抗nkg2a的单克隆抗体的制作方法

专利名称：抗nkg2a 的单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及针对NK细胞表面受体NKG2A的单克隆抗体及其片段，以及生产和评价这样的抗体的方法。单克隆抗体及其片段在治疗免疫疾病，尤其是自身免疫性疾病以及其他要求调控NK细胞功能的疾病中是有用的。总体而言，本发明方法涉及使用抗体及其片段，以防止导致促成待治疗疾病病理的表达HLA-E或Qalb的细胞如树突细胞或活化T细胞的溶解的NK细胞上NKG2A受体的刺激。
背景技术：
保持有效的免疫监视而不引起自身免疫反应需要效应T细胞反应的准确滴定。当免疫系统针对自身抗原发起免疫反应时便出现自身免疫性疾病(参见，例如，Ludewig etal. (1999) Immunol Rev. 169 :45-54)。尽管在引发和维持自身免疫性反应中涉及的机制还不清楚，但是可能涉及在次级淋巴器官中以前在免疫方面被忽视的抗原的出现。树突细胞是骨髓来源的抗原呈递细胞(APC)，其在免疫反应中发挥关键作用(参见,例如，0’ Neill et al. (2004)Bloodl04 :2235-2246)。DC通过吞噬、胞吞和胞饮作用将细菌、病毒、濒死细胞和各种复合分子加以内化。并入的蛋白被分解为肽，它们接着与MHCI和II类分子一起被呈递到DC细胞表面上。加载到MHC I类上的抗原通常来源于内源性蛋白并且由CD8+T细胞识别，而MHC II类加载的抗原通常来源于外源蛋白并且由CD4+T细胞识别。在抗原捕获之后，未成熟的DC细胞变成熟而形成了成熟的DC，它们表现出减少的吞噬作用，移动到淋巴组织并且具有增强的T细胞刺激能力。在淋巴组织中，DC起动原初(naive ) T细胞，刺激它们的克隆扩增和分化，并且也可以与B细胞和本身免疫系统的细胞(包括NK细胞)相互作用。活化的NK细胞可以杀伤不成熟的DC细胞，而不是成熟的DC细胞。由于T淋巴细胞的抗原运送和初始敏化主要是通过抗原呈递树突细胞介导的，所以有可能通过树突细胞自身抗原的不合适的呈递至少部分地促进自身免疫性障碍。自然杀伤(NK)细胞是包括在非传统免疫中涉及的淋巴细胞的亚种群。NK细胞提供一种有效的免疫监督机制，由此可消除不希望的细胞如肿瘤细胞或病毒感染的细胞。NK细胞活性是通过包含两种活化和抑制信号的复杂机制进行调控的(参见，例如，Morettaet al. (2001)Annu Rev TmmunoI 19 :197-223 ；Moretta et al. (2003)EMBO J EPub Dec18 ；Ravetch et al. (2000)Science 290 :84-89 ;Zambello et al. (2003)Blood 102 1797-805 ；Moretta et al. (1997)Curr Opin Immunol 9 :694-701 ;将其全部内容通过引用结合在此)。已证实多种不同的NK特异性受体在NK细胞介导的对HLA I类缺陷型靶细胞的识别和杀伤中起重要作用。这些受体(称为NKp30、NKp46和NKp44)是Ig超家族的成员。它们的交联(通过特异性mAb诱导)导致强烈的NK细胞激活，致使细胞内Ca++水平升高，触发细胞毒性和淋巴因子释放。重要的是，mAb介导的NKp30、NKp46和/或NKp44的活化导致对于多种靶细胞的NK细胞毒性的激活。这些发现为这些受体在天然细胞毒性中的一种中心性作用提供了证据。NK细胞由主要组织相容性复合物(MHC) I类-特异性抑制性受体进行负调控(Karre et al. (1986)Nature 319 :675-8 ；0hlen et al, (1989) Science 246 :666-8)。这些特异性受体与主要组织相容性复合体(MHC) I类分子或HLA的多态决定子相结合，并抑制自然杀伤(NK)细胞溶解。在人体内，称为杀伤Ig-样受体(KIR)的受体家族的某些成员识别HLA I 类等位基因的组(参见，例如 Yawata et al. (2002)Crit Rev TmmunoI 22:463-82;Martin et al. (2000)Immunogenetics. 51 :268-80 ；Lanier (1998)Annu Rev Immunol. 16 359-93 ;将其全部内容通过引用结合在此)。NK细胞上的另一重要的抑制性受体是⑶94-NKG2A，其与非典型的MHC I类分子HLA-E相互作用(参见，例如Braud et al. (1998)Nature 391 :795-799 ；Lee et al. (1998) PNAS 95 :5199-5204 ；Vance et al. (2002)PNAS 99 :868-873 ；Brooks et al. (1999)J Immunoll62 :305-313 ;Miller et al. J Immunol(2003) 171 :1369-75 ;Brooks etal. (1997) J Exp Med 185 :795-800 ；Van Beneden et al. (2001)4302-4311 ;美国专利申请第20030095965号；将每一篇的内容都通过引证方式合并入本文中)。这些受体中的一些具有调节T细胞抗原受体-依赖性T细胞活化的阈值的能力。在罕见的抑制性受体缺乏的情况下，这些活化同工型(isoform)可能扩大T细胞效应器的功能并且促成自身免疫病理。NKG2A的氨基酸序列在哺乳动物(包括灵长类动物)中发生变化。例如，NKG2A蛋白的人类和猕猴形式共享少于90%的一致性，包括在配体结合结构域内的大约86%。对于用于调节NKG2A的疗法的努力(主要用于防止炎症)已集中在对非典型MHCI类分子、用于人类受体的HLA-E和用于小鼠受体的Qa-Ib的研究上。对于细胞表面表达，这些MHC分子优选与来源于其他MHC I类分子的信号肽的肽结合。其他I类MHC分子的表达可以调控HLA-E的表达，因此，允许NK细胞在潜在的靶细胞中监控MHC I类依赖性抗原呈递途径的状态。细胞表面HLA-E的水平对于针对肿瘤和病毒感染细胞的NK细胞毒性是至关重要的。用于调节HLA-E表达或功能的治疗方案通常集中在利用HLA-I或HSP60肽来诱导用于防止发炎的保护状态，致使NK细胞不被活化。美国专利公开第20030095965号披露了一种抗体3S9，其与NKG2A、NKG2C和NKG2E结合。据称3S9引起这些受体的交联并且伴随着NK细胞介导的溶解的抑制。共同拥有的PCT专利公开W02005/105849披露了一种抗体的应用，其中该抗体与NK受体(包括NKG2A)特异结合，以治疗患有粒状淋巴细胞(NK-LDGL)的NK型淋巴细胞增殖性疾病的患者。这样的抗体抑制NK细胞活性。已证明单克隆抗体对于各种疾病的诊断和治疗是非常有用的。治疗用单克隆抗体可以通过不同的机制起作用。一些抗体如利妥昔(Rituxan)识别在病态细胞(例如，肿瘤细胞)表面上存在的抗原(在利妥昔的情形下的CD20)，并且通过指导免疫细胞破坏所识别的细胞而起作用。其他抗体如将托西莫(Bexxar)、Oncolym或泽娃灵(Zevalin)连接于放射性同位素、化学治疗剂或毒素，导致与该抗体结合的细胞的直接杀伤。还有其他的抗体如巴利昔单抗(Basiliximab)和达利珠单抗(Daclizumab)(它们封闭IL_2)、IgE封闭的奥马佐单抗(Omalizumab)和efaluzimab起作用以封闭特异性蛋白的活性。基于抗体的疗法在本领域是众所周知的并且被综述在例如Gatto (2004) Curr Med Chem Anti-Canc Agents4(5) :411-4, Casadevall et al. (2004)Nat Rev Microbiol. 2(9) :695-703, Hinoda etal. (2004)Cancer Sci.95(8) :621-5, Olszewski et al. (2004)Sci STKE. Jul06(241)pe30, Coiffier(2004)Hematol J. Suppl 3 :S154_8，Roque et al. (2004)BiotechnolProg. 20(3) :639-54中，将其每一篇的全部内容都通过引用结合在此。在抗体可被用于人类的治疗应用、或进入临床试验之前，它们必须在非人类动物中经过临床前研究以评价各种参数如它们的毒性、体内有效性、生物利用度、半衰期以及各种其他的药代动力学和药效学参数。这样的化验分析通常是在哺乳动物中进行的，并优选地，在它们具有生物活性，即在mAb与物种内的同系物分子起反应的部位进行，因此人们可以期望其与人类最大程度的生理相似性。然而，如果针对人类蛋白的抗体不与靶蛋白的非人类动物同系物相结合，则在非人灵长类动物中的研究可能被阻止。相反，当存在交叉反应性时，在该动物体内不仅可以检测该抗体的体内有效性，而对其他问题如副作用、毒性或与抗体结合于靶蛋白有关的动力学性质也可以进行研究。易于获得的灵长类动物的实例 包括新世界猴(New World monkey)和旧世界猴(Old World monkey),如短尾猴(Macacamulatta)、称猴(Macacus mulatta)、非洲绿猴(Chlorocebus aethiops)、滅猴(Callithrixjacchus)、松鼠猴(Saimiri sciureus)都可以从“Centre de Primatologie”(CDP :ULP,Fort Foch,67207Niederhausbergen, France)获得，并且狒狒(Papio hamadryas)可以从“Station de Primatologie du CNRS”, CD56,13790Rousset/Arc, France 获得。黑猩猩和猿通常也可以用于检测候选药物，尽管这样的情形很少，并且只有当没有其他用于检测的替代物存在或已被用尽时。由于抗体与它们的目标的特异性三维特征相结合，所以在靶蛋白的氨基酸序列上的微小变化可使其无法结合在一起，使得很难预测针对来自一个物种的蛋白的所给抗体是否会结合于享有一部分但不是全部序列一致性的同源蛋白。已经描述了许多情形，其中例如针对人类蛋白的抗体对于即使紧密相关的物种中的同系物也不结合。例如，抗人类CD4蛋白的一些抗体不结合猴同系物，即使人类和猕猴CD4蛋白具有接近94%的一致性(参见，例如，Genbank IDs GI 116013and 20981680 ；Sharma et al. (2000) JPET 293 :33-41,2000，将其全部内容通过引用结合在此)。其他的实例包括抗人类CD3(对于抗体开发的而被广泛研究的药物靶点)的一些抗体，本来具有适于开发的特性的一些抗体，如UCHT2，不与猴CD3蛋白进行交叉反应。鉴于许多自身免疫性疾病的突出性和严重性，以及成熟树突细胞在协调针对自身抗原的免疫反应中的作用，本领域很需要新的且有效的疗法，调节潜在的这些疾病的树突细胞的活性或水平。此外，也需要针对以可以屏蔽自身不被免疫系统破坏的异常细胞(例如，以某些癌细胞或病毒感染的细胞)为特征的疾病的疗法。最后，还需要找到对于针对NKG2A的单克隆抗体在人体内的治疗潜力的有效体内检测系统。本发明致力于解决这种和其他的需求。

发明内容
本发明提供了针对NKG2A受体的单克隆抗体及其片段。本发明的单克隆抗体及其片段可以抑制NK细胞溶解正常地易感染靶细胞的能力(“NK细胞抑制性抗体”)，或重建NK细胞溶解另外受保护的靶细胞的能力(“NK细胞活化抗体”)。本发明的单克隆抗体及其片段的功能依赖于它们结合Fe受体的能力。Fe受体如Fe Y受体被表达在白细胞的表面上。这些受体与免疫球蛋白(Ig)的Fe部分结合，例如，Fe y受体与IgG的Fe部分结合。这种结合通过将由抗体对抗原的识别与基于细胞的效应子机制相关联而有助于促进免疫功能。不同的免疫球蛋白种类通过免疫球蛋白Fe区域与免疫细胞上的特异性Fe受体(FcR)的差异相互作用而触发不同的效应器机制。活化 Fe Y 受体包括 Fe Y RI、Fe YR IIA, FcyR II C 和 FcyRIIIA。FcyRII B被认为是一种抑制性的Fe Y受体。(对于综述，参见，例如，Woof et al. (2004)NatRev Tmmun01. 4(2) :89-99 ;Baumann et al. (2003)Arch TmmunoI Ther Exp (Warsz)51(6)399-406 ；Pan et al. (2003)Chin Med J (Engl)116(4) :487-94 ;Takai et al. (1994)Cell76 :519-529 ；Ravetch et al. (2001)Annu Rev Immunol 19 :275_290，将其每一篇的全部内容通过引用结合在此)。
不受理论的限制，本发明的发明人相信，在本发明的抗体和片段中存在的Fe受体结合区域在带有Fe受体的细胞存在下引起NK细胞溶解的抑制。缺乏Fe受体结合区域的那些抗体和片段可以在它们的细胞表面上重建带有HLA-E或Qalb的靶细胞的NK细胞溶解。这样的靶细胞通常通过HLA-E或Qalb与NKG2A受体的相互作用来保护其不发生NK细胞溶解。本发明还提供了一种包括本发明的抗体和片段的组合物，以及利用这样的组合物来治疗不同疾病和障碍的治疗方法。本发明进一步提供了用非人灵长类动物来评价和表征针对人类NKG2A的抗体或其片段的活性、毒性和合适剂量方案。所以，一方面，本发明提供了一种活化抗体，它是单克隆抗体或其片段，其特征在于a)特异性结合NKG2A ；b)非特异性结合Fe受体；和c)当结合于人类NK细胞上的NKG2A时，引起所述NK细胞溶解在靶细胞表面上带有HLA-E或Qalb的靶人类细胞(当所述靶细胞与所述NK细胞接触时)。优选地，该单克隆抗体或片段不与其他的人类NKG2受体结合，特别是活化受体NKG2C或NKG2E。更优选的是本发明的抗体或片段与选自Z199或Z270的抗-NKG2的单克隆体完全竞争。在一个优选的具体实施方式
中，该单克隆抗体或其片段能够与非人灵长类动物的NKG2A结合。更优选地，当结合在非人灵长类动物NK细胞上的NKG2A时，该单克隆抗体或其片段具有在靶细胞表面上重建带有HLA-E的靶非人灵长类动物细胞的溶解(当所述靶细胞与所述NK细胞接触时)。在另一优选的具体实施方式
中，该单克隆抗体或其片段包括Z270的可变重链区或Z270的可变轻链区的氨基酸序列。在可替换的优选具体实施方式
中，该单克隆抗体或其片段包括Z199的可变重链区或Z199的可变轻链区的氨基酸序列。在又一优选的具体实施方式
中，该单克隆抗体或其片段包括小鼠或人类IgGl恒定区，该恒定区已被修饰以防止与Fe受体或人类IgG4恒定区结合。在另一优选的具体实施方式
中，该抗体或片段是嵌合或人源化的。更优选的是包括ch270VK或ch270VH的抗体或其片段。在另一具体实施方式
中，该抗体或其片段被衍生化以增强其体内的生物可利用度或稳定性。在另一具体实施方式
中，该抗体是用PEG进行衍生化。本发明的活化抗体和片段对于重建某些在正常情况下抵抗NK细胞介导的溶解的靶细胞溶解很有用。因此，在另一具体实施方式
中，本发明提供一种在包括NK细胞和所述靶细胞的种群中重建NK细胞介导的靶细胞溶解的方法，其中所述NK细胞的特征在于其表面上的NKG2A，并且所述靶细胞的特征在于其表面上存在HLA-E或Qalb,所述方法包括将所述NK细胞与上述单克隆抗体或片段进行接触的步骤。优选地，该靶细胞是人类细胞。更优选地，该靶细胞是树突细胞(“DC”)、癌细胞或病毒感染的细胞。最优选地，该靶细胞是成熟的树突细胞(“mDC”)。活化的抗体或其片段可以被配制到另外包含药学上可接受的载体或赋形剂的组合物中。进行这样的组合可以被形成制剂以适于药学上给药。该药物组合物可以可选包括对于被治疗的特定疾病或症状有用的第二治疗剂。所有这样的组合物也是本发明的一部 分。本发明的活化抗体组合物可用于治疗或预防患者体内的自身免疫或炎性障碍、或免疫反应；或治疗患者体内以在其表面上存在表达HLA-E或Qalb的癌细胞为特征的癌症，或以在其表面上存在表达HLA-E或Qalb的病毒感染细胞为特征的病毒性疾病。这些方法可以另外包括给予患者对于待治疗的特定疾病或症状有用的第二治疗剂的步骤。该第二治疗剂可以作为一个单独的剂型或作为所述组合物的一部分给予。在一个具体实施方式
中，在包含本发明的活性抗体或片段的组合物和利用本发明的活性抗体或片段的方法中的第二治疗剂是激动活化的NK细胞受体如NKp30、NKp44和NKp46的化合物。在另一具体实施方式
中，该第二治疗剂是抑制性NK细胞受体如抑制性KIR受体的拮抗剂。在另一具体实施方式
中，第二治疗剂是TGF-Pl的拮抗剂。在另一具体实施方式
中，第二治疗剂选自由细胞因子抑制剂、造血生长因子、止痛药、胰岛素、抗炎剂和免疫抑制剂组成的组。在另一具体实施方式
中，该第二治疗剂是抗癌化合物或止吐剂。在另一具体实施方式
中，该第二治疗剂是抗病毒化合物。在另一具体实施方式
中，待预防或治疗的自身免疫性或炎性障碍选自由以下组成的组自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、结节性多动脉炎、系统性红斑狼疮、韦格纳肉芽肿(Wegener ' s granulomatosis)、阿耳茨海默氏病、自身免疫性肝炎、白塞氏病(Beh^efs disease)、克隆氏病(Crohn' s disease)、原发性胆汁性肝硬化、硬皮病、溃瘍性结肠炎、干燥综合症(Sj6gren’S syndrome)、I型糖尿病、葡萄膜炎、葛瑞夫兹氏病(Graves' disease)、甲状腺炎、I型糖尿病、心肌炎、风湿热、硬皮病、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、肾小球肾炎、结节病、皮肌炎、重症肌无力、多肌炎、格林巴利综合症(GuiIIain-Barresyndrome)、多发性硬化、斑秀、天疱疮/类天疱疮、牛皮癣和白癜风。在另一方面，本发明提供了一种抑制性单克隆抗体或其抑制性片段，其特征在于a)特异性结合NKG2A ；b)特异性结合Fe受体；c)不结合NKG2C或NKG2E ；d)与Z270或Z199完全竞争；e)能够抑制一个NK细胞敏感的靶细胞的NK细胞溶解，其中所述交联的单克隆抗体不是Z199。在一个优选的具体实施方式
中，该抑制性抗体进一步的特征在于结合非人灵长类动物NKG2A。在一更优选的具体实施方式
中，抑制性抗体或其片段包括Z270的可变轻链区的氨基酸序列，或Z270的可变重链区的氨基酸序列。在最优选的具体实施方式
之一中，该抗体是Z270。在另一个优选的具体实施方式
中，该抑制性抗体或片段是嵌合的或人源化的。更优选的是包括ch270VK或ch270VH的抑制性抗体或其抑制性片段。在另一个最优选的具体实施方式
中，该抗体是chZ270或Z270。在另一个具体实施方式
中，本发明提供了一种组合物，其包括一种有效量的上述抑制性抗体或其抑制性片段、或Z199 ;以及一种药学上可接受的载体或赋形剂。这些抑制性抗体组合物优选进行配制以用于药学上的应用。本发明的抑制性抗体组合物可选包括对治疗特征在于不希望的其他细胞的NK细胞介导的溶解、过度活化的NK细胞活性或不需要的NK细胞增生的疾病或症状有用的第二治疗剂。这样的第二治疗剂可以选自例如细胞因子、抗癌化合物(如化学治疗用化合物、抗血管形成化合物、促进凋亡的化合物、激素剂、干扰DNA复制、有丝分裂和/或染色体分离的化合物、或破坏多核苷酸前体的合成和保真度的试剂)、辅助性化合物、能够刺激抑制性NK细胞受体的化合物(如能够刺激⑶94/NKG2A受体或抑制性KIR受体如KIR2DL1、KIR2DL2、 KIR2DL3、KIR3DL1和KIR3DL2的活性的天然配体、抗体或小分子)、或活化的NK细胞受体(如 NKp30、NKp44 或 NKp46)的抑制剂。本发明的抑制性抗体和片段可以在减少NK细胞介导的细胞溶解的方法中使用。可替换地，本发明的抑制性抗体和片段可以在减少细胞种群中的NK细胞数量的方法中使用。这两种方法都包括将所述NK细胞与抑制性单克隆抗体或片段进行接触的步骤。本发明的包括抑制性抗体的药学上适合的组合物可用于治疗或预防患有以不希望的NK细胞介导的其他细胞溶解、过度活化的NK细胞活性、或不需要的NK细胞增生为特征的疾病或症状的患者的方法中，所述方法包括给予患者所述组合物的步骤。一种这样的症状是NK-LDGL。NK-LDGL(粒状淋巴细胞的NK-型淋巴细胞增生性疾病；另外称之为NK-LGL)是指由NK细胞或NK样细胞，即表现出表面抗原表达的特性组合(例如，⑶3_、CD56+、CD16+等等；参见，例如Loughran (1993) Blood 82 1)的大粒状淋巴细胞的克隆扩增引起的一类增生性障碍。在一可替换的具体实施方式
中，利用本发明的抑制性抗体的任何方法可以包括给予所述患者第二治疗剂的附加步骤。第二治疗剂是正常情况下用于治疗以不希望的NK细胞介导的其他细胞溶解、过度活化的NK细胞活性或不需要的NK细胞增生为特征的疾病或症状的药剂。这样的药剂的实例在上文中已陈述。该第二治疗剂可以作为单独的剂型或作为所述抑制性抗体或片段组合物的一个成分给予。另一方面，本发明提供一种包括本文中描述的抗体或其片段的任何一个或多个的试剂盒。通常，该试剂盒还包括一根据本发明方法使用该抗体的说明书。在相关的具体实施方式
中，该试剂盒在一个单独的容器中另外包括一个第二治疗剂，如上面描述的用于在治疗或预防各种疾病或症状中与活化或抑制性抗体或片段联用的那些中的任一种。根据另一个方面，本发明提供了一种评价针对人类NKG2A的抗体的方法，包括以下步骤a)将所述抗体与其表面上具有以NKG2A为特征的非人灵长类动物细胞、或非人灵长类动物NKG2A多肽进行接触jPb)评估所述抗体与所述细胞或多肽结合或影响所述细胞或多肽结合的活性的能力。在一个相关的具体实施方式
中，该方法用于评价活化的抗体；将所述抗体与包含非人灵长类动物NK细胞和靶细胞的细胞种群进行接触，其中所述NK细胞的特征在于在其表面上的NKG2A，并且所述靶细胞的特征在于在其表面存在HLA-E ;并且所述评估步骤是确定所述靶细胞是否被溶解。在另一具体实施方式
中，本发明提供了一种生产适用于人类的疾病治疗的抗体的方法，所述方法包括a)用包括人类NKG2A的组合物使非人类哺乳动物免疫；b)选择结合NKG2A、但不结合NKG2C或NKG2E的单克隆抗体；c)使所述抗体适合于人类使用；d)将所述抗体给予非人灵长类动物；以及e)评估所述抗体在所述灵长类动物体体内与NKG2A的结合能力和所述灵长类动物对所述抗体的耐受性。如果该抗体与之结合并且被所述非人灵长类动物所耐受，则表明所述抗体适用于人类的疾病治疗。在优选的具体实施方式
中，该方法包括在步骤d之前修饰所述抗体使之不结合于Fe受体的附加步骤。本发明还提供了通过这种方法生产的一种抗体。在又一个具体实施方式
中，本发明提供了一种对于针对人类NKG2A的一种治疗抗体的合适的给药方案进行鉴别的方法，所述方法包括a)利用其中所述抗体的剂量和频率 被改变的一系列给药方案将所述抗体给予一个非人灵长类动物jPb)确定表达NKG2A的细胞在所述非人灵长类动物体内的活性和所述灵长类动物对于每一种所述给药方案的耐受性。一旦确定一种方案被所述灵长类动物耐受并且导致可以检测到的对在所述表达NKG2A的细胞的活性中的调节，则该给药方案被认为适用于人类。根据一可替换的具体实施方式
，本发明提供了一种结合物，包括a) —种抑制性或活性抗体，和b) —种细胞毒性试剂。所得到的结合物用于杀死NK细胞。因此，活性抗体与细胞毒性试剂的结合将产生一种杀死NK细胞的分子，与单独通过活性抗体所实现的细胞活化相反。本发明的细胞毒素/抗体结合物能够以一种类似于本发明的抑制性抗体的方式配制到组合物中并用于各种方法。


图I示出重建用抗-NKG2A mAb的溶解，具体地为克隆体Z270 (mlgGl)。其示出了三种不同浓度的Z270对处于不同的NK细胞与PHA胚细胞比率的表达HLA-E的PHA胚细胞的NK细胞溶解的影响。图2示出重建用抗-NKG2A mAb的溶解，具体地为克隆体Z199 (mlgG2b)。其示出了三种不同浓度的Z199对处于不同的NK细胞与PHA胚细胞比率的表达HLA-E的PHA胚细胞的NK细胞溶解的影响。图3示出重建用抗-NKG2A mAb的溶解，具体地为第13天的NK主体/PHA胚细胞，其中E/T比率=I. 50ii g/ml mAb。其示出了 Z270的F (ab' ) 2片段对表达HLA-E的PHA胚细胞的NK细胞溶解的影响。图4示出第16天的抗-NKG2A mAb、克隆体Z270与短尾猴NK主体的结合(300u/ml)。其示出了结合于短尾猴NK细胞的抗体Z270以及IgGl和抗-⑶16，证实了 Z270结合于短尾猴NK细胞。还对猕猴和狒狒显示出了结合。
具体实施例方式引言本发明提供针对NKG2A的新的抗体，这些抗体活化NK细胞介导的以在其细胞表面上存在表达HLA-E或Qalb的细胞为特征的靶细胞溶解；提供用于生产、评价和表征用于治疗用途的这些抗体的方法；以及提供包括用于治疗自身免疫或炎性障碍和其他的以其细胞表面上存在表达HLA-E或Qalb的细胞(例如树突细胞)为特征的症状的那些抗体的组合物和使用这样的抗体用于治疗自身免疫或炎性障碍和其他的以其细胞表面上存在表达HLA-E或Qalb的细胞(例如树突细胞)为特征的症状的方法。本发明部分地基于令人意外的发现，即NKG2A对于通过许多NK细胞抑制成熟树突细胞的溶解中负有主要责任。成熟树突细胞表达显著水平的HLA-E，其通过NK细胞上存在的NKG2A受体发挥作用以抑制树突细胞的靶向作用。因此，不受限于下面的理论，所相信的情况是阻止NKG2A介导的NK细胞抑制导致了由NK细胞靶向的树突细胞的增多，从而提供对于自身免疫性障碍或炎性障碍或实际上对于任何可通过减少树突细胞、尤其是成熟树突细胞的活性来减轻或治愈的症状的有效治疗。因此，更一般而言，本发明还提供了在哺乳动物中抑制或减少树突细胞、优选成熟树突细胞的数量，以及通常减少免疫反应、优选自身反应性免疫反应的方法。相反地，本发明还提供针对NKG2A的新抗体，其抑制NK细胞介导的靶细胞溶解；提供生产、评价和表征用于治疗用途的那些抗体的方法；以及提供包括用于治疗自身免疫疾病或移植排斥的那些抗体的组合物和使用这些抗体的方法。 定义如本文所使用，除非另外说明，下面的术语具有赋予它们的含义。如本文中所使用，“NK”细胞是指在非传统免疫中涉及的淋巴细胞的亚群。NK细胞可以借助于某些特性和生物学性质加以鉴别，如特异性表面抗原包括⑶16、⑶56和/或⑶57的表达、在细胞表面上缺少a/0或y/S TCR复合体、通过活化特异性细胞溶解酶而结合和杀死不能表达“自身”MHC/HLA抗原的细胞的能力、杀死肿瘤细胞或其他的表达用于NK活化受体的配体的疾病细胞的能力、以及释放刺激或抑制免疫反应的称为细胞因子的蛋白质分子的能力。任何这些特性或活性可以利用本领域熟知的方法用来鉴别NK细胞。树突细胞是骨髓中产生的免疫细胞的异源种群(参见，例如，0’Neill etal. (2004)Blood 104 :2235-2246, Mohamadzadeh et al. (2004)J Immune Based TherVaccines. 2004 ；2 :1 ;将其全部内容通过引用结合在此)。如本文中提到的，DC可包括DC前体、不成熟DC和成熟DC。DC前体和不成熟DC是种系负性(CD3-CD14-CD19-CD56-)HLA-DR+单核细胞。这些细胞可以被进一步分成两个种群髓样DC和浆细胞样DC。髓样DC是⑶I Ic+和⑶123低，并具有单核细胞样外观，而浆细胞样DC是⑶IIc-和⑶123高，且具有类似于浆细胞的形态特征。在抗原捕获后，DC经历一个成熟的过程，其中捕获的抗原被处理为肽并加载到MHC I类或II类上用于在细胞表面上呈递。成熟DC细胞表现出较低的吞噬摄取，具有称为菌幕的胞质扩展，移动到淋巴组织，并表达特征标记物如⑶83和DC-LAMP。TLR还在DC中被表达，其中不同DC型表达不同的TLR标记(参见，例如，O’Neill et al. (2004))。NKG2A(0MIM 161555，将其全部内容通过引用结合在此)是转录物的NKG2群的一员(Houchins, et al. (1991) J. Exp. Med. 173 :1017-1020)。NKG2A 被跨接 25kb 的 7 个外显子编码，表现出一些差异性剪接。NKG2A是一种在NK细胞表面上发现的抑制性受体。与抑制性KIR受体相似，在其胞质结构域中具有ITIM。如本文中用到的，“NKG2A”是指NKG2A基因或编码的蛋白的任何变异体、衍生物或同工型。还包括在内的是与野生型(全长NKG2A)共有一种或多种生物学性质或功能的任何核酸或蛋白质序列，并且具有至少70%、80%、90%,95%,96%,97%,98%,99%或更高的核苷酸或氨基酸一致性。NKG2A在本文通篇中也被称为“NKG2A受体”。NKG2C (0MIM 602891，将其全部内容通过引用结合在此)和NKG2E (0MM 602892，将其全部内容通过引用结合在此)是转录物的NKG2群的另外的两个成员(Gilenke，etal. (1998) Immunogenetics 48:163-173)。NKG2C 和 NKG2E 是在 NK 细胞表面上发现的活化受体。如本文中用到的，“NKG2C”和“NKG2E ”分别是指NKG2C或NKG2E基因或编码的蛋白的任何变异体、衍生物或同工型。还包括的是与野生型(全长NKG2C或NKG2E)共有一种或多种生物性质或功能的任何核酸或蛋白质序列，并且与披露的基因或编码的蛋白质具有至少70 %、80 %、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或更高的核苷酸或氨基酸一致性。CD94(0MM 602894，将其全部内容通过引用结合在此)。CD94是一种优先在NK细胞上表达的抗原(Chang et al. (1995)Europ. J. Immun. 25 :2433-2437)。CD94 在 NK 细胞系中被表达为0. 8、I. 8和3. 5kb的3个主要转录物和5. 5kb的一个次要转录物，并对具有147个氨基酸胞外结构域和C-型凝集素的多个基序特征的一种蛋白质进行编码。CD94的氨 基酸序列与那些NKG2家族成员NKG2A、NKG2C、NKG2D和NKG2E具有27% 32%的一致性。由于实际缺乏胞质结构域，所以CD94要求与其他受体联合，与NKG2A、NKG2C和NKG2E形成二硫键合的杂二聚体(Lazetic et al. (1996) J. Immun. 157 :4741-4745)。如本文中所所使用，“CD94”是指CD94基因或编码的蛋白的任何变异体、衍生物或同工型。还包括在内的是与野生型(全长CD94)共有一种或多种生物性质或功能的任何核酸或蛋白质序列，并且具有至少70 %、80 %、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或更高的核苷酸或氨基酸一致性。HLA-E(0MIM 143010，将其全部内容通过引用结合在此)是一个非典型MHC分子，其被表达在细胞表面上并且通过结合由其他的MHC I类分子的信号序列衍生的肽进行调控。HLA-E结合自然杀伤(NK)细胞和一些T细胞，特异性地与⑶94/NKG2A、⑶94/NKG2B和⑶94/NKG2C结合，并且不与抑制性KIR受体结合(参见，例如，OMM 604936，将其全部内容通过引用结合在此)(参见，例如，Braud et al. (1998)Nature 391 :795_799，将其全部内容通过引用结合在此)。HLA-E的表面表达足以保护靶细胞不受CD94/NKG2A+NK细胞克隆体的溶解。如本文所所使用，“HLA-E”是指HLA-E基因或编码的蛋白的任何变异体、衍生物或同工型。还包括的是与野生型(全长HLA-E)共有一种或多种生物学性质或功能的任何核酸或蛋白质序列，并且具有至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的核苷酸或氨基酸一致性。Qalb是小鼠细胞表面抗原，其是NKG2A的生理学配体。如本文所使用的，“Qalb”是指Qalb基因或编码的蛋白的任何变异体、衍生物或同工型。还包括在内的是与野生型(全长Qalb)共有一种或多种生物学性质或功能的任何核酸或蛋白质序列，并且具有至少70%、80%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或更高的核苷酸或氨基酸一致性。“自身免疫性”障碍包括源于对辨别自身与非自身或其他细胞的能力的破坏而导致的其中免疫系统发动针对自身细胞或组织的任何障碍、症状或疾病。自身免疫性障碍的实例包括桥本氏甲状腺炎(Hashimoto ' s thyroiditis)、恶性贫血、阿狄森氏病(Addison; s disease)、I型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、皮肌炎、干燥综合症、红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、赖特氏综合症、格雷夫氏病、多发性肌炎、格林巴利综合症、韦格纳肉芽肿、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、颞动脉炎、白塞氏病、变应性肉芽肿性血管炎(Churg-Strauss syndrome)、高安氏动脉炎和其他障碍。“炎性障碍”包括以不需要的免疫反应为特征的任何障碍。自身免疫和炎性障碍可涉及免疫系统的任何部分，并且可以在体内靶向任何细胞或组织型。关于NKG2A活性的术语“抑制”、“减少”、“阻断”、“下行调节”和“减量调节”是指可以减慢、减少、逆转或以任何方式负面性地影响细胞(优选NK细胞)上的NKG2A受体的刺激或表达的任何过程、方法或化合物。这些术语可以指这样的化合物，它们通过配体抑制对NKG2A的刺激、它们在缺少配体的情况下拮抗性地发挥作用以降低该受体的活性、它们降低受体的表达水平、它们阻断NKG2A触发的信号转导或基因表达、或者它们阻断任何由NKG2A活化导致的该细胞的其他活性。在一个优选的具体实施方式
中，该抑制性化合物或方法阻止受体通过一个配体例如HLA-E的结合。NKG2A受体分子的数量或任何在此描述的活性可以通过任何标准途径(例如在本申请其他地方披露的)进行检测。如本文所使用的，术语“抗体”是指多克隆抗体和单克隆抗体。取决于重链中恒定结构域的类型，抗体被分为五大类之一 IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。它们的一些进一步被分为亚类或同种型，如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4等等。一个示例性免疫球蛋白(抗体)结构单 位包括一个四聚体。每一个四聚体是由两个相同的多肽链对组成，每一对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的N-端定义为约100 110或更多个氨基酸的一个可变区，其主要负责抗原识别。术语“可变轻链(\)”和“可变重链(Vh) ”分别是指这些轻链和重链。对应于不同种类免疫球蛋白的这些重链恒定结构域被分别称为“ a ”、“ 6 ”、“ e ”、“ y ”和“ ii ”。不同种类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构象是熟知的。本发明中优选使用的抗体种类为IgG和/或IgM，其中尤其优选为IgG，因为它们是生理状况下最普通的抗体并且因为它们最容易在实验室条件下制备。优选地，本发明的抗体是单克隆抗体。尤其优选是人源化的、嵌合的、人类或其他适合人类的抗体。术语“抗体”也包括任何本文描述的抗体的片段或衍生物，除非在本发明披露内容的上下文中这样的包括变得重复多余(例如，特定参照“一种抗体或其片段”)。在一个优选的具体实施方式
中，该抗体是非-耗尽性抗体，意思是指它们与NK细胞结合并且抑制NKG2A刺激(该刺激导致在它们细胞表面上带有HLA-E或Qalb的细胞溶解)，但不导致杀死NKG2A表达细胞。非-耗尽性抗体或抗体片段是那些不被Fe受体识别或仅仅被很弱地识别的抗体或抗体片段，如IgG4抗体、缺乏Fe部分的抗体片段、或其Fe尾部被修饰以减少或消除由Fe受体结合的任何其他抗体(参见，例如W003101485，将其全部内容通过引用结合在此)。在另一优选的具体实施方式
中，抗体或抗体片段与Fe受体结合。这样的抗体和片段引起NKG2A分子的交联，导致抑制NK细胞活性，并且在一些情况下，导致NK细胞死亡。术语“特异性结合”是指当利用重组形式的蛋白、其中的表位、或在分离的NK或其他细胞表面上存在的天然蛋白进行评价时，抗体(优选在竞争性结合试验中)可以结合至结合伴侣例如NKG2A。竞争性结合试验和其他用于确定特异性结合的方法在下文中进一步描述并且在本领域是熟知的。“人类适合的”抗体是指任何可以安全地用于人类例如用于本文描述的治疗方法的抗体、衍生的抗体或抗体片段。人类适合的抗体包括所有形式的人源化、嵌合或完全的人类抗体，或其中抗体的至少一部分衍生自人类或其他方式修饰的任何抗体，以避免在使用天然非人类抗体时通常会引起的免疫反应。为了本发明的目的，一个“人源化”抗体是指一种抗体，其中一个或多个人类免疫球蛋白的恒定和可变框架结构区与动物免疫球蛋白的结合区(如CDR)融合。设计这样的人源化抗体以保持非人类抗体(结合区域由其衍生而来)的结合特异性，而避免对非人类抗体的免疫反应。一个“嵌合抗体”是一种抗体分子，其中(a)恒定区或其一个部分被改变、取代或交换以使抗原结合点(可变区)被连接至不同或改变种类的恒定区、效应器功能和/或物种，或一种赋予嵌合抗体新特性的完全不同的分子例如酶、毒素、激素、生长因子、药剂等等；或(b)可变区或其一个部分被具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、取代或交换。—个“人类”抗体是从转基因小鼠或其他动物(其被“基因工程化”以在抗原激发响应中产生特异性人类抗体。(参见，例如，Green et al. (1994)Nature Genet 7:13; Lonberg et al. (1994) Nature368 :856 ；Taylor et al. (1994) Int Immun 6 :579,将其全部内容通过引用结合在此)。一个完全的人类抗体也可以通过遗传或染色体转染的方法和噬菌体显示技术(这些都是本领域已知的)加以构建(参见，例如，McCafferty et al. (1990)Nature 348:552-553)。人类抗体也可以通过体外活化的B细胞产生(参见，例如，美国专利第5，567，610号和5，229，275号，将其全部内容通过引用结合在此)。在本发明的背景中，“活性”或“活化”的NK细胞是指生物学活性NK细胞，更具体地，是具有溶解靶细胞能力的NK细胞。例如，“活性”NK细胞是能够杀伤表达NK活化受体-配体但不能表达“自身"MHC/HLA抗原的细胞(KIR不相容细胞)。这样的细胞在本文中也被称为“NK细胞敏感的祀细胞”。适用于重导向杀伤实验(redirected killing assay)的这样的靶细胞的实例是P815和K562细胞。然而，多个细胞种类的任何一种均可使用并且在本领域是熟知的(参见，例如，Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186 :1129-1136 ;Vitale et al. (1998) J. Exp. Med. 187 :2065-2072 ；Pessino et al. (1998) J. Exp. Med. 188 953-960 ；Neri et al. (2001)Clin. Diag. Lab. Immun. 8 :1131-1135)。“活性，，或“活化，，的细胞也可以通过与NK活性相关领域已知的任何其他性质或活性来进行鉴定，如在游离胞内钙水平下细胞因子(例如IFN-Y和TNF-a)生产的提高。为了本发明的目的，活化的NK细胞理想地是指这样的NK细胞，其中NKG2A受体没有被刺激，并且其中一个NCR (优选NKp30)被刺激，从而导致产生针对成熟树突细胞的细胞毒性。如在本文中使用的术语“NKG2A刺激”是指当NKG2A结合其天然配体(例如，HLA-E或Qalb)或其一个功能性片段时在一个带有NKG2A的细胞(例如，NK细胞)中发生的过程。因为NKG2A是一个抑制性受体，所以这样的结合可以导致NK细胞活性的抑制。因此，“NKG2A刺激的抑制”是指这样的过程，通过其NKG2A与其天然配体或其功能性片段的结合在结合发生处被减少或抑制，但不引起NK细胞活性的抑制。因此，如在本文提及针对NKG2A的抗体中所使用的术语“活化抗体”是用来指这样的一个抗体，其通过结合到NK细胞上的NKG2A而阻止NKG2A与其靶细胞上天然的配体(例如，HLA-E或Qalb)结合，或阻止通常通过HLA-E阳性靶介导的NKG2A依赖的信号转导，由此逆转由NKG2A与配体结合引起的通过NK细胞对靶细胞的溶解的抑制。因此，一个活化抗体引起对NKG2A刺激的抑制。
如本文对于针对NKG2A的抗体所使用的术语“抑制性抗体”是用来指这样的一个抗体，其通过结合到NK细胞上的NKG2A而引起NK细胞对在其他情况下应当被溶解的细胞进行溶解的能力的抑制。本发明的抑制性抗体通常在NK细胞内引起NKG2A分子的交联，这导致NK细胞的抑制和有时导致死亡。应该注意，本发明的针对NKG2A的抑制性抗体可以阻止NKG2A与其天然配体或其活性片段的结合，但不会导致带有该天然配体的细胞溶解，因为NK细胞溶解细胞的能力已经被该抗体抑制。术语“分离出的” “纯化的”或“生物纯的”是指大致或基本上没有以其天然状态发现的通常伴随的成分的物质。纯度和同质性通常是用分析化学技术如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱来确定。在一种制备物中以主要物种存在的一种蛋白质是基本上被纯化的。如本文中使用的术语“生物样品”包括但不限于生物液体(例如血清、淋巴、血液)、细胞样品或组织样品(例如骨髓)。在本文中可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指氨基酸残基的聚合物。 这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物以及非天然存在的氨基酸聚合物。当参照例如细胞或核酸、蛋白质或载体时使用的术语“重组”是指该细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白或天然核酸或蛋白变异而被修饰，或该细胞来源于被如此修饰的一个细胞。因此，例如，重组细胞表达在该细胞的天然(非重组)形式中没有的基因，或表达其他方面异常表达、低表达或完全不表达的天然基因。当参照一个特定的单克隆抗体(例如Z199或Z270)时，术语“竞争”是指在利用重组NKG2A分子或表面表达的NKG2A分子的一个结合试验中，被检测的抗体或其片段减少该参照单克隆抗体(例如Z199或Z270)与NKG2A的结合(与包含该参照单克隆抗体和NKG2A但缺乏该试验抗体的一个对照相比较)。例如，在一个结合试验中，如果一个抗体减少Z270与人类NKG2A分子的结合，则该抗体与Z270 “竞争”结合到人类NKG2A上。如本文中所使用的术语“完全竞争”是指该试验抗体大致或基本上结合到与参照单克隆抗体相同的表位上。如本文中所使用的“有效量”是指任何要达到或促进一个所期望结果的必要或充分的量。在一些情形下，一个有效量是一个治疗有效量。一个治疗有效量是在受治疗者体内用于促进或达到一个所期望的生物学反应必要或充分的任何量。对于任何特定应用的有效量可根据以下因素变化被治疗的疾病或症状、所给予的特定药剂、受治者的大小、或疾病或症状的严重性。本领域的普通技术人员可以凭经验判断一个特定药剂的有效量而无需进行过度试验。术语非人灵长类动物包括属于灵长目的任何哺乳动物，其包括猿，新世界猴，旧世界猴，原猴，婆罗洲猩猩Oorneo orangutan),苏门达腊猩猩(Sumatran orangutan),大猩猩(western lowland gorilla),倭黑猩猩(bonobo),黑猩猩(chimpanzee),白脸黑猩猩(chimpanzee),褐狐猴(brown lemur),白须柽柳猴(white-lipped tamarin),红腹柽柳猴(red-bellied tamarin),巴拉圭滅(Paraguayan titi),松鼠猴(squirrel monkey),黑掌蜘蛛猴(black-handed spider monkey),绒毛猴(woolly monkey),红面猴(stumptaiImacaque)，食蟹称猴(crab-eating macaque),日本称猴(japanese macaque),称猴(rhesusmonkey)，豚尾猴(pigtailed macaque)，黑冠称猴(Celebes ape)，赤猴(patas monkey)，狒狒，狨，卷尾猴，短尾猴，吼猴，蜘蛛猴，西非大狒狒，长尾猴，赤猴，疣猴，长臂猿，狐猴，指猴，蜂猴，婴猴，和跗猴。在一个优选的具体实施方式
中，本发明中利用的非人灵长类动物不是猿猴，例如，是除了黑猩猩、大猩猩、猩猩或长臂猿的非人灵长类动物。为了本发明的目的，用非人灵长类动物实施的试验包括体内试验(其中将抗体给予该灵长类动物)、体外试验(其中例如将取自灵长类动物的细胞用抗体处理并且返回到该灵长类动物)以及涉及取自灵长类动物的细胞、蛋白质或组织的体外试验。如果说诸如非人灵长类动物的一个哺乳动物“耐受” 一个抗-NKG2A抗体的给药方案，则意味着该给药在动物中不是致命的并且没有严重的副作用，尽管副作用依然可能存在，但只要它们不严重，并且通常它们被通过给药提供的治疗益处所超过。获得与NKG2A特异性结合的化合物本发明涉及与在免疫细胞上，优选在NK细胞上的NKG2A结合的活化和抑制性抗 体，以及它们的鉴定、生产、评价和应用。鉴定这样的抗体的一种方法是找出能够与NKG2A结合的那些抗体。一旦鉴定了特异性结合的抗体，就可以检测它们抑制或活化例如在NK细胞上的NKG2A的能力。然而，应当理解，进行这样的结合试验对于本发明的实践来说不是必需的。多种试验中的任何一种均可以用于评价抗体与NKG2A的结合。除其他之外，基于ELISA、放射免疫试验、蛋白质印迹、BIAC0RE和其他竞争试验等的方案都适合利用并且是本领域熟知的。例如，可以使用简单的结合试验，其中在靶蛋白或表位(例如，NKG2A或其部分)存在的情况下孵育试验抗体，未结合的抗体被洗掉，存在的结合抗体用以下方法评价，例如，放射性标记、物理方法如质谱、或者利用例如细胞荧光测定法分析(例如FACScan)检测的直接或间接荧光标记检测。这样的方法对本领域的技术人员是熟知的。高于用一个对照的非特异性抗体所观察的量的任何结合的量即表明该抗体特异性地结合到该靶标上。在这样的试验中，试验抗体结合靶细胞或人类NKG2A的能力可以与(阴性)对照蛋白例如针对结构不相关的抗原或非-Ig肽或蛋白产生的抗体结合相同靶标的能力进行比较。相对于对照蛋白，使用任何合适的试验，以25 %、50 %、100 %、200 %、1000 %或更高增加的亲和力结合靶蛋白或NKG2A的抗体或片段被称为与靶标“特异性结合”或与靶标“特异地相互作用”，并且它们在下面描述的治疗方法中优选被使用。在一个具体实施方式
中，评价了一个试验抗体影响的一个(阳性)对照抗体(例如3S9，20d5，Z270或Z199，或它们的衍生物)针对NKG2A的结合能力。在另一个实施方式中，测试了一个试验抗体影响一个自然配位体对于NKG2A，例如HLA-E，的结合能力。美国专利公开20030095965种说明了 3S9，该公开通过引用结合在此。3S9与NKG2C和NKG2E以及 NKG2A 向结合。20d5 是一种可商购的抗体(BD Biosciences Pharmingen, CatalogNo. 550518，USA)。20d5与小鼠的NKG2A, NKG2E和NKG2C相结合。Z199是一种可商购的抗体(Beckman Coulter, Inc. ,Product No.頂2750,USA)。Z270 在此充分说明。Z270 特别与人类NKG2A结合，但不结合人类NKG2C或NKG2E。此外，可采用简单的竞争测试，其中一个对照抗体(例如3S9，Z270或Z199)与一个试验抗体被混合在一起(或预先吸附)并施用到一个含NKG2A的样品上。在某些实施方式中，可在施用到含NKG2A的样品上之前的一段时间将多种对照抗体与不同量的试验抗体预先混合(例如，I 10或I : 100)。在其他实施方式中，该对照与不同量的试验抗体在暴露于抗原/靶样品期间可以被简单地混合。只要可以区分结合抗体和游离抗体(例如，通过使用分离或洗涤技术来除去未结合的抗体)以及区分对照抗体和试验抗体(例如，通过使用物种-或同种型-特异性的二级抗体，通过用可检测标记特异性地标记对照抗体，或通过使用物理方法例如质谱来区分不同的化合物)，就能够确定试验抗体是否减少对照抗体与抗原的结合，表明试验抗体大致识别与对照相同的表位。在上面描述的竞争性试验中，在完全不相关抗体存在的情况下，(标记的)对照抗体的结合是对照高值。对照低值通过孵育标记的(阳性)对照抗体(例如3S9、Z270或Z199)和完全相同类型的未标记抗体(例如3S9、Z270或Z199)而得到，其中可以产生竞争并且减少标记抗体的结合。在试验分析中，在试验抗体存在的情况下，经标记的抗体反应性的显著降低表明 试验抗体识别相同的表位，也就是与经标记的对照抗体“交叉反应”的抗体。以对照试验抗体或化合物在约I : 10至约I : 100之间的比例，减少经标记的对照与抗原/靶标的结合的至少50%或更优选70%的任何试验抗体或化合物被认为是基本上结合与对照一样的表位或决定子的抗体或化合物。优选地，这样的试验抗体或化合物将减少对照与抗原/靶标的结合的至少90%。尽管如此，将一个对照抗体或化合物的结合减少到任何可以检测程度的任何化合物或抗体都可以用于本发明。与所讨论的单克隆抗体大致结合到相同的表位的一种或多种抗体的鉴定可以容易地通过利用免疫筛选试验的任何一种来确定，其中可以评估抗体竞争。这样的试验在本领域是常规性的(参见，例如，美国专利第5，660，827号，将其通过引用结合在此)。应当理解，为了鉴定一个抗体结合到与所讨论的单克隆抗体相同或基本上相同的表位上并不要求实际确定该抗体所结合的表位。在一个具体实施方式
中，可以通过流式细胞仪试验来评价竞争。例如，带有NKG2A/CD94受体的细胞先用已知与该受体特异性结合的对照抗体(例如，3S9、Z270或Z199)孵育，然后用已用例如荧光色素或生物素标记的试验抗体孵育。如果通过用饱和量的对照抗体预孵育所获得的结合是没有用对照预孵育的抗体所获得的结合(荧光均值)的80%、优选50^^40%或更少，则称试验抗体与该对照竞争。可替换地，如果通过利用在细胞上的标记对照(用荧光色素或生物素)与饱和量的试验抗体预孵育获得的结合是没有与该抗体预孵育获得的结合的80%、优选50%、40%或更少，则称该试验抗体与对照竞争。在一个优选实施例中，可以采用简单的竞争试验，其中试验抗体被预吸附并以饱和浓度施加到一个表面上，其上固定有用于抗体结合的底物，例如NKG2A/CD94受体或含其表位的部分，该部分已知与例如3S9结合。该表面优选是一个BIAC0RE芯片。然后，将对照抗体(例如3S9、Z270或Z199)在一个饱和底物浓度下与该表面进行接触并且测量对照抗体的底物表面结合。将对照抗体的这种结合与没有试验抗体的情况下对照抗体与包含底物的表面的结合相比较。在一个试验测定中，在一个试验抗体存在下该对照抗体与包含底物的表面的结合的显著减少表明试验抗体识别相同的表位，即是与该对照抗体“交叉反应”的抗体。任何将该对照抗体与包含抗原的底物的结合减少至少30%或更优选40%的试验抗体都被认为是与对照抗体基本上相同的表位或决定子相结合的抗体。优选地，这样的试验抗体将使该对照抗体与该底物的结合减少至少50%。可以理解，对照和试验抗体的顺序可以反转，也就是对照抗体首先结合到表面而试验抗体其后与该表面接触。优选地，对底物抗原具有更高亲和力的抗体首先与包含底物的表面结合，因为将会预期对于该第二抗体(假设这些抗体是交叉反应的)所看到的结合减少的幅度会更大。在Saunal et al. (1995)J. Immunol. Meth 183 :33-41中提供了此类试验的其他实例，将其全部内容通过引用结合在此。优选地，根据本发明的识别NKG2A的单克隆抗体与在具有自身免疫性或炎性障碍的患者体内的相当大百分比的NK细胞上存在的表位发生反应，但不会与其他细胞(即不表达NKG2A的免疫或非免疫细胞)发生显著反应。因此，一旦鉴定了特异性识别在细胞例如NK、优选人类NK细胞上的NKG2A的抗体，就可以检测其结合从具有自身免疫或炎性障碍的患者提取的NK细胞的能力。同样地，可以理解，本方法可以用多种抗体来实行，例如针对NKG2A的不同表位Gpitopes)或同工型，其方式被设计为最大程度地抑制NKG2A的刺激。在一个具体实施方式
中，在给予抗体或化合物之前，从患者提取NK细胞和树突细胞，并评 价试验抗体克服NKG2A介导的对树突细胞溶解的抑制的能力。在本发明的那些具体实施方式
中，当对其他抗原(例如，来源于其他物种的NKG2A、NKG2C、NKG2E、Fc受体)的特异性结合或缺乏特异性结合必须进行测量时，可以使用与上述那些相似的试验，替代用于NKG2A的合适抗原并使用对该抗原(正在对其进行结合测试)特异性的对照抗体。这样的抗原或对照抗体在本领域是熟知的并且许多可以商购。评价抗体抑制NKG2A刺激的能力能够抑制由HLA-E或Qalb对NKG2A/⑶94刺激的本发明的活化抗体的鉴定通常涉及基于细胞的试验，以此在试验抗体存在的情况下评估NKG2A的活性。在一些具体实施方式
中，如上描述的，候选抗体首先根据它们结合NKG2A的能力进行鉴定。在其他的具体实施方式
中，实施基于细胞的筛选以直接鉴定能够抑制NKG2A刺激的抗体，而不管它们的结合亲和力。在一个具体实施方式
中，利用在美国专利申请第20030171280号，Braud etal. (1998)Nature 391 :795-799 ；Lee et al. (1998)PNAS 95 :5199-5204 ；Vance etal. (2002)PNAS 99 :868-873 ；Brooks et al. (1999)J Immunol 162 :305-313 ；Miller etal. J Immunol(2003) 171:1369-75 ;Brooks et al. (1997) J Exp Med 185 :795-800 ;VanBeneden et al. (2001)4302-4311 ;美国专利申请第20030095965号中描述的方法或试验来鉴定NKG2A的调节子，将其全部内容并入本文作为参考。在一个具体实施方式
中，评估本发明的活化抗体抑制由配体对NKG2A受体的刺激的能力。可以使用大量试验中的任何一个，其为基于分子、细胞和基于动物的模型。在一些典型的具体实施方式
中，使用以细胞为基础的试验，其中将细胞例如表达NKG2A的NK细胞暴露于NKG2A配体(或表达该配体的细胞)，优选HLA-E，并且评估抗体破坏该受体的刺激的能力。可以利用大量以细胞为基础的试验中的任何一种来评估NKG2A活性，包括基于基因表达的活性、基于细胞毒性的试验和增生试验。在某些具体实施方式
中，体外试验使用从具有自身免疫性或炎性障碍的患者中取得的细胞，例如NK细胞，但通常可以使用任何表达NKG2A的细胞，包括NK细胞系如YTS或NK-92 (可由ATCC获得)。例如，细胞系可以用编码NKG2A的转基因进行转染并在本试验中使用，只要表达的受体的刺激以可检测到的方式(例如，激活信号转导途径、影响增殖、或改变细胞的细胞毒性)改变该细胞的活性或性质。可以理解，对于这样的试验，NKG2A、⑶94或HLA-E任何的同工型(参见，例如OMMrefs. 161555、602894和143010，将其全部披露的内容引入本文以供参考)可以在这样的试验(或任何其他的涉及本文中描述的NKG2A的试验或方法)中使用。在一个优选的具体实施方式
中，使用细胞测定，其中将表达NKG2A的细胞例如NK细胞与NKG2A配体如HLA-E或表达NKG2A配体的细胞优选树突细胞加以孵育，并且评估试验化合物阻断NK细胞的抑制的能力。在这样的试验中，可以测量树突细胞的溶解本身作为NK细胞活性的反映。在一个具体实施方式
中，可以使用取自具有自身免疫或炎性障碍的患者的NK细胞来构建细胞系。在大量的具体实施方式
中，使用的各个试验中利用了包含适当配体(例如，在小鼠的情况下，Qa-I)的非人类细胞或非人类NKG2A/⑶94，例如表达NKG2A/⑶94的非 人灵长类动物细胞，或表达小鼠或人类NKG2A/CD94的小鼠细胞。NKG2A与合适配体的结合引起带有NKG2A的细胞中的多种生理变化。这些包括在基因表达、细胞生长、细胞繁殖、pH、细胞内第二信使例如Ca2+、IP3、cGMP或cAMP，细胞因子生产、或诸如细胞毒活性的活性的变化。这样的变化在本文中被称为“NKG2A活性”。在NKG2A配体存在的情况下，这样的变化的任何反转可以用于评估试验抗体的效用。这样的反转在本文中被称为“NKG2A活性的抑制”。在一个具体实施方式
中，NKG2A活性是通过检测NKG2A-应答基因或蛋白，例如SHP-I或SHP-2或它们的靶的表达或活性来评估的(参见，例如，Le Drean et al. (1998)Eur J TmmunoI 28 :264-276, Augugliaro et al. (2003)Eur JImmunol 33 =1235-141 ;将其全部内容通过引用结合在此)。在任何本文描述的试验中，这些细胞中NKG2A活性以任何可检出的测定中的减少5%U0%,20%,优选 30%、40%、50%，最优选 60%、70%、80%、90%、95%或更大的减少表明该试验抗体是适合在本方法中使用的候选物。除了结合之外，可以评估抗体或化合物引起NK细胞以抑制带有NKG2A配体的靶细胞例如树突细胞、某些癌细胞或某些病毒感染的细胞的增生或活化，或优选杀伤这些革巴细胞的能力。在一个具体实施方式
中，表达NKG2A受体的人类NK细胞随着带有NKG2A配体的靶细胞被引入孔板中，例如96孔板，并暴露于各种量的试验抗体。通过加入一种活体染料(即被完整细胞摄取的染料)如 AlamarBlue (BioSource International, Camarillo CA),并洗涤以除去多余的染料，存活细胞的数目可以借助于光密度值进行测量(抗体杀死的细胞越多，光密度值越低)。(参见，例如，Connolly et al. (2001) J Pharm Exp Ther 298 25-33，将其全部内容通过弓I用结合在此)。最优选地，本发明的活化抗体不显示与Fe受体的实质性的特异结合。这样的抗体可以包括已知不与Fe受体结合的各种重链的恒定区。一个这样的实例是IgG4恒定区。可替换地，可以使用不包含恒定区的抗体片段，如Fab或F(ab’)2片段，以避免Fe受体结合。Fe受体结合可以根据本领域已知的方法进行评估，包括例如在BIAC0RE试验中检测抗体与Fe受体蛋白的结合。同样，可以使用任何其他的抗体种类，其中Fe部分被修饰以最小化或消除与Fe受体的结合(参见，例如，W003101485，将其全部内容通过引用结合在此)。用来评估Fe受体结合的试验，例如基于细胞的试验在本领域是熟知的，并被描述在例如W003101485中。优选地，本发明活化单克隆抗体包括一个Fe区域，优选为IgG4或IgG2亚型的Fe区域，或IgGl或IgG3亚型的Fe区域，其已被修饰以减少与Fe受体的结合。最优选地，该IgG4或IgG2的Fe区域被修饰以进一步最小化或完全消除与Fe受体的结合(参见，例如Molecular Immunology 30 :105-108,将其全部内容通过引用结合在此)。IgG4同种型不是完全没有Fe结合活性，表现出与Fe y (“Fcg”)受体的一些结合(Newman et al. (2001) Clin. Immunol. (98(2) :164-174)。一种未修饰的 IgG4 单克隆抗体可以引起体内细胞的耗尽(Isaacs et al, (1996)Clin. Exp. Immunol. 106,427) 所报道的主要负责与Fcg受体结合的序列被定义为LLGGPS(Burton et al, (1992)Adv. Immunol. 51 I)。这个序列(位于重链CH2区域的N末端(EU编号234-239))被保留在人类IgGl、IgG3和鼠IgG2a同种型中，它们全部与Fcg受体强烈结合。用于IgG4同种型的野生型序列包 含在位置234处的苯丙氨酸，形成基序FLGGPS。鼠IgG2b同种型(也是Fcg受体的较差结合物)包含该序列LEGGPS。Newman等(2001)将与鼠IgG2b相关的谷氨酸残基合并入人类野生型IgG4CH2结构域，以产生序列FEGGPS，这甚至进一步减少了⑶C和ADCC活性，并且事实上消除了在体外与FcgRI和FcgRII的结合。除了引入谷氨酸之外，由脯氨酸取代丝氨酸228导致产生一个比野生型IgG4更稳定的分子。IgG4分子趋向于在铰链区显示低效的链间二硫键的形成。引入一个脯氨酸被称为给铰接提供了刚性并且促进了更有效的链间成键，并且在228位存在的丝氨酸可能通过邻接半胱氨酸分子而优先促进链内键接而不是链间的二硫键。对本发明的抗体可以容易地进行任何这样的修饰和其他修饰。在许多情况下，本发明的抑制性抗体可以转变为本发明的活化抗体，这是通过消除前者与Fe受体结合的大部分或全部能力。价针对NKG2A的抗体抑制NK细胞活件的能力能够结合NKG2A并抑制NK细胞活性(尤其是细胞的NK细胞溶解)的本发明的抑制性抗体的鉴定是利用基于细胞的试验进行分析的。通常，在不同量的试验抗体存在的情况下，将带有NKG2A的细胞如NK细胞与NK敏感的细胞如RMA、RMA的TAP-2衍生物、P815和K562进行接触。将在试验抗体存在的情况下杀死的NK敏感细胞的百分比与抗体不存在情况下的杀伤进行比较。在用于本发明的抑制性抗体的另一个试验中，将NK细胞在不同量的试验抗体存在下进行孵育，与抗体不存在时的NK细胞死亡相比较，从而确定该抗体对NK细胞的直接杀伤影响。NK细胞杀伤也可以在包含存在NK敏感细胞的试验中加以确定。在任何本文描述的试验中，NK敏感细胞杀伤减少5%、10%、20%，优选30%、40%、50%，最优选60%、70%、80%、90%、95%和/或爾细胞死亡增加5%、10%、20%，优选30%、40%、50%，最优选60%、70%、80%、90%、95%表明该试验抗体是本发明的一种抑制性抗体。灵长类动物物种间NKG2A的交叉反应性已经发现，在人类和非人灵长类动物的NKG2A之间存在交叉反应性。因此，可以利用来源于任何灵长类动物的NKG2A多肽来实施用于评价抗-NKG2A抗体对受体活性的影响的试验。例如，可以在体外使用非人灵长类动物NK细胞来实施这样的试验，或可以将抗体给予非人灵长类动物并且检测它们调节NKG2A活性(例如，如在NK细胞活性的变化中反映)的能力。牛产杭体本发明的抗体可以通过本领域已知的多种技术中的任何一种来生产。通常，利用在细胞如T细胞或NK细胞或树突细胞表面上包括NKG2A(或者，对于本文中描述的所有具体实施方式
，对于CD94或HLA-E)受体的一个免疫原将非人类动物优选小鼠免疫化而生产。该受体可以包含完整细胞或细胞膜，NKG2A (或CD94、等)的全长序列或任何NKG2A的片段或衍生物(通常为免疫原片段)，即，包含暴露在表达该受体的细胞表面上的表位的多肽的一部分。可以使用NKG2A的任何同工型或剪接片段(参见，例如OMM 161555 ;将其全部内容通过引用结合在此)。这样的片段通常包含成熟多肽序列的至少7个连续氨基酸，甚至更优选其至少10个连续氨基酸。它们基本上来源于该受体的胞外结构域。在优选的具体实施方式
中，用于产生抗体的NKG2A受体是一种人类受体。在某些具体实施方式
中，以异质二聚体形式例如与CD94联合存在的NKG2A可以用于产生抗体。
在一个最优选的具体实施方式
中，该免疫原包括在类脂膜中(通常在细胞的表面上)的一个野生型人类NKG2A受体多肽。在特定的具体实施方式
中，该免疫原包括完整NK细胞，尤其是完整人类NK细胞，可选被处理或被溶解。在一个优选的具体实施方式
中，该免疫原是取自具有自身免疫障碍或炎性障碍的患者的一个NK细胞。在一个具体实施方式
中，这些抗体来源于一个或多个已经存在的识别NKG2A的单克隆抗体，例如 Z199(Della Chiesa et al, (2003)Eur. J. Immunol. 33 :1657-1666)、Z270、3S9(参见，例如，美国专利申请第 0030095965 号)或 20D5 (Vance et al, (1990) J. Exp.Med. 190(12) :1801-1812),将其全部内容通过引用结合在此)。对于某些应用，这样的抗体可以直接或间接地加以标记(即使用一种标记的第二抗体)，以用作诊断抗体来确定在现有细胞，优选来自具有自身免疫或炎性障碍的患者的NK细胞上存在的NKG2A。另外，可以将这些抗体制成适于如本文描述的人类给药，以用于本发明治疗方法中。本发明的抗体可以是全长抗体或抗体片段或衍生物。抗体片段实例包括Fab、Fab丨、Fab丨_SH、F (ab丨)2和Fv片段；双抗体；单链Fv (scFv)分子；在没有相关的重链部分的情况下，只包含一个轻链可变结构域的单链多肽，或其包含轻链可变结构域的三个CDR的片段；在没有相关的轻链部分的情况下，只包含一个重链可变区的单链多肽，或其包含重链可变结构域的三个CDR的片段；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。这样的片段和衍生物以及制备它们的方法在本领域是熟知的。例如，胃蛋白酶可用于在铰链区的二硫键之下消化抗体，以产生F (ab)' 2 (其是本身通过二硫键结合到Vh-ChJ^ Fab的二聚物)。在温和的条件下断裂铰链区中的二硫键可以减少F (ab)' 2，从而将F(ab)' 2 二聚物转变为Fab'单体。Fab'单体实质上是带有部分绞链区的Fab (见Fundamental Immunology (Pauled.，3ded. 1993))。尽管各种抗体片段都是根据完整抗体的消化定义的，但是技术人员可以理解，这样的片段可以化学地或通过使用重组DNA方法从头合成。在一个优选的具体实施方式
中，该活化抗体是非-耗尽性抗体，意思是指它们与NK细胞结合并且抑制NKG2A的刺激，但不导致杀伤表达NKG2A的细胞。杀伤表达NKG2A细胞的能力可以使用标准方法进行评估，包括体外试验以确保抗体不是细胞毒性的、直接杀伤结合的细胞、以及体内试验(其中给予抗体并评估表达NKG2A细胞的水平和活性。在一个特别优选的具体实施方式
中，如上所述的，使用不被Fe受体识别(或仅很弱识别)的抗体。因此，优选的抗体包括IgG4、诸如Fab或F(ab’ )2的片段、或其Fe部分被修饰以减少或消除与Fe受体的结合的任何其他的IgG、IgE、IgM等等(参见，例如W003101485，将其全部内容通过引用结合在此)。单克隆或多克隆抗体的制备在本领域是熟知的，并且大量可利用的技术的任何一种都可以使用(参见，例如 Kohler & Milstein, Nature 256:495-497(1975) ；Kozbor etal. , Immunology Today 4:72(1983) ；Cole et al., pp. 77_96in Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy (1985))。用于生产单链抗体的技术(美国专利第4，946，778号)可以适合于生产针对期望的多肽(例如，NKG2A)的抗体。而且，转基因小鼠或其他有机体如其他的哺乳动物，可以用于表达人源化、嵌合或类似修饰的抗体。可替换地，噬菌体显示技术可以用于鉴定与所选抗原特异型结合的抗体和异源Fab片段(参见,例如，McCaffertyet al. ,Nature 348:552-554(1990) ；Marks et al. ,Biotechnology 10:779-783(1992))。在一个具体实施方式
中，该方法包括从文库或表达谱(repertoire)中选择与NKG2A受体多肽交叉反应的单克隆抗体或其片段或衍生物。例如，该表达谱可以是抗体或其片段的任 何(重组)表达谱，可选地通过任何合适的结构(例如，噬菌体、细菌、合成复合体)加以显
/Jn o用一种抗原来免疫非人类哺乳动物的步骤可以以本领域熟知的方式进行(参见，例如，E. Harlow and D. Lane, Antibodies A Laboratory Manual. , Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor,NY(1988))。通常,将免疫原悬浮或溶解在缓冲液中，可选地利用佐剂如完全Freund’ s佐剂。用于确定免疫原的量、缓冲液的类型和佐剂的量的方法对本领域的技术人员是熟知的并且不以任何方式限制本发明。类似地，足以刺激抗体产生的免疫化的部位和频率在本领域也是熟知的。在一个典型的免疫化方案中，在第I天和约I周后再次给非人类动物腹膜内注射抗原。然后大约在第20天时,跟随抗原的回忆(recall)注射,可选地利用佐剂如不完全的Freund’s佐剂。回忆注射是在静脉内实施的并且可连续多天重复进行。随后在第40天跟随一次静脉内或腹膜内强化(booster)注射，通常没有佐剂。这个方案导致在大约40天后产生抗原特异性抗体的B细胞的形成。其他方案也可以使用，只要它们导致产生表达针对免疫化中使用的抗原的抗体的B细胞产生。在另一个具体实施方式
中，分离出来自未免疫的非-人类哺乳动物的淋巴细胞，在体外生长，然后在细胞培养中暴露于免疫原。然后收获淋巴细胞并且实施下面描述的融合步骤。对于优选用于本发明目的的单克隆抗体，接下来的步骤是从免疫的非人类哺乳动物分离细胞，例如，淋巴细胞、脾细胞或B细胞，并且接下来将这些脾细胞、或B细胞、或淋巴细胞与永生化细胞融合以形成产生抗体的杂交瘤细胞。因此，如本文中所使用的，术语“从免疫动物制备抗体”包括从免疫动物获得B细胞/脾细胞/淋巴细胞，并利用这些细胞来产生表达抗体的杂交瘤细胞，以及直接从免疫化动物血清中得到抗体。例如从非-人类哺乳动物中分离脾细胞在本领域是熟知的，并且例如包括从麻醉的非人类哺乳动物提取脾，将其切成小块并且将来自脾被膜中的脾细胞通过细胞尼龙滤网压入合适的缓冲液，以便产生单细胞悬液。将这些细胞洗涤，离心并重悬在溶解任何血红细胞的缓冲液中。将该溶液再一次离心并且最后将小球中余下的淋巴细胞重悬在新鲜的缓冲液中。一旦被分离出并存在于单细胞悬液中，将这些产生抗体的细胞与一个永生细胞系融合。这通常是一个小鼠骨髓瘤细胞系，尽管许多其他对于形成杂交瘤细胞的永生细胞系在本领域是已知的。优选的鼠骨髓瘤细胞系包括，但不限于，那些来源于M0PC-21和MPC-11小鼠肿瘤(可从 the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif.U.S.A.获得)、X63 Ag8653 和 SP-2 细胞(可从 the American Type Culture Collection,Rockville, Maryland U.S.A.获得)。利用聚乙二醇等来实现融合。然后将得到的杂交瘤细胞在包含一种或多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞的生长或存活的底物的选择性培养基中生长。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于该杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT-缺陷型细胞的生长。杂交瘤细胞可以在一个巨噬细胞的滋养层上生长。这些巨噬细胞优选来自用于分离脾细胞的非人类哺乳动物的同胞仔，并且通常在培养杂交瘤细胞之前，用不完全Freund’s佐剂等刺激多天。融合的方法描述在,例如(Goding, “Monoclonal Antibodies Principles and Practice, ”pp. 59-103 (Academic Press, 1986)),将其全部内容通过引用结合在此。让这些细胞在选择性培养基中生长足够的时间，以形成集落和产生抗体。这通常为7到14天。然后对杂交瘤集落产生特异性识别的期望底物例如NKG2A的抗体进行测定试验。尽管可以采用任何可以适合于杂交瘤细胞所生长的孔中的试验，该试验通常是比色ELISA型试验。其他的试验包括免疫沉淀和放射性免疫测定。对于期望抗体产生是阳性的孔进行考察，以确定是否存在一个或多个不同集落。如果存在多于一个的集落，则该细胞可以再次克隆和生长，以确保只有单个细胞形成产生所期望抗体的集落。具有显染是单个集落的阳性孔通常被再次克隆和再次测定，以确保被检测和生产的只有一个单克隆抗体。然后将确定为生产本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞在合适的培养基如DMEM或RPMI-1640中以更大量进行生长。可替换地，这些杂交瘤细胞可以在动物体内作为腹水瘤生长。在充分生长以产生想要的单克隆抗体后，将包含单克隆抗体的生长培养基(或腹水)与细胞分离并且纯化在其中存在的单克隆抗体。纯化通常是通过凝胶电泳、透析、利用蛋白A或蛋白G琼脂糖的色谱、或连接到固体载体如琼脂糖或琼脂糖珠的抗小鼠Ig(所有描述例如在 the Antibody Purification Handbook,Amersham Biosciences,publicationNo. 18-1037-46，Edition AC中，将其全部内容通过引用结合在此)来实现的。结合的抗体通常利用低PH缓冲液(pH 3.0或更低的甘氨酸或醋酸盐缓冲液)从蛋白A/蛋白G柱洗脱，并对包含抗体的片段立即中和。将这些片段根据需要集中、透析并浓缩。在优选的具体实施方式
中，对结合在NKG2A免疫原上存在的决定子(抗原决定基)的抗体进行编码的DNA被从杂交瘤细胞分离出来并且放入合适的表达载体中用于转染入合适的宿主中。然后将该宿主用于抗体、其变异体、其活性片段、或包含该抗体的抗原识别部分的人源化或嵌合抗体的生产。优选地，在这个实施方式中使用的DNA编码识别在NK细胞(例如，取自具有自身免疫或炎性疾病的患者的NK细胞)的NKG2A受体上存在的决定子的抗体。
对本发明的单克隆抗体进行编码的DNA可以使用传统过程(例如，通过使用能够特异结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)而容易地被分离和测序。一旦分离，则可将该DNA放入表达载体，然后其被转染入宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞(它们不另外产生免疫球蛋白)，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。在编码该抗体的DNA的细菌中的重组表达在本领域是熟知的(参见，例如 Skerra et al. (1993)Curr. Op. Immunol. 5 :256 ；and Pluckthun(1992) Immunol. Revs. 130 :151)。抗体也可以通过选择组合的免疫球蛋白文库而生产,例如在Ward et al. (1989)Nature 341 :544 中披露的。
在一个特定的具体实施方式
中，该抗体实质上结合到与单克隆抗体Z199或Z270 之一相同的表位或决定子。在一个优选的具体实施方式
中，该单克隆抗体包括Z270的Fab 或F(ab' )2部分。根据另一个优选的具体实施方式
，该单克隆抗体包括Z270的可变重链区的三个CDR(CDR1 = SEQ ID NO 2的氨基酸31至35 ;CDR2 = SEQ ID NO 2的氨基酸 50至66 ;CDR3 = SEQ ID NO 2的氨基酸99-108)。更优选的是包括Z270的可变重链区 (Z270VH ；SEQ ID NO 2)的单克隆抗体。更加优选的是包括Z270的可变重链区并且是由包括chZ270VH(SEQ ID NO :3)的核苷酸序列转录和翻译的单克隆抗体。根据另一个优选的具体实施方式
，单克隆抗体包括Z270的可变轻链区的三个CDR (⑶Rl = SEQ ID NO :6的氨基酸 24 至 34 ; CDR2 = SEQ ID NO 6 的氨基酸 50 至 56 ;CDR3 = SEQ ID NO 6 的氨基酸 89-95)。 更优选的是包括Z270的可变轻链区(SEQ ID NO 6)的单克隆抗体。甚至更优选的是包括 Z270可变轻链区并且是由包括chZ270VK(SEQ ID NO :7)的核苷酸序列转录和翻译的单克隆抗体。在另一优选的具体实施方式
中该抗体是Z270。Z270是于2005年12月22日在法国巴黎25，Rue du Docteur Roux，F-75725的巴士德研究院的国家微生物培养物保藏中心 (the Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institute Pasteur,25, Rue du Docteur Roux, F_75725Paris, France)保藏的，登记号为 1-3549。
将针对NKG2A的活化和抑制性单克隆抗体通常加以修饰，以使它们适用于人类治疗应用。例如，它们可以是人源化的、嵌合的或用本领域熟知的方法从人类抗体文库选取。 这样的适合人类的抗体可以直接应用于本发明治疗方法中，或可以进一步衍化为细胞毒性抗体(如后文描述的)以用于本发明方法中。
在一个优选的具体实施方式
中，产生本发明的抗体(例如，结合到与Z199或Z270 基本上相同的表位)的杂交瘤细胞的DNA可以在插入表达载体之前被修饰，例如，通过用人类重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源性非人类序列(例如，Morrison et al. (1984) PNAS 81 :6851)，或通过共价结合到免疫球蛋白编码序列、或非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列。以这种方式，所制备的“嵌合”或“杂合”的抗体具有原始抗体的结合特异性。通常，这样的非免疫球蛋白多肽用本发明抗体的恒定结构域取代。
在一个优选的具体实施方式
中，该抗体包括融合到人类重链恒定区的Z270的可变重链区(SEQ ID NO 2) 0在一个优选的具体实施方式
中，人类重链恒定区是IgG4 恒定区。在另一个优选的具体实施方式
中，人类重链恒定区是IgGl恒定区，优选人类 IgGlm(-1, -2，-3)恒定区。优选地，这样的包含一个人类重链恒定区的抗体是由包括 chZ270VH(SEQ ID NO 3)的核苷酸序列转录和翻译的。
在另一个优选的具体实施方式
中，该抗体包括融合到人类轻链恒定区的Z270的可变轻链区的(SEQ ID NO:并6)。更优选的是包括融合到人类K (k3)轻链恒定区的Z270 的可变轻链区的抗体。优选地，这样的包括人类轻链恒定区的抗体是由包括chZ270VK(SEQ ID N07)的核苷酸序列转录和翻译的。
更优选的是包括融合到人类轻链恒定区的270VK和融合到人类重链恒定区的 270VK的一种抗体。优选地，该轻链恒定区是K (k3)恒定区，并且该重链恒定区是选自 IgG4或IgGlm(-l，-2，-3)。并且，优选地，抗体的每一个重链和轻链分别是由包括包含 chZ270VH(SEQ ID NO 3)的核苷酸序列和包括包含chZ270VK (SEQ ID NO 7)的核苷酸的核苷酸序列转录的。
在一个特别优选的具体实施方式
中，本发明的抗体是人源化的。根据本发明的抗体的“人源化”形式是特异性嵌合的免疫球蛋白、其免疫球蛋白链或片段(例如Fv、Fab、 Fab'、F(ab' )2、或抗体的其他抗原结合序列)，其包括最小量的来源于鼠或其他非人类免疫球蛋白的序列。对于大多数部分，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者的互补决定区(CDR)的残基被来自原始抗体(供者抗体)的CDR的残基取代，同时保持原始抗体期望的特异性、亲和力和能力。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架结构残基可以被相应的非人类残基取代。此外，人源化抗体可以包括既没有在受者抗体也没有在引入的CDR或框架结构序列中发现的残基。形成这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。通常，人源化抗体可以包括大致至少一个，通常两个可变结构域中的全部，其中所有或基本上所有的CDR区域对应于原始抗体的那些区域，并且所有或基本上所有的FR区域是人免疫球蛋白共有序列的那些区域。对于进一步的详细情况，参见Jones et al. (1986) Nature321 :522 ;Reichmann et al. (1988)Nature 332 323 ；Verhoeyen et al. (1988) Science 239 :1534(1988) ；Presta(1992)Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593 ;将其每一个通过引用结合在此。
用于制备人源化抗体的人类可变结构域(轻链和重链)的选择对于减少免疫原性是非常重要的。根据所谓的“最佳拟合”方法，本发明抗体的可变结构域的序列是在整个已知的人类可变-结构域序列的文库中筛选的。然后，将最接近小鼠的人类序列接受为用于人源化抗体的人类框架结构(FR) (Sims et al. (1993) J. Tmmun. , 151 :2296 ；Chothia and Lesk(1987) J.Mol. Biol. 196 :901)。另一个方法使用来自轻链或重链特定亚群的所有人类抗体的共有序列的特定框架。相同的框架结构可以用于多种不同的人源化抗体(Carter et al. (1992)PNAS 89 :4285 ；Presta et al. (1993)J. Immunol. 51 :1993))。
更重要的是，抗体被人源化同时保持它们对NKG2A，优选人类和非人灵长类动物 NKG2A的高亲和力以及其他有利的生物学性质。为了达到这个目的，根据一个优选的方法， 通过使用亲本和人源化序列的三维模型来分析亲本序列和各种概念上的人源化产物的过程来制备人源化抗体。这些三维免疫球蛋白模型通常可利用并且对于本领域的技术人员是熟悉的。由计算机程序可供使用，其图解和展示被选择的候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构。对这些显示的检查允许对残基在候选免疫球蛋白序列功能化中的可能作用进行分析，即，分析残基影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力。以这种方式，FR残基可以从有共识的和引入序列中加以选取和组合以便获得期望的抗体特性如对于靶抗原增加的亲和力。总之，该DCR残基是直接和极其实质性地参与了影响抗原结合。
在优选的实施例中，本发明提供了具有至少5、6、8、9、10、15或20天的半衰期的人类或人源化活化抗-NKG2A抗体，其基本上不结合人类Fe YRIIIa(CD16)。更优选地，该活化抗-NKG2A抗体是人源化抗体并且对于结合人类NKG2A与Z199或Z270抗体完全竞争。为了用根据本文的方法适于使用的优选抗体进行说明的目的，可以使用Z199或Z270抗体来制备人源化抗体。根据本发明优选的人源化抗体包括人类框架结构、至少一个来源于非人类抗体的CDR，并且其中存在的任何恒定区基本上等同于人类免疫球蛋白恒定区，例如，至少约60-90%，优选至少95%等同。因此，人源化抗体的所有部分(除了可能的⑶R)都基本上等同于一个或多个天然人类抗体序列的相应部分。在一些情况下，除了来自于非人类抗体的CDR，人源化的抗体在人类框架结构区包括另外的非人类残基。
人源化抗体的设计可以如下进行。当氨基酸归入以下种类时，使用的人类抗体 (受者抗体)的框架结构氨基酸被来自提供CDR的非人类抗体(供者抗体)的框架氨基酸替代(a)在受体抗体的人类框架结构区中的氨基酸在那个位置对于人类抗体是不寻常的， 而在供者抗体中的相应氨基酸在那个位置对人类抗体是典型的；(b)该氨基酸的位置紧邻着一个CDR ;或(c)该氨基酸能够与在三维结构抗体模型中的CDR相互作用(参见，C. Queen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,10029 (1989), and Co et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,2869(1991)，将其全部内容通过引用结合在此)。
对于人源化抗体生产的进一步详细描述,参见Queen et al. , op. cit. and Co et al，op. cit.和美国专利第 5，585，089,5, 693，762,5, 693，761 和 5，530，101 号，将其全部内容通过引用结合在此。通常，人源化抗体的CDR区域大致相同，并且更通常地，与衍生其的小鼠抗体中相应的CDR区域相同。尽管不是通常期望的，但是有时有可能在没有显著影响所得到的人源化抗体的结合亲和力的情况下，形成CDR残基的一个或多个保守性氨基酸取代。偶尔地，CDR区域的的取代能够增强结合亲和力。除了上面讨论的特定氨基酸取代外，人源化抗体的框架结构区通常基本上一致，更常见地，与衍生其的人类抗体的框架结构区一致。当然，框架结构区的许多氨基酸对于抗体的特异性或亲和力具有很少的或没有直接贡献。因此，在没有显著改变所得到的人源化抗体特异性或亲和力的情况下，框架结构残基的许多个体保守取代可以被容忍。人源化抗体的抗原结合区域(非人类部分)可以来源于具有对NKG2A的特异性的非人类起源的抗体(称为供者抗体)。例如，合适的抗原结合区域可以来源于Z199或Z270单克隆抗体。其他来源包括从非人类来源如啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)、兔、猪、山羊或非人灵长类(例如，猴)或骆驼科动物(例如，骆驼或美洲驼)得到的NKG2A特异性(阻断)抗体。另外，可以形成其他的多克隆或单克隆抗体，如结合到与Z199或Z270抗体相同或相似的表位的抗体(参见，Kohler et al.，Nature, 256 495-497(1975) ；Harlow et al. ,1988, Antibodies ALaboratory Manual, (Cold Spring Harbor, N. Y.) ；and Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2 (Supplement 27, Summer ' 94), Ausubel et al. , Eds. (John Wiley & Sons New York, N. Y. ), Chapter 11(1991))。
在一个具体的实施方式中，具有对人类和非人灵长类动物NKG2A的结合特异性的人源化抗体包含至少一个非人类起源的⑶R。例如，具有对人类和非人灵长类动物NKG2A 的结合亲和力的人源化抗体包含一条重链和一条轻链。该轻链可以包括来源于非人类来源的抗体(结合NKG2A)的CDR和来源于人类起源的轻链的FR。例如，该轻链可以包括CDR1、 ⑶R2和/或⑶R3，其具有与Z199或Z270抗体的任何一个的各自⑶R相似或基本上相同的氨基酸序列，使得该抗体与人类和非人灵长类动物NKG2A特异性结合。该重链可以包括来源于非人类起源的抗体(结合NKG2A)的CDR和来源于人类起源的重链的FR。例如，该重链可以包括⑶R1、⑶R2和⑶R3，其具有下面提出的氨基酸序列或与Z199或Z270抗体各自的CDR相似或基本上相同的氨基酸，使得该抗体特异地结合到人类或非人灵长类动物的 NKG2A。
本发明的一个具体实施方式
是与人类和非人灵长类动物NKG2A特异性结合并且包括人源化轻链的人源化抗体，该人源化轻链包括来自Z199或Z270抗体的三个轻链CDR 和来自人类抗体轻链的轻链可变区框架结构序列。本发明进一步包括人源化重链，其包括来自Z199或Z270抗体的三个重链⑶R和来自人类抗体重链的重链可变区框架结构序列。
人类起源的人源化抗体或抗体链的部分(人类部分)可以来源于任何合适的人类抗体或抗体链。例如，人类恒定区或其部分(如果存在)可以来源于人类抗体(包括等位基因变异体)的K或λ轻链、和/或Y (例如，Y I、Y 2> Y 3> Y 4) > μ、α (例如， α I、α 2)、δ或ε重链。可以选择一个特定恒定区如IgG2b或IgG4、其变异体或部分，以修饰效应子功能。因此，尤其优选后者的恒定区或部分，因为它们基本上不结合 NK细胞上的Fe Y IIIa受体(⑶16)，并且因此基本上不诱导ADCC介导的本发明的抗-NKG2A抗体结合至其的NK效应子的溶解。例如，突变的恒定区(也被称为“变异体”)可以并入融合蛋白，以最小化与Fe受体的结合和/或固定补体的能力(参见,例如，Winter et al.,美国专利第 5，648，260 号；Morrison et al.，WO 89/07142 ；Morgan et al.，W094/29351)。另外，与天然的Fe区域相比，可以形成突变的IgG2Fc结构域以减少有丝分裂反应(参见，例如，Tso et al.，美国专利第5，834，597号，将其全部内容通过引用结合在此)。如果存在， 则人类FR优选来源于具有与抗原结合区域供体的相似或等同区域的序列相似性的人类抗体可变区域。用于人源化抗体的人类起源的部分的FR的其他来源包括人类可变共有序列 (参见，Kettleborough, C. A. et al. , Protein Engineering 4 :773-783(1991) ；Queen et al.，美国Pat. Nos :5,585, 089, 5，693，762 and 5，693，761，将其全部内容通过引用结合在此)。例如，用于获得非人类部分的抗体或可变区域的序列可以与人类序列(如在Kabat， E. A. , et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition,美国 Department of Health and Human Services,美国 Government Printing Office (1991) 中描述的)进行比较。在一个优选的具体实施方式
中，一个人源化抗体链的FR来源于与非人类供体(例如，Z199或Z270抗体)的可变区具有至少约60%总体序列一致性，优选至少约80%总体序列一致性的人类可变区。
在两个核酸或多肽(例如，编码人源化抗体或人源化抗体的氨基酸序列的DNA)的背景下，如利用以下序列比对方法和/或视觉检查，当对最大对应性进行比较和排齐时，术语“基本上相同”是指两个或多个具有至少约80%，最优选的90-95%或更高的核苷酸或氨基酸残基一致性的序列或顺序。这样的“基本上相同”的序列通常认为是同源的。优选地，“基本上相同”存在于一个序列的区域内，其长度为至少约50个残基，更优选是在至少约 100个残基的区域内，并且最优选是在至少约150个残基内、或在比较的两个序列的全长范围内基本上相同的序列。如下面描述的，任何两个抗体序列通过使用在Kabat中的编序方案只能以一种方式排齐。因此，对于抗体，一致性百分率具有唯一和明确定义的含义。
来自抗体的成熟重链和轻链的可变区的氨基酸分别被命名为Hx和Lx，其中X是根据 Kabat 的方案，(Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda,Md. , 1987and 1991))指定氛基酸位置的编号。Kabat 对每个亚群列出了用于抗体的许多氨基酸序列，并且列出了在该亚群中每个氨基酸位置最通常存在的氨基酸。Kabat使用了一种方法，其在列出的序列中将残基编号分配给每一个氨基酸，并且这种用于分配残基编号的方法在本领域已经成为标准。Kabat方案可以扩展到不包括在他的纲要中的其他抗体，其通过将讨论的抗体与Kabat中的共有序列之一进行排齐。 应用Kabat编号系统容易鉴定在不同抗体中的等价位置处的氨基酸。例如，在人类抗体的 L50位置处的氨基酸占据与小鼠抗体的L50位置处的氨基酸等价的位置。从N末端到C末端，轻链和重链可变区均包含交替的框架结构和(CDR) " FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和 FR4。每个区域氨基酸的分配是根据Kabat (1987)和(1991)的定义，supra and/or Chothia & Lesk，J.Mol· Biol. 196 :901-917(1987) ；Chothia et al. ,Nature 342:878-883(1989)。
也可以在用于鉴定和/或分离具有必需特异性的人源化抗体(例如，来自文库) 步骤是使用结合和/或粘附试验或其他合适的方法(例如竞争试验)。
用于本发明的非人类和人类起源的抗体部分包括轻链、重链以及轻链和重链的部分。这些抗体部分可以从抗体获得或衍生(例如，通过一部分的新合成)，或可制备和表达编码具有期望性质(例如，结合NKG2A，序列相似性，例如与Z199或Z270抗体的序列相似性)的抗体或其链的核酸。包含期望的人类和非人类起源的部分(例如，抗原结合区域、 CDR、FR、C区域)的人源化抗体可以利用合成和/或重组核酸(以制备编码期望的人源化链的基因(例如，cDNA))来生产。为了制备链的一部分，将一个或多个终止密码子在期望位置引入。例如，编码新设计的人源化可变区的核酸序列可以利用PCR突变方法以改变现有的 DNA 序列进行构建(参见例如，Kamman, M. , et al. , Nucl. Acids Res. 17 :5404 (1989))。编码新的CDR的PCR引物可以与前面的人源化可变区(其基于相同的，或非常相似的人类可变区)的 DNA 模板杂交(Sato, K. , et al. , Cancer Research53 :851-856 (1993))。如果不能得到相似DNA序列用作模板，包含编码可变区序列的序列的核酸可以由合成的寡核苷酸进行构建(参见，例如，Kolbinger,F. ,Protein Engineering 8 :971-980 (1993))。编码信号肽的一个序列也可以并入该核酸(例如，通过合成，通过插入载体)。如果不能得到天然信号肽序列，则可以使用来自另一个抗体的信号肽序列(参见，例如，Kettleborough, C. A., Protein Engineering 4 :773-783 (1991))。使用这些方法(本文中描述的方法或其他合适的方法)，可以容易地生产变异体。在一个具体的实施方式中，克隆的可变区可以被诱变， 并且可以选择(例如，从噬菌体文库；参见例如Krebber et al.，美国Pat. No. 5，514，548 ； Hoogengoom et al.，WO 93/06213, published Apr. 1,1993))编码具有期望特异性的变异体的序列。
本发明还涉及分离和/或重组(包括，例如，基本上纯的)的包含编码本发明的人源化抗体或人源化抗体的轻链和重链的序列的核酸。
人类抗体也可以根据各种其他技术进行生产，如为了免疫化通过使用已被改造为表达人类抗体表达谱的其他转基因动物。在这种技术中，人类重链和轻链基因座的成分利用内源性重链和轻链基因座的靶向破坏引入小鼠和其他动物(参见，例如，Jakobovitz et al. (1993)Nature 362 255 ；Green et al. (1994)Nature Genet. 7 13 ；Lonberg et al. (1994)Nature 368 856 ；Taylor et al. (1994) Int. Immun. 6 :579，将其全部内容通过引用结合在此)。可替换地，人类抗体可以通过基因或染色体转染的方法、或通过使用噬菌体显示方法来选择抗体所有组分进行构建。在该技术中，抗体可变结构域基因符合框架结构地被克隆入丝状噬菌体的大或小壳体蛋白基因，并且在噬菌体颗粒表面上显示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能性质的选择也导致选择编码显示那些性质的抗体的基因。以这种方式，噬菌体模拟B细胞的一些性质(参见，例如，Johnson et al. (1993)Curr Op Struct Biol 3:5564-571 ；McCafferty et al. (1990)Nature 348 :552_553，将其全部内容通过引用结合在此)。人类抗体也可以通过在体外活化的B细胞产生(参见，例如，美国专利第5，567，610和5，229，275号，将其全部内容通过引用结合在此)。
在一个具体实施方式
中，“人源化”单克隆抗体是使用动物如用于免疫化的 XenoMouse (Abgenix, Fremont, CA)制备的。一个 XenoMouse 是一个鼠类宿主，其免疫球蛋白基因已被功能性的人类免疫球蛋白基因取代。因此，由这种小鼠产生的抗体或在由这种小鼠的B细胞制成的杂交瘤细胞中产生的抗体已经是人源化的。该XenoMouse描述在美国专利第6，162，963号中，将其全部内容通过引用结合在此。一个类似的方法可以使用 HuMAb-Mouse (Medarex)实现。
本发明的抗体也可以衍生成“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与原始抗体中相应的序列等同或类似，而链的其余部分与来源于其他物种的抗体或属于另一抗体类或亚类中的相应序列等同或类似，以及这样的抗体的片段，只要它们表现出期望的生物学活性(参见，例如，Morrison et al. (1984)PNAS81 :6851 ;美国Pat. No. 4，816，567)。
在另一具体实施方式
中，本发明提供了结合至细胞毒性剂的上文描述的(无论活化或抑制性的)任何抗体或其片段。如本文中使用的术语“细胞毒性剂”是能够杀伤在其细胞表面上带有NKG2A受体的分子。本文中使用的术语“结合”是指两种试剂通过共价和 /或非共价键互相结合；或直接或通过连接部分拴住或其他方式连接于另一个。
大量毒性部分或方法中的任何一个都可以用于生产这样的细胞毒性抗体结合物。 在一些优选的具体实施方式
中，抗体可以直接用放射性同位素或其他毒性化合物衍生。在这样的情况下，可以将标记的单一特异性抗-NKG2A抗体注入患者体内，在那里它可以结合到并且杀伤表达靶抗原的细胞，尤其是NK细胞，其中未结合的抗体简单地在体内清除。 也可以使用间接方案，例如“亲和力增强系统(Affinity Enhancement System) ” (AES)(参见，例如，美国专利第 5，256，395 号；Barbet et al. (1999) Cancer Biother Radiopharml4 153-166 ;将其全部内容通过引用结合在此)。这种特殊的途径包括使用放射性标记的半抗原和识别NK细胞受体与放射活性半抗原的抗体。在这种情况下，首先将抗体注入患者并允许结合到靶细胞，然后，一旦允许从血流中清除未结合的抗体，则给予放射性标记的半抗原。该半抗原结合到在过度增殖的LGL(例如，NK或T)细胞上的抗体-抗原复合体，从而杀伤它们，其中未结合的半抗原从体内清除。
任何形式的具有细胞毒性或细胞抑制性作用的部分均可结合到本发明抗体上， 以形成本发明的细胞毒性结合物并抑制或杀伤特异性NK受体表达的细胞，包括发射性同位素、毒性蛋白、毒性小分子，例如药剂、毒素、免疫调节剂、激素、激素拮抗剂、酶、寡核苷酸、酶抑制剂、治疗放射性核素、血管形成抑制剂、化学治疗剂、长春碱、氨茴环霉素、表叶毒素(epidophyllotoxin)、紫杉烷、抗代谢物、烷化剂、抗生素、C0X-2抑制剂、SN-38、抗有丝分裂物、抗血管形成和凋亡剂、尤其是阿霉素、氨甲蝶呤、红豆杉醇、CPT-11、喜树碱 (camptothecans)、氮芥、吉西他滨、烧基磺酸盐、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、喃唳类似物、嘌呤类似物、钼配位化合物、假单胞外毒素、蓖麻毒、相思豆毒蛋白、5-氟尿嘧啶核苷、 核糖核酸酶(RNase)、脱氧核糖核酸酶I (DNase I)、葡萄球菌肠毒素_A，美洲商陆抗病毒蛋白、白树素、白喉毒素、假单胞菌外毒素、和假单胞菌内毒素以及其他物质(参见，例如， Remington’s Pharmaceutical Sciences,19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995) ；Goodman and Gilman’ s The Pharmacological Basis of Therapeutics(McGraw Hill,2001)； Pastan et al. (1986)Cell 47 :641 ;Goldenberg(1994)Cancer Journal for Clinicians 44 :43;美国专利第6，077，499号；将其全部内容引入本文以供参考)。可以理解，毒素可以是动物、植物、真菌或微生物来源的，或可以通过化学合成在体外新生成。
毒素或其他的化合物可以使用大量可获得的方法中的任何一种直接或间接连接到抗体。例如，试剂可以通过使用交联剂例如N-琥珀酰基3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(STOP)形成二硫键，或通过在抗体的Fe区的糖部分连接到减少抗体成分的铰链区(参见，例如，Yu et al. (1994) Int. J. Cancer 56 244 ；ffong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking(CRC Press 1991) ；Upeslacis et al. ," Modification of Antibodies by Chemical Methods, " in Monoclonal antibodies !principles and applications, Birch et al. (eds. ) , pagesl87_230 (Wiley-Liss, Inc. 1995)； Price, " Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies, " in Monoclonal antibodies Production, engineering and clinical application, Ritter et al. (eds. ), pages 60-84(Cambridge University Press 1995), Cattel et al. (1989)Chemistry today 7 :51-58, Delprino et al. (1993)J. Pharm. Sci 82 :699-704 ；Arpicco et al. (1997)Bioconjugate Chemistry 8 :3 ；Reisfeld et al. (1989)Antihody, Tmmunicon. Radiopharrn. 2 217 ;将其每一个全部内容通过引用结合在此)。
在一个(优选)具体实施方式
中，抗体可用放射活性同位素如1-131进行衍生。可以使用大量合适的放射活性同位素中的任何一种，包括但不限于铟-111、镥-171、铋-212、 铋-213、砹-211、铜-62、铜-64、铜-67、钇-90、碘-125、碘-131、磷-32、磷-33、钪-47、 银-111、镓-67、镨-142、钐-153、铽-161、镝-166、钦-166、铼-186、铼-188、铼-189、 铅-212、镭-223、锕-225、铁-59、硒-75、砷-77、锶-89、钥-99、铑-105、钯-109、镨-143、 钷-149、铒-169、铱-194、金-198、金-199和铅-211。通常，放射性核素优选具有在20到 6，OOOkeV的范围内的衰变能量，优选地，对于俄歇(Auger)放射体在60至200keV的范围内、对于β放射体在100-2，500keV内、对于α放射体在4，000-6，OOOkeV内。也优选的是大致随α粒子产生而衰变的放射性核素。
在本发明的细胞毒性组合物中选择结合到抗-NKG2A抗体的细胞毒性部分，期望确保该部分在体内不产生针对延续生命的正常组织严重的负作用，如选自心脏、肾、大脑、 肝、骨髓、结肠、乳房、前列腺、甲状腺、胆囊、肺、肾上腺、肌肉、神经纤维、胰腺、皮肤、或其他的在人类体内的保持生命的器官或组织中的一种或多种。如本文中所使用的，术语“严重的副作用”是指抗体、配体或抗体结合物，当在体内给予时，其会仅仅产生可忽略或临床上可处理的负作用，例如在化学治疗过程中通常遇到的那些。
在一些相关的具体实施方式
中，本发明也提供结合到可检测标记物的本发明的抗体。本文中所使用的术语“可检测标记物”是指任何可以定量或定性观察或测量的分子。可用于本发明的结合抗体的可检测标记物的实例是放射性同位素、荧光色素或互补结合对中的一员，例如以下中的任何一员抗原/抗体(不是针对NKG2A的抗体)、凝集素/碳水化合物；亲和素/生物素；受体/配体；或分子印迹聚合物/印迹分子系统。
结合本发明抗体的可检测标记可以用于检测体外或体内该在抗体与NKG2A的结合。这样的结合物也可以用来在竞争型实验中检测另一个分子与NKG2A的结合。在一个体内环境下，本发明的可检测标记物-抗体结合物可以用于监测用本发明的NKG2A抗体组合物治疗患者的效力，其中通过可检测标记物体表外检测(例如，通过这样的全身扫描)或通过检测在从患者获得的生物材料(例如，血液、活体组织、其他体液、皮肤碎屑等)。将在各种生物材料中标记物的检测与在所述材料中的治疗性抗体的存在关联起来。
在一个相关的具体实施方式
中，本发明提供了一种试剂盒，其在独立的容器中包括可检测标记-抗-NKG2A抗体结合物；和包含NKG2A的材料。包含NKG2A的材料可以是分离的NKG2A，包含本发明的抗-NKG2A抗体结合的表位的NKG2A片段，或表达在其细胞表面上的NKG2A的细胞。
在非人灵长类动物体内评价抗人类NKG2A抗体
在优选的一系列具体实施方式
中，在非人灵长类动物体内评价本发明的抗-NKG2A 抗体的活性。这样的具体实施方式
可以为了各种理由中的任何一个而实施。考虑到在人类NKG2A和来自非人灵长类动物的NKG2A之间的交叉反应性，并且考虑到在灵长类动物之间的生理相似性，给予非人灵长类动物的识别人类NKG2A的抗体允许在体内评价许多方面，包括但不限于其调节表达NKG2A(例如，NK细胞)的细胞的活性、产生的副作用、毒性、药效学、药代动力学、生物利用度、半衰期、给药的最佳剂量或频率、最佳剂型(包括与其他治疗物质的组合物)、或可以测量以确定该抗体的效率、安全性或最佳给药方式的任何其他性质。在体内评价候选治疗化合物的方法在本领域是熟知的，并描述在例如The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,17th edition,Remington' s Pharmaceutical Sciences, 20th edition,将其全部内容通过引用结合在此。
任何非人灵长类动物可以用于本文描述的方法，包括猿、猴子和原猴类。优选的灵长类动物包括恒河猴(Macacus mulatta)、非洲绿猴(Chlorocebus aethiops)、狨猴 (Callithrix jacchus)、松鼠猴(Saimiri sciureus)、食蟹猴和狒狒(Papio hamadryas)。 在另一个优选的具体实施方式
中，灵长类动物不是猿，例如，是不同于黑猩猩的灵长类动物。非人灵长类动物通常用于候选人类治疗剂的安全性和有效性试验，并且它们的注意事项、给药方式、生物学和其他相关特征对本领域的技术人员是熟知的。在一个具体实施方式
中，在将任何抗体给予任何非人灵长类动物(或在任何试验中使用来自非人灵长类动物的组织、细胞或蛋白)之前，将确定候选抗-人类NKG2A抗体与来源于非人灵长类动物的 NKG2A的交叉反应性。
在某些具体实施方式
中，非人灵长类动物用作用于可通过调节NKG2A的化合物治疗的疾病或症状的模型。例如，可以使用自身免疫疾病、过敏反应、癌症或感染性疾病的模型，例如，用来评价抗体治疗或减轻该疾病或症状的能力。虽然不以任何方式限制本发明的实现，但是某些非人灵长类动物对于研究特定形式的疾病或症状是尤其有用的。例如，狨猴已用作用于研究免疫性和心血管疾病的模型动物，松鼠猴用作用于研究感染性疾病的模型动物，猕猴(包括恒河猴)用作用于研究特异性化合物的药效和毒性的模型动物，以及狒狒作为外科研究、移植和生物材料的模型。
在一个具体实施方式
中，将抗-NKG2A的抗体给予非人灵长类动物以评价这些抗体在结合和/或调节NKG2A活性方面的效力。在这样的具体实施方式
中，抗体可以以任何剂量、频率或剂型给药，并且事实上可以变化这样的因素以评价它们对药效的相对影响。抗体的效力可以用大量方式中的任何一种评价。例如，可以评价抗体与NKG2A或表达NKG2A 的细胞的体内结合、抗体对在细胞例如NK细胞上的NKG2A表达的体内影响，或抗体对NKG2A 活性的体内影响，例如，如使用本文中描述的任何试验测量NK细胞活性。在这样的具体实施方式
中，通常将抗体给予非人灵长类动物，并且例如在从非人灵长类动物获得的生物样品上检测其影响。可替换地，可以在体外实施某些方法，其中考察抗体对例如从非人灵长类动物获得的表达NKG2A的细胞的作用。
为了评价抗-人类NKG2A抗体的结合，可以将抗体直接或间接地标记。例如，可以在给药之前用放射性同位素标记该抗体，并且给药后通过考察各种在不同时间点获得的生物样品(例如，血、各种组织或器官、免疫相关的组织如骨髓、脾、淋巴系统成分或其他) 来评价其在动物体内的定位。在一个优选的具体实施方式
中，获得PBL，并且利用例如荧光标记的第二抗体(其中检测结合的抗体，例如，通过FACS分析)来确定抗体与NK细胞的结八口 ο
类似地，可将抗体给予非人灵长类动物并且评价它们对NKG2A活性的影响。例如， 可以在给予抗-NKG2A抗体前和后获得NK细胞，并且可以利用任何标准方法来评价NKG2A 的活性、表达、和/或两个(或更多)组细胞的数量。可以期望阻断NKG2A刺激(由此通过该受体阻断NK细胞的抑制)的本发明的活化抗体增强NK细胞的活性。可以期望交联NKG2A 受体的本发明的抑制性抗体降低NK细胞的活性并且降低存活NK细胞的数量。可以引起非人灵长类动物体内的NK细胞活性改变的两种类型的抗体都被认为适合用于治疗人类的疾病(其中希望NK细胞活性升高或降低)。
在另一组具体实施方式
中，将抗-NKG2A的抗体给予非人灵长类动物以便评价这些抗体的安全性，以及它们的各种药代动力学和药效学性质。安全性可以用大量方法中的任何一种进行评价。例如，可以通过确定半致死剂量(LD50)(通常以毫克每千克(mg/kg)表达)来评价这些抗体的整体毒性，其中数值50是指被研究动物中的死亡百分数。除了决定 LD50外，还可以通过监测动物对于给药的任何可检测反应，包括通过心率、血压等表现的行为、身体、或生理变化来评价安全性。反应也涉及血液和其他的试验室为基础的试验，以检查器官功能的标记物指示，如用于肾功能的肌酸或BUN，凝血酶原，胆红素，白蛋白，或确定肝功能的各种酶或其他(参见，例如，The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17th edition,通过引用结合在此)。
用于评价该抗体的体内药代动力学和药效学的方法是标准的并且在本领域是熟知的(参见，例如，He et al. (1998) J. Immunol. 160 :1029-1035 ；Alyanakian et al. (2003) Vox Sanguinis 84 :188-192，Sharma et al. (2000) JPET 293 :33_41，将其全部内容通过引用结合在此)。这样的试验通常包括将抗-NKG2A抗体给予非人灵长类动物，并且在给药后31的不同时间检测该抗体的水平(在血浆和其他组织中)、分布、结合、稳定性和其他性质。这样的试验是临床前研究的重要组成部分，并且通过确定该抗体的体内半衰期、分布、生物利用度等有助于确定通过给予抗体达到最佳的表达NK细胞的靶向作用的治疗窗以及由此的正确给药方式(例如，给药的频率和剂量)。
联合抗-NKG2A抗体的效力、安全性、药代动力学和药效学的研究，多种剂型和给药方案也可以系统地进行试验研究以获得抗-人类NKG2A抗体的最佳效力和安全性。例如，可以确定治疗窗(具有高度治疗成功的可能性的该抗体的血浆浓度范围)，以及那些在体内靶向NKG2A和调节NK细胞活性方面最安全和有效的给药方案和剂型。例如，可以每I、 2、3、4、5或6天或每1、2、3或4周等给予抗体，并且考察其安全性、效力、动力学等参数。同样地，在任何一个时间给予的抗体的剂量可以变化并且考察相同的参数，或可以检测给药的剂量和频率的任何组合。而且，也可以在非人灵长类动物内检测不同的剂型，例如包含不同赋形剂不同组合的抗-NKG2A抗体、或NKG2A抗体与其他治疗剂的不同组合(依赖于待治疗的症状，例如治疗癌症的化学治疗物质)的组合物。同样，可以比较不同的给药途径，例如静脉、肺部、局部等等。改变给药参数的这样的方法对本领域的技术人员是熟知的。
药物纟目合物
本发明也提供了组合物(例如药物组合物)，其包含有效量的在任何合适载体中的任何本发明的抗体，包括其片段和衍生物。
可用于这些组合物中的药学上可接受的载体包括，但不限于，离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人类血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和的植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质类，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧化丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
本发明的组合物可以口服、肠胃外给药，通过吸入喷雾、局部地、经直肠地、经鼻地、向颊地、经阴道地或通过植入池给药。如本文中所使用的术语“肠道外的”包括皮下的、 静脉内的、肌肉内的、关节内的、胸骨内的、胸内的、肝内的、病灶内和颅内注射或输注技术。 对于局部疾病例如RA，经常将该组合物局部给药，例如，在发炎的关节。
本发明的组合物的无菌可注射形式可以是水性或油质悬液。这些悬液可以根据本领域已知的技术，利用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌的可注射制剂也可以是在非毒性肠道外可接受的稀释液或溶剂中(例如在1，3_ 丁二醇中)的无菌可注射溶液或悬液。这些可采用的可接受载体或溶剂是水、林格溶液和等渗氯化钠溶液。另外，传统地使用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。脂肪酸如油酸和其甘油衍生物在制备可注射制剂是有用的，因为是天然的药学上可接受的油，如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙基化形式。这些油溶液或悬浮液也可以包含长链醇稀释剂或分散剂，如羟甲基纤维素或类似的分散剂(其通常用于药学上可接受的剂量形式，包括乳液和悬浮液)。其他经常使用的表面活性剂，如吐温、司盘和其他的乳化剂或生物利用度增强剂(其通常用于药学上可接受的固体、液体或其他剂型)也可用于配制制剂的目的。
本发明的组合物可以以任何口服可接受的剂型(包括，但不限于胶囊剂、片剂、水性悬液或溶液)口服给药。如果是口服使用的片剂，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。 通常还加入润滑剂，例如硬脂酸镁。对于以胶囊形式的口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当要求口服用水性悬液时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂联合。如果需要，也可以添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。
可替换地，本发明的组合物可以以直肠给药的栓剂形式给药。这些可以通过混合该药物与合适的无刺激性赋形剂(其在室温下是固体的，但在直肠温度下是液体，因此在直肠内会溶解以释放药物)进行制备。这样的物质包括可可油、蜂蜡、聚乙二醇。这样的组合物是根据药剂领域熟知的技术制备的。
本发明的组合物可以局部给药，尤其是当治疗目标包括通过局部施加容易到达区域和器官，包括眼、皮肤、关节或肠下段。合适的局部制剂对于这些区域或器官的每一个都容易制备。肠下段的局部施加可以直肠栓剂(见上文)或合适的灌肠剂来实现。也可以使用局部的皮肤贴。
对于局部施加，组合物可以制成合适的药膏，其包含悬浮或溶解在一种或多种载体中的活性成分。用于本发明化合物的局部给药的载体包括但不限于，矿物油、液体石蜡、 白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。可替换地，该组合物可以制成合适的洗液或霜剂，其包含悬浮或溶解在一种或多种药学上可接受的载体中的活性成分。 合适的载体包括，但不限于矿物油、单硬脂酸山梨醇酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
对于眼科应用，在有或没有防腐剂的情况下，将该组合物可以在等渗pH调节的无菌盐水中制成微粉化悬液，或优选地在等渗PH调节的无菌盐水中制成溶液，如苯扎氯铵 (benzylalkonium chloride)。可替换地,对于眼科应用，该组合物可以制成药膏例如凡士林油。
本发明的组合物也可以通过鼻气雾剂或吸入进行给药。这样的组合物可以根据药剂领域熟知的技术进行制备，并且可以在盐水中制成溶液，采用苄醇或其他合适的防腐剂， 吸收促进剂以增强生物利用度、碳氟化合物和/或其他传统的增溶剂或分散剂。
在一个具体实施方式
中，本发明的抗体或治疗化合物可以单独或与用于靶向输送到患者或动物的另一物质一起并入脂质体(在抗体情形下的“免疫脂质体”)。这样的其他物质可以包括用于递送基因治疗基因或用于递送活化NK细胞或者抑制成熟树突细胞的反义RNA、RNAi或siRNA，或者用于通过其他方式活化NK细胞(或抑制树突细胞)的毒素或药物，或者任何本文中描述的对于本发明目的有用的其他药物。
在另一个具体实施方式
中，本发明的抗体或其他化合物可以被修饰以提高其生物利用度、体内半衰期等。例如，可以使用大量形式的聚乙二醇的任一种和本领域已知的连接方法(参见，例如，Lee et al. (2003)Bioconjug Chem. 14(3) :546-53 ； Harris et al. (2003)Nat Rev Drug Discov. 2(3) :214-21 ;Deckert et al. (2000)Int J Cancer. 87 (3) :382-90)将抗体和其他的化合物聚乙二醇化。
确定给药的剂量和频率
如上面描述的，本发明的一个重要部分是在非人灵长类动物中试验抗-NKG2A抗体，以确定安全和有效的给药剂量和频率。合适的起始给药方案可以通过研究利用其他已经开发的治疗性单克隆抗体的经验来确定。已证实多种单克隆抗体在临床条件下有效，例如利妥昔单抗(Rituximab)、曲妥单抗(Trastuzumab)、奥马佐单抗(Omalizumab)、托西莫单抗(Tositumomab)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、替伊莫单抗(Zevalin)、Oncolym并且本发明的抗体可以使用类似的给药方案(即制剂和/或剂量和/或给药方案)。给药的进度和剂量可以根据对于这些产品已知的方法来确定，例如使用制造商的说明书。例如，单克隆抗体可以是在IOOmg(IOmL)或500mg(50mL)单次使用小瓶中的10mg/mL的浓度。对于IV给药，该产品可以在9. Omg/mL氯化钠、7. 35mg/mL朽1檬酸钠二水化物、O. 7mg/mL聚山梨醇酯80 和无菌水中配制成注射用的。将PH值调节到6.5。对于本发明的抗体的示例性合适剂量范围可以在约10mg/m2和500mg/m2之间。然而，可以理解，这样的进度是示范性的并且最佳进度和方案可以在考虑该抗体的亲和力和抗-NKG2A活性调节以及必须在临床试验中确定的抗体耐受性的基础上进行修改。考虑抗体的亲和力和它的药代动力学参数而确定用针对 NKG2A的抗体饱和细胞24小时、48小时、72小时或一星期或一个月的注射量和进度。
然而，可以理解，这些进度是示范性的并且最佳进度和方案可以在考虑该抗体的亲和力和抗-NKG2A活性调节以及必须在临床或临床前试验中确定的抗体耐受性的基础上进行修改。考虑抗体的亲和力和它的药代动力学参数而确定用针对NKG2A的抗体保护细胞 24小时、48小时、72小时或一星期或一个月的注射量和进度。
在现在的方法中给予患者或非人灵长类动物的剂量应该足以在一定时间内在患者体内实现有益的效果。剂量可以通过使用的特定调节剂的效力和患者的症状，以及待治疗的体重或区域的表面积来确定。剂量的大小也将通过在特定患者中可能伴随给药的任何不良负作用的存在、类型和程度来确定。在确定特定患者的待给予化合物的有效量中，医生可以评估该化合物的循环血浆水平、化合物毒性和抗-化合物抗体的产生。通常，化合物的剂量当量在典型的患者中为约lng/kg到10mg/kg。给药可以通过单次或分开的剂量完成。
结合人类和非人灵长类动物NKG2A受体的本发明的抗体可以有利地用于确定给药的剂量和频率。选择用于利用抗-NKG2A抗体的治疗的最佳治疗窗的选择可以基于将抗体给予非人灵长类动物来实现。尽管已建议在短时间内(24小时共培养)的NK细胞活化以避免骨髓细胞(BMC)的毒性，但是已经证实更长(48小时骨髓细胞与活化的NK细胞的共培养)时间会有害影响造血重建(Koh et al. (2002)Biol. Blood Marrow Transplant. 8 17-25)。然而，采用允许在个体内的NK细胞暴露于NK细胞活化的抗-NKG2A抗体达更长时间(例如比24小时或甚至48小时更长)的给药方案是非常有价值的。虽然不希望受理论限制，但是这样的方案(其中抗-NKG2A抗体存在大于24小时或48小时)将使抗-NKG2A抗体接触并活化在个体内的足够量的NK细胞用于针对靶标的有效治疗。因此，本发明的发明人提供了一种用抗NKG2A抗体治疗个体的方法，其包括将所述的个体暴露于抗-NKG2A抗体达到大于24小时，更优选大于48小时的时间期。最优选地，本发明包括给予所述个体具有大于24小时、或48小时、或更优选地至少5、6、7、10、14或20天的血浆半衰期的抗-NKG2A 抗体。最优选地，本发明包括给予所述患者包含Fe部分，优选地G2或G4型的Fe部分的抗-NKG2A抗体。如本文进一步讨论的，可以使用阻断NKG2A功能的任何合适抗体，例如具有Z199或Z270结合特异性的抗体。在优选的具体实施方式
中，抗体可以给予第二次或更多次剂量，并且抗体可以是嵌合的、CDR接枝的人类或人源化的抗体。
本发明提供了一种鉴定对于针对人类NKG2A的治疗抗体合适给药方案的方法，该方法包括使用某种给药方案，优选地其中抗体的剂量和频率变化的一系列方案将抗体给予非人灵长类动物，并且确定在非人灵长类动物中表达NKG2A的细胞的活性和对于特定给药方案疗法对灵长类动物的骨髓细胞(BMC)和/或造血细胞，尤其是骨髓来源细胞重建的影响。优选地，所述方法进一步包括在给予抗-NKG2A抗体之后评估骨髓重建，通常涉及确定对于骨髓重建到正常例如接近抗NKG2A治疗之前观察的水平或预定的水平所需要的天数。 然后可以选择或鉴定允许骨髓重建到正常的给药方案。
该方法可以进一步包括确定在非人灵长类动物中的表达NKG2A的细胞的活性和/ 或鉴定或选择在表达NKG2A的细胞活性方面导致可检测调节的给药方案。
所述的给药方式可以表达为例如根据个体暴露于活化NK细胞的抗-NKG2A抗体的时间和抗体给药的频率。基于这样的参数，可以根据使用的特定抗体，例如考虑抗体的血浆半衰期、亲和力、生物利用度(或达到峰值血清浓度的时间)等来调整给药的频率和剂量。
确定一种给药方案在哺乳动物体内允许骨髓重建部分或完全恢复或正常化并且导致在表达NKG2A的细胞活性方面可检测到的调节，表明该给药方案适用于人类。
内源性的人类免疫球蛋白的分解代谢速率已被很好表征。IgG的半衰期根据同种型变化，对于IgGl、IgG2和IgG4达到3周而对于IgG3接近I周。除非药代动力学通过抗原结合或免疫原性改变，完整的人类IgG单克隆抗体将显示与内源性IgG相当的药代动力学。如前面讨论的，人类IgGl、IgG2和IgG4同种型的特别长的半衰期是由于FcRn的分解代谢保护。FcRn表达在网状内皮系统(RES)的肝细胞、内皮细胞和吞噬细胞上表达。当 IgG经历细胞内吞时，内含体的低pH值促进IgG Fe结构域结合FcRn，其使IgG再循环到细胞表面并且补救IgG不被溶酶体降解。相比于其他IgG同种型，IgG3的较短半衰期是由于在FcRn结合结构域中的单个氨基酸的不同(在435位置用精氨酸取代组氨酸)。
完整小鼠IgGl和IgG2抗体的消除比相应的人类同种型快得多。鼠抗体的半衰期在人体内为在12到48小时的范围内。鼠抗体在人体内的短半衰期是由于小鼠Fe结构域与人类FcRn的低结合亲和力。人类FcRn结合人类、兔和豚鼠IgG，但对大鼠、牛、羊或小鼠 IgG的结合不明显；小鼠FcRn结合来自所有这些物种的IgG。抗体片段(包括F(ab’)2、 Fab和scFV)缺乏Fe结构域，并且不与FcRn结合。因此，这些片段的半衰期实质上比完整 IgG的短，其中主要通过它们的分子量确定半衰期。低分子量Fab和scFv片段经历肾清除， 其加速消除。报道的半衰期对于F(ab’)2片段为在11到27h的范围内，而对于Fab片段为在O. 5到21h的范围内。单价和多价scFv构建体的为半衰期可以从几分钟到几小时的范围内。
抗原结合可以明显影响抗体的药代动力学。如果抗体结合内化的细胞膜抗原或与从循环中有效清除的分泌抗原形成的免疫复合体，该抗原在抗体清除时充当“泄口 (sink)”。一个抗原泄口将产生剂量依赖的药代动力学。如果剂量水平不足以使抗原库饱和，这抗原介导的清除会起主要作用并且抗体的半衰期会比内源性IgG的半衰期短；在使抗原饱和的剂量水平下，RES-介导的清除会起主要作用并且半衰期与内源性IgG类似。
本发明优选的具体实施方式
描述了一种给药方案，其中抗-NKG2A抗体在第一次给药中给予。抗-NKG2A抗体的第一剂量活化NK细胞并且可以间接地通过激活NK细胞来抑制个体内的骨髓细胞重建。给予的抗-NKG2A抗体的第二剂量符合骨髓的细胞重建恢复的药效外形，例如在当期望个体骨髓细胞重建的速度具有至少部分恢复时进行给药。因此， 通过利用与人类和非人灵长类动物体内的受体交叉反应的抗NKG2A抗体，本发明的发明人提供了一种其中NK细胞与抗-NKG2A抗体接触超过24小时(在该期间已报道骨髓重建未受影响)的方法。
在优选的具体实施方式
中，抗-NKG2A抗体的第二剂量将在初次给药之后的至少 6、7、8、9或10天给药，并且优选在初次给药之后的至少14、15、16或20天给药。最优选地抗-NKG2A抗体的第二剂量是在评价受治者体内抗-NKG2A抗体的血浆浓度确定达到初始 (给药)浓度的一半的时间(天)之后的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10天或者至少14、15、 16或20天给药，优选在抗-NKG2A抗体的至少一个血浆半衰期的持续时间之后的至少6_10 天或至少15-20天。可替换地，该方法可以以抗-NKG2A抗体的峰值血清浓度来表示，其中抗-NKG2A抗体的第二剂量在评价受治者体内抗-NKG2A抗体血浆浓度达到个体峰值血清浓度的一半的时间(天)之后的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10天或者至少14、15、16或20天给药。
在进一步的具体实施方式
中，抗-NKG2A抗体的第二剂量是在评价受治者体内抗-NKG2A抗体的血浆浓度确定达到不可检测浓度的时间(天)之后的至少2、3、4、5、6、7、 8、9或10天或者至少14、15、16或20天给予，优选在至少2、3、4或更多个抗-NKG2A抗体的血浆半衰期的持续时间之后的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10天或者至少14、15、16或20天给药。
在一个优选的具体实施方式
中，描述的给药方案用于包含G2b，优选G4亚型(分别IgG2b或IgG4)的Fe区域的抗体。优选所述抗体具有约5、6、7、8、9、10、12、15、18、20、 21天或优选约10 15天、15-21天的半衰期。优选地该抗体包含基本上不与NK细胞上的 Fe受体(CD16)结合的Fe区域。所述抗体优选以第一剂量、以及第二剂量和/或随后的剂量给药，其中第二和/或随后的剂量是在评价抗体达到其初始浓度的一半之后的至少6、7、 8、9、10、14、15、16或20天给药的。所述第二和/或随后的剂量也可以以给药后的绝对天数表达，例如，优选在初次给药后至少6、7、8、9或10天，并且优选在第一次给药后至少14、 15、16、20、21、24、28、30或35天给药。所述抗体可以是包含天然存在的Fe部分，优选天然存在的人类Fe部分的抗体，或更优选地可以包含修饰，例如一个或多个氨基酸取代以增强抗体的血浆半衰期和/或改变与Fe受体的结合，例如增强与Fcn受体的结合以延长血浆半衰期、或减少与Fe YlIIa的结合以减轻对NK细胞不期望的毒性(ADCC)。这样的修饰可以根据本领域熟知的方法实施，这些修饰中的多种将进一步在本文中描述。
在又一个优选的具体实施方式
中，描述的给药方案用于抗体片段，优选例如用本文描述的聚乙二醇修饰的F(ab’)2片段，以具有约5、6、7、8、9、10、12、15、18、20、21天的血浆半衰期。所述抗体优选以第一剂量给药，以及第二和/或随后的剂量给药，其中第二和/ 或随后的剂量在评价抗体达到其初始浓度的一半之后的至少6、7、8、9、10、14、15、16或20 天给药。所述第二和/或随后的剂量也可以以给药后的绝对天数表达，例如，优选在初次给药后的至少6、7、8、9或10天，优选在第一次给药后的至少14、15、16、20、21、24、28、30或35 天。
药物组合物
根据本发明另一个重要的具体实施方式
，抗-NKG2A抗体和/或其他化合物可以与一种或多种另外的治疗剂一起配制，其中所述另外的治疗剂包括对于特定治疗目的(该抗体或化合物被给予)而正常使用的药物。另外的治疗剂通常按照在单一治疗中用于治疗特定疾病或症状所常用的剂量给药。这样的治疗剂包括，但不限于治疗癌症中所使用的治疗剂(“抗癌化合物”，包括化学治疗化合物、激素、血管形成抑制剂、凋亡剂等)；用于治疗传染病的治疗剂(包括抗病毒化合物)；用于其他免疫治疗的治疗剂，例如自身免疫性疾病、 炎性障碍和移植排斥的治疗剂；细胞因子；免疫调节剂；辅助化合物；或针对激活和抑制NK 细胞受体的其他抗体和其他抗体的片段。除非另有指明，下面列出的联合组合物可以包括本发明的活化抗体、抑制抗体或细胞毒素-抗体结合物。
用于治疗癌症的治疗剂包括化学治疗剂(包括干扰DNA复制、有丝分裂和染色体分离的药物，以及破坏多核苷酸前体合成和精确度的试剂)、激素治疗剂、抗血管形成剂以及诱导凋亡的试剂。
作为示例性考虑的化学治疗药包括但不限于烷化剂，抗代谢药，细胞毒性抗生素，长春花生物碱，例如阿霉素、更生霉素、自力霉素、洋红霉素、道诺霉素、亚德里亚霉素、三苯氧胺、红豆杉醇、紫杉特尔(taxotere)、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、依托扑沙 (VP-16)、5_氟尿嘧啶(5FU)、阿糖胞苷、环磷酰胺、硫替派、氨甲叶酸、喜树碱、放线菌素-D、 丝裂霉素C、顺钼(CDDP)、氨喋呤、考布他汀(combretastatin)及其衍生物和前物。
激素类药剂包括但不限于例如LHRH促效剂，如亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林、 和布舍瑞林；抗雌激素类，如三苯氧胺和托瑞米芬；抗雄激素类诸如氟他米特、尼鲁米特、 去乙酰环丙氯地孕酮和比卡鲁胺；芳香酶抑制剂，如阿纳托唑、依西美坦、来曲唑和法倔唑 (fadrozole);以及孕激素类,如美沙洛尔(medroxy)、氯地孕酮和甲地孕酮。
许多用于联合疗法的示例性化学治疗剂列于美国专利第6，524，583号的表C中， 将其披露的药物具体地通过引用结合在此。列出的每一个药物是示例性的而不是限制性的° 技术人员关注"Remington' s Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, chapter 33，in particular pages 624-652。剂量变化可能取决于待治疗疾病。实施治疗的医师将能够确定单个受治者的合适剂量。
抗血管形成剂的实例包括中和抗体、反义RNA、siRNA、RNAi、RNA适体和每一针对 VEGF或VEGF受体的核糖核酸酶，(美国专利第6，524，583号，将其全部内容通过引用结合在此)。也可以使用具有拮抗特性的VEGF变异体，如在WO 98/16551中所描述的，明确地以引用方式并入本文。用于与联合疗法有关的另外的示例性抗血管形成剂列于美国专利第 6，524，583号的表D中，将这些药物和披露内容明确地通过引用结合在此。
示例性的细胞凋亡剂包括但不限于bcr_abl, bcl_2 (不同于bcl_l,细胞周期蛋白Dl ;基因库登记号为M14745，X06487 ;美国专利第5，650，491和5，539，094号；将其均通过引用结合在此)和包括Bcl-Xl、Mcl-l、Bak、Al及A20的家族成员。bcl_2的过表达首先发现于T细胞淋巴瘤。致癌基因bcl-2通过结合继而灭活凋亡Bax (路径中的一个蛋白) 而发挥作用。抑制bcl-2的功能阻止了 Bax的失活，从而使凋亡路径继续。这类致癌基因的抑制(例如，使用反义核苷酸序列、RNAi, siRNA或小分子化合物)被考虑用于本发明以促进凋亡(美国专利第5，650，491 ;5，539，094和5，583，034号；将其每一个均通过引用结合在此)
可以与本发明的分子联合使用的有用的抗病毒剂包括但不限于蛋白酶抑制剂、 核苷逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂和核苷类似物。抗病毒剂的实例包括但不限于叠氮胸苷、阿昔洛韦、gangcyclovir、阿糖腺苷、5-碘脱氧尿苷、三氟尿苷和病毒唑，以及磷碳钠、金刚烷胺、金刚乙胺、沙奎那韦、印地那韦、安泼那韦、洛匹那韦、利托那韦、α -干扰素；阿德福韦、clevadine、恩替卡韦(entecavir)和普来可那立(pleconaril)。
对于自身免疫性或炎性障碍，已知的对于一种或多种类型的自身免疫性或炎性障碍、或自身免疫性或炎性障碍的任一症状或特征有效的其他化合物，除其他之外，包括免疫抑制剂，例如硫唑嘌呤(例如依木兰)，瘤可宁(例如苯丁酸氮芥)，癌得星(例如环磷酰胺)，环孢霉素(例如山地明，Neoral)，氨甲叶酸(例如甲氨蝶呤胶囊剂)，皮质激素，泼尼松(例如去氢可的松，强的松)，依那西普(例如Enbrel)，英夫利昔单抗(例如小前指羽)， TNF抑制剂，FK-506，雷怕霉素，麦考酚酸吗乙酯，来氟米特，抗淋巴细胞球蛋白，脱氧精胍菌素或OKT。
免疫调节化合物的优选实例包括细胞因子。其他实例包括，具有优选具有活化或增强NK细胞活性，或诱导或促进NK细胞增生的作用的化合物。免疫调节化合物的实例包括但不限于N0D和PKR受体的配体；TLR(Toll类受体)的促效剂，如TLR3(dsRNA， poly I :C和polyA:U)促效剂，TLR4 (ANA380，艾沙托立宾，LPS和模拟物，如MPL)促效剂， TLR7 (寡核苷酸，ssRNA)促效剂，TLR9 (寡核苷酸如CpG)促效剂，其许多实例描述于Akira 和Takeda((2004)Nature Reviews 4:499、)中；阻断在NK细胞上的抑制受体(如抑制 KIR2DL1和KIR2DL2/3活性)的抗体或用作NK细胞活性受体的抗体(如与NCR受体抗体 NKp30,NKp44或NK046交联的抗体)。在根据本发明的组合方法中可以使用各种细胞因子。 用于本发明考虑的组合中的细胞因子的实例包括IL-I a、IL-1 β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL_21、TGF_P 、GM_CSF、M_CSF、 G-CSF、TNF- a、TNF- β、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG, MP、LIF、OSM、TMF、PDGF、IFN- a、 IFN-β、IFN-Y。在本发明的联合治疗或组合物中使用的细胞因子根据标准方案给药，该方案与诸如患者的症状和细胞因子的相对毒性的临床显示一致。
以实例的方式，辅助化合物可以包括抗催吐药如5-羟色胺拮抗剂和治疗药如酚噻嗪系、取代的苯酰胺类、抗组胺剂、丁酰苯、皮质激素、地西泮和大麻素类；二膦酸盐如唑来膦酸和帕米膦酸；以及造血生长因子如促红细胞生成素和G-CSF，例如非格司亭 (filgrastim)、来诺拉提(Ienograstim)和 darbepoietin。
可与本发明的活化抗-NKG2A抗体一起配制的其他治疗剂包括可以活化NK细胞的其他化合物。例如，可以利用刺激NCR的化合物，例如NKp30、NKp44和NKp46 (参见，例如 PCT WO 01/36630，Vitaleet al. (1998)J. Exp. Med. 187 :2065-2072, Sivoriet al. (1997) J.Exp. Med. 186 :1129-1136 ；Pessinoet al. (1998)J.Exp. Med. 188 :953-960 ；Pessinoet al. (1998) J. Exp Med. 188 :953-960 ;将其全部披露内容通过引用结合在此)；作为KIR抑制性受体的抑制剂(参见，例如 Yawata et al. (2002)Crit Rev Immunol 22:463-82; Martinet al. (2000)Immunogenetics. 51 :268-80 ；Lanier (1998)Annu Rev Tmmunol.16 359-93 ;将其全部披露内容通过引用结合在此)。优选地，使用一种活化剂，例如NKp30的天然配体或活化抗体。在一个具体实施方式
中，使用TGF-β I的抑制剂，因为TGF-β I可以下调 ΝΚρ30(参见，例如 Castriconiet al. (2004) C. R. Biologies327 :533_537，将其全部披露内容通过引用结合在此)。
可以与本发明的抑制性抗-NKG2A抗体一起配制的治疗化合物是可以抑制NK细胞的化合物。这样的化合物包括NCR的抑制剂，例如NKp30，NKp44和NKp46，活化NKG2受体(例如NKG2C)的抑制剂；抑制性KIR受体的活化剂或抑制性Ly49受体的活化剂。
本发明的活化性抗体也可以和抗原(期望其可耐受)一起配制。认为由本发明的活化性抗体引起的杀伤树突细胞增强将使得此时免疫系统中存在的抗原耐受。这样的组合物对于治疗自身免疫性疾病以及变态反应很有用。可以和本发明的活化性抗体配制的抗原的实例包括，mylein碱性蛋白、豕草属和其他花粉及植物变应原，引起宠物变态反应的变应原，引起食物过敏的变应原(如花生和其他坚果变应原，奶制品变应原，芝麻和其他种子类变应原)或昆虫变应原。
动物和人用药量(基于毫克每平方米体表面积)的相互关系描述于Freireichet al. (1966)Cancer Chemother Rep 50 :219。人体表面积可以近似地由患者的身高和体重确定。参见，例如 Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, N. Y. , 1970, 5370 本发明的化合物的有效量可以在约O. OOlmg/kg至约1000mg/kg的范围内，更优选为O. Olmg/ kg至约100mg/kg,更优选地0. lmg/kg至约10mg/kg ;或任意范围,其中该范围的下限为在0.001mg/kg至900mg/kg之间的任何量,该范围的上限为在0. lmg/kg至1000mg/kg之间的任何量(例如0. 005mg/kg至200mg/kg,0. 5mg/kg至20mg/kg)。如本领域的普通技术人员认识到的，有效量也将随治疗的疾病、给药途径、赋形剂使用以及与其他治疗方式共同使用的可能性(如其他试剂的使用)而变化。
对于包含另外的治疗剂的药物组合物，另外的治疗剂的有效量为在单一疗法方案中只使用该另外试剂时正常使用的剂量的约20%至100%之间。优选地，有效量在正常单一治疗剂量的约70%至100%之间。这些另外的治疗剂的正常的单一治疗剂量在本领域是熟知的。参见，例如，Wellset al. ,eds. ,Pharmacotherapy Handbook, 2. sup. nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (2000) ；PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000,Deluxe Edition,Tarascon Publishing,Loma Linda,Calif. (2000), 将其每一个的全部内容通过引用结合在此。
希望以上列举的另外的治疗剂的一些可以和本发明中的化合物协同发挥作用。当这种作用发生时，允许该另外的治疗剂和/或本发明中的化合物的有效剂量将比单一疗法中要求的减少。这具有如下优点另外的治疗剂或本发明化合物的毒副作用最小化，效力协同提高，使给药或使用简单和/或减少化合物制备或制剂的总费用。
本领域的普通技术人员将认识到上述的治疗剂可落入两个或多个上面披露的类别。对于本发明的目的，认为这些治疗剂均是各种不同治疗剂的成员，并且作为在某一具体类别中的任何治疗剂的特征也不能从另一具体类别中排除。
在另一具体实施方式
中，本发明提供了一种组合物，其包含本发明的抗体和选自上述任何药剂或变应原的第二治疗剂或变应原，其中，所述抗体和第二药剂为独立的剂型， 但是彼此关联。如本文所使用术语“彼此关联”指的是一种单独剂型与另一种一起包装，或者彼此附着，使之很明显该单独剂型是作为相同方案的部分进行销售和给药的。药物和抗体优选一起包装在透明包装物或其他多腔包装物中，或者作为连接的，但使用者可以分开 (例如，通过撕开两个容器之间的划线)的单独密封容器(如箔囊或其类似物)中。
在又一具体实施方式
中，本发明提供了一种试剂盒，包括(在单个容器中)a)本发明的抗体；以及b)第二治疗剂或变应原。再次，上述的任何治疗剂或变应原都可以存在于该试剂盒中。
抗NKG2A抗体和组合物的应用
本发明的活化性抗体使NK细胞在接触靶细胞时能溶解在其表面上带有HLA-E或 Qalb的靶细胞。因此，根据一个具体实施方式
，本发明提供了一种在包括NK细胞和所述靶细胞的种群中重建NK细胞介导的靶细胞溶解的方法，其中，所述NK细胞的特征在于在其表面上的NKG2A，并且所述靶细胞的特征在于在其表面上存在HLA-E或Qalb,所述方法包括使所述NK细胞与上述活化性单克隆抗体或其片段接触的步骤。
这种活性对于治疗特征在于在其细胞表面上表达HLA-E或Qalb的有害细胞的疾病非常有用。一种这样的细胞类型是树突细胞，优选成熟的树突细胞。因此，本发明提供了一种治疗自身免疫性或炎症疾病或至少部分由树突细胞过剩和活动亢进引起的其他任何疾病的方法。治疗这样的疾病的方法包括对患者给予包含活化性抗体的本发明的非细胞毒性组合物的步骤的。
使用本方法可以治疗的示例性自身免疫性疾病(除其他之外)包括溶血性贫血、 恶性贫血、结节性多动脉炎、系统性红斑狼疮、韦格纳肉芽肿、自身免疫性肝炎、白塞氏病、 克隆氏病、原发性胆汁性肝硬化、硬皮病、溃疡性结肠炎、干燥综合症、I型糖尿病、眼葡萄膜炎、葛瑞夫兹氏病、阿尔茨海默病、心肌炎、风湿热、硬皮病、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、肾小球肾炎、结节病、皮肌炎、重症肌无力、多肌炎、格林巴利综合症、多发性硬化、斑秃、 天疱疮/类天疱疮、大疱性类天疱疮、桥本氏甲状腺炎、牛皮癣和白癜风。
可以通过这些方法治疗的炎症性疾病的实例包括，但不限于，肾上腺炎、牙槽炎、 胆囊胆管炎、阑尾炎、龟头炎、睑炎、支气管炎、粘液囊炎、心炎、蜂窝组织炎、宫颈炎、胆囊炎、声带炎、耳蜗炎、结肠炎、结膜炎、膀胱炎、皮炎、憩室炎、脑炎、心内膜炎、食管炎、咽鼓管炎、纤维组织炎、毛囊炎、胃炎、胃肠炎、銀炎、舌炎、肝脾炎、角膜炎、内耳炎、喉头炎、淋巴管炎、乳腺炎、耳炎、脑脊膜炎、子宫炎、粘膜炎、心肌炎、肌炎、鼓膜炎、肾炎、神经炎、睾丸炎、骨软骨炎、耳炎、心包炎、腱鞘、腹膜炎、咽炎、静脉炎、脊髓灰质炎、前列腺炎、牙髓炎、视网膜炎、鼻炎、输卵管炎、巩膜炎、seleiOchoroiditis、阴囊炎、鼻窦炎、脊椎炎、脂肪组织炎、口腔炎、滑膜炎、咽鼓管炎、腱炎、扁桃体炎、尿道炎和阴道炎。
也已表明，树突细胞同种异体反应性NK细胞杀伤提高了骨髓移植中造血细胞移植物的移入(L. Ruggeri et al.，Science，2002，295 :2097-2100)。因此，在另一具体实施方式
中，本发明提供了一种提高患者造血细胞移植物移入的方法，该方法包括给予患者包含活化性抗体的本发明的组合物的步骤。移植过程得到明显改善，表现为移植物抗宿主疾病的发病率和严重度的降低、移植物的存活延长、或通过移植所治疗的疾障碍状的减轻或消除(如造血癌)。这个方法优选地用于非白血性白血病的治疗。
已经证实癌细胞由于在其细胞表面上存在HLA-E，可以逃避杀伤。HLA-E已经在手术摘除的恶性胶质瘤标本、神经胶质瘤细胞系和恶性胶质瘤细胞培养物中检测到(J. Wischhusen et al. , JNeuropathol Exp Neurol. 2005 ；64 (6) 523~8);也在白血病衍生的细胞系、黑素瘤、黑素瘤衍生的细胞系和颈部肿瘤中检测到(R Marin et al.， Immunogenetics. 2003 ;54(11) :767-75)。因此，在另一个具体实施方式
中，本发明提供了一种治疗患癌症患者的方法，其中，所述癌症以细胞表达HLA-E为特征，所述方法包括给予所述患者包括活化性抗体的本发明的组合物的步骤。
根据这种方法可以治疗的癌症的实例包括，但不限于癌，包括膀胱的、乳房的、结肠的、肾脏的、肝脏的、肺脏的、卵巢的、前列腺的、胰腺的、胃的、宫颈的、甲状腺的和皮肤的癌，包括鳞状上皮细胞癌；淋巴性造血系瘤，如非白血性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍杰金淋巴瘤、非霍杰金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和Burketts淋巴瘤；髓样造血系瘤，包括急慢性髓细胞性白血病和前髓细胞性白血病；间充质细胞起源肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其他肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和外周神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、 成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；间充质细胞起源的肿瘤,包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以及其他肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状滤泡癌和畸胎瘤。
根据本发明优选可以治疗的癌症包括神经胶质瘤、恶性胶质瘤、非白血性白血病、 黑素瘤和颈部肿瘤。
病毒感染细胞也使用HLA-E表达作为避免NK细胞杀伤的机制。HLA-E的表达和丙型肝炎病毒感染细胞相关(J. Mattermann et al, American Journal of Pathology. 2005 ；166 :443-453);以及细胞巨化病毒感染细胞有关(C. Cerboni et al. ,Eur J Immunol. 2001 ;31 (10) :2926-35)。因此，在另一具体实施方式
中，本发明提供了一种治疗患病毒感染患者的方法，其中，所述病毒感染的特征在于感染细胞表达HLA-E，所述方法包括给予所述患者包括活化性抗体的本发明的组合物的步骤。
通过这种方法可以治疗的病毒感染的实例包括，但不限于以下病毒引起的感染 家族逆转录病毒科(例如人类免疫缺陷病毒如HIV-I (也称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/ LAV、或HIV-III ;和其他分离物、如HIV-LP));小核糖核酸病毒科(如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、EV病毒、柯萨奇病毒、鼻病毒属、埃可病毒群);Calciviridae (如引起胃肠炎的菌株)；披盖病毒科(如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(如登革热病毒、脑炎、黄热病毒)；冠状病毒科(如冠形病毒)；弹状病毒科(如水泡性口炎病毒、狂犬病毒)；纤丝病毒科(如ebola病毒)；副粘病毒科(如副流感病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(如流感病毒)或禽流感病毒(H5N1或相关病毒)；Bungaviridae (如汉坦病毒、bunga病毒、白蛉病毒属和Nairo病毒);沙粒病毒科(出血热病毒);呼肠孤病毒科(如呼肠病毒、orbiviurses和轮状病毒)；双RNA病毒；肝DNA病毒科(乙型肝炎病毒)；微小病毒科(细小病毒)；乳头多瘤空泡病毒科(乳头瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科 (多数腺病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(HSV) I和2、水痘-带状疱疹病毒、细胞巨化病毒(CMV));痘病毒科(类天花病毒、常见正痘病毒、痘病毒)；虹彩病毒科(如非洲猪霍乱病毒)；以及未分类的病毒(如海绵状脑病病原，丁型病毒性肝炎(被认为是乙型肝炎病毒的不完全伴随体)，非甲、非乙型肝炎动因(I类=中心传送型；2类=经注射途径传送型 (如丙型肝炎);Norwalk及相关病毒，和星状病毒)。
最优选地，被治疗的病毒感染选自丙型肝炎病毒感染或巨细胞病毒感染。
本发明的活化性抗体还可以用于诱导对抗原的耐受性。因此，根据另一具体实施方式
，本发明提供了一种在患者体内诱导对抗原的耐受性的方法，该方法包括给予所述患者包括活化性抗体的本发明的组合物；以及给予所述患者抗原(对其期望是耐受的)的步骤。该方法优选用于治疗变态反应症，其中，该抗原是一种变应原。抗原的选择可以由上面列出的包括本发明的活化性抗体和抗原的联合组合物制成的那些抗原。
包括本发明的抑制性抗体或细胞毒素-抗体结合物的组合物对于杀伤NK细胞、降低NK细胞的活性、抑制NK细胞的增殖、阻止对NK细胞溶解作用敏感的细胞的溶解、或减少种群中NK细胞的数量非常有用。根据一个具体实施方式
，本发明提供了一种降低NK细胞活性、减少NK细胞增生、阻止对NK细胞溶解作用敏感的细胞的溶解或减少NK细胞数量的方法，该方法包括使NK细胞与本发明中的抑制性抗体或细胞毒素-抗体结合物组成的组合物接触的步骤。这些方法尤其对于以NK细胞活性过高和/或增殖旺盛为特征的疾病有效。
例如，共有的PCT公开WO 2005/105849总体描述了抗多种NK细胞受体的抗体用于治疗NK型LDGL的应用。PCT公开W02005/115517披露了 NK细胞活性过高与胰岛自身免疫性出现、进展、阶段和/或侵袭性有关，因此在I型糖尿病中发挥作用。因此，根据一个具体实施方式
，本发明提供了一种治疗患有以NK细胞活性过高或NK细胞过度增殖为特征的疾病的患者的方法，该方法包括给予所述患者包括抑制性抗体或细胞毒素抗体结合物的根据本发明的组合物的步骤。在一个优选的具体实施方式
中，疾病选自NK型LDGL或I型糖尿病。
上述任何一种治疗方法都可以包括给予患者适用于被治疗症状的第二治疗剂的另外的步骤。可以给予患者的第二治疗剂类型的实例包括细胞因子，细胞因子抑制剂，造血生长因子，胰岛素，抗炎药，免疫抑制剂，抗癌化合物(如化学治疗化合物，抗血管形成化合物，促凋亡化合物，激素剂，干扰DNA复制、有丝分裂和/或染色体分离的化合物，或阻断多聚核苷酸前体的合成与准确度的药剂)，辅助化合物(如疼痛减轻剂或止吐药)，激动活化性NK细胞受体的化合物(如NKp30、NKp44、NKp46)，抑制性NK细胞受体的拮抗剂(如KIR 受体抑制剂)，TGF-β I的拮抗剂，刺激抑制性NK细胞受体的化合物(如天然配体，抗体或能够刺激CD94/NKG2A受体或抑制性KIR受体如KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1和 KIR3DL2的活性的小分子)，或活化性NK细胞受体的抑制剂(如NKp30、NKp44或NKp46)。
上述种类的化合物的具体实例列在关于药物组合和任何这样的具体化合物的部分中提出，以及这类治疗剂的任何其他成员可以在本发明的方法中给予患者。选择使用的治疗剂可由医学领域的技术人员容易地决定并且取决于治疗或预防的症状本身的性质、症状的严重性、被治疗患者的全身总体健康状况和治疗医生的判断。
第二治疗剂可以和本发明的抗-NKG2A组合物同时、或先于、或之后给药。当同时给予时，第二治疗剂可以作为单独配制的组合(即，作为多剂型)或作为包含该抗体的组合物的一部分进行给药。
在一些具体实施方式
中，在给予本发明的NKG2A抗体组合物之前，评价NK细胞上的NKG2A或其他可能蛋白的表达，和/或检测树突细胞(优选成熟的树突细胞)的活性或数量、和/或其他细胞上NKG2A配体(如HLA-E或Qalb)的存在。这可以通过从患者获得的 NK细胞或树突细胞的样本并对于NK细胞应用免疫测定法进行试验以确定细胞上标记物相对主体如KIR受体、其他NKG2受体、或NCR(如NKp30、NKp44、NKp46)来实现。也可应用其他方法来检测这些蛋白的表达，如基于RNA的方法，例如，RT-PCR或RNA印迹法。在患者体内检测到表达NKG2A的NK细胞表明该方法很适用于治疗该患者。
所述治疗可以涉及多轮的抗体。例如，在首轮给药后，可再次检测表达NKG2A的NK 细胞的水平和/或活性，和/或树突细胞或在细胞表面上表达NKG2A或HLA-E，或Qalb的其他细胞，而且果合适，可实施另外一轮的给药。这样，可实施多轮的受体/细胞/配体检测和抗体组合物给予，例如，直到疾病得到控制。
还应当理解，使用本方法可以生产和/或使用多于一种抗体。例如，可以使用针对 NKG2A不同表位、针对NKG2A、CD94或HLA-E的不同组合、针对可能存在于任何个体的这三种蛋白的任何不同同种型的抗体的组合，当适于获得NKG2A刺激抑制或NK细胞活性抑制的理想水平，这可以是总体上或在任何个体病人(例如，在分析病人的表达NKG2A的细胞以确定适当的治疗方案之后)。
只要已知特定治疗方法对于患者障碍本身的情况无害，而且不会显著抵消NKG2A 抗体的疗效，其与本发明的联合就值得考虑。
本发明也可能和经典的方法如外科手术等联合应用。当一种或多种第二治疗剂或方法与本发明疗法联合应用时，不要求组合的效果是每个疗法单独进行时观察的效果的加合。虽然通常期望至少的累加效应，但只要本发明的抗体组合物对抑制或活化NK细胞保持有效，则本发明的方法可以另外包括使用第二治疗剂或其他方法。而且，对联合治疗显示协同效应没有特殊要求，虽然这确实是可能且有益的。基于NKG2A抗体的治疗可以先于或在其他治疗之后，例如，间隔可在几分钟到数周和数月的范围内。也可以考虑利用本发明的抗 NKG2A组合物的多于一次的给药。第二治疗剂或其他方法可能和本发明的NKG2A抗体组合物在交替数日或数周互换给予；或先用抗-NKG2A治疗一个循环，再用其他治疗或方法治疗一轮。无论何种情形，对于包括给予病人第二治疗剂的附加步骤的方法，所有要求就是以发挥治疗的有益效果的联合有效量递送第二治疗剂和本发明的抗体，而不考虑给药的次数。
可以理解，本发明的给予病人抗体和组合物的方法也可以用于治疗动物，或者在动物模型中检测任何本文描述的方法或组合物对于人类疾病的效力。因此，本文使用的术语“患者”指的是任何温血动物，优选哺乳动物，更优选灵长类动物，最优选人类。
本发明的其他方面和优点将在下面的实验部分披露，其应被认为是说明性的并且不限制本申请的范围。
实施例
实施例I :由⑶94/NKG2A+KIR-NK细胞的一个亚群介导的自体iDC的杀伤
在外源性IL-2存在下培养的多克隆NK细胞开始就表现出很强对iDC的溶解活性。因此，在本研究中，从供者体内AM、AC、DB分离出的多克隆NK细胞种群有效地杀伤自体或者同种异体的iDC。然而，在适当的抗-HLA I类mAb存在的情况下，针对自体iDC的溶解活性增强。
这些数据可能是由于发生在DC上的自身I类HLA和NK细胞上的抑制性受体之间存在的抑制性相互作用中断的结果。在这些结果的基础上，我们得出这样的假设在整个 NK细胞池中，只有一部分表现出自发的针对iDC的细胞毒性，而由于它们的受体和I类HLA 分子及之间有效抑制性作用，其他NK细胞没有这种细胞毒性。为了分析这种可能性，对从供者AM、AC、DB中分离的NK细胞克隆体评估其对自体(及同种异体)iDC的溶解活性。同我们的假设一致，只有一部分NK细胞克隆体溶解了自体iDC。其他克隆体只显示很小或者没有细胞毒性。此外，当把自体iDC换成同种异体iDC时，溶解的克隆体的百分比稍有增加 (见下文)。
为了证实某些NK细胞不具有溶解iDC的能力是否反映了其抑制性NKR与I类HLA 分子的相互作用，分析了这些克隆体在抗-HLA I类mAb不存在或存在条件下(即在阻断这种抑制性相互作用的条件下)溶解自体iDC的能力。在这些实验结果的基础上，NK细胞克隆体被分为三种不同的功能种类，并进一步分析了其中HLA
I类特异性受体的表达，包括杀伤Ig-类受体(KIR) 2DL、KIR3DL1和CD94/ NKG2A(即人类主要的MHC I类特异性抑制性受体)。
第一组(A组)的NK细胞的特征在于对iDC的高度自发溶解活性。在抗HLA I类 HiAb存在的情况下，它们的溶解活性的强度不能或者仅仅最低限度地增强。这些克隆体根据抑制性受体的表达(因为它们表达⑶94/NKG2A，但缺少KIR2DL和KIR3DL1 (其与自体HLA I类等位基因反应))是相当一致性的。第二组(B组)NK细胞克隆体也是以能够自发性杀伤iDC为特征。然而，与A类克隆体不同的是，它们的细胞毒性在抗HLA I类mAb存在的情况下有所增加。这意味着，产生的抑制性相互作用抑制而没有消除NK细胞介导的细胞溶解作用。这组细胞同样由⑶94/NKG2A+克隆体和缺少与自体HLA I类等位基因反应的KIR组成。值得注意的是，B组NK克隆体的溶胞活性在抗-⑶94mAb存在的情况下也会增加，因而表明细胞毒性的(部分)抑制的确是由CD94/NKG2A介导的。
属于第三组(C组)的NK克隆体不显示针对自体iDC的细胞毒性。然而，在抗HLA I类mAb存在的情况下，iDC被有效溶解，表明有效的抑制性相互作用的发生。这些NK克隆体对于抑制性受体的表达是更多异源性的。值得注意的是，事实上所有表达对于自体HLA I 类等位基因特异性的KIR2DL或KIR3DL1的NK克隆体都被包括在这个组中此外，这些克隆体的一部分的特征在于表达单个KIR，而其他以不同特异性表达多个KIR。针对iDC的溶胞活性的重建可不仅利用抗-HLA I类mAb而且利用抗-KIR mAb获得(参见下文)。
最后，小部分的C组NK细胞克隆是KIR-⑶94/NKG2A+。它们的细胞毒性可以通过 mAb-介导的CD94的封闭或者通过抗-HLAI类mAb进行重建。这些数据表明(a)不是所有的NK细胞都能够杀伤自体iDC (虽然所有的NK细胞在抗-HLA I类mAb存在的情况下都能溶解iDC) ； (b)显示对iDC的自发细胞溶解活性的克隆体限于特征在于⑶94/NKG2A+KIR表型的NK亚组(A组和B组)；(c)表达KIR2DL或KIR3DL1的克隆体，其对于自体HLAI型等位基因是特异性的，不杀伤自体iDC (C组)。
一些NK克隆体表达自反应性KIR和⑶94/NKG2A。在所有情况下，它们被限于C组并且它们的细胞溶解活性可以通过抗-HLA
I类和抗-KIRmAb进行重建，而抗-⑶94mAb只有很小或没有作用。最后，需要提到的是，发现KIR+NKG2A-克隆体只在其中iDC来源于同种异体(KIR错配)个体的实验中显示对iDC的溶胞活性。在这种情况下，KIR+NKG2A-细胞显示出同种异体反应性，这是由于表达的KIR不能识别在同种DC上的HLA I类等位基因。代表性NK克隆体AM4 (KIR3DL1+) 不能杀伤自体同源iDC(BW4+BW6-)，而其溶解同种异体iDC，KIR错配的(BW4-BW6+) iDC。对自体同源iDC的杀伤可以在抗-HLA I类mAb存在下进行重建，而对同种异体iDC的杀伤不进行显著修饰。
另一个显示KIR区别自体同源和同种异体(KIR错配)iDC的能力的实例是由与 KID2DL1和KID2DL2共表达的克隆体DB3提供的。这种克隆体可以被定义为“不非同种异体反应性的”，因为在KIR表现型的基础上，应该识别所有不同的HLA-C等位基因(包括I组和2组)。事实上，这种克隆体不杀伤自体同源或同种异体iDC，而对这两种靶细胞的溶解可以通过抗-HLA I类mAb有效地进行重建。此外，针溶解的重建可通过针对自体同源(CWl/CW3) iDC的抗-KID2DL2mAb和通过对同种异体(CW2/CW4) iDC的抗_KID2DLlmAb进行重建。 最后，如所期望的，在NKG2A+KIR-克隆体的情况下，在杀伤自体同源或者同种异体iDC的能力上没有实质区别。
实施例2-iDC对NK介导的细胞毒性的敏感性反映了 HLA-E I类分子的下调
前面的研究证明，iDC和mDC在HLA I类表面表达上显示出显著的差异。因此，通过使用对HLA-A、HLA-B, HLA-C和HLA-E分子的单形钛决定子特异性的mAb，已证明正在成熟的DC极大地上调在细胞表面处的HLA I类的表达。此外，HLA I类的上调代表了通过其 mDC变得抗NK细胞介导的溶解的关键机制。
为了直接评价各种HLA I类分子在代表不同DC成熟阶段的细胞上的表达，我们比较地分析了 HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E在单核细胞(来源于相同个体的iDC和mDC)上的表达。与iDC相比，所有的HLA I类分子在mDC中都被高度上调。显著地，与单核细胞(即， iDC的前体)相比，它们在iDC中被显著下调。因此，看起来来自单核细胞的iDC的产生不仅导致新型表面分子(例如，CDla)和功能特性的获得(或者上调)，而且还导致包括CD14 和HLA-A，HLA-B, HLA-C和HLA-E分子的各种分子的表达的损失(或者下调)。这意味着 HLA I类下调的程度被调整为使iDC变得对由特定亚群的NK细胞(⑶94/NKG2A+KIR-)介导的溶解更敏感的水平。
根据这种思路，由于KIR+NK细胞不能杀伤iDC，可以想象，由iDC表达的HLA-B或者HLAC分子的量足以产生KIR交联和抑制性信号的传递。另一方面，HLA-E的下调足以使一部分的KIR-NKG2A+NK细胞杀伤iDC。事实上，可以看到，HLA-E(如通过HLA-E特异性 3D12mAb检测的)在iDC中几乎是无法检测的，而其在mDC上仅被部分再表达。然而，在所有情况下，与来源于相同个体的单核细胞或PBL相比，mDC中的HLA-E表达较低。出人意料的是，虽然HLA-A，HLA-B和HLA-C分子通过mDC表达在水平高于通过PHA胚细胞表达，但 HLA-E的表面表达在mDC中一直低于PHA胚细胞的表达。在上下文中，前面的研究有力证明，自体同源的PHA胚细胞对不依赖效应子NK细胞的KIR/NKG2A表型的NK溶解具有高度的抗性。
实施例3-小部分的NK克降体可以介导杀伤mDC
与前面的报道一致，多克隆NK细胞不能有效地杀伤mDC，我们证明大多数溶解iDC 的NK细胞克隆体不能杀伤mDC。然而，令人感兴趣的是，mDC被一小部分属于A组的NK克隆体(即，显示具有不能通过抗-HLA I类mAb增强的自发性抗iDC细胞溶解活性的那些) 溶解。与iDC相比，自体同源mDC的溶解更少，并且可以在抗-HLA I类mAb存在下被增强。 这意味着，与iDC相比，mDC中的HLAE的更高表达导致通过CD94/NKG2A的更有效信号转导(这也通过抗-⑶94mAb增加它们的溶解的能力)。关于B组NK克隆(即，能够杀伤iDC 并且其溶解性可以通过抗HLA I类mAb增强)，它们不显示对mDC的细胞溶解性；然而，在抗-HLA I类或者抗_CD94mAb存在的情况下，细胞溶解活性可以表现出来。最后，属于C组 (大多数情况为KIR+)的克隆体不能杀伤iDC，也不能杀伤mDC。对mDC的细胞毒性只有在 HLA I类和KIR之间的相互作用的mAb介导的中断后才能检测到。
实施例4-KIR-NKG2A+NK细胞在杀伤DC活件中的不均匀件
如上所述，属于A组和B组的NK细胞克隆体的特征在于同源性KIR-NKG2A+表面显型，而C组包括KIR+NKG2A-或者KIR-NKG2A+两种克隆体，(或者，较少见地，KIR+NKG2A+克隆体)。假定通过KIR的负性信号转导比通过NKG2A的信号转导更有效(或者由于它们的信号转导能力上的本质差别或者由于DC上的特异性HLA I类配体的不同可利用度)， 应当清楚为何KIR-NKG2A+细胞在全部三组NK克隆体中都是可检测的。由于给定NK细胞克隆体的细胞溶解活性是抑制性(KIR，NKG2A)和引发性(NCR，NKG2D)受体之间的平衡的结果，我们分析了这些分子在不同组的NK细胞中的表达水平。尤其是，我们将注意力集中在NKG2A和NKp30的表达(即，触发在诱导NK细胞介导的iDC和mDC溶解中起重要作用的 NCR)。
首先，对属于A、B、C组的NKG2A+KIR-克隆体的NKG2A表面表达水平进行了评估。 与A和B组相比，属于C组的NK克隆体表达非常高水平的NKG2A。而且，与B组克隆体相比， A组克隆体的特征在于NKG2A表达更低。这些数据表明，在NKG2A表达水平和杀伤iDC (和 mDC)能力之间存在负相关关系。iDC中表达的低量HLA-E分子可以被表达高或低水平的 NKG2A的NK细胞有差别地探测到，而mDC (表达更高水平的HLA-E)仅通过特征在于非常低 NKG2A表面密度的NK克隆体对溶解敏感。至于NKp30的表达，在分析的多数NKG2A+克隆体中是可比的。与这些数据一致，在抗-HLA I类mAb存在的情况下(即，在没有抑制性相互作用的情况下)，它们杀伤iDC的能力没有显示显著的差别。
讨论不一致性甚至存在于细胞溶解反应强度的NKG2A+KIR-细胞之中。这似乎与 NKG2A的表面密度负相关。因此，表达低水平NKG2A的NK克隆体(A组)溶解iDC和mDC， 而表达更高水平NKG2A的那些克隆体仅杀伤iDC，或者，在极少数情况下，(NKG2A亮)既不能杀伤iDC也不能杀伤mDC。
显著地，我们也证明了，与单核细胞相比，HLA-E的表面表达在iDC中急剧减少，而在mDC中部分恢复。相反，在iDC中减少的HLA-B和HLA-C的细胞表面水平仍然足以有效地结合 KIR3DL1 或 KIR3DL2。
一个意外发现是对能够杀伤自体同源mDC的属于A组的NK细胞克隆体的小亚组 (5%-10%)的鉴定。这些NK克隆体不表达自体反应性KIR，并且特征在于低水平的NKG2A。 这就使这些NK细胞易于探测到HLA-E对靶细胞的下调(与表达高水平NKG2A的NK细胞相比)。因此，在抗HLA I类mAb存在的情况下，出现的NKG2A低的NK细胞对iDC的细胞溶解活性没有增强。另一方面，在mDC(表达高水平的HLA-E)中，抗HLA I类mAb的添加则会引起细胞溶解活性的增强，表明如果提供足够水平的受体-配体相互作用，则通过A组克隆体表达的NKG2A分子可以抑制细胞溶解。可以想象，在mDC中，某些程度的不均匀性可能在 HLA-E表达中存在，并且可能在NKp30的配体的表达中存在。假定一部分NK细胞具有区分表达不同量的HLA-E的各细胞的能力，可能在mDC中，只有一部分可以表达组赋予对该特定亚组的NK细胞的抗性的HLA-E表面密度。
实施例5-抗NKG2A mAb的Z270增加NK细胞系对未成熟树突细胞的溶解能力
Z270是一种抗NKG2A的小鼠IgGl单克隆抗体。Z270的氨基酸序列在SEQ ID NO 中列出。由于Z270是一种鼠抗体，所以它不与人类Fe受体结合，因此在人类细胞系统或者缺乏带有鼠Fe受体的任何系统用作本发明的活化性抗体。相反，在包括带有鼠Fe受体的系统中，Z270是本发明的抑制性抗体，这是由于其IgGl恒定区结合于这样的Fe受体。
利用标准方法产生表达NKG2A的人类NK细胞克隆体和未成熟树突细胞(类浆细胞树突细胞或髓样树突细胞)。检测所得人类NK细胞克隆体BH3，BH18, BH34对自体未成熟树突细胞的溶解活性。在对CD94的单克隆抗体(IgM)及对NKG2A的单克隆抗体(Z270， IgGl)存在或者不存在的情况下，平行地测试每种细胞对未成熟树突细胞的溶解活性。为了比较，同时在抗HLA I类抗体和对照IgGl (抗-2B4抗体)存在的情况下，测定细胞溶解活性。
如下表I所示，在没有抗体或对照抗体抗_2B4mAb存在的情况下，NK克隆体表现出较少的iDC溶解。然而，在抗-CD94、抗-NKG2AmAb Z270或抗-HLA I类mAb存在的情况下，可能重建自体同源性iDC的杀伤。这个结果证明，干扰NKG2A功能重建了 iDC的NK细胞溶解。它还证明单克隆抗体Z270的NKG2A结合区能够阻断NKG2A的抑制功能。
表I :自体同源iDC的溶解
NK克隆体BH3BH18BH34对照溶解257382318抗 CD94134124552376抗-NKG2A(Z270)98419772108抗-HLA I类139726032498抗-2B4(对照 IgGl)236353292
实施例6-利用抗-NKG2A抗体重建自体同源靶细胞溶解
检测了人类NK主体细胞对在没有抗体或者mAb Z199或mAbZ270存在的情况下表达HLA-E的自体同源PHA胚细胞靶细胞的细胞溶解活性。通过标准4小时51Cr释放测定来评价细胞溶解活性。在微滴定板中以每孔3000个细胞使用所有靶细胞。变化NK细胞的数量以产生在O. 01-100之间的效应子/靶比率(如图I中所示)。
在没有抗体的情况下，NK细胞几乎没有针对表达HLA-E的靶细胞的细胞溶解活性。然而，在抗-NKG2A抗体Z270 (具有mlgGl恒定区)或者Z199 (具有mIgG2b恒定区) 存在情况下，NK克隆体变得不能识别它们的HLA-E配体，并且显示较强的对PHA胚细胞靶的细胞溶解活性。Z270具有鼠IgGl恒定区，而Z199具有鼠IgG2b恒定区。这些抗体都不能与人类Fe受体结合。
类似地，NK主体细胞对HLA-E阳性自体同源PHA胚细胞的杀伤的抑制可以通过利用以下物质有效逆转Z270F(ab’)2片段(图2)、阻断通过KIR2DL1和KIR2DL2，3的信号转导的抗-KIRmAb DF200或pan2D、或者抗体W6/32。而且，在该检测条件(E/T比=1，50μ g/ ml mAb)下，PHA胚细胞不被NK主体细胞杀伤，但是这种抑制可以通过利用Z270mAB或者 Z270Fab片段得到逆转。
实施例7-材料和方法
mAb。将以下mAb (在发明人实验室生产的)用于本研究JT3A(IgG2a，抗-⑶3)， AZ20 和 F252(分别为 IgGl 和 IgM，抗-NKp30)，cl27(IgGl，抗-CD16)，c218(IgGl，抗-CD56)， EB6b(IgGl,抗-KIR2DL1 和 KIR2DS I)，GL183(IgGl,抗-KIR2DL2、KIR2DL3 和 KIR2DS2)， FES172(IgG2a,抗-KIR2DS4)， Z27(IgGl，抗-KIR3DL1)， XA185(IgGl，抗-CD94)， Z199， Z270 (IgG2b，抗-NKG2A)，A6-136 (IgM,抗 HLA I 类)，131 (IgGl，抗-HLA-A 等位基因，包括 A3、A11 和 A24)和E59/53 (IgG2a，抗-HLA-A) [Ciccone 等，(1990) PNAS USA 87 :9794-9797 ； Pende 等，(1998) JImmunol. 28 :2384-2394]。单抗 F4/326 (IgG，抗 HLA-C) [Marsh 等，(1990) Tissue Antigens 36 :180-186]，116-5-28 (IgG2a，抗_HLA_Bw4 等位基因)和 126-39 (IgG3， 抗_HLA_Bw6等位基因)是由Dr K. Gelsthorpe (Sheffield, GB)(第十二届HLA国际研讨会)友好提供的，以及 3D12(IgGl，抗-HLA-E) [Lee 等· (1998) J. Immunol. 160 :4951-4960] 是由 Dr. Daniel Geraghty (Fred Hutchinson 肿瘤研究所，Seattle, WA)提供的。
抗-CDla(IgGl-PE)，抗-CD14 (IgG2a)，抗-CD83 (IgG2b)和抗-CD86 (IgG2b_PE) 从 Immunotech (Marseille,法国)购买的。D1.12(IgG2a,抗 HLA_DR)mAb 是由 Dr R. S. Accolla(Pavia,意大利)提供的。HP2.6(IgG2a,抗 _CD4)mAb 是由 Dr P. Sanchez-Madrid(Madrid,西班牙)提供的。
多克隆或者克隆NK细胞种群的传代。为了获得PBL，在FicolI-Hypaque梯度上和可塑性黏附细胞的衰竭分离了 PBMC。通过用抗-⑶3(JT3A)、抗-⑶4(HP2.6)和抗-HLA-DR(D1. 12)mAb (4 °C，30 分钟)随后用包被了 Dynabeads (Dynal, Oslo,挪威) 的羊抗-鼠(4°C，30分钟)培养PBL，以及免疫磁性测定来分离富集的NK细胞。将 CD3-CD4-HLA-DR-细胞在 100U/ml rIL-2 (Proleukin, Chiron Corp. , Emeryville, CA)和I.5ng/ml PHA(Gibco Ltd,Paisley,GB)存在下在辐射饲养细胞上进行培养，以获得多克隆 NK细胞种群，或者在进行一定稀释后就获得如前所述的NK细胞克隆体。
DC的传代。将来源于健康供体和塑性粘附细胞的PBMC在IL_4和 61 ^ ( 印1'0仏(*，伦敦，GB)存在二者最终浓度分别为20ng/ml和50ng/ml)的情况下进行培养。培养6天后，将细胞通过对应于iDC的⑶14-⑶Ia+⑶83-表型进行表征。为了形成 CD14-CDla+CD83+CD86+mDC,将 iDC 用最终浓度为 I μ g/ml 的 LPS(Sigma-Aldrich, St. Louis, MI)刺激两天。
流式细胞荧光分析和细胞溶解活性。为了进行一种或两种颜色的细胞荧光分析 (FACSCalibur,Becton Dickinson 和 Co. ,Mountain View, CA),用适当的 mAb 接着用 PE-或 FITC-结合的同种型特异性羊抗-鼠第二试剂(Southern Biotechnology Associated, Birmingham)对细胞进行染色。利用4_h[51Cr]释放法来检测多克隆及单克隆NK细胞种群针对自体同源性或者异源性DC的溶解能力。所加的各种mAb的浓度为10 μ g/ml用于掩蔽实验。E T比率在上下文中指出。
实施例8-Z270重链可变区和轻链可变区的嵌合
小鼠杂交瘤细胞系(Z270)的冰冻细胞小球解冻后利用RNeasy Midi试剂盒 (Qiagen cat. No. 75142)处理以分离 71 μ g 的总 RNA。利用 Amersham Biosciences 第一链合成试剂盒(Amersham Biosciences, Cat. No. 27-9261-01)，将大约 5 微克的 Z270RNA 进行反转录以生产Z270cDNA。利用大量不同的IgH引物结合恒定区引物，将免疫球蛋白重链可变区(VH)cDNA通过PCR扩增，以便确定哪一个引物对最适用于PCR。类似地，利用多个IgK 引物结合K恒定区引物将免疫球蛋白K链可变区(VK)进行扩增。
对于每一个重链和轻链可变区的合适引物进行鉴定并分别结合到 pCR2.1 -TOPO vectors 中，用于转导入大肠杆菌TP010细菌中进行扩增和测序 (利用BigDye 终止子V3. OCycle测序反应试剂盒(ABI))。重链可变区(Z270VH)的 DNA序列和相应的氨基酸序列分别在SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中列出。轻链可变区 (Z270VK)的DNA序列和相应的氨基酸序列分别在SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4中列出。
Z270VK的嵌合包括借助于合适的引物和PCR引入Hind III限制性酶切位点、 Z270VK DNA序列的5’末端的Kozak翻译起始位点和K2A/RFT2 κ引导序列以及3’末端的剪接供体位点和Bam HI限制性酶切位点。所得PCR产物被克隆到编码人类κ轻链的恒定区的载体中，以便编码含Z270轻链的可变区的全长嵌合轻链。所得chZ270VK的DNA序列和相应的氨基酸序列分别在SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6中列出。
Z270VH的嵌合包括借助于合适引物和PCR引入Hind III限制性酶切位点、Z270VH DNA序列的5’末端的Kozak翻译起始位点和A003引导序列，以及3’末端的包含天然Apa I限制性酶切位点的YC区。所得PCR产物被克隆入编码人类IgGl重链的恒定区的载体中，以便编码包含Z270重链的可变区的全长嵌合性IgGl重链。所得chZ270VH的DNA序列和相应的氨基酸序列分别在SEQID NO 7和SEQ ID NO 8列出。
所得的包含质粒的重链和轻链同时被电穿孔入表达所得Z270的人类IgGl-κ嵌合构建体的COS 7细胞中。
实施例9-新mAb的牛成
mAb通过使5周龄Balb C小鼠NK克隆体SA260 (⑶94亮)免疫来产生。在不同的细胞融合后，首先选择 mAb Z199 和 Z270 JBMoretta et al.，(1994) J. Exp. Med. 180 545 描述的。利用一种或两种颜色的荧光细胞荧光分析来对活化的NK细胞种群对于CD94分子的分布进行测试分析，如在Moretta等(1994)中描述的。
阳性单克隆抗体进一步对其重建由NK克隆体的细胞溶解的能力进行筛选。通过标准4-h51Cr释放测定来评估NK克隆体的细胞溶解活性其中针对用各种HLA I类基因转染或没有转染的P815小鼠细胞系或ClR人细胞系检测效应子NK细胞。用于这些研究中的其他靶细胞通过用各种HLA类转染或未转染的人HLA-I类-LCL721. 221细胞系表示，如在 Sivori et al. (1996)Eur. J. Immunol. 26 :2487-2492 中描述的。
实施例IO-PBL的纯化和多克降或同源NK细胞系的产牛
PBL通过Ficoll Hypaque梯度和排除可塑性粘附细胞从健康供体获得。为了获得富集的NK细胞，将PBL用抗⑶3、抗⑶4和抗HLA-DR mAb孵育(在4°C，30min)，随后用羊抗鼠磁性小珠(Dynal)孵育(在4°C, 30min),以及通过本领域已知的方法(Pende等，1999) 进行免疫磁性选择。将⑶3_，⑶4_，DR_细胞培养在受辐照的饲养层细胞以及100U/ml白细胞介素 2 (Proleukin, Chiron Corporation)和 I. 5ng/ml 植物凝集素 A (Gibco BRL)以获得多克隆NK细胞种群。NK细胞通过有限稀释进行克隆并且NK细胞的克隆体应用流式细胞计量术对细胞表面受体的表达进行表征。
实例11-对来自猴的全血染色以鉴定结合抗NKG2a mAb的受体的个体表汰
材料
猴血恒河猴和食蟹猴的血购自Centre de Primatologie, ULP, Strasbourg。狒狒猴血购自 Centre de Primatologie, CNRS, Station Rousset0 将猴血收集在包含 EDTA 或枸橼酸钠的“真空离心”管中。收集后的血在24小时内处理并于室温保存。
抗体FITC-CD3、FITC-CD4、FITC-CD14、FITC-CD20和 CyCr_CD45 来自 BD Pharmingen, PC7-CD16获自Beckman Coulter ;所有这些克隆体与猴PBMC发生交叉反应。 PE-GaM(羊 F (ab，)2 片段抗 _ 鼠 IgG (H+L) -PE)和 OptiLyse C 购自 Beckman Coulter。 抗-NKG2a mAb (克隆体 Z270，鼠 IgGl)，以 I μ g/ml 应用。
其他试剂PBS(IX)获自 Gibco Invitrogen ;鼠血清来自 Janvier 的 NMRI 鼠；37% 甲醒来自Sigma。
方法
根据以下方案进行细胞染色
-100μ I 血+10μ I 的 IOX 纯化的 mAb
-室温搅拌孵育30min
-用3ml PBS 清洗(1400RPM，IOmin,室温)
-加入100 μ I 的 PE-GaM 或 PE-GaH，最后为 I : 200，振荡
-室温搅拌孵育30min
-用3ml PBS 清洗(1400RPM，IOmin,室温)
-加入50μI的20%鼠血清，振荡并孵育IOmin
-加入30 μ I 60 μ I 的 FITC-CD3、(-CD4、-CD14、-CD20)、PC7-CD16、CyCr_CD45 混合物或10 μ I的各自相应的同种型对照
-室温搅拌孵育30min
-加入500 μ I OptiLyse' C,振荡并孵育 IOmin
-加入500μ I PBS，振荡并孵育IOmin
-用3ml PBS 清洗(1400RPM, IOmin,室温)
-在300μ I PBS+0. 2%甲醛中重悬细胞。
按照以下步骤实施流式细胞计数
-样本在XL/MCL细胞计数器(BeckmanCoulter)上运行。用EXPO 32vl. 2软件 (Beckman Coulter)实施采集和分析。
-主要对通过其FSC和SSC特征鉴定的淋巴细胞进行分析。
-分析T细胞或NK细胞小室
T细胞=⑶3+淋巴细胞，被定义为在Ly上选通的抗-⑶3染色柱状图的阳性细胞。
NK细胞=⑶3XD56+淋巴细胞，对应于在⑶3/⑶56点图中的⑶3_⑶56+通道(象限的左上部分)。
结果
对NKG2A单克隆抗体Z270与恒河猴、食蟹猴及狒狒的结合进行评估。将食蟹猴主体NK细胞(第16天，300 μ I)与mAb (I μ g/ml)在4°C孵育30min，清洗并用PE-GaM在4°C 标记20min。图I示出了与食蟹猴NK细胞的结合，以及IgGl和抗-⑶16结合，表明Z270结合于食蟹猴NK细胞。将猕猴(恒河猴)NK细胞(来自全血)用mAb孵育，清洗并用PE-GaM 标记。结果(示于表2)表明克隆体Z270与恒河猴NK细胞结合。最后，将狒狒NK细胞(来自全血)用mAb孵育，清洗并用PE-GaM标记。结果(示于表3)表明克隆Z270与狒狒NK 细胞结合。
实施例12 :染色来自猴的全血以鉴定结合抗_NKG2a mAb的受体的个体表汰。
材料
将来源于恒河猴和食蟹猴的猴全血收集在包含EDTA或者枸橼酸钠的试管中。抗体FITC-CD3、FITC-CD4、FITC-CD14、FITC-CD20 和 CyCr_CD45 来源于 BD Pharmingen, PC7-CD 16获自Beckman Coulter ;所有这些克隆体与PBMC交叉反应。PE-GaM(羊F (ab，)2 片段抗-鼠 IgG(H+L)-PE)和 OptiLyse C购买自 Beckman Coulter。其他试剂=PBS(IX) 获自 Gibco Invitrogen ;37% 甲醒来自 Sigma。
方法
根据以下方案进行细胞染色
将100 μ I 的全血(EDTA)+11 μ I mAb 溶液，Ζ270 或 Z 199 (10 μ g/ml)或同种型对照在室温孵育30分钟。
用PBS清洗，加入100 μ I PE-或FITC GaM(最后为1/200)在常温放置30分钟。
·用PBS清洗，力卩入50 μ I的20 %小鼠血清，力卩入60 μ I的含 FITC-抗-CD3、-CD4、-CD14、-CD20 的 CyCr_CD45、PC7-CD16，并在常温放置 30 分钟。
·加入500 μ I的optilyseC，并在常温放置10分钟
·加入500 μ I的PBS，并在常温放置10分钟
·用PBS和O. 2 %甲醛清洗
· ·分析集中在⑶45 *小细胞(⑶45/SSC)然后在和⑶16+CD3TD4TD14XD2(T细胞上。
结果
对NKG2A单克隆抗体Z270和Z299与恒河猴NK细胞和食蟹猴NK细胞的结合进行分析和比较。食蟹猴主体NK细胞(第16天，300 μ I)用mAb (I μ g/ml)在4°C孵育30min， 清洗并用PE-GaM在4°C标记20分钟。表4示出了 Z199和Z270与食蟹猴NK细胞的结合， 以及IgGl和抗-⑶16结合，表明Z199和Z270结合于食蟹猴NK细胞。将猕猴(恒河猴)NK 细胞(来自于全血)用mAb孵育，清洗并用PE-GaM标记，结果(示于表5)表明克隆体Z199 和Z270都与猕猴NK细胞结合。
进一步观察至Ij(Biassoni et al.，(2005) J. Immunol. 174 :5695-5705)，除了 NKG2A 外，Z199还与食蟹猴NKG2C结合，此外，这种mAb在更改杀伤试验中导致P815靶细胞的溶解增强。后者的溶解增强与利用人类NK细胞观察到的结果相反，并且与抑制性受体NKG2A 期望的结果相反。因此，尽管不希望受理论限制，但本发明的发明人提出，Z199在食蟹猴中通过活化性受体NKG2C发挥作用。Z270也结合食蟹猴细胞并在更改杀伤试验中导致P815 靶细胞的溶解增强，表明Z270还识别食蟹猴中的NKG2C。
然而，依据染色的细胞百分比和荧光强度，这两种mAb在相同物种(例如，食蟹猴) 上的结合水平极不相同。这表明，这两种抗体差异地结合于NKG2A表位。
表权利要求
1.一种选自由Fab、Fab’、Fab’ _SH、F(ab’)2、Fv片段、双抗体和单链抗体组成的组的单克隆抗体或其片段，其特征在于 a.与NKG2A特异性结合； b.不与人类FeY受体IIIa特异性结合； c.当结合到人类NK细胞上的NKG2A时，使所述NK细胞在靶人类细胞与所述NK细胞接触时溶解在靶细胞表面上带有HLA-E或Qalb的所述靶人类细胞；并且 d.进一步的特征在于不与NKG2C或NKG2E特异性结合。
2.根据权利要求I所述的单克隆抗体或其片段，进一步的特征在于防止人类NKG2A与HLA-E结合。
3.一种组合物，包括权利要求1-2中任一项所述的单克隆抗体或其片段，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
4.一种药物组合物在制备用于治疗患者的自身免疫性或炎性障碍的药物中的应用，所述药物组合物包括单克隆抗体或其片段，所述单克隆抗体或其片段的特征在于 a.与NKG2A特异性结合； b.不与人类FeY受体IIIa特异性结合；以及 c.当结合到人类NK细胞上的NKG2A时，使所述NK细胞在靶人类细胞与所述NK细胞接触时溶解在靶细胞表面上带有HLA-E或Qalb的所述靶人类细胞。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述单克隆抗体或其片段的进一步特征在于，不与NKG2C或NKG2E特异性结合。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其中，所述单克隆抗体或其片段的进一步特征在于，防止人类NKG2A与HLA-E结合。
全文摘要
本发明涉及一种抗NKG2A的单克隆抗体。本发明提供的单克隆抗体或其片段的特征在于与NKG2A特异性结合；不与人类Fcγ受体IIIa特异性结合；当结合到人类NK细胞上的NKG2A时，使所述NK细胞在靶人类细胞与所述NK细胞接触时溶解在靶细胞表面上带有HLA-E或Qa1b的所述靶人类细胞；进一步的特征在于不与NKG2C或NKG2E特异性结合。本发明还涉及包括单克隆抗体或其片段的药物组合物在制备用于治疗患者的自身免疫性或炎性障碍的药物中的应用。
文档编号A61P37/02GK102977213SQ201210214930
公开日2013年3月20日 申请日期2005年12月27日 优先权日2004年12月28日
发明者阿莱斯山德罗·莫雷塔, 埃马努埃拉·马尔切纳罗, 弗朗索瓦·罗马涅, 帕斯卡莱·安德烈 申请人:依奈特制药公司, 热那亚大学