st.17)。在起始生物？0.251的情况下，来自它的F1个体具有多种GFP表达水平。通过荧光增加顺序区分低、中、高表达GFP的个体(分别称之F0.25-1、F0.25-2和F0.25-3)。Fl的这样一些变化可能归因于FO中整合在该基因组中的不同转基因联体(concagm§res)分离成三个在遗传上不同的整合位点。这些胚胎(F1)培养直到孵化，孵出仅仅具有低和中等荧光的胚胎，生出性成熟的成体鱼。该转基因传递到下一代(即F2、F3和F4)依然是均一的，这证实了该转基因的稳定整合。根据在阳性Fl个体后代中转基因的表达估算了起始生物个体的平均传递比率。得到的比率变化很大，且低于50%。在转基因a,TI-EGFP-I的情况下，该平均值是30±12.5%。四个起始鱼中的唯一一个(F0.19I)这时会明显地达到50%的传递，这相应于半合子传递百分数。在这种情况下，可能的是在FO中，在生殖品系的所有细胞中该转基因被整合在唯一一个位点。最终，这些结果表明在两个或单个I-SceI位点存在下，该转基因整合在生殖品系中的效率明显提高。7)转基因整合在该基因组中的分析:根据SAMBROOK等人描述的方案(CSHLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,1989)，使用蛋白酶K和苯酚，由Fl成体转基因鱼提取基因组DNA。7-A.转基因qTI-EGFP-I:对于使用转基因a,TI-EGFP-I的Southern印迹实验，用Sac/或WW/消化基因组DNA，使用0.8。/。琼脂糖凝胶(TAElx)分离，再通过毛细作用转移到硝酸纤维素膜上，该膜已用特异探针杂交，而该探针已随机地用放射性核苷酸("P)进行标记。这个探针相应于EGFP序列。在用银胶片曝光几小时后用感光成像仪(phosphoimager)显示转基因的杂交。这些结果示于图l中。对于品系F0.19,用S^/消化(用所述探针识别所述区域外存在的位点)揭示有两个大小约4kb的强条带和多个小尺寸条带(2kb与约3kb)。两个约4kb的条带可能分别相应于类型I的正向串联与反向串联的转基因插入(分别见图2A和2B)。对于小尺寸条带(2kb与约3kb)，它们非常可能相应于在整合的DNA与基因组DNA之间的连接片段。与该连接片段相比，两个4kb条带的强度表明在该基因组中大量存在这两类串联，并且比例相似。对于品系F0.25-l和-2，结果表明存在两个4kb诊断条带中的唯一一个(图l，箭头)。与F0.19的谱比较表明，或许涉及类型I的反向串联的联体形式(图2B)。这些条带的低强度暗示了在这些品系中存在少量的转基因拷贝。通过^4ge/(所述探针识别区域之外；未显示数据)和消化(在该转基因中没有位点；未显示数据)证实了这三种品系的这些结果。使用iVw/消化能够分析品系的类型II的反向串联形式的存在(图2C)。这些结果表明，仅品系F0.19具有这样一些整合(图1，星号)。分析品系F0.36的基因组DNA揭示与品系F0.19的DNA的相同的消化谱(未显示数据)。因此，两个品系F0.25具有插入谱，其具有多个单一联体与少量拷贝(类型I的反向串联)。7-B.转基因act-GFPI2:THERMES等人(2002，同前)描述了用这种转基因得到的转基因品系的分析结果。这些结果还表明在不同试验品系的基因组DNA中有少量转基因拷贝(l-8个拷贝)的插入谱。最后，使用大范围核酸酶/-&"和有其一或两个识别位点的构建体，在大多数分析的品系中都能够得到在单一拷贝或少量拷贝形式的基因组中稳定整合的报告基因。因此与在基因组中观察到大量插入的转基因中通常采用的技术相比(HACKETT,《BiochemistryandMolecularBiologyofFishes》，Elsevier,第207-240页，1993年；IYENGAR等人，《TransgenicRes.》，第5巻，第147-166页，1996年)，这两种随机插入技术是优秀的技术。8)整合的I-Scel位点的完整性:在期望使用这些得到的转基因品系进行用大范围核酸酶/-5^/的同源重组并且特别有可能靶向整合感兴趣基因的情况下，重要的是在该基因组中这个或这些整合的/nSce/位点应是功能性的。为了体外试验在品系F0.25-1、-2、F0.19和F0.36的基因组中整合的I-Scel位点的完整性，纯化了这些品系的基因组DNA。所述基因组DNA然后采用PCR借助特异引物进行扩增，该引物定位于/-&^/识别位点两侧(图3A)。扩增的DNA片段长度是500个碱基对。得到的PCR产物然后用酶/-5^/(ROCHEDIAGNOSTICS)按照生产商的产品说明书进行消化，最后置于电泳凝胶上。这些结果示于图3B。该反应产物在凝胶上的迁移显示有约500pb的条带，该条带相应于未断开的DNA，还有200和300pb的两个其它小条带(断开的DNA，图3A和3B)。500pb条带的存在可能是由不完全的酶消化或存在突变的/-5^/位点造成的。在所有这些情况下，这些结果表明4个分析的品系都具有未突变的功能性/-&￡/位点，它们的数量随分析的品系而改变。实施例2:在具有I-Scel位点的青鏘鱼转基因品系的基因组中转基因的耙向插入1)修复构建体(constructionder印aration，CR):为了以靶向方式将转基因整合在青鲻鱼的基因组中，我们试验了缺口(br&he)修复技术。为此，我们使用了含有wii^示踪基因(单体红色荧光蛋白)的第二种转基因，其两侧被至少500pb序列围绕，该序列与围绕转基因aiTI-EGFP-I的/-&6/位点的区域完全同源(01，修复构建体)。5'同源区相应于启动子aiTI的内含子序列，这样因此排除了游离型(6pisomale)形式的m//^7表达的任何可能性。为了实现这种构建体，纯化相应于位于/-&"位点两侧同源区的质粒piTI-EGFP(1.7kb)的Sacl-Notl片段，并在通过&c/-A^/消化进行线性化的载体pCRII-TOPO⑧(Invitrogen)中克隆。通过测序证实获得了RH载体。同时，相应于mRFP]的ORF的质粒mRFP广pRSETB的BamHI-EcoRI片段(Campbell等人，《Proc.Natl.Acad.Sci.USA》,99(12)，第7877-82页，2002年)在EGFP位置，在BamHI与Notl位点之间在质粒pJI-EGFP中已进行亚克隆(sousclon6)。得到的构建体作为在每个末端添加BglII位点时采用PCR扩增序列mRFP,-PolyA的模板(有义引物(SEQIDNO:3):5'國GAAGATCTCTTAAGCATGGCCTCCTCCGAGGAC-3';反义引物(SEQIDNO:4):5'-CCTAGATCTGCTAGCATACATTGATGAGTTTGGAC-3')。得到的PCR产物克隆在质粒pCRII-TOPO(Invitrogen)中，并且通过测序证实了该序列。然后在进行这种构建体的Sg/II消化时分离片段mRFP,-PolyA。最后，在构建体RH的BamHI位点引入片段mRFPrPolyA(^g/11消化)时产生了修复构建体(CR)。在构建体PlTI-EGFP中引入这同一片段mRFPrPolyA时产生了对照构建体pa,TI-mRFPl-EGFP。2)微量注射修复构建体和大范围核酸酶I-Scel根据Thermes等人(2002，同前)描述的方案，将环状形式的修复构建体与大范围核酸酶I-SceI共注射到细胞期的青鏘鱼卵中。使用的卵来自转基因鱼品系(F3、F0.25-l和-2、F0.19和F0.36)。用试剂盒Midiprep⑧(Qiagen)扩增并过滤(0.2jim过滤器)后，在浓度为每^1个单位的I-Scel存在下，注射终浓度约lOng/pl的环状修复构建体(CR)。在注射细胞期青鏘鱼卵后，把卵置于28t:的孵箱中直到孵化。同时，为了检査mRFPl的正确表达，按照同样的方案，在细胞期的青鏘鱼卵中只是注射对照构建体ponTI-mRFPl-EGFP。注射该构建体导致mRFPi在该胚胎中很好表达，没有绿色荧光。3)mRFPl在卵(T0)中的表达为了跟踪在这些微量注射的卵中在其过程中的转基因表达，在配备紫外灯(在580-590nm激发)与mRFPl在607nrn发射的滤光片的放大镜LEICAMZFLIII下观察了胚胎的荧光。这些注射胚胎在接近期28期(30个体节(somites),64hpf)和32期(体节发生(somitogen6se)结束，授精后4天)在该放大镜下观察到其绿色和红色(特别)荧光。这些实验能够分离来自品系F0.25-l的阳性mRFPl胚胎(简单联体形式的低GFP表达和转基因整合)。红色荧光只是在SNC中检测到这种荧光弱而均匀，因此暗示该转基因在这些初期卵裂球(premiersblastomferes)中同等分酉己(^partition6gale)。如果(i)这种表达谱相应于用构建体pa,TI-mRFPl-EGFP得到的谱和(ii)该修复构建体没有功能a,微管蛋白的启动子，则可能的是得出下述结论基因mRFPl被特异性地整合，并通过同源重组，整合在(X,微管蛋白的启动子上游，并在与预先整合在品系F0.25-l基因组中的至少一个I-Scel位点处。这些结果因此表明，可以用大范围核酸酶在青鏘鱼卵基因组中获得共注射的转基因的特异插入(通过同源重组)，所述青鲻鱼卵基因组有几个拷贝的这样一种大范围核酸酶的识别位点。4)微量注射条件改变:由2)描述的条件出发，或者彼此独立地，或者全部地，试验了该方案的不同变化。试验变化表如下-增加修复构建体的量直到最高50ng/ml;-增加大范围核酸酶的量直到最高2单位/W-降低注射后卵的孵化温度，直到这些卵置于28'C之前在最低13°C下2-16小时。如前所述，在得到的胚胎中跟踪mRFP的表达。结果列于表III。表III<table>complextableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>这些结果表明，获得特异插入的最有利的条件是2单位/ml大范围核酸酶I-Scel和25ng/mlDNA。另外，这些结果还表明，微量注射后接着在低于28"C的温度下孵化卵能够显著提高具有标记的个体率(微量注射后在13t:孵化4h时接近3%)。实施例3:借助其它大范围核酸酶在青鏘鱼转基因品系基因组中耙向插入转基因首先按照实施例1的方案进行随机整合，但使用大范围核酸酶I-Crel和I-Ceul与分别在斑马鱼a/微管蛋白启动子与EGFP报告基因之间含有大范围核酸酶I-Crel的识别位点(SEQIDNO:5;5'-CTGGGTTCAAAACGTCGTGAGACAGTTTGG-3')禾卩I-Ceul的识别位点(SEQIDNO:6:5'-CGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAA-3')的构建体。这些构建体与进行靶向插入所采用的方案与前面实施例2描述的相同，但是使用大范围核酸酶I-Crel禾口I-Ceul(NEWENGLANDBIOLABS)。权利要求1、生产具有靶向基因组修饰的非人脊椎动物卵母细胞或卵的体外方法，该方法包括如下步骤a)在卵母细胞或卵的核中表达核酸内切酶，其特征在于以外源方式引入所述核酸内切酶，其特征还在于所述卵或卵母细胞的基因组DNA具有至少一个所述核酸内切酶的识别位点，该识别位点相应于至少12个碱基对的特异序列，因此允许(i)该核酸内切酶特异序列固定在所述的识别位点；(ii)在所述的识别位点或在其邻近区，优选地所述邻近区在所述识别位点的100个碱基对以内，通过所述核酸内切酶连续诱发该基因组DNA双链断开，然后(iii)通过同源重组机制修复所述的双链断开；以及b)鉴定具有所需靶向基因组修饰的卵或卵母细胞。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于在该基因组DNA中存在的所述识别位点通过转基因引入。3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述核酸内切酶是大范围核酸酶。4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于该大范围核酸酶选自/-Cew/、/-Oe/、/-C7m/、/-Csw/、/-Z)mo/、/-尸朋/、/-Sce/、/-5^//、7-Scei7J、7U、F-&e厶FH尸"ae/、尸/-如/、P/-Ce"/、P/-Cz>/、尸/-0/、P/-i>a/、尸/-Mav/、iV-，、iV-Mgo/、尸/-毕/、尸/-施/、iYU、尸慮"/、iY-M威/、J°/-iW//、户/-，/、户/-尸M、尸/-尸W、户/,/、尸/A廳/、尸ASbe/、尸/-&//、尸/-^7^/、iV-77//、iY-77氾、尸J-7Jp/、尸/-7^//、尸/-万《/7/、尸/-McW、iY-泽/、/Y-M一、尸7-Mga//、尸/-倫/、尸/-M廳/、尸/插柳仏P/-Mf/z/、尸/-7^/、户/-77^//、/H/-細//、/一7fev/、/-尸op/、/-DW、/-//mw/、/-//mw//、/-7fev//、/-rev///、尸-&"、F-&e//(^Q)、F-<Swv/、F-7fev/和F-revi7或由它们衍生的大范围核酸酶。5、根据权利要求1-4中任一项权利要求所述的方法，其特征在于每个卵或卵母细胞以外源方式并以蛋白形式引入的所述核酸内切酶的浓度是每微升0.1-5单位，优选地每微升0.5-2.5单位。6、根据上述权利要求中任一项权利要求所述的方法，其特征在于在断开位点的靶向基因组修饰相应于缺失或插入。7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于该方法还包括在卵母细胞或卵中引入外源核酸序列的步骤，该外源核酸序列与位于该基因组DNA中核酸内切酶识别位点上下游的核酸序列具有同源性。8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于该引入的外源核酸序列没有任何所述核酸内切酶的识别位点。9、根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于给予每个卵或卵母细胞的核酸序列的浓度是l-50ng/|Lil，优选地5-40ng/]id。10、根据权利要求7-9中任一项权利要求所述的方法，其特征在于所述外源核酸序列包括被两个不同的核酸序列围绕的感兴趣的序列，这些不同的序列与分别位于该基因组DNA中核酸内切酶的识别位点上游和下游的核酸序列具有同源性。11、根据上述权利要求中任一项权利要求所述的方法，其特征在于非人脊椎动物卵或卵母细胞是哺乳动物、爬行动物、两栖动物、禽类、昆虫或鱼类的卵或卵母细胞。12、根据权利要求11所述的方法，其特征在于非人脊椎动物的卵或卵母细胞是选自鲑鱼、鳟鱼、金枪鱼、庸鲽、鲶鱼、斑马鱼、青鏘鱼、鲤鱼、刺鱼、astyanax、罗非鱼、金鱼、狼鲈、鲟鱼和鳕鱼的卵或卵母细胞。13、根据上述权利要求中任一项权利要求所述的方法，其特征在于该方法还包括在适合于能使非人脊椎动物发育的条件下培养具有耙向基因组修饰的预先受精的卵母细胞或卵的步骤。14、根据权利要求13所述的方法，其特征在于该方法在该培养步骤之前还包括一个步骤，该步骤相应于在低于该培养温度5-2(TC、优选低于10-15-C的温度下孵化所述卵或卵母细胞，且在孵化期间能够保持相应于达到孵化的卵的卵成活力高于5%，优选地高于10%。15、根据权利要求14所述的方法，其特征在于在该培养步骤之前的所述步骤相应于进行孵化1-24小时，优选地1-20小时。全文摘要本发明涉及生产具有靶向基因组修饰的非人脊椎动物卵母细胞或卵的方法，还涉及在宿主细胞基因组DNA中随机整合外源核酸序列的方法。文档编号C12N15/90GK101175858SQ200580043072公开日2008年5月7日申请日期2005年12月19日优先权日2004年12月17日发明者F·索姆,J-S·若利,V·瑟姆斯申请人:国立农业研究所-Inra