一种优化的单克隆抗体的制作方法

专利名称：一种优化的单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体的说，本发明涉及在哺乳动物细胞中高效表达的载体，一种通过密码子优化提高抗体在哺乳动物细胞中表达的技术，密码子优化的抗CD20单克隆抗体序列，及采用优化的表达系统在哺乳动物细胞中高效表达抗CD20单克隆抗体。
背景技术：
对表达蛋白基因的编码密码子分析发现，氨基酸的编码密码子并不是平均使用的Ikemura T.J Mol Biol 1981，151(3)389；Grantham R et al.，Nucleic Acids Res1981，9(1)43。密码子的使用可分三种水平，优选密码子，较优选密码子和非优选密码子Hooper SD et al.，Nucleic Acids Res 2000，28(18)3517。另外，低等生物和高等生物对编码密码子的偏好也不相同，已证明真核表达的基因在原核表达系统中会因有些密码子在原核中使用频率很少而使表达停滞(Robison et al.，Nucleic Acids Res.1984 126663)。普遍认为稀少的密码子会造成核糖体的终止，并使mRNA的3’端被细胞的核糖核苷酶分解。因此，在真核表达系统中表达微生物或病毒来源的基因时，已有通过优化编码密码子来提高表达水平的报道Yukie Koresawa et al.，J Biochem.2000 127367；Lisa H Nucleic Acids Res.1986143075；David B Mol.Biol.Evol.2002 191534。优化来源于真核细胞的基因优化也同样可以提高其在微生物中的表达水平。但是，直观的推理是在真核细胞中的高效率表达来源于真核细胞的基因是不需要经过密码子的。尤其是对于在真核中表达水平较高的抗体产品，文献中没有关于密码子优化的报道。
哺乳动物细胞如CHO/dhfr-细胞普遍用于真核蛋白的稳定表达。目前，已有开发了多种商业化的哺乳动物的表达载体。它们都采用的增强的启动子如CMV，SV40来增强目的基因表达的启动。但由于其插入基因组位点的差异，这些表达载体重组细胞株的表达量可相差几百倍，技术人员需从数千个重组克隆中筛选到高表达的细胞株。因此，通过标记基因筛选到高表达的重组细胞株，从而减少筛选工作量已成为优化细胞株构建的主要方法之一。但由于共转染的标记基因和目的基因的转录和翻译并不紧密相连，通过筛选获得高表达标记基因的同时高表达目的基因的克隆比例很低，并且长期培养于高选择压力下，表达产物的遗传稳定性无法保证。
B淋巴细胞是真核生物免疫系统的重要组成部分，在宿主细胞中，每个B淋巴细胞都在其细胞表面表达不同的抗体蛋白。在人体中，B淋巴细胞能表达约107到108个抗体分子。当某种异源抗原被中和后，产生的特异中和抗体的B淋巴细胞的生长将被终止和大幅度减少。但有时会发生该特异B淋巴细胞仍继续大量扩增的情况，这种细胞的扩增将导致癌症的发生，这种癌症被称为B细胞淋巴瘤。
CD20分子(人B淋巴细胞限制性分化抗原Bp35)是一个33～37kD的磷酸化蛋白，作为B淋巴细胞的标志蛋白，它在前B淋巴细胞、未成熟B淋巴细胞、成熟B淋巴细胞和激活B淋巴细胞中有表达，而在干细胞和浆细胞中没有表达，在人体血清中也无游离CD20的存在Ginaldi L.et al.，J Clin Pathol 1998 51364。CD20分子参与细胞周期起始和分化的活化过程，并且几乎在所有B细胞淋巴瘤的细胞表面都表达CD20分子，这使得抗CD20的抗体成为了非常有前景的治疗B细胞淋巴瘤疾病的约物Reff ME et al.，Blood 1994 83435；Golay J.etal.，Blood 2000 953900。
研究证明，当B淋巴肿瘤细胞表面蛋白CD20与其抗体结合后，能导致B淋巴肿瘤细胞的崩溃和消亡。抗CD20单克隆抗体主要通过诱导抗体依耐性细胞毒性作用(ADCC)，诱导补体介导的溶细胞作用(CDC)，诱导补体介导的细胞毒性作用(CDCC)及通过活化酪氨酸激酶和半胱氨酸蛋白酶信号传导通路而诱导细胞的凋亡来杀伤肿瘤细胞Gazzano-Santoro H.et al.，J.Immunol Methods1997 202163；Harjunpaa A.et al.，Scand J Immunol 2000 51634；Flieger D.et al.，Cell Immunol 2000 20455。目前已有一些抗CD20单克隆抗体在临床上用于非何杰金氏B细胞淋巴瘤的治疗，如上市的产品有IDEC公司的RetuximabKai U.et al.，haematologica 2002 8733。但由于抗体的生产成本过高而使药物无法大量使用，因此降低抗CD20单克隆抗体生产成本，提高蛋白表达量以满足临床应用是十分有意义的工作。
复杂的蛋白结构和糖基化形式使抗CD20单克隆抗体蛋白只能在哺乳动物细胞表达系统中表达才能有正常的生理活性。但哺乳动物细胞由于其生长速度缓慢，培养成本偏高，蛋白表达水平低等缺点使得抗体药物表达成本很高。如有些抗体的商业化生产中其表达水平仅为100-500mg/L。因此，优化抗CD20单克隆抗体蛋白在哺乳动物细胞中的表达是其得到广泛使用的必要条件。
位于小核糖核酸病毒和脑心肌炎病毒(EMCV)5’端非翻译引导区的IRES(internal ribosomal entry sites)序列拥有特别的可结合真核生物核糖体的二级结构，从而引起内部翻译起始。Belsham et al.，Microbiological Reviews 1996 60449；Etchison et al.，J Biol Chem 1982 25714806；Jackson et al.，Curr TopMicrobiol Immunol 1990 2031；Rueckert，Philadelphia，1996 pp.609。第二个顺反子为标记基因的双顺反子结构能使目的基因和标记基因同时表达，使标记基因成为目的基因表达的真正选择方式，几乎所有的耐受细胞都能表达目的基因Gurtu et al.，Biochem Biophys Res Commun 1996 229295；Rees et al.，Bio Techniques 1996 2048。

发明内容
本发明的目的在于提供一种优化来源于真核细胞的蛋白(包括抗体)基因序列中的核苷酸密码子的技术和方法，提供抗CD20单克隆抗体密码子优化的基因序列和高效的哺乳动物细胞基因工程表达系统，及采用这些表达载体使抗CD20单克隆抗体基因序列在哺乳动物细胞中高效表达的方法。
本发明的目的在于提供一种优化抗体基因序列中的核苷酸密码子的技术和方法，以及核苷酸密码子优化的CD20嵌合抗体可变区基因序列。
在一个优选实例中，抗体的轻链可变区基因序列为SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4中所示的序列，优选的轻链可变区基因序列为SEQ ID NO3；重链可变区基因序列为SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7和SEQ ID NO8所示的序列，优选的重链可变区基因序列为SEQID NO7。
在该实例中，该抗CD20单克隆抗体重链和轻链的可变区进行了核苷酸密码子的优化，采用在小鼠中优选的密码子代替部分较优选的密码子和非优选的密码子，用优选的密码子或较优选的密码子代替部分非优选的密码子，从而避免了因细胞中密码子合成不足而造成的蛋白表达障碍，提高抗CD20单克隆抗体蛋白在哺乳动物细胞中的表达量。
优选的密码子包括Ala(gcc)；Arg(cgc)；Asn(aac)；Asp(gac)；Cys(tgc)；Gln(cag)；Glu(gag)；Gly(ggc)；His(cac)；Ile(atc)；Leu(ctg)；Lys(aag)；Pro(ccc)；Phe(ttc)；Ser(agc)；Thr(acc)；Tyr(tac)和Val(ctc)。较优选的密码包括Gly(ggg)；Ile(att)；Leu(ctc)；Ser(tcc)；Val(gtc)和Arg(agg)；Pro(cct)；Thr(aca)；Ala(gct)。
在一个优选实例中，轻链和重链可变区基因中的非优选密码子替代率为10％-20％，20％-50％，50％-70％，70％-100％和100％。
在一个优选实例中，在保证非优选密码子替换率的基础上，优化的轻链和重链可变区基因中的CG序列个数降低或不明显增加。
在一个优选实例中，合成基因的抗CD20单克隆抗体在哺乳动物细胞，如HEK-293细胞中的表达量是天然基因的抗CD20单克隆抗体的至少120％，150％甚至190％。
在一个优选实例中，该抗CD20单克隆抗体为嵌合抗体，其轻链的恒定区可为人κ和λ型序列，优选κ型序列，重链的恒定区为人IgG1，IgG2，IgG3，IgG4和IgM型序列，优选IgG1型序列。
本发明的目的在于提供一套高效表达的哺乳动物细胞表达载体。
在一个优选实例中，将neo基因与抗CD20单克隆抗体的重链基因构建在同一个操纵子中，位于抗CD20单克隆抗体的重链基因后IRES序列的后面，因而该载体弱化了选择性标记基因neo的表达，使通过G418的筛选获得neo基因和抗CD20单克隆抗体的重链基因同时高表达的重组CHO细胞克隆。
在一个优选实例中，将neo基因与抗CD20单克隆抗体的重链基因构建在同一个操纵子中，位于抗CD20单克隆抗体的重链基因后IRES序列的后面，将hyg基因和抗CD20单克隆抗体的轻链基因构建在同一个操纵子中，位于抗CD20单克隆抗体的轻链基因后IRES序列的后面，因而该载体弱化了选择性标志基因neo和hyg的表达，使通过G418和hygmycin B的筛选获得neo基因与抗CD20单克隆抗体重链基因同时高表达和hyg基因与抗CD20单克隆抗体轻链基因同时高表达的重组CHO细胞克隆。
在一个优选实例中，将neo基因与抗CD20单克隆抗体的重链基因构建在同一个操纵子中，位于抗CD20单克隆抗体的重链基因后IRES序列的后面，因而该载体弱化了选择性标志基因neo的表达，使通过G418的筛选获得neo基因与抗CD20单克隆抗体重链基因同时高表达的重组CHO细胞克隆。将dhfr基因和抗CD20单克隆抗体的轻链基因构建在同一个操纵子中，位于抗CD20单克隆抗体的轻链基因后IRES序列的后面，因而该载体弱化了扩增基因dhfr的表达，因而在MTX压力培养条件下，能筛选到dhfr基因和抗CD20单克隆抗体轻链同时高表达的重组CHO细胞。
在一个优选实例中，在G418或G418加hygmycin B筛选下，优化的表达载体的表达量比原载体增加了50％；在另一个优选实例中，在MTX扩增下，优化的载体的平均表达量比原载体增加了10％和30％。
本发明的目的在于提供一个高效表达抗CD20单克隆抗体的方法，该方法包括a)提供一种密码子优化的抗CD20单克隆抗体的DNA分子；b)提供多种优化的表达载体，该载体含有步骤a)DNA分子及表达该DNA分子的调控序列；c)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞，包含哺乳动物细胞，特别是HEK-293，CHO/dhfr-细胞；d)在适合所述单克隆抗体的培养条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和e)分离纯化步骤c)所表达的所述单克隆抗体。


图1多个核苷酸密码子优化的抗CD20单克隆抗体对照表达载体的构建图。
图2a多个核苷酸密码子优化的抗CD20单克隆抗体对照表达载体在HEK-293细胞中的瞬时表达趋势图。
图2b多个核苷酸密码子优化的抗CD20单克隆抗体对照表达载体在HEK-293细胞中第七天的瞬时表达量。
图3a比较抗CD20单克隆抗体轻链可变区原始序列(L-wt)与优化后的序列L-3(SEQ ID NO3)。
图3b比较抗CD20单克隆抗体重链可变区原始序列(H-wt)与优化后的序列H-3(SEQ ID NO7)。
图4优化的pIRESneo3hygd-anti-CD20表达载体的构建图。
图5优化的pIRESneo3dhfr-anti-CD20表达载体的构建图。
图6抗生素筛选后，抗CD20单克隆抗体在三种表达载体中的表达量比较。
图7MTX扩增后，抗CD20单克隆抗体在三种表达载体中的表达量比较。
图8a纯化抗CD20单克隆抗体的HP-SEC分析。
图8b未纯化和纯化的抗CD20单克隆抗体在13％SDS-PAGE中的电泳图。
具体实施例方式
本发明涉及一种通过核苷酸密码子优化来提高抗体在真核细胞中表达水平的技术。该技术的发明和人的常规思维是相反的，一方面是因为抗体的表达水平通常较高，另一方面是因为大多数情况下抗体本身来源于真核细胞。常规的逻辑是来源于真核细胞的蛋白基因本身已经比较适合于在真核细胞中获得高效表达，不需要再进行核苷酸密码子优化。文献中未见有关抗体基因核苷酸密码子优化的报道。尽管本发明中采用的实例是一个来源于人和鼠的嵌合抗体，本发明中公布的技术可以很容易被本领域内普通的技术人员应用于其它种属的抗体在真核细胞中的表达。也可以采用本发明的技术根据所选用的真核细胞种属(如鼠源CHO细胞，人源293细胞等)按着该种属中密码子使用的频率对抗体基因的核苷酸密码子进行更针对性的优化，所采用的基本原理是一致的，本领域的普通技术人员可以参照本发明的技术方案完成。本发明公布的核苷酸密码子优化技术也同样可以应用于其他来源于真核细胞的重组蛋白在真核细胞中的表达。
本发明涉及抗CD20嵌合抗体的核苷酸密码子优化并提供一系列的优选方案。非优选的密码子替代率可以任意选择，可以是0-20％，20％-50％，50％-70％，或70-100％。本领域内普通的技术人员可以选择某一具体的密码子替代率并可在不同的基因序列中进行替换，所得到的基因序列将会与本发明中公布的具体实例不完全一样，但同样属于本发明的范围。
本发明还涉及通过优化真核细胞的表达载体来提高目标产品在真核细胞中的表达水平。本领域的普通技术人员可以按本发明的方案，采用其他的真核表达载体对优化的抗体进行表达。
实施例一、抗CD20单克隆抗体轻链和重链可变区基因的优化抗CD20单克隆抗体的原始序列来源于IDEC公司的专利US.5,736,137，其表达基因为本公司所收藏，抗体的可变区序列也可通过寡核苷酸链连接获得。
表达糖基化的抗CD20单克隆抗体的宿主细胞可来源于多种组织，但优选脊椎动物细胞。可用的细胞系有SV40转化的猴肾CV1细胞系(ATCC CRL 1651)，人胚胎肾细胞(293或悬浮培养的293)Graham et al.，J.Gen Virol.1977 3659，婴幼仓鼠肾细胞(BHK-21 ATCC CCL 10)，中国仓鼠卵巢细胞(CHO/dhfr-ATCCCRL 9096)，猴肾细胞(CV1 ATCC CRL90)，非洲绿猴肾细胞(VERO-76 ATCCCRL 1587)，人子宫癌细胞(HELA ATCC CCL 2)，犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)，人肺细胞(W138，ATCC CCL95)，人肝细胞(Hep G2，HB 8065)等。优选表达抗CD20单克隆抗体的宿主细胞为CHO/dhfr-和HEK-293细胞。
为能在哺乳动物细胞，如HEK-293和CHO/dhfr-细胞，特别是CHO/dhfr-细胞中获得更高的蛋白表达量，将重链和轻链可变区基因原始序列进行了密码子的优化。密码子优化可参考的文献有Koresawa et al.，J.Biochem，2000，127(3)367；Robinson et al.，Nucleic Acids Res.1984 126663。
选用在小鼠中优选的密码子和较优选的密码子代替非优选的密码子，见表1，主要考虑Ser，Leu，Val，Thr，Ala，Asn，Lys，Arg和Gly密码子的优化，并同时考虑优化序列中CG的个数。优化后的轻链可变区的核苷酸序列L-1见SEQ ID No1，其非优选密码子的替代率为20％，CG个数为9；优化后的轻链可变区的核苷酸序列L-2见SEQ ID No2，其非优选密码子的替代率为40％，CG个数为11；优化后的轻链可变区的核苷酸序列L-3见SEQ ID No3，其非优选密码子的替代率为70％，CG个数为3；优化后的轻链可变区的核苷酸序列L-4见SEQ ID No4，其非优选密码子的替代率为85％，CG个数为12，见表2。优化后的重链可变区的核苷酸序列见H-1见SEQ ID No5，其非优选密码子的替代率为20％，CpG个数为9；优化后的重链可变区的核苷酸序列H-2见SEQ IDNo6，其非优选密码子的替代率为40％，CG个数为8；优化后的重链可变区的核苷酸序列H-3见SEQ ID No7，其非优选密码子的替代率为60％，CG个数为10；优化后的重链可变区的核苷酸序列H-4见SEQ ID No8，其非优选密码子的替代率为85％，CG个数为9，见表3。
表1(Genbank)

表2

表3

优化的抗CD20单克隆抗体轻链和重链可变区基因序列可采用寡核苷酸链拼接的方式获得，也可由其他公司全基因合成获得(Invitrogen)。其中，轻链可变区序列的5’端设计BamH I位点，3’端设计BsiW I位点，重链可变区序列的5’端设计EcoR V位点，3’端设计Nhe I位点。
抗CD20单克隆抗体轻链可为人κ和λ型序列，优选κ型序列，重链的恒定区可为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4和IgM，优选IgG1。将wt-L，L-1，L-2，L-3和L-4与人κ相连，将wt-H，H-1，H-2，H-3和H-4与IgG1恒定区相连。分别将wt-L和wt-H，L-1和H-1，L-2和H-2，L-3和H-3，L-4和H-4的完整抗体序列构建到表达载体中。
实施例二、抗CD20单克隆抗体基因的制备(1)人κ轻链恒定区及人IgG1重链恒定区的制备收集新鲜人全血5ml，300g离心5min沉淀红细胞和白细胞。按BBI公司的classical total RNA isolation kit说明书的操作方案提取白细胞RNA。按BBI公司的MMLV first strand cDNA synthesis kit说明书的操作方案将白细胞mRNA反转录为cDNA。反应体系为11μl RNA(2.7μg)，5×reaction buffer 4μl，RNaseinhibitor(20U/μl)1μl，dNTP mix(10mmol/L)2μl，M-MuLV reverse transcriptase1μl，总反应体积为20μl。
根据已知的人κ和IgG1序列设计PCR引物。以反转录的cDNA为模板，PCR扩增获得目的基因。
合成引物序列L-F/BamH I5’GCGGGATCCCGTACGGTGGCTGCACCATCT 3’(SEQ ID NO9)L-R/Xho I5’GCGCTCGAGCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC 3’(SEQ IDNO10)H-F/Eco52 I5’GCGCGGCCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGG 3’(SEQ IDNO11)H-R/Xho I5’GCGCTCGAGGATCCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC 3’(SEQ ID NO12)PCR反应体系20μl 10*Pyrobest buffer，16μl 2.5mM dNTP，14μl 10μM重链或轻链恒定区引物对，4μl人白细胞cDNA，2μl 5U/μl Pyrobest DNAPolymerase，反应体系为200μl。
扩增条件变性94℃4min；变性94℃1min，退火60℃1min，延伸72℃1min，30个循环；延伸72℃5min。
(2)多个抗CD20单克隆抗体轻链的制备采用本领域技术人员熟知的常规分子生物学技术萨幕布鲁克J等，《分子克隆试验指南》，北京科学出版社，κ基因的PCR产物分别用BamH I和Xho I(TaKaRa)双酶切，在30μl体系中加入3μl 10×K buffer，κPCR纯化产物20μl，Xho I 2μl，BamH I 3μl，37℃酶切1h。pcDNA3(Invitrogen)载体也用BamH I和Xho I双酶切，在30μl体系中加入3μl 10×K buffer，pcDNA3 10μl，Xho I 2μl，BamH I 3μl，37℃酶切1h。用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1试剂盒将κ分别插入到pcDNA3中，构建为pcDNA3-κ，转化细菌后保存。
抗CD20单克隆抗体的轻链可变区基因L-wt，L-1，L-2，L-3，L-4和pcDNA3-κ分别用Kpn I(TaKaRa)酶切，酶切体系为在50μl体系中加入5μl 10×L buffer，轻链可变区基因30μl或pcDNA3-κ10μl，Kpn I 3μl，37℃酶切1h。酶切产物使用promega的Wizard SV Gel and PCR clean-up System纯化试剂盒进行纯化，再分别使用BsiW I(ToYoBo)酶切，酶切体系为在50μl体系中加入5μl 10×Hbuffer，轻链可变区基因Kpn I酶切产物30μl或pcDNA3-κKpn I酶切产物30μl，BsiW I 3μl，37℃酶切1h。胶回收400bp左右的轻链可变区Kpn I和BsiW I酶切产物，并用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1试剂盒将轻链可变区插入pcDNA3-κ载体，构建为pcDNA3-L-wt，pcDNA3-L-1，pcDNA3-L-2，pcDNA3-L-3，pcDNA3-L-4，转化细菌后保存。
(3)多个抗CD20单克隆抗体重链的制备IgG1 Fc基因的PCR产物分别用Eco52 I和Xho I(TaKaRa)酶切，在30μl体系中加入3μl 10×H buffer，IgG1 Fc PCR纯化产物20μl，Xho I 2μl，37℃酶切1h。酶切产物使用promega的Wizard SV Gel and PCR clean-up System纯化试剂盒进行纯化，再使用Eco52 I酶切，酶切体系为在在30μl体系中加入3μl10×Basal buffer，IgG1 Fc Xho I酶切产物20μl，0.1％BSA 3μl，Eco52 I 2μl，37℃酶切1h。pcDNA3载体也用Eco52 I和Xho I双酶切，在30μl体系中加入3μl10×H buffer，pcDNA3 20μl，Xho I 2μl，37℃酶切1h。酶切产物使用promega的Wizard SV Gel and PCR clean-up System纯化试剂盒进行纯化，再使用Eco52 I酶切，酶切体系为在在30μl体系中加入3μl 10×Basal buffer，pcDNA3 Xho I酶切产物20μl，0.1％BSA 3μl，Eco52 I 2μl，37℃酶切1h。用TaKaRa的DNALigation Kit Ver.2.1试剂盒将IgG1 Fc插入到pcDNA3中，构建为pcDNA3-IgG1Fc，转化细菌后保存。
抗CD20单克隆抗体的重链可变区基因H-wt，H-1，H-2，H-3，H-4和pcDNA3-IgG1 Fc分别用EcoRV(TaKaRa)酶切，酶切体系为在50μl体系中加入5μl 10×H buffer，重链可变区基因30μl或pcDNA3-IgG1 Fc 10μl，EcoR V 3μl，37℃酶切1h。酶切产物使用promega Wizard SV Gel and PCR clean-up System纯化试剂盒进行纯化，再分别使用Nhe I(TaKaRa)酶切，酶切体系为在50μl体系中加入5μl 10×M buffer，重链可变区基因EcoR V酶切产物30μl或pcDNA3-IgG1 Fc EcoR V酶切产物30μl，Nhe I 3μl，37℃酶切1h。胶回收420bp左右的重链可变区EcoR V和Nhe I酶切产物，并用TaKaRa的DNA LigationKit Ver.2.1试剂盒将重链可变区插入pcDNA3-IgG1 Fc载体，构建为pcDNA3-H-wt，pcDNA3-H-1，pcDNA3-H-2，pcDNA3-H-3，pcDNA3-H-4，转化细菌后保存。
实施例三、抗CD20单克隆抗体表达载体的构建抗CD20单克隆抗体基因在真核细胞中的表达需要借助于一个高效的真核表达载体将抗体基因介导进入宿主细胞。这些载体中需要含有信号序列，复制起点，1个或多个标记基因，增强子序列，启动子和转录终止序列。本发明采用商品化的pIRESneo3和pIREShyg(Clontech)为基础，利用IRES可形成的多顺反子的原理对表达载体进行了优化，使多个标记基因弱化，从而筛选抗CD20单克隆抗体高表达的细胞克隆。
采用本领域技术人员熟知的常规分子生物学技术，将CD20单克隆抗体重链插入到本公司制备的哺乳动物表达载体pIRESneo3d(通过在pIRESneo3载体中插入dhfr表达盒而获得)多克隆位点区中萨幕布鲁克J等，《分子克隆试验指南》，北京科学出版社。具体操作为pIRESneo3d经EcoR V和BamH I双酶切，酶切体系为50μl体系中加入5μl 10×K buffer，pIRESneo3d 15μl，EcoR V 3μl，BamH I 3μl，37℃酶切1h。重链表达质粒pcDNA3-H-wt，pcDNA3-H-1，pcDNA3-H-2，pcDNA3-H-3，pcDNA3-H-4载体经EcoR V和BamH I双酶切后胶回收1.4Kb的酶切片段，酶切系统同上。用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1试剂盒将重链片段与pIRESneo3d载体进行粘端连接。获得的重组质粒pIRESneo3d-H-wt，pIRESneo3d-H-1，pIRESneo3d-H-2，pIRESneo3d-H-3，pIRESneo3d-H-4转化DH5α细菌后保存。
再将CD20单克隆抗体的轻链插入到pIRESneo3d-H载体中。具体操作为重链表达质粒pIRESneo3d-wt，pIRESneo3d-H-1，pIRESneo3d-H-2，pIRESneo3d-H-3，pIRESneo3d-H-4载体经Nru I单酶切，酶切体系为在50μl体系中加入5μl 10×basal buffer，重链表达质粒15μl，0.1％BSA 0.5μl，Nru I 3μl，37℃酶切1h。酶切产物使用promega Wizard SV Gel and PCR clean-up System纯化试剂盒进行纯化，再用CIAP酶去磷酸化，在50μl体系中10×AlkalinePhosphatase Buffer 5μl，CIAP 2μl，重链表达质粒Nru I酶切产物43μl，50℃反应30min，65℃加热处理30min以上使CIAP酶失活。轻链表达质粒pcDNA3-L-wt，pcDNA3-L-1，pcDNA3-L-2，pcDNA3-L-3，pcDNA3-L-4用NruI和Nae I分别酶切，酶切体系为在50μl体系中加入5μl 10×basal buffer，轻链表达质粒30μl，0.1％BSA 0.5μl，Nru I 3μl，37℃酶切1h。酶切产物使用promega的Wizard SV Gel and PCR clean-up System纯化试剂盒进行纯化，再用Nae I进行酶切，酶切体系为50μl体系中加入5μl 10×L buffer，轻链表达质粒Nru I酶切产物30μl，Nae I 3μl，37℃酶切1h。胶回收含轻链表达盒的1.8kb的Nru I～Nae I片段，并用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1试剂盒将轻链表达盒分别与pIRESneo3d-H-wt，pIRESneo3d-H-1，pIRESneo3d-H-2，pIRESneo3d-H-3，pIRESneo3d-H-4载体进行平端连接。获得的重组质粒pIRESneo3d-anti-CD20-wt，pIRESneo3d-anti-CD20-1，pIRESneo3d-anti-CD20-2，pIRESneo3d-anti-CD20-3，pIRESneo3d-anti-CD20-4转化DH5α细菌后保存。图1为CD20单克隆抗体的表达载体的构建图。
实施例四、抗CD20单克隆抗体在HEK-293细胞中的瞬时表达抗CD20单克隆抗体转染哺乳动物宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主细胞为293细胞时，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法Jordan et al.，Nucleic Acids Res.1996 244，脂质体包装法(如lipofectamine 2000)Audouy S.et al.，Mol Membr Biol.2001 18(2)129，电穿孔法和显微注射法Morrison et al.，Science 1985 2291202。我们采用lipofectamine2000(Catinvitrogen)转染法，按其使用说明，平行制备1.6μg表达载体质粒和4.0μl lipofectamine 2000的混合物，各转染12孔板的一个孔中8×105个HEK-293贴壁细胞，转染4h后，用DMEM+10％FBS培养基清洗细胞一次，再加入适量的DMEM+10％FBS培养基，每天取样到第7天。
抗CD20单克隆抗体的ELISA定量检测采用夹心法进行ELISA检测。包被液为50μl的1μg/ml的山羊抗人IgG(Fc)多克隆抗体(KPL)，封闭液为2％BSA，室温下封闭3h，标准品为Human IgG1，KAPPA(Sigma)，室温放置4h，第二抗体为50μl 1∶2000稀释的辣根酶标记山羊抗人IgG(H+L)(北京中杉金桥有限公司)，37℃下温育2h，TMB显色。OD450下读值。结果见图2a，相比原始序列，密码子优化的抗CD20单克隆抗体的表达量均有所提高，第七天的表达量与原始序列相比所提供的倍数见图2b。以优化后的L-3和H-3组合的抗体的表达量最高(图3a和图3b)。
实施例五、抗CD20单克隆抗体表达载体的优化(1)pIRESneo3hygd-anti-CD20表达载体的构建a)pIREShyg-L-3的构建抗CD20单克隆抗体轻链基因的PCR扩增获得含EcoT22 I和Not I酶切位点的L-3轻链基因，合成引物为CD20-L-F1/EcoT22 I5’GCGATGCATATGGATTTTCAGGTGCAGATT 3’(SEQID NO13)
CD20-L-R1/Not I5’GCGGCGGCCGCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAG 3’(SEQ ID NO14)采用本领域技术人员熟知的常规分子生物学技术，将CD20单克隆抗体轻链插入到哺乳动物表达载体pIREShyg(Clontech)的多克隆位点区中。具体操作为pIREShyg经EcoT22 I酶切，酶切体系为50μl体系中加入5μl 10×H buffer，pIREShyg 15μl，EcoT22 I 3μl，37℃酶切1h。酶切产物使用promega Wizard SVGel and PCR clean-up System纯化试剂盒进行纯化。再用Not I进行酶切，酶切体系为50μl体系中加入5μl 10×H buffer，5μl 0.1％BSA，5μl 0.1％Triton X-100，pIREShyg EcoT22 I 15μl，Not I 3μl，37℃酶切1h。轻链PCR产物经EcoT22 I和Not I双酶切，酶切系统同上。用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1试剂盒将轻链片段与pIREShyg载体进行粘端连接。获得的重组质粒pIREShyg-L-3，转化DH5α细菌后保存。
b)pIRESneo3hygd-anti-CD20表达载体的构建将CD20单克隆抗体的轻链插入到pIRESneo3d-H-3载体中。具体操作为重链表达质粒pIRESneo3d-H-3载体经Nru I单酶切，酶切体系为在50μl体系中加入5μl 10×basal buffer，pIRESneo3d-H-3 15μl，0.1％BSA 0.5μl，Nru I 3μl，37℃酶切1h。酶切产物使用promega的Wizard SV Gel and PCR clean-up System纯化试剂盒进行纯化，再用CIAP酶(TaKaRa)去磷酸化，在50μl体系中10×AlkalinePhosphatase Buffer 5μl，CIAP 2μl，pIRESneo3d-H-3 Nru I酶切产物43μl，50℃反应30min，65℃加热处理30min以上使CIAP酶失活。
轻链表达质粒pIREShyg-L-3经Nru I酶切，酶切体系为在50μl体系中加入5μl 10×basal buffer，0.5μl 0.1％BSA，pIREShyg-L-330μl，Mlu I 3μl，37℃酶切1h。酶切产物使用promega Wizard SV Gel and PCR clean-up System纯化试剂盒纯化后用Xho I酶切，酶切体系为在50μl反应体系中，10×H Buffer 5μl，pIREShyg-L-3Nru I酶切产物38μl，Xho I 2μl，37℃反应1h。使用promegaWizard SV Gel and PCR clean-up System纯化试剂盒胶回收4kb左右片段。Klenow(TaKaRa)酶补平酶切产物，在50μl反应体系中，10×Klenow FragmentBuffer 5μl，pIREShyg-L-3 NruI～Xho I酶切产物38μl，dNTP(2.5mM)5μl，Klenow酶(4U/μl)2μl。37℃反应1h。用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1试剂盒将轻链表达盒与pIRESneo3d-H-3载体进行平端连接。获得的重组质粒pIRESneo3hygd-anti-CD20，转化DH5α细菌后保存。图4为pIRESneo3hygd-anti-CD20抗CD20单克隆抗体的表达载体的构建图。
(2)pIRESneo3dhfr-anti-CD20表达载体的构建a)pIRESdhfr-L-3的构建抗CD20单克隆抗体轻链基因的PCR扩增获得含EcoR V和BamH I酶切位点的L-3轻链基因，合成引物为CD20-L-F2/EcoR V 5’GCGGATATCATGGATTTTCAGGTGCAGATT 3’(SEQ IDNO15)CD20-L-R2/BamH I5’GCGGGATCCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAG 3’(SEQID NO16)采用本领域技术人员熟知的常规分子生物学技术，将CD20单克隆抗体轻链插入到本公司制备的哺乳动物表达载体pIRESdhfr(通过将pIRESneo3中的neo基因替换为dhfr基因获得)的多克隆位点区中。具体操作为pIRESdhfr经EcoRV和BamH I双酶切，酶切体系为50μl体系中加入5μl 10×K buffer，pIRESdhfr15μl，EcoR V 3μl，BamH I 3μl，37℃酶切1h。轻链PCR产物经EcoR V和BamH I双酶切，酶切系统同上。用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1试剂盒将轻链片段与pIRESdhfr载体进行粘端连接。获得的重组质粒pIRESdhfr-L-3，转化DH5α细菌后保存。
b)pIRESneo3-H-3的构建采用本领域技术人员熟知的常规分子生物学技术，将CD20单克隆抗体重链插入到哺乳动物表达载体pIRESneo3(Clontech)多克隆位点区中。具体操作为pIRESneo3经EcoRV和BamH I双酶切，酶切体系为50μl体系中加入5μl 10×Kbuffer，pIRESneo3 15μl，EcoR V 3μl，BamH I 3μl，37℃酶切1h。重链表达质粒pcDNA3-H-3载体经EcoR V和BamH I双酶切后胶回收1.4Kb的酶切片段，酶切系统同上。用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1试剂盒将重链片段与pIRESneo3载体进行粘端连接。获得的重组质粒pIRESneo3-H-3，转化DH5α细菌后保存。
c)pIRESneo3dhfr-anti-CD20表达载体的构建将CD20单克隆抗体的轻链插入到pIRESneo3-H-3载体中。具体操作为重链表达质粒pIRESneo3-H-3载体经Nru I单酶切，酶切体系为在50μl体系中加入5μl 10×basal buffer，重链表达质粒15μl，0.1％BSA 0.5μl，Nru I 3μl，37℃酶切1h。酶切产物使用promega的Wizard SV Gel and PCR clean-up System纯化试剂盒进行纯化，再用CIAP酶(TaKaRa)去磷酸化，在50μl体系中10×AlkalinePhosphatase Buffer 5μl，CIAP 2μl，重链表达质粒Nru I酶切产物43μl，50℃反应30min，65℃加热处理30min以上使CIAP酶失活。
轻链表达质粒pIRESdhfr-L-3经Mlu I(TaKaRa)酶切，酶切体系为在50μl体系中加入5μl 10×H buffer，pIRESdhfr-L-330μl，Mlu I 3μl，37℃酶切1h。酶切产物使用promega的Wizard SV Gel and PCR clean-up System纯化试剂盒胶回收3.5Kb片段，Klenow(TaKaRa)补平Mlu I酶切位点，在50μl反应体系中，10×Klenow Fragment Buffer 5μl，pIRESneo3-L-3Mlu I酶切产物38μl，dNTP(2.5mM)5μl，Klenow酶(4U/μl)2μl。37℃反应1h。用TaKaRa的DNA LigationKit Ver.2.1试剂盒将轻链表达盒分别与pIRESneo-H-3载体进行平端连接。获得的重组质粒pIRESneo3dhfr-anti-CD20，转化DH5α细菌后保存。图5为pIRESneo3dhfr-anti-CD20抗CD20单克隆抗体的表达载体的构建图。
实施例六、抗CD20单克隆抗体在CHO/dhfr-细胞中的表达本发明中，产生抗CD20单克隆抗体细胞，如CHO细胞可培养于多种培养基中。商业化的培养基如DMEM，MEM，Ham’s F12，RPMI-1640(Gibco)都可用于宿主细胞的培养。此外，Ham et al.，Meth.Enz.1979 5844；Barnes et al.，Anal.Biochem.1980 102255；U.S.Pat.Nos.4,767,707；4,657,866；4,927,762中的培养基均可用于培养宿主细胞。宿主细胞的培养条件，如温度，pH值等也是本领域技术人员熟知的常规条件。
抗CD20单克隆抗体转染宿主细胞，如CHO/dhfr-细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。我们采用脂质体lipofectamine 2000(invitrogen)转染法，按其使用说明，三种载体各制备1.5μg表达载体质粒和4.5μl lipofectamine 2000的混合物，各转染6×105个CHO/dhfr-细胞，过夜转染后，将细胞平均分配到1块96孔板中进行选择基因的筛选。
抗CD20单克隆抗体pIRESneo3d-anti-CD20和pIRESneo3dhfr-anti-CD20转染的CHO细胞在DMEM+5％dFBS+1.0mg/ml G418下进行筛选，CD20单克隆抗体pIRESneo3hygd-anti-CD20转染的CHO细胞在DMEM+5％dFBS+1.0mg/mlG418+0.6mg/ml hygromycin B下进行筛选，2～3天更换筛选培养基，培养2-3周各获得30多个筛选细胞克隆。将三种抗CD20单克隆抗体表达载体转染CHO细胞各取30个单克隆按相同的密度传至24孔板中，在0.5ml DMEM+5％dFBS培养基中培养5天，ELISA检测培养基上清液中CD20单克隆抗体的表达量，其中表达量高于5mg/L的克隆结果见图6。
为了使G418或G418加hygmycin B筛选的抗CD20单克隆抗体细胞更高效的表达，每种载体重组细胞各挑选10个高表达细胞用MTX进行扩增表达。具体操作为，重组CHO细胞在DMEM+5％dFBS培养基中培养，并在培养过程中加入逐步增加的MTX浓度，培养过程中持续监测抗体的表达水平，当MTX浓度增加到细胞生长无法耐受时停止增加MTX浓度。当MTX增至300nM时，细胞按相同的数量接入含5ml DMEM+5％dFBS+300nM MTX培养基的T25培养瓶中，培养五天后ELISA检测培养基清液中CD20单克隆抗体的表达量，结果见图7。
实施例七、CD20单克隆抗体的纯化及SDS-PAGE分析CHO细胞培养液20L经过Prostak切向流系统0.45μm过滤澄清。过滤后培养液进Protein A Sepharose FF.柱亲和纯化Lindmark et al.，J.Immunol.Meth.1983 621，0.1M pH2.7柠檬酸缓冲液洗脱。亲和层析洗脱峰用1M Tris pH9.0调pH3.5，室温孵育1hr。样品加入固体NaCl至终浓度1.5M，调pH7.5，0.45μm过滤后进Butyl Sepharose FF疏水层析分离，20mM Na3PO4，pH 7.5洗脱。HIC洗脱峰用6M HCl调pH6.3，进CM Sepharose FF分离，50mM Citrate/250mMNaCl pH7.3洗脱。最终产品0.22μm过滤后冻干保存。终产品经HP-SEC检测纯度97％以上(图8a)。13％SDS-PAGE电泳可见清洗的重链和轻链条带(图8b)。
序列表(1)一般信息(i)申请人神州细胞工程有限公司(ii)发明名称一种优化的单克隆抗体(iii)序列数目16(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度384(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(A)描述抗CD20单克隆抗体轻链可变区密码子优化序列-1(iii)序列描述SEQ ID NO1ATGGACTTTC AGGTGCAGAT TATCAGCTTC CTGCTAATCA GCGCTTCAGT CATAATGTCC60CGCGGGCAAA TTGTGCTCTC CCAGTCTCCC GCAATCCTGA GCGCATCTCC AGGGGAGAAG 120GTCACAATGA CTTGCAGGGC CAGCTCAAGT GTAAGTTACA TCCACTGGTT CCAGCAGAAG 180CCAGGCTCCT CCCCCAAACC CTGGATTTAT GCCACATCCA ACCTGGCTAG CGGCGTCCCT 240GTTCGCTTCA GTGGCAGTGG GTCTGGGACT TCTTACTCTC TCACAATCAG CAGAGTGGAG 300GCTGAAGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAGTGGACTA GTAACCCACC CACCTTCGGA 360GGGGGGACCA AGCTGGAAAT CAAA 384(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度384(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(A)描述抗CD20单克隆抗体轻链可变区密码子优化序列-2(iii)序列描述SEQ ID NO2ATGGATTTTC AGGTGCAGAT TATCAGCTTC CTGCTAATCA GCGCTTCCGT CATAATGTCC60CGCGGGCAAA TTGTGCTCTC CCAGTCCCCT GCCATCCTGA GCGCATCCCC AGGGGAGAAA 120
GTCACAATGA CCTGCAGGGC CAGCTCAAGT GTGAGTTACA TCCACTGGTT CCAGCAGAAG 180CCAGGCTCCT CCCCCAAACC CTGGATTTAT GCCACATCCA ACCTGGCTAG CGGCGTCCCT 240GTTCGCTTCA GTGGCAGTGG GAGCGGGACT TCTTACTCTC TCACAATCAG CAGAGTGGAG 300GCTGAAGACG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAGTGGACTA GTAACCCCCC CACCTTCGGA 360GGGGGGACCA AGCTGGAAAT CAAA 384(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度384(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(A)描述抗CD20单克隆抗体轻链可变区密码子优化序列-3(iii)序列描述SEQ ID NO3ATGGACTTCC AGGTGCAGAT CATCAGCTTC CTGCTGATCA GTGCCAGCGT CATTATGTCC60CGCGGCCAGA TTGTGCTCTC CCAGTCCCCA GCCATCCTGT CTGCCAGCCC TGGGGAGAAG 120GTGACCATGA CCTGCAGGGC CAGCTCCAGT GTGAGCTACA TCCACTGGTT CCAGCAGAAG 180CCAGGCTCCT CCCCCAAGCC CTGGATCTAT GCCACCTCCA ACCTGGCCTC TGGGGTGCCT 240GTGCGCTTCA GTGGCTCTGG CTCTGGGACC TCCTACTCTC TCACCATCAG CAGGGTGGAG 300GCTGAGGATG CTGCCACCTA TTACTGCCAG CAGTGGACCA GCAACCCACC CACCTTCGGA 360GGGGGCACCA AGCTGGAGAT CAAG 384(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度384(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(A)描述抗CD20单克隆抗体轻链可变区密码子优化序列-4(iii)序列描述SEQ ID NO4ATGGACTTCC AGGTGCAGAT CATCAGCTTC CTGCTGATCA GTGCCAGCGT CATTATGTCC60CGCGGCCAGA TTGTGCTCTC CCAGTCCCCC GCCATCCTGA GCGCCAGCCC TGGGGAGAAG 120GTGACCATGA CCTGCAGGGC CAGCTCCAGC GTGAGCTACA TCCACTGGTT CCAGCAGAAG 180CCCGGCTCCT CCCCCAAGCC CTGGATCTAC GCCACCTCCA ACCTGGCCAG CGGGGTGCCT 240
GTGCGCTTCA GTGGCTCTGG CTCTGGGACC TCCTACTCTC TCACCATCAG CAGGGTGGAG 300GCTGAGGACG CTGCCACCTA TTACTGCCAG CAGTGGACCA GCAACCCACC CACCTTCGGA 360GGGGGCACCA AGCTGGAGAT CAAG 384(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度420(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(A)描述抗CD20单克隆抗体重链可变区密码子优化序列-1(iii)序列描述SEQ ID NO5ATGGGCTGGA GCCTCATCCT CCTGTTCCTT GTCGCAGTAG CTACTCGTGT GCTGTCCCAG60GTGCAATTGC AGCAGCCCGG AGCTGAGCTG GTAAAACCTG GTGCCTCAGT GAAGATGTCC 120TGCAAGGCAT CTGGCTACAC ATTTACCAGC TACAATATGC ACTGGGTCAA GCAGACACCT 180GGCAGAGGCC TGGAATGGAT TGGGGCCATT TACCCCGGCA ATGGTGATAC ATCCTACAAC 240CAGAAGTTCA AAGGCAAGGC CACCCTGACT GCAGACAAGT CCTCCAGCAC GGCCTACATG 300CAGCTCAGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCGGTGTATT ACTGTGCCCG CAGCACCTAC 360TATGGTGGGG ACTGGTACTT CAATGTCTGG GGAGCTGGGA CCACGGTCAC CGTGTCTGCT 420(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度420(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(A)描述抗CD20单克隆抗体重链可变区密码子优化序列-2(iii)序列描述SEQ ID NO6ATGGGCTGGA GCCTTATCCT CCTGTTCCTG GTGGCTGTCG CTACACGTGT GCTGTCCCAG60GTCCAACTGC AGCAGCCAGG TGCTGAGCTG GTGAAACCTG GGGCCTCAGT GAAGATGTCC 120TGCAAGGCCT CTGGCTACAC ATTTACCAGC TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGACACCT 180GGCAGAGGCC TGGAATGGAT TGGTGCTATT TACCCCGGCA ATGGGGATAC CTCCTACAAC 240CAGAAGTTCA AAGGCAAGGC CACCCTCACT GCAGACAAGT CCTCCAGCAC TGCCTACATG 300CAGCTCAGCA GCCTGACCTC CGAGGACTCT GCGGTGTATT ACTGTGCCCG CAGCACCTAC 360
TATGGTGGGG ACTGGTACTT CAATGTATGG GGAGCTGGCA CCACGGTCAC CGTGTCTGCT 420(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度420(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(A)描述抗CD20单克隆抗体重链可变区密码子优化序列-3(iii)序列描述SEQ ID NO7ATGGGCTGGA GCCTGATCCT GCTGTTCCTG GTGGCGGTGG CCACGCGTGT GCTGTCCCAG60GTGCAACTGC AGCAGCCAGG GGCTGAGCTG GTGAAGCCTG GGGCCTCAGT GAAGATGTCC 120TGCAAGGCCT CTGGCTACAC CTTTACCAGC TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGACCCCT 180GGCCGGGGCC TGGAATGGAT TGGGGCCATT TATCCGGGCA ATGGGGATAC CTCCTACAAC 240CAGAAGTTCA AAGGCAAGGC CACCCTGACT GCAGACAAGT CCTCCAGCAC GGCCTACATG 300CAGCTCAGCA GCCTGACCAG TGAGGACTCT GCGGTGTATT ACTGTGCCCG CAGCACCTAC 360TATGGTGGGG ACTGGTACTT CAATGTCTGG GGAGCTGGGA CCACGGTCAC CGTGTCTGCT 420(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度420(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(A)描述抗CD20单克隆抗体重链可变区密码子优化序列-4(iii)序列描述SEQ ID NO8ATGGGCTGGA GCCTGATCCT GCTGTTCCTG GTGGCTGTGG CCACTAGGGT GCTGTCCCAG60GTGCAACTGC AGCAGCCCGG GGCTGAGCTG GTGAAGCCTG GGGCCAGCGT GAAGATGTCC 120TGCAAGGCCT CCGGCTACAC CTTTACCAGC TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGACCCCT 180GGCAGGGGCC TGGAGTGGAT TGGGGCCATT TACCCCGGCA ACGGGGACAC CTCCTACAAC 240CAGAAGTTCA AAGGCAAGGC CACCCTGACT GCAGACAAGT CCTCCAGCAC TGCCTACATG 300CAGCTCAGCA GCCTGACCAG CGAGGACTCT GCTGTGTACT ACTGTGCCCG CAGCACCTAC 360TATGGTGGGG ACTGGTACTT CAACGTGTGG GGGGCTGGGA CCACTGTGAC CGTGTCTGCT 420
(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度30(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(A)描述引物(iii)序列描述SEQ ID NO9GCGGGATCCC GTACGGTGGC TGCACCATCT30(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度34(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(A)描述引物(iii)序列描述SEQ ID NO10GCGCTCGAGC TAACACTCTC CCCTGTTGAA GCTC 34(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度31(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(A)描述引物(iii)序列描述SEQ ID NO11GCGCGGCCGG CTAGCACCAA GGGCCCATCG G 31(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度40
(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(A)描述引物(iii)序列描述SEQ ID NO12GCGCTCGAGG ATCCTCATTT ACCCGGAGAC AGGGAGAGGC40(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度30(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(A)描述引物(iii)序列描述SEQ ID NO13GCGATGCATA TGGATTTTCA GGTGCAGATT 30(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度33(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(A)描述引物(iii)序列描述SEQ ID NO14GCGGCGGCCG CCTAACACTC TCCCCTGTTG AAG 33(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度30(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型DNA(A)描述引物(iii)序列描述SEQ ID NO15GCGGATATCA TGGATTTTCA GGTGCAGATT 30(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度31(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(A)描述引物(iii)序列描述SEQ ID NO16GCGGGATCCC TAACACTCTC CCCTGTTGAA G 3权利要求
1.一种根据宿主细胞种属所特有的蛋白基因密码子使用频率来优化重组蛋白(包括抗体)的表达水平的技术方案，其特征为a)确定宿主细胞中蛋白基因密码子的使用频率；b)选择各氨基酸的密码子使用频率最高的为优选密码子，使用频率第二高的为次优选密码子；c)将蛋白基因序列中一定比例的非优选密码子替换成优选密码子；d)检查CG序列的个数，在保证非优选密码子替换率的基础上尽量减少或不增加CG序列的数目；e)将密码子优化的蛋白基因插入一个真核表达载体；f)将含有目标蛋白基因的表达载体转染哺乳动物细胞进行高效表达。
2.权利要求1所述的技术，其特征在于非优选密码子替换比例是10-100％。
3.权利要求1所述的技术，其特征在于所优化的蛋白质是一种来源于真核细胞的抗体，比如人抗体，鼠抗体，人源化抗体，嵌合抗体，兔抗体等。
4.权利要求1所述的技术，其特征在于所优化的基因序列是一种来源于真核细胞的抗体组成部分，包括a)抗体片段；b)抗体轻链；c)抗体重链；d)抗体Fab片段；e)单链抗体。
5.权利要求1所述的技术，其特征在于所优化的蛋白质是一种来源于真核细胞的抗体Fc与任何来源的蛋白组成的融合蛋白。
6.权利要求1所述的技术，其特征在于所优化的蛋白质是抗CD20抗体。
7.权利要求1所述的技术，其特征在于所优化的抗CD20抗体的来源是高等生物(即真核)，包括鼠源抗体、人源抗体、人源化抗体、人鼠嵌合抗体。
8.一种密码子优化的抗CD20单克隆抗体DNA分子。
9.权利要求8所述的抗体DNA分子，其特征在于抗体的轻链可变区的DNA分子的序列为SEQ ID NO3，重链可变区的DNA分子为SEQ ID NO7。
10.一种优化的抗CD20单克隆抗体表达载体，其特征在于表达载体所含的标记基因neo和hyg均位于IRES序列后，分别与重链和轻链在同一个操纵子中表达。
11.权利要求10所述的表达载体，其特征在于可在低浓度的G418和hygmycin B下的筛选到重链和轻链基因均高效表达的细胞株。
12.一种优化的抗CD20单克隆抗体表达载体，其特征在于表达载体所含的标记基因neo和扩增基因dhfr均位于IRES序列后，分别与重链和轻链在同一操纵子中表达。
13.权利要求12所述的表达载体，其特征在于可在低浓度G418下筛选到重链高表达的细胞株，在低浓度MTX扩增下获得轻链高表达的细胞株。
14.一种抗体表达方法，其特征在于用权利要求10或权利要求12所述的表达载体在中国仓鼠卵巢细胞中表达抗体蛋白。
全文摘要
本发明提供了真核细胞表达蛋白(包含抗体)的核苷酸密码子的优化方法。本发明还提供了核苷酸密码子优化的抗CD20单克隆抗体的可变区DNA分子，该优化的抗CD20单克隆抗体在宿主细胞中的表达有明显的增加。本发明还提供了优化的哺乳动物细胞表达载体。本发明还提供了使用包含核苷酸密码子优化的抗CD20单克隆抗体DNA分子的优化的载体在CHO细胞中更高效的表达抗CD20单克隆抗体的方法。
文档编号C12N15/13GK101058807SQ20061001200
公开日2007年10月24日 申请日期2006年5月26日 优先权日2006年5月26日
发明者谢良志 申请人:神州细胞工程有限公司