专利名称：具有海星卵母细胞周期抑制作用的新的二萜类衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及从西太平洋帕劳(Palau)群岛海域采集的海绵(Phyllospongiadendyi)中分离得到的多个具有海星卵母细胞周期抑制活性的下列新的二萜类化合物。这些化合物在体外试验中可以显著抑制海星卵母细胞的成熟分裂，不仅可用于防治沿海一带因海星大量繁殖对海洋鱼苗养殖业等造成的损害，还可用作体外研究细胞分裂机制的生化试剂。
背景技术及文献海洋是生命之源，亦是地球上物质资源最丰富的领域，海洋生物不同于陆地生物，由于其生存环境的艰难苛刻(高盐、高压、缺氧等)，为求生存及竞争生存空间，很多海洋生物在长期的进化过程中能够代谢产生一些结构独特的次生代谢产物。现代药理研究表明很多海洋生物次生代谢产物亦对人类多种疾病有很好的疗效，从而引起化学家、生物学家、药理学家等的极大兴趣。
世界上海洋药物的研究起始于50年代末60年代初。到了80年代后期，由于科学技术的巨大进步，尤其是高分辨核磁共振技术的广泛应用，使的微量化合物的结构测定工作变得相当容易，海洋生物活性物质的研究变得热门起来。各国学者相继开展了海洋生物抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗心脑血管病、抗艾滋病等活性成分的研究。在过去的几十年间，大约6000多种海洋天然产物被发现，其中有重要生物活性已申请专利的新化合物有300多种[1，2]。细胞周期的异常与很多疾病的发生发展都有着密切的关系，正常情况下哺乳动物体内的大部分细胞处于休止期(G0期)，只有在一定条件下(如生长因子刺激)才进入G1期。分裂后的细胞大都重新进入G0期或是分化形成成熟的不分裂细胞，少数进入G1期进行下一次分裂。细胞有丝分裂的周期性和顺序性说明细胞周期是一个受到严格调控的过程，一旦某个环节出现缺陷，就可能导致细胞增殖失控，进而产生肿瘤。大规模筛选细胞周期抑制剂，一般采用流式细胞术方法(Flow Cytometry，FCM)，但这种方法需要昂贵的仪器，操作复杂。海星卵母细胞因其具有的下列特征，如細胞周期调控机制与真核细胞的细胞周期调控机制相似；且細胞周期自发地同步于第一次减数分裂的前期，即G2/M期；未成熟卵细胞与成熟卵细胞在显微镜下很容易鉴别，作为一种简易方便的细胞周期抑制剂筛选方法已经得到了有效地应用[3，4]。申请者采用该活性筛选方法，从西太平洋帕劳(Palau)群岛海域采集的海绵(Phyllospongia dendyi)中成功地分离得到多个具有海星卵母细胞细胞周期抑制活性的新的二萜类化合物。
参考文献[1]Faulkner DJ，marine pharmacology.Antonie van leeuwenhoek 77135-145[2]Faulkner DJ，marine natural products.Nat Prod Rep 191-48[3]Morinaga，C.，Izumi，K.，Sawada，H.，Sawada，M.T.，Activation of maturation promoting factorand 26S proteasome assembly accelerated by a high concentration of 1-methyladenine instarfish oocytes.，Biosci.Biotechnol.Biochem，2000，64，268-274. Toraya，T.；Maoka，T.；Tsuji，H.；Kobayashi，M.Purification and structural determination of aninhibitor of starfish oocyte maturation from a Bacilus speciese.，Applied and Environ.Micro.，1995，61，1799-1804
发明内容
本发明涉及具有海星卵母细胞周期抑制活性的新的二萜类化合物及其用于防治因海星大量繁殖对海洋鱼苗养殖业等造成的损害的保护作用，以及用作细胞分裂周期抑制剂的应用。
具体实施例方式
实施例1新的二萜类化合物的分离方法本发明所用原料海绵(Strongyphora strongylata)采自日本西表岛，冻存于-20°的冰箱中。应用时取出海绵，在室温下化冻，切碎，用3倍重量无水乙醇提取3次，合并提取液，减压干燥。残留物分散于等体积的水中，用等体积的氯仿萃取2次，合并氯仿层，真空减压干燥，得氯仿提取物。随用反相ODS填料开放柱进行层析分离，甲醇-水梯度洗脱。60％甲醇-水洗脱部分经反相高效液相分离(65％甲醇-水)得到化合物1，2；70％甲醇-水洗脱部分经反相高效液相分离(73％甲醇-水)得到化合物5；80％甲醇-水洗脱部分活性流份再经反相高效液相分离(78％甲醇-水)得到化合物3，4，6。
化合物1和2白色粉末，UV(MeOH)λmaxnm(ε)203(8450)，293(3264)；HRFABMS，m/z430.2706[M]+(calcd for C26H38O5，430.2719)；13C and1H NMR数据见表2。
化合物3和4白色粉末，UV(MeOH)λmaxnm(ε)204(12882)，220(s，4097)，230(s，3074)，296(2085)；HRFABMS，m/z 412.2595[M]+(calcd for C26H36O4，412.2614)；13C and1H NMR数据见表2。
化合物5白色粉末，UV(MeOH)λmaxnm(ε)208(10865)，220(s，6580)，228(s，5752)，250(1592)，257(1558)，263(s，1340)，296(3396)；HRFABMS，m/z 414.2774[M]+(calcd for C26H38O4，414.2770)；13C and1H NMR data见表2。
化合物6白色粉末，白色粉末，UV(MeOH)λmaxnm(ε)206(9257)，220(s，4696)，229(s，4015)，295(2089)；HRFABMS，m/z 398.2792[M]+(calcd for C26H38O3，398.2821)；13C and1HNMR数据见表2。
化合物7白色粉末，UV(MeOH)λmaxnm(ε)207(21645)，229(s，5434)，257(2492)，297(1624)；HRFABMS，m/z 427.2465[M+H]+(calcd for C26H35O5，427.5609)；13C and1H NMR data数据见表2。
实施例2 海星卵母细胞周期抑制活性的测试方法海星卵母细胞在成熟期之前自发同步于第一次减数分裂的前期，即G2/M期，在这个阶段，可以观察到完整的细胞核。但在成熟诱导激素(1-methyladenines)的作用下卵细胞将成熟进入M期，细胞核破裂并进行减数分裂。
雌性海星(Asterina pectinifera)个体采自日本沿岸，于每年4-5月份和8-10月份采集，养殖于人工海水(ASW，10mM EPPS-NaOH(pH8.2)含有0.46M NaCl，10mM KCl，35.9mMMgCl2，1.75mM MgSO4，and 9.18mM CaCl2)中。取雌性海星Asterina pectinifera一个，沿各个触手中心剪开，取出红色的卵巢，放入不含钙离子的人工海水中洗涤2-3次，悬浮于30mL不含钙的人工海水中。将卵巢剪碎，除去浮着的卵泡细胞，三层纱布过滤。然后低速离心，将得到的沉淀悬浮于200ml人工海水中，显微计数，将细胞数调至100个/ml，即得所需的海星未成熟卵母细胞。
实验样品溶于DMSO，浓度为2mg/ml，作为供试液。取1ml的海星未成熟卵母细胞加入24孔板中，同时加入不同浓度的供试液10ul，冰浴上培养10分钟后，加入1.25uM1-methyladenines 100ul，作用50分钟后，在倒置显微镜下观察细胞核的形态，如果与阴性空白对照组相比，细胞核保持完整即示对海星卵细胞成熟过程具有抑制活性。海星卵母细胞成熟抑制率按如下公式计算。
表1化合物1-7对海星卵母细胞成熟的抑制活性
表2化合物1-7的13C-NMR谱数据(pyridine-d5，500MHz)C# 1 2 3 4 5 6 7140.4 40.440.5 40.535.635.039.9222.8 22.922.9 22.719.219.020.1335.3 40.935.1 40.736.442.140.3437.3 37.137.4 37.139.133.243.2551.1 48.751.5 49.157.357.049.7619.8 20.021.0 20.418.918.421.2740.1 40.638.9 39.342.941.931.9839.4 39.736.4 36.637.537.543.5956.9 57.556.9 57.662.462.146.310 37.8 37.637.9 37.742.442.836.711 17.6 17.619.0 18.022.122.519.112 44.7 44.742.1 42.143.043.139.913 73.8 73.876.3 76.376.776.774.014 63.0 63.053.0 53.053.453.499.615 27.6 27.622.9 22.923.123.031.916 131.9 131.9 123.5 123.5 123.5 123.5 130.117 149.9 149.9 146.8 146.8 146.9 146.8 154.018 117.7 117.7 118.0 118.0 118.0 118.0 108.719 114.6 114.6 115.3 115.3 115.3 115.3 114.420 151.3 151.3 152.2 152.2 152.0 152.0 152.621 119.4 119.4 116.9 116.9 116.9 116.8 112.422 24.7 24.721.0 21.020.520.524.923 16.4 16.515.7 15.715.515.617.524 67.9 62.067.9 62.062.261.573.825 24.3 24.124.0 24.228.634.223.526 98.9 99.198.9 99.164.922.0176.1
表3化合物1-6，8的1H-NMR谱数据(pyridine-d5，500MHz)C#1 2 3 4 5 6 71.00，m 1.00，m 1.00，m1.00，m 0.77，m 0.67，m0.86，m12.17，m 2.17，m 2.17，m2.17，m 2.51，m 2.53，m1.95，m1.55，m 1.56，m 1.56，m1.56，m 1.45，m 1.43，m1.15，m22.84，m 2.50，m 2.83，m2.56，m 1.88，m 1.74，m1.50，m1.22，m 1.34，m 1.20，m1.34，m 1.09，m 1.16，m1.30，m32.50，m 1.56，m 2.52，m1.56，m 2.14，m 1.37，m1.74，m5 0.88，m 0.80，m 1.12，m1.04，m 1.13，m 0.90，m1.15，m1.25，m 1.50，m 1.06，m1.72，m1.15，m6 1.73，2H，m 1.44，2H，m1.60，m 2.50，m 1.65，m2.60，m1.50，m0.88，m 0.88，m 0.88，m0.88，m 0.95，m 1.00，m1.25，m72.06，m 2.06，m 1.65，m1.65，m 1.76，m 1.72，m1.58，m9 0.85，m 0.85，m 0.94，m0.94，m 1.10，m 1.03，d(11.0)b 2.05，d(12.5)1.28，m 1.28，m 1.12，m1.55，m 2.03，m 2.05，m1.17，m111.55，m 1.55，m 1.74，m1.72，m 2.16，m 2.20，m1.70，m1.75，m 1.75，m 1.74，m1.74，m 1.76，m 1.74，m1.93，m122.03，m 2.03，m 2.08，m2.08，m 2.14，m 2.12，m2.22，m141.95，m 1.95，m 1.65，m1.65，m 1.74，m 1.72，m2.65，m 2.65，m 3.02，d(15.0)152.60，2H，m2.60，2H，m 2.66，2H，d，(9.0) 2.68，2H，m3.24，m 3.24，m 3.51，d(15.0)187.18，m 7.18，m 6.98，m6.98，m 6.99，d(9.0)6.99，d(9.0) 6.80，d(9.0)197.10，m 7.10，m 7.04，m7.04，m 7.04，dd(3.0，9.0) 7.04，dd(3.0，9.0) 6.94，d(9.0)217.34，m 7.34，m 7.05，m7.05，m 7.09，d(3.0)7.09，d(3.0) 7.12，br.s221.36，3H，s 1.36，3H，s 1.17，3H，s1.16，3H，s 1.25，3H，s 1.25，3H，s1.38，3H，s230.87，3H，s 0.96，3H，s 0.75，3H，s0.86，3H，s 1.15，3H，s 1.17，3H，s0.96，3H，s3.65，d(12.5) 3.40，d(12.5) 3.67，d(11.0) 3.42，d(11.0) 4.09，dd(5.5.12.0) 4.03，dd(5.5，12.0)4.01,d(12.5)244.17，d(12.5) 4.57，d(12.5) 4.20，d(11.0) 4.61，d(11.0) 4.23，dd(5.5，12.0) 4.20，dd (5.5，12.0) 4.76，d (12.5)251.01，3H，s 1.08，3H，s 1.03，3H，s1.11，3H，s 1.25，3H，s 0.87，3H，s1.18，3H，s3.75，d(10.0)265.18，br.s5.06，d(3.3)5.20，br.s 5.08，d(3.3)0.80，3H，s3.99，d(10.0)OH8.02，br.s7.56，d(3.3)8.10，br.s 7.65，d(3.3)
权利要求
1.具有下列结构的新的二萜类化合物。
2.权力要求1所述的新的二萜类化合物在体外试验中证明可以显著抑制海星卵母细胞的成熟分裂，可用于防治因海星大量繁殖对海洋鱼苗养殖业等造成的损害。
3.权力要求1所述的新的二萜类化合物作为细胞分裂周期抑制剂的应用。
全文摘要
本发明涉及具有海星卵母细胞周期抑制活性的新的二萜类衍生物。申请者从日本西表岛海域采集的海绵(Strongylophora strongylata)中分离得到的新的二萜类化合物，在体外可以显著抑制海星卵母细胞的成熟分裂，不仅可用于防治沿海一带因海星大量繁殖对鱼苗养殖业等造成的损害，还可用作体外研究细胞分裂机制的生化试剂。另外，由于海星卵母细胞成熟过程与真核细胞的G2/M期转化在分子作用机理上十分相似，都是依赖于cyclinB/cdc2激酶的活化，故海星卵母细胞周期抑制剂也还可能对肿瘤细胞的生长具有抑制作用。
文档编号C07D493/00GK1562991SQ20041002667
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月31日 优先权日2004年3月31日
发明者姚新生, 刘宏伟, 浪越通夫, 小林久芳 申请人:深圳中药及天然药物研究中心