专利名称：蓍草中倍半萜内酯a的提纯及其抗肿瘤细胞增殖活性的制作方法
技术领域：
本发明涉及天然药物化学、分子生物学、生物化学和药理学等技术领域。
背景技术：
肿瘤(tumor)是一种常见病、多发病，其中恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的一类疾病。中药应用于恶性肿瘤的防治已有悠久的历史，并且常以复方的形式为主。在目前的肿瘤治疗中，中草药主要以化疗的辅助性药物应用在肿瘤术后的治疗过程中，因其毒副作用小，越来越受到人们的青睐。目前临床上在治疗食道癌、前列腺癌、胃癌和妇科恶性肿瘤等恶性肿瘤的药物，因其在抑制癌细胞增殖的同时，无选择地也抑制骨髓等细胞的增殖，所以目前期待着在抗恶性肿瘤药物的研究中，研究和开发毒副作用低、选择性高的抗恶性肿瘤药物已成为亟待解决的问题。本发明的目的就在于提供对恶性肿瘤细胞增殖具有选择性高、毒副作用低的天然化合物。
本发明为达到上述目的，对许多的化合物进行了研究。结果发现了菊科植物蓍草(Achillea millefolium)中的倍半萜内酯(Sesquiterpene Lactone)化合物Achillinin A，具有抑制肿瘤细胞增殖的活性，从而完成了本发明。
发明的详细描述本发明提供了下述是表示的倍半萜内酯(Sesquiterpene Lactone)化合物Achillinin A。
本发明化合物可按以下步骤制备1)取蓍草的花4.2公斤，用甲醇在室温下浸泡2周，重复提取两次，减压除去甲醇，得到的甲醇提取物溶于饱和的盐水中，用水饱和的正己烷萃取，除去脂溶性成分，水层用水饱和的乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液用无水硫酸钠脱水，回收溶剂，得到149g乙酸乙酯萃取物。
2)将乙酸乙酯萃取物用硅胶干柱层析技术，用乙酸乙酯/甲醇洗脱，再将硅胶柱分成15段，把第3段至第6段进行合并，得到43g倍半萜类化合物的富集物。
3)将此富集物再次进行柱层析分离纯化，用环己烷/乙酸乙酯(3∶1-1∶4)进行梯度洗脱，得到10份的梯度洗脱物。
4)将第3份洗脱物用制备型TLC(20cm×20cm)，以CH2Cl2-CNCH3为展开剂进行展开；展开后刮取在紫外灯下有吸收色带的部分，用丙酮进行洗脱，丙酮洗脱物回收溶剂后再用高效液相进一步纯化处理(乙氰-水25-75梯度系统)，得到7.1mg的倍半萜内酯(Sesquiterpene Lactone)化合物Achillinin A。
通过以下实验说明本发明化合物的活性1)选用的细胞株为人前列腺癌细胞株(MCF7)、人乳腺癌类细胞株(PC3)、人子宫颈癌细胞瘤(HeLa)和神经胶质瘤(T98)。
2)使用的实验方法为MTT实验法。
将各肿瘤细胞株悬液接种于96孔板，每孔90μl(含1×104个细胞)，分别加入加入终浓度为30μM、15μM、7.5μM和3.8μM的Achillinin A各10μl，每组均设3个复孔。置于饱和湿度、37℃和5％CO2培养箱中培养72小时。于培养结束前4小时，各培养孔加入5mg/ml四氮唑盐(MTT)10μl，培养结束后，弃去培养上清，每孔加入15％SDS100μl，过夜。次日用酶联免疫检测仪检测各孔吸光度(OD)值，测定波长λ＝570nm，参考波长λ＝630nm。并计算抑制率。
3)本发明化合物溶解于DMSO，添加后的最终浓度在0.1％以下。以只添加DMSO的培养基作为对照。
本发明化合物的抗人前列腺癌细胞株(MCF7)和人乳腺癌类细胞株(PC3)的细胞增殖活性以相对于对照(添加DMSO)的结果在下表中表示。
权利要求
1.由下述结构式表示此倍半萜内酯(Sesquiterpene Lactone)化合物Achillinin A
2.
权利要求
倍半萜内酯(Sesquiterpene Lactone)化合物Achillinin A具有以下理化特性1)外观白色结晶；2)分子式C15H20O6；3)质谱m/z[M+]296.1260；4)核磁共振波谱数据包括氢谱，碳谱，碳氢远程偶合等简表1表1.1H-and13C-NMR spectral data of Achillinin A in CDCl3(500MHz for1H，125MHz for13C).
3.权利要求1所述化合物的制备方法，其包括以下步骤1)取蓍草的花4.2公斤，用甲醇在室温条件下浸泡2周，该步骤重复提取两次，合并三次浸泡液，减压蒸馏除去甲醇，得到的甲醇提取物并溶于饱和的盐水中，用水饱和的正己烷萃取三次，除去脂溶性成分，水层继续用水饱和的乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯萃取液合并后用无水硫酸钠脱水，过滤，减压蒸馏除回收溶剂，得到149g乙酸乙酯萃取物。2)将乙酸乙酯萃取物用硅胶干柱层析技术进行分离，用乙酸乙酯/甲醇洗脱，再将硅胶柱分成15段，把第3段至第6段进行合并，得到43g倍半萜(Sesquiterpene)比较富集的流分。3)将此倍半萜富集流分再次进行柱层析分离纯化，用环己烷/乙酸乙酯(3∶1-1∶4)进行梯度洗脱，得到10份的梯度洗脱物。4)将第3份梯度洗脱物用制备型TLC(20cm×20cm)，以CH2Cl2-CNCH3为展开剂进行展开；展开后刮取在紫外灯下有吸收色带的部分，并用丙酮进行洗脱，丙酮洗脱物回收溶剂后再用高效液相进一步纯化(乙氰-水25-75梯度系统)，得到7.1mg的倍半萜内酯(Sesquiterpene Lactone)化合物Achillinin A。
4.权利要求1所述化合物的制备方法，其由下述方法组成1)取蓍草的花，用甲醇在室温下浸泡三次，减压蒸馏除去甲醇，得到的甲醇提取物溶于饱和的盐水中，用水饱和的正己烷萃取三次，除去脂溶性成分，水层继续用水饱和的乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液并用无水硫酸钠脱水，减压蒸馏回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取物。2)将乙酸乙酯萃取物用硅胶干柱层析技术进行分离，用乙酸乙酯/甲醇洗脱，得到倍半萜(Sesquiterpene)比较的富集的流分。3)将此倍半萜比较富集流分再次进行柱层析纯化，用环己烷/乙酸乙酯进行梯度洗脱，得到10份的梯度洗脱物。4)将第3份洗脱物用制备TLC(20cm×20cm)，以CH2Cl2-CNCH3为展开剂进行展开；展开后刮取在紫外灯下有吸收色带的部分，并用丙酮进行洗脱，丙酮洗脱物回收溶剂后再用高效液相纯化(乙氰-水25-75梯度系统)，得到倍半萜内酯(Sesquiterpene Lactone)化合物Achillinin A 7.1mg。
5.组合物，其含有治疗有效量的权利要求1所述化合物以及药学上可以接受的载体。
6.权利要求6所要求的组合物，其用于前列腺癌和乳腺癌的治疗。
7.权利要求1所述化合物或权利要求5-6的组合物在制备抑制前列腺癌和乳腺癌增殖的药物中的应用。
8.权利要求1所述化合物或权利要求5-6的组合物在制备特异性地抑制前列腺癌和乳腺癌细胞增殖的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种从菊科植物蓍草(Achillea millefolium)中分离得到的倍半萜内酯(Sesquiterpene Lactone)化合物Achillinin A，本发明还涉及该化合物的制备方法以及发明化合物抑制肿瘤细胞增殖的应用。
文档编号A61P35/00GK101037428SQ200610070868
公开日2007年9月19日 申请日期2006年3月15日 优先权日2006年3月15日
发明者史清文, 董玫, 丛斌 申请人:河北医科大学