专利名称：正反向双启动子植物RNAi双元表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种新型的可用于植物RNAi研究、沉默目的基因表达的真核表达载体“正反向双启动子植物RNAi双元表达载体”。
背景技术：
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是真核生物体内由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介导的降解同源RNA的现象。在细胞中，长的dsRNA被类似RNA酶III的Dicer酶切割成21～26核苷酸(nucleotide，nt)的干扰性小RNA(small interfering RNA或shortinterfering RNA，siRNA)。随后，siRNA与蛋白复合物结合后形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，并解链。而有活性的RISC在其中的siRNA反应链指导下同与其互补的转录物结合，导致RNA的降解。这是一种转录后水平的基因沉默(post-transcriptional gene silence，PTGS)，也称RNA沉默(RNA silence)。
目前，针对某个已知的基因，设计可诱导其沉默的siRNA，通过合适的手段导入细胞或机体，使该基因表达水平下降或完全沉默，从而了解该基因的功能，是RNA干扰技术在目前最广泛的应用。同时，借助操作简便的RNA干扰技术，使得在基因组水平批量地沉默众多基因，短期内对大量基因的功能进行鉴定成为可能。Boutros等针对果蝇基因组设计了19470个不同的siRNA屏蔽果蝇培养细胞基因组内的基因，鉴定出了438个与细胞的生长变异有关的基因。Kim等则对果蝇的胚胎进行了基因组范围内的RNA干扰分析后，从5800多个基因中鉴定出在果蝇心脏形成过程中发挥重要作用的一系列编码转录因子及细胞信号蛋白的基因。这些基因的发现对于深入了解果蝇的发育生物学将起到极大的促进作用。在利用RNA干扰技术进行哺乳动物基因功能鉴定方面，目前还没有规模性鉴定基因功能的报道，大多只是对所研究的某一个基因利用RNA干扰手段了解其作用。最近Berns等和Paddison等进行的RNA干扰文库的研究工作大大促进了哺乳动物中大范围的基因功能遗传缺失研究。Berns等针对7914个人类基因建立了可表达23742个不同siRNA的RNA干扰文库，并证实了该文库的有效性；而Paddison等不但建立了可作用于9610个人类基因的RNA干扰文库，同时还建立了针对5563个小鼠基因的dsRNA表达文库。这些RNA干扰库的建立将为全面而深入地了解哺乳动物的基因功能打下坚实的基础。
众多实验结果显示，利用RNA干扰技术进行功能基因组分析的巨大优势是可快速建立基因与表型之间的直接对应关系，在较短的时间内明确众多基因的功能。在动物及医学研究中，诱导RNAi的起始物多是目的基因的siRNA，主要通过化学手段体外合成或通过载体体内表达产生。可是，从目前各公司合成价格情况来看，体外合成费用很高，一对siRNA的价格在2000元(人民币)左右，而针对一个基因要想获得较高沉默效率的siRNA，至少要合成4对siRNA来比较沉默效率，这对于研究单个基因来说费用还能够接受，如果在基因组范围内研究众多基因功能则费用根本承受不起，所以这时人们都采用载体表达的方法来产生目的基因的siRNA。可是这也同样有一个问题，目前人们导入哺乳动物细胞、线虫、果蝇的表达载体，都有一个目的小片段(21-26nt)的反向重复序列结构，有时在中间还插入一段几个核苷酸的间隔序列，这就涉及多个片段的连接或者合成，所以费用同样较高，对于小片段的操作也需要一定的实验技术。这些费用上困难或者操作上的不便对于国内外资金投入很高的医学分子生物学、功能基因组学来说或许不是各自研究领域的瓶颈问题，然而对于资金投入相对较少的植物功能基因研究来讲，经费还是很多实验室不得不考虑的问题。对于植物中的RNAi技术应用，人们大多采用载体表达较长的dsRNA来达到试验目的，而dsRNA的产生是通过中间连有间隔序列的基因片段的反向连接结构表达产生的。该结构的构建涉及3个或2个片断的连接，同样，对于单个基因的研究，构建一个这样的结构不是一个难题，可是如果要象线虫或果蝇中的研究那样，在基因组范围内大批量的沉默众多基因，都通过该种方式反向连接的话，那么工作不仅量大而且繁琐，费用也较高。
发明内容
本发明针对上述领域中的空白，提供一种可用于植物RNAi研究、沉默目的基因表达的真核表达载体“正反向双启动子植物RNAi双元表达载体”，该载体能够一步插入目的序列后，即可表达产生其同源基因的dsRNA(图3)，这不但可减少工作量，也极大降低了实验费用。
正反向双启动子植物RNAi双元表达载体，其特征在于含有正、反向真核表达启动子和终止子。
所述真核表达启动子为CaMV35S，Emu，Actin，Ubi或Nos。
所述真核表达启动子为CaMV35S，所述终止子为Nos。
上述表达载体，其特征在于含有可表达的新霉素磷酸转移酶标记基因、反向Nos终止子、正向CaMV35S启动、目的基因片段插入替换序列、反向CaMV35S启动子、正向Nos终止子。
本发明表达载体通过将真核表达启动子正反向连接，使其表达两者之间插入的同一段序列的正义、反义两条链而达到表达双链RNA的目的。本发明是以双元载体pBI121(图1)为骨架改造而成的具有独特结构和功能特点的新载体，该载体含有可表达的新霉素磷酸转移酶标记基因、反向Nos终止子、正向CaMV35S启动、目的基因片段插入替换序列、反向CaMV35S启动子、正向Nos终止子及其他双元载体所必需的基因。
本发明载体实现了通过1个连接反应即可完成传统方法需2至3个连接反应才可完成的能表达双链RNA的植物表达载体构建过程，大大节约时间和财力。
利用本发明的载体通过农杆菌瞬时转化系统沉默转绿色荧光蛋白基因(Greenfluorescence protein，gfp)烟草叶片中的gfp表达。结果表明在转染部位，gfp的表达受到了由载体表达的dsRNA的抑制，从而不能显示绿色荧光；对这些叶片中的gfp mRNA进行RT-PCR分析，证实了在有上述颜色反应的叶片中没有gfp mRNA的存在，说明已经被RNAi机制所降解，从而不能表达GFP。这个载体在植物基因功能研究中应用潜力很大，尤其应用于功能基因组众多基因的功能鉴定，优势更加明显；同时，在双启动子dsRNA植物表达载体中插入植物病毒基因组片段也可应用于植物抗病毒基因工程研究。另外，载体表达框架中每个元件两端都有适当的单酶切位点，可以根据试验安排用其他适当的元件进行替换。
图1pBI121图谱图2pGEM-3Z部分酶切位点分布图3正反向双启动子植物RNAi双元表达载体中表达框架表达示意图A载体中CaMV 35S启动子正反向连接构成的表达框架结构B该框架表达出目的序列的双链RNA形态图4利用发明载体沉默转gfp烟草中的gfp表达A1，A2，A3，A4分别为对照在转染烟草叶片后4、7、9、11天的颜色变化B1，B2，B3，B4分别为沉默gfp载体转染烟草叶片a后4、7、9、11天时的颜色变化C1，C2，C3，C4分别为沉默gfp载体转染烟草叶片b后4、7、9、11天时的颜色变化图5转染后叶片gfp的RT-PCR结果MMarker；CK对照；a，b分别为叶片a和叶片b
具体实施例方式
现结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1正反向双启动子植物RNAi双元表达载体构建本发明是以双元载体pBI121(图1)为骨架改造而成的具有独特结构和功能特点的新载体，其构建方法如下1.含不同酶切位点的CaMV35S启动子和Nos终止子序列的获得①设计不同CaMV35S启动子两端PCR扩增引物如下第一对引物(S1)上游ATCTAGAAGATTAGCCTTTTCAATTTCXbaI位点(划线部分)下游AGGATCCCGTGTTCTCTCCAAATGAAABamHI位点(划线部分)第二对引物(S2)上游AGAGCTCAGATTAGCCTTTTCAATTTC SacI位点(划线部分)下游AGGATCCCTCGAGCGTGTTCTCTCCAAATGAAA BamHI(单划线部分)，XhoI位点(双划线部分)②设计不同Nos终止子两端PCR扩增引物如下第一对引物(N1)上游AGAGCTCGATCGTTCAAACATTTGGCASacI位点(划线部分)下游AGAATTCCCCGATCTAGTAACATAGATEcoRI位点(划线部分)第二对引物(N2)上游ATCTAGAGATCGTTCAAACATTTGGCAXbaI位点(划线部分)下游AAAGCTTCCCGATCTAGTAACATAGATHindIII位点(划线部分)③根据gus基因片断设计插入片段序列为了避免反向重复结构直接相连导致的质粒结构不稳定的问题，试验设计了一个与启动子和终止子无关的插入片段将反向重复的35S启动子隔开，从而稳定质粒结构。该片段是gus基因的一段序列引物(I)上游ACTCGAGTGCGTCACAGCCAAAAGCCAGXhoI位点(划线部分)下游AGGATCCCGTTGCTTCCGCCAGTGGCGCBamHI位点(划线部分)④用上述5对引物以质粒pBI121为模板扩增获得5个片断扩增体系如下95℃预变性3min，95℃变性1min，52℃退火2min，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min。
回收PCR扩增目的条带后，分别以扩增引物名称将它们命名为S1，S2，N1，N2，I，将5个片断分别连入pGEM-T载体，分别命名为pGEM-T-S1，pGEM-T-S2，pGEM-T-N1，pGEM-T-N2，pGEM-T-I。热激转化大肠杆菌Top10感受态细胞后，挑取单克隆测序，使用测序正确的克隆作下一步试验。
2.顺序连接5个片断获得表达框架首先用SacI/BamHI双酶切将pGEM-T-S2的S2片段切下，连入同样酶切的pGEM-3Z(图2)中，将该载体命名为pGEM-3Z-S2。
第二步，用BamHI/XhoI双酶切将pGEM-T-I的I片段切下，连入同样酶切的pGEM-3Z-S2中，将该载体命名为pGEM-3Z-S2-I。
第三步，用XbaI/BamHI双酶切将pGEM-T-S1的S1片段切下，连入同样酶切的pGEM-3Z-S2-I中，将该载体命名为pGEM-3Z-S2-I-S1。
第四步，用XbaI/HindIII双酶切将pGEM-T-N2的N2片段切下，连入同样酶切的pGEM-3Z-S2-I-S1中，将该载体命名为pGEM-3Z-S2-I-S1-N2。
第五步，用SacI/EcoRI双酶切将pGEM-T-N1的N1片段切下，连入同样酶切的pGEM-3Z-S2-I-S1-N2中，将该载体命名为pGEM-3Z-N1-S2-I-S1-N2。
在每一步连接反应中，都对连接产物进行酶切鉴定和序列测定以保证连接的正确性。最后得到连接正确的“反向Nos终止子(N1)-正向35S启动子(S2)-插入序列(I)-反向35S启动子(S1)-正向Nos终止子(N2)”表达框架(图3A)。
3.正反向双启动子植物RNAi双元表达载体的获得将⑤中的表达框架“N1-S2-I-S1-N2”用EcoRI/HindIII双酶切切下，连入同样酶切的pBI121(pBI121经双酶切后去除了原来存在的35S启动子、gus基因、Nos终止子)中，获得正反向双启动子植物RNAi双元表达载体的。
实验例利用发明的载体通过农杆菌瞬时转化系统沉默转绿色荧光蛋白基因(Greenfluorescence protein，gfp)烟草叶片中的gfp表达。
1实施方法①根据gfp基因序列设计上游引物P1(5’-AGGATCCGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3’)含有BamHI酶切位点和下游引物P2(ACTCGAGTTACTTGTACAGCTTGTCCA)含有XhoI酶切位点，以转gfp基因烟草的基因组DNA为模板进行扩增。扩增的600bp片段连入pGEM-T载体，通过BamHI/XhoI双酶切连入同样双酶切的本发明载体中，酶切鉴定载体连接正确后构建成gfp沉默载体。
②将构建好的gfp沉默载体0.1μg加入到100μl农杆菌LBA4404感受态细胞中，液氮冷冻5min后取出融化，加入500μl YEB培养基，28℃摇床培养4h后离心，去除上清400μl，剩余200μl重悬菌体，全部涂布于含有链霉素(50mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的YEB固体培养基上，25℃培养3天。
③挑取单菌落于液体YEB培养基(含链霉素50mg/L，卡那霉素50mg/L)中，28℃振荡培养过夜；次日按1∶100的比例重新加入到YEB液体培养基(含链霉素50mg/L，卡那霉素50mg/L)中，等到OD600达0.5时取出，离心收集菌体，重悬于MgCl2(0.01mmol/L)和MES(0.01mmol/L)中；利用1ml注射器对含有gfp基因的烟草叶片进行注射转染，分别在4天、7天、9天、11后在长波紫外灯下观察叶片变化情况，拍照。同时，以未连入gfp片段的本发明载体为对照进行转染。
④提取叶片总RNA，反转录后以P1/P2为引物作RT-PCR，检测gfp mRNA的存在情况。
2实施结果与对照相比，处理的叶片在7dpi时开始变红，到第11dpi时叶片转染部分完全变红，而对照没有明显变化。这样的结果说明在转染部位，gfp的表达受到了由载体表达的dsRNA的抑制，从而不能显示绿色荧光(图4)。对这些叶片中的gfp mRNA进行RT-PCR分析(图5)，证实了在有颜色反应的叶片中没有gfp mRNA的存在，说明已经被RNAi机制所降解，从而不能表达GFP。
权利要求
1.正反向双启动子植物RNAi双元表达载体，其特征在于含有正、反向真核表达启动子和终止子。
2.根据权利要求1所述的正反向双启动子植物RNAi双元表达载体，所述真核表达启动子为CaMV35S，Emu，Actin，Ubi或Nos。
3.根据权利要求2所述的正反向双启动子植物RNAi双元表达载体，所述启动子为CaMV35S，所述终止子为Nos。
4.根据权利要求3所述的正反向双启动子植物RNAi双元表达载体，其特征在于含有可表达的新霉素磷酸转移酶标记基因、反向Nos终止子、正向CaMV35S启动、目的基因片段插入替换序列、反向CaMV35S启动子、正向Nos终止子。
5.权利要求1-4所述的任一正反向双启动子植物RNAi双元表达载体在沉默目的基因表达中的应用。
全文摘要
本发明涉及“正反向双启动子植物RNAi双元表达载体”，其特征在于含有正、反向真核表达启动子。该载体实现了通过1个连接反应即可完成传统方法需2至3个连接反应才可完成的能表达双链RNA的植物表达载体构建过程，大大节约时间和财力。可应用于植物功能基因组学研究、病毒沉默抑制蛋白研究和植物抗病毒基因工程研究；尤其适用于在基因组范围沉默众多基因表达的植物功能基因RNA干扰库的建立。同时，载体表达框架中每个元件两端都有适当的单酶切位点，可以根据试验安排用其他适当的元件进行替换。
文档编号C12N15/82GK1844403SQ200610011669
公开日2006年10月11日 申请日期2006年4月13日 优先权日2006年4月13日
发明者燕飞, 成卓敏, 张文蔚, 肖红, 李世访 申请人:中国农业科学院植物保护研究所