专利名称：一种卵母细胞生发泡移植技术的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术，特别涉及生物及医学的实验研究方法以及临床应用。
生发泡移植是最近几年才建立起来的一种技术，该技术被广泛应用于建立细胞核和细胞质之间相互作用的细胞模型，以及进一步探讨卵母细胞质与卵母细胞非整倍性之间的联系等的研究，尤其是后者与人类生殖健康息息相关。利用生发泡移植技术可以降低高龄妇女(40岁以上)的生育风险，达到优生优育的目的。生发泡移植主要是指将处于生发泡时期的卵母细胞的生发泡及少量细胞质通过显微操作取出形成的核体(Karyoplast)与去核所得的胞质体(Cytoplast)(此胞质体包括去核的GV期卵母细胞，MII期卵母细胞以及受精卵)进行融合形成重组卵的过程。本发明是将生发泡移植技术进行进一步简化，利用透明带去除术与生发泡移植术的结合，使得先前效率低、成本高、难度大的生发泡移植技术有了新的突破。可使初学者的学习时间从先前的几个月的时间减少到1天。
本发明的目的是利用透明带去除术与生发泡移植技术进行结合，使得生发泡移植技术从先前效率低、成本高、难度大的情况转化为高效、低成本、简易的新型生发泡移植技术。特别是可使初学者的学习时间从先前的几个月的时间减少到1天。
本发明的内容是当前生发泡移植技术的最大缺点就是效率低，成本高，对试验者的技术水平要求极高。我们采用透明带去除术使得卵母细胞在整个过程中更便于操作，减少了操作流程，降低了操作难度，提高了工作效率。将透明带去除术运用于生发泡移植，使得该技术变得高效、成本低廉、对实验者技术背景无特定的要求。从而使生发泡移植技术由原来的需要有专业人士进行操作的高难度技术转变为简单的适用于一般人员的常规技术。
(1)使用0.1-1.0％的链霉蛋白酶或T酸去除卵母细胞的透明带。
(2)将去透明带的卵母细胞在含有5μg/ml-25μg/ml细胞松弛素B和IBMX或dbcAMP的培养液中处理一段时间，对已经产生变形后又恢复的卵母细胞进行显微操作以取出生发泡。
(3)将去除生发泡的胞质体与同体或异体的生发泡在含10μg/ml-100μg/ml的PHA的培养液中进行粘合，接着进行电融合。
(4)选择完全融合的重构卵进行体外成熟培养，12小时后观察极体排出情况。
(5)将已经排出极体的卵母细胞进行第二次显微操作以得到核区，并将此核区与体内成熟的已去除核区的MII期卵母细胞的胞质体进行粘合以及电融合，融合后的重构卵在体外进行激活处理，随后转移至培养液进行发育培养。所得到的各个时期的胚胎可以选择生物体内移植或进行相关的生物学或医学实验研究本发明的优点和积极效果1、本发明由于采用的卵子的透明带均被去除，所以不需要进行专门的透明带开口术，同时卵子也不需要在体外进行2小时的培养以等待卵周隙的形成。而当前通行的生发泡移植技术必需将卵子在体外培养至少2小时以上，只有当卵母细胞出现卵周隙时才能借助县微操作进行透明带的开口。因此，本发明不仅缩短了实验时间而且减少了一步难度较大的显微操作，提高了实验效率。
2、本发明所使用的持卵针为闭口持卵针，这样可使操作人员不需要控制持卵针。当前通行的生发泡移植技术要求操作人员同时控制持卵针和去核针。因此，本发明简化了操作流程，降低了操作难度，提高了操作效率。
3、生发泡移植技术包括两次不同时间的显微操作。因此，本发明整体上降低了操作难度，提高了工作效率。
4、利用去透明带卵母细胞生发泡移植技术，可以使得生发泡移植技术从以前的低效、高成本转化为高效、低成本的新型技术方案。这样就大大地提高了卵母细胞生发泡移植技术的推广，从而为相关的研究，例如卵母细胞成熟的细胞核与细胞质之间相互关系以及高龄妇女卵母细胞成熟过程中所出现的染色体非整倍性的产生以及高龄妇女的人工生育奠定了坚实的基础。
5、利用卵母细胞去透明带生发泡移植技术，还可以为今后的核移植技术提供新的研究思路，即结合去透明带技术的显微操作。
综上所述，去透明带卵母细胞生发泡移植技术作为一个新技术具有简单易学、省时、省力、效果好的特点。
权利要求
1.使用链霉蛋白酶或T酸去除卵母细胞的透明带。
2.如权利要求1所述链酶蛋白酶的浓度为0.1-1.0％。
3.将去除透明带的卵母细胞在细胞松弛素B和IBMX或dbcAMP的操作液中处理一段时间，对已经产生变形后又恢复的卵母细胞进行显微操作。
4.如权利要求3所述细胞松弛素B的浓度为5μg/ml-50μg/ml，IBMX或dbcAMP的浓度是10-100μg/ml。
5.将去除生发泡的胞质体与同体或异体的生发泡在含PHA的培养液中进行粘合。
6.如权利要求5所述PHA的浓度为10μg/ml-100μg/ml。
全文摘要
去透明带卵母细胞生发泡移植技术属于生物工程技术，本发明利用化学试剂将卵母细胞的透明带去除。由于卵母细胞失去透明带，所以带来去除卵母细胞生发泡的显微操作上的一系列简化。该技术不仅达到卵母细胞生发泡移植的目的，同时使得生发泡移植技术从先前效率低、成本高、难度大的情况转化为高效、低成本、简易的新型生发泡移植技术，并且也使生发泡移植技术由原来的需要有专业人士进行操作的高难度技术转变为简单的适用于一般人员的常规技术。
文档编号A61K35/48GK101045915SQ200610070988
公开日2007年10月3日 申请日期2006年3月29日 优先权日2006年3月29日
发明者旭日干, 邵华, 茫烈, 王玲玲 申请人:旭日干, 邵华