专利名称：一种消化卵母细胞透明带的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说涉及一种消化卵母细胞透明带的方法。
背景技术：
透明带是一均质而明显的半透膜，是由卵泡细胞和卵母细胞形成的细胞间质，可以被蛋白分解酶如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶所溶解。在哺乳动物卵裂球分离或胚胎细胞做供体核进行克隆时均需要消化透明带以获得卵裂球。
目前取得卵裂球的方法主要有三种一种是用蛋白酶消化透明带，然后用微管把胚胎分散成单个卵裂球；另一种方法是用尖锐的吸管穿过透明带吸出胚胎中的卵裂球；第三种是用酸化法消化透明带。酸化法(Tyrode’s，pH2.5)作用时间快，但要求操作迅速，时间过长所获得的卵裂球容易裂解死亡，时间不够时透明带不能完全溶解；酶化法对卵裂球的体外发育没有不利影响，但一定要掌握好处理条件和时间，而且利用酶消化透明带的费用较高，每克胰蛋白酶182.7美元。因此，上述方法均有不足之处。
发明内容
(一)要解决的技术问题本发明目的在于针对上述不足提供一种新的消化卵母细胞透明带的方法。
(二)技术方案谷胱甘肽是一种小分子水溶性巯基，作为一种还原剂，可以反映细胞的抗氧化活性而成为细胞内氧化还原的指示剂。经研究发现，谷胱甘肽溶于生理盐水后，还原型谷胱甘肽被空气中的氧所氧化生成氧化型谷胱甘肽，释放出H+，多余的H+可降解透明带糖蛋白基质而达到消化透明带的目的。
将卵母细胞置于谷胱甘肽制溶液中，适当消化，即可去掉透明带。谷胱甘肽溶液优选为其生理盐水溶液，这样不易损伤细胞，其浓度为0.1～0.3g/mL。根据谷胱甘肽的浓度，其消化时间宜为0.5～7分钟。优选地，谷胱甘肽的浓度为0.2g/mL，消化时间为1分钟。
(三)有益效果本发明应用谷胱甘肽来消化卵母细胞透明带，操作简单，消化时间短，不易损伤细胞，并且成本低廉。
图1为透明带消化前卵母细胞示意图；图2为透明带消化后卵母细胞示意图；图3为台盼蓝染色后卵母细胞示意图。
具体实施例方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不用来限制本发明所要保护的范围。
实施例1 应用谷胱甘肽消化卵母细胞透明带谷胱甘肽的配制称取1.00克还原型谷胱甘肽溶于5ml灭菌的生理盐水中，分装成小管后储存于-20℃冰箱中备用。
操作将冷冻的谷胱甘肽溶液解冻，然后将卵母细胞置于谷胱甘肽溶液中，消化一分钟后取出。
实施例2 应用谷胱甘肽消化卵母细胞透明带将卵母细胞置于新鲜制备的0.1g/mL谷胱甘肽溶液中，消化7分钟后取出。
实施例3 应用谷胱甘肽消化卵母细胞透明带将卵母细胞置于新鲜制备的0.3g/mL谷胱甘肽溶液中，消化0.5分钟后取出。
实施例4 去除透明带的卵母细胞死活鉴定台盼蓝常用于鉴定细胞的死活，细胞死亡时，细胞膜通透性发生改变，丧失原有功能及增殖能力，可被台盼蓝染成蓝色；如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞。
将去除透明带的卵母细胞置于台盼蓝染色液中染色一分钟，后用PBS pH 7.4洗涤2～3次，在显微镜下观察膜的完整性。结果表明卵母细胞未被台盼蓝染成蓝色，说明卵母细胞膜仍保持完整性，即使用谷胱甘肽溶液消化透明带后并没有对膜造成损伤(图1、图2及图3)。
台盼蓝染液配制称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4℃保存。使用时，用PBS(pH 7.4)稀释母液至0.4％(v/v)即可。
权利要求
1.一种消化卵母细胞透明带的方法，其特征在于，将卵母细胞置于谷胱甘肽溶液中进行消化。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，谷胱甘肽溶液为0.1～0.3g/mL的生理盐水溶液，消化时间为0.5～7分钟。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，谷胱甘肽溶液为0.2g/mL的生理盐水溶液，消化时间为1分钟。
全文摘要
本发明涉及一种消化卵母细胞透明带的方法。所述的方法是将卵母细胞置于谷胱甘肽溶液中进行消化。本发明利用谷胱甘肽来消化透明带，操作简单，消化时间短，不易损伤细胞，并且成本低廉。
文档编号C12N5/08GK101082040SQ200610012029
公开日2007年12月5日 申请日期2006年5月29日 优先权日2006年5月29日
发明者田见晖, 成文敏, 安磊 申请人:中国农业大学