一种β－葡萄糖苷酶基因启动子及其应用的制作方法

专利名称：一种β－葡萄糖苷酶基因启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种玉米β-葡萄糖苷酶基因启动子及其应用。
背景技术：
植物病害给农作物生产带来严重的影响，人类与植物病害的斗争贯穿于农业生产的始末。兴起于20世纪初期的经典遗传学使人们能够通过杂交育种成功地培育出新抗病作物品种，大幅度地提高粮食产量。近年来，分子生物学理论和技术的不断发展，植物遗传分析和遗传工程技术的不断革新，使人们不但能够从分子水平上进一步研究植物与病原菌的相互作用机制，而且还可以通过基因工程这一现代生物技术直接、快速和高效地培育新抗病作物品种。植物抗病基因工程指的是用基因工程(遗传转化)的手段提高植物的抗病能力，并获得转基因植物的方法。自从1992年克隆到第一个抗病基因(Hm1)(JOHALGS，BRIGGS SP.Reductase activity encoded by the HM1 diseaseresistance gene in maize.Science，1992，258985-987)，人们已经克隆得到了上百个抗病相关基因，这些抗病基因大多数由异源组成型启动子(如CaMV 35S)驱动在植物中组成型表达，这样的表达可以达到抗病的效果。但是由于在一些非必要组织中大量表达外源蛋白，不仅无谓消耗植物体内的能源，增加植物生长负担，影响植物本身的优良性状，而且过多的在作物食用组织中积累抗性蛋白(大多数抗性蛋白是毒性蛋白)增加了转基因生物安全风险，引起更大的转基因生物安全争论。因此，现今植物抗病基因工程迫切需要合适的启动子，使植物抗病基因能在植物特定的发育阶段和部位表达。植物基因工程中常用的启动子按其作用方式及功能可分为三类组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。组织特异性启动子，可以使基因的表达仅限于某些特定的器官或组织部位，并降低对植物的负面影响。在有些时候，如果用组织特异性或诱导型启动子来驱动抗病基因在特定的时候或地方特异性的表达，不仅可以达到抗病的目的，还能减少对植物本身优良性状的冲击并降低转基因安全性风险。
近年来，玉米苗期病害越来越严重，已由过去的次要病害上升为主要病害。一般年份平均发病率约为10％，重病田块往往缺苗30％～50％，形成矮化不育株甚至毁种而减产(晋齐鸣，骈跃斌，宋淑云，李红，沙洪林，张伟.玉米苗期病害诊断与防治技术研究.吉林农业大学学报，2004，26(4)355～359)。玉米苗期病害可初步分为侵染性和非侵染性病害。非侵染性病害主要包括缺素症、环境胁迫和药害等因素引起的病害。使用优良品种，加强田间管理等农业技术措施即可以控制非侵染性病害。侵染性病害主要是受病原菌(致病真菌、细菌、病毒)侵入引起，主要病原菌有禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)、玉米圆斑离蠕孢菌(Helminthosporiumcarbo2num)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、串珠镰孢菌胶孢变种(Flmoniliforme varlsubglutinans)、丝轴团散黑粉菌(Sporisoriumreilianum)和玉米假单胞杆菌(Pseudomonas zeae Hsia et Fang)等。对于侵染性病害，传统上一般采用种衣剂处理来防治，这样要消耗大量的人力物力。转基因技术的出现为人类提供了一个廉价的方法。玉米苗期的侵染性病害大多是从根部侵入。土壤中存在着大量的病原菌，肥料中也存在病原菌，有时种子自身亦带有病原菌，这些病原菌在种子萌发后通过根系侵入植株，如腐霉菌、串珠镰刀菌和丝核菌等。另外有些苗期虫害也是根系虫害，如地老虎。因此应用基因工程技术提高玉米苗期抗病性的重点在于保护根系。
至今分离和研究过的植物组织特异性启动子多达上百种，植物的许多组织中如根、叶、花粉、维管束和种子等都先后分离到了能组织特异性驱动报告基因表达的启动子，但是特异在苗期强烈表达、特别是在根中强烈表达的启动子还未见报道。
ZmGLU1是一种能特异性水解细胞分裂素β-葡萄糖苷复合体并释放活性细胞分裂素的酶。它特异性的分布在细胞分裂旺盛的组织中，特别是在细胞分裂旺盛的苗期含量非常高，因此，该基因的启动子可能在玉米苗期具有很高的活性。

发明内容
(一)要解决的技术问题本发明的目的是提供一种β-葡萄糖苷酶基因启动子。
(二)技术方案本发明所提供的β-葡萄糖苷酶基因启动子，是玉米体内细胞分裂素动态平衡过程中活化糖苷细胞分裂素的β-葡萄糖苷酶ZmGLU1基因的启动子。具有下述核苷酸序列序列表中SEQ ID NO1或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为杂交后用含1×SSC、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
具有序列表中SEQ ID NO1的核苷酸序列的启动子命名为ZmGLU1P，由1907个碱基组成。
本发明还包括含有β-葡萄糖苷酶基因启动子的载体、所述载体转化的宿主细胞(包括动植物细胞系和宿主菌)。
(三)有益效果本发明β-葡萄糖苷酶基因启动子，可启动报告基因gusA基因在除了成熟种子外的其它组织中高效表达。特别是在幼苗的根中活性最高，比CaMV 35S启动子还强，说明它能使目的基因在植物的大部分组织中特别是幼苗的根中高效表达，但在成熟种子中微量表达，既可达到转基因提高植物抗性的目的，又可减少外源蛋白在种子中的积累，从而减少对转基因植物种子品质的影响。该启动子将在植物抗病和转基因玉米种子改良中发挥重要作用。


图1为RT-PCR扩增得到的用于筛库的片段的电泳图谱；图2A为第一轮筛选玉米基因组文库的杂交显影的X光片扫描图；图2B为第二轮筛选玉米基因组文库的杂交显影的X光片扫描图；图2C为第三轮筛选玉米基因组文库的杂交显影的X光片扫描图；图2D为验证第三轮筛选得到的单克隆杂交显影的X光片扫描图；图3A为lambda DNA的酶切电泳图谱；图3B为lambda DNA酶切后的杂交图谱；图4A为ZmGLU1启动子驱动的GUS酶在转基因烟草各个组织中的活性比较以及与CaMV 35S驱动子驱动的GUS酶活性比较图；图4B为ZmGLU1启动子驱动的GUS酶在转基因烟草果实成熟和种子萌发过程中的活性变化图。
具体实施例方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不用来限制本发明所要保护的范围。
实施例中所涉及到的数量词×溶液表示的是多少倍浓度的该溶液，例如“20×SSC”表示20倍浓度的SSC，在使用时需要将其稀释，比如使用时是“2×SSC”表示的是将上述溶液稀释了10倍使用；所述的单位M表示mol/L。
材料的准备1、菌株与质粒大肠杆菌(E.coli)DH5α、农杆菌LBA4404均购自博大公司、λ噬菌体的宿主菌LE392购自Clontech公司。
2、工具酶及生化试剂各种限制性内切酶和pGEM-T Easy载体试剂盒购自Promega公司；普通Taq酶和Trizol RNA小量提取试剂盒购自天根公司；ExTaq酶购自Takara公司；dNTP混合物购自上海生工；T4 DNA连接酶购自Promega公司；萘乙酸(NAA)、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、链霉素(Sm)和噻孢霉素(Cef)购自欣经科公司；同位素α-32P dCTP购自北京亚辉生物公司；尼龙膜购自Amersham公司；4-甲基伞型酮(4-MU)和4-甲基伞型酮酰-β-葡萄糖醛酸酐酶(4-MUG)均购自上海生工。
3、培养基LB液体培养基(1升)10g NaCl，5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，pH7.0LB固体培养基(1升)1升液体LB培养基加15g琼脂YEB液体培养基(1升)1g酵母提取物，10g蛋白胨，0.5gMgSO4·7H2O，5g蔗糖，pH 7.5YEB固体培养基(1升)1升YEB液体培养基加15g琼脂MS基本培养基(1升)MS大量元素，MS微量元素，MS有机物，各组份的基本成分参照Murashige，T&Skoog，F.在1962年发表的MS培养基成分(Murashige，T&Skoog，F. A revised medium for rapidgrowth and bioassays with tobacco tissue culture.Physiol.Plant.1962，15473-497)MS盐溶液只含有MS大量元素和微量元素MS固体培养基1升MS基本培养基中加30g蔗糖，8g琼脂，pH5.6-5.8烟草分化固体培养基1升MS基本培养基中加30g蔗糖，8g琼脂，3mg 6-BA，0.2mg NAA，pH 5.6-5.8烟草诱导生根培养基1升MS基本培养基加30g蔗糖，8g琼脂，pH5.6-5.84.筛选基因组文库所需溶液1)20×SSC175.3gNaCl(3.0M)88.2g 柠檬酸三钠(0.3M)用NaOH调pH至7.0，定容至1升，室温保存备用。
2)20×SSPE175.3gNaCl(3.0M)27.6g 磷酸二氢钠(0.2M)40ml 0.5M EDTA(终浓度0.02M)用NaOH调pH至7.4，定容至1升，室温保存备用。
3)50×Denhardt液5.0g聚蔗糖(Ficoll)5.0g聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone)5.0gBSA(组分V)加水定容至500ml，-20℃保存备用。
4)20％SDS
5)10×lambda稀释缓冲液58.3g NaCl(0.1M)24.65gMgSO4·7H2O(0.1M)350ml 1.0M Tris-HCl(pH7.5)(终浓度0.35M)加水定容至1000ml。
5.PCR引物Probe-F5′-ACCTAGTAGGACCCAACAATGAGAG-3′Probe-R5′-CTCTTATCTAGGAAGCCGCCGTAC-3′P1735-F5′-CCGTCTAGAGGTGGAAATATCTTCTCAAGC-3′P1735-R5′-TCCATGGCCCCCCCTTTGCT-3′GUS-F5′CAGGAAGTGATGGAGCATCAG3′GUS-R5′TCGTGCACCATCAGCACGTTA3′以上引物均由上海生工合成。
实施例1玉米β-葡萄糖苷酶基因ZmGLU1基因5’侧翼序列的克隆一、探针的制备根据GenBank中ZmGLU1基因的cDNA序列(Accession No.X74217)设计一对引物(Probe-F和Probe-R)。用Trizol RNA提取试剂盒提取萌发4天的玉米幼苗总RNA，提取步骤按试剂盒说明书提供的方法操作。以提取的玉米幼苗总RNA为模板，进行反转录。
取1μL Oligo(dT)18加到10μL浓度为200ng/μL的总RNA溶液中，70℃，5分钟后置于冰上冷却5分钟，然后加入以下成分试剂 体积5×反转录缓冲液(试剂盒中提供) 5μLdNTP混合物(每种10mM) 2.5μLRNasin核糖核酸酶抑制剂(浓度为50U/μL) 1μL
AMV反转录(30U/μL)3μLDEPC处理水定容至25μL参照Promega公司AMV Reverse Transcriptase使用说明书设定如下的反应条件25℃ 10min，42℃ 60min，70℃ 10min，冰浴2min。然后以合成的cDNA第一链为模板，以Probe-F和Probe-R为引物进行PCR扩增。
反应体系为试剂 体积10×缓冲液 (试剂盒中提供) 5μLdNTP混合物 (每种10mM) 1μL引物Probe-F(浓度为10μM) 1μL引物Probe-R(浓度为10μM) 1μLEx-Taq (5U/μL)1μL反转录产物 (浓度为10ng/μL)5μL灭菌水 定容至50μL反应条件94℃ 5min；94℃ 1min，53℃ 30s，72℃ 1min(7个循环)；94℃ 1min，59℃ 30s，72℃ 1min(30个循环)；72℃ 7min；4℃ 保存。
将得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，表明扩增得到一条500bp左右的片段，将此片段作为筛选玉米基因组文库的探针。图1中，左边泳道为1kb ladder marker；中间泳道为目的片段；右边泳道为负对照。
二、筛选玉米基因组文库得到ZmGLU1基因5’侧翼序列1、玉米基因组文库玉米基因组文库购自Clontech公司，目录号为FL1032D。
2、文库滴度的测定1)挑取一个宿主菌(LE392)的单斑于10ml LB液体培养基(含10mM MgSO4、0.2％麦芽糖)中，在200rpm、37℃条件下振荡过夜，使OD600达2.0左右。
2)文库噬菌体的稀释a.从购买的玉米基因组文库中取2μLλ噬菌体原种加到1ml 1×lambda稀释缓冲液中(稀释比为1∶500)。
b.从上述稀释缓冲液中取出20μL加到980μL 1×lambda稀释缓冲液中(稀释比为1∶50)。
c.在六支试管加入100μL 1×lambda稀释缓冲液，200μL宿主菌，然后分别加入稀释噬菌体缓冲液(步骤b所得)0μL、5μL、10μL、50μL、100μL和250μL。
3)、将上述六管在37℃水浴20分钟左右。
4)、然后加4ml溶解的0.7％LB顶层培养基(50℃左右)，充分混匀后铺到15％LB固体平板上，快速旋转培养皿使顶层培养基均匀分布于整个平板。
5)、室温静置10分钟，待顶层培养基凝固后，在37℃倒置培养6-7hr.。
6)、统计每个平板上长出的噬菌斑个数，根据下面的公式计算文库的滴度(pfu/ml)
将六个平板测得的滴度求平均值为8.22×108pfu/ml。文库的滴度大于108pfu/ml，所以该文库可以用于筛选。
3、用DNA探针筛选文库1)铺板宿主菌的准备；接种λ噬菌体的宿主菌LE392单菌落于LB液体培养基(MgSO410mM，麦芽糖0.2％)，37℃，200rpm，振荡培养至OD600为2.0，取出备用。
2)λ噬菌体侵染宿主菌及铺板取15ml溶化的顶层培养基加到侵染后的噬菌体和宿主菌的混合物中，充分混匀，迅速均匀地铺在预先准备好的1.5％LB固体平板上。室温静置10分钟，待顶层培养基凝固后，在37℃倒置培养5-8hr.。当噬菌体长到不同噬斑间边缘刚彼此接触时，取出平板放于4℃，以备后面的转膜。
3)噬菌斑原位吸附固定至尼龙膜a.剪取适当大小(比培养皿略小)的尼龙膜。在每张膜上剪三个不对称的缺口，并用铅笔在膜上标号。
b.将与平板编号相同的膜轻轻放到平板培养基上，尽量不产生气泡。
c.用灭菌牙签插在预先在膜上剪好的三个不对称缺口处，作为膜回位标记。2分钟后用无菌镊子小心地揭起尼龙膜，吸附有噬菌体的一面朝上，放于干净滤纸上，室温晾干。
d.将晾干的膜分别在变性液(1.5M NaCl、0.5M NaOH)和中和液(1.5M NaCl、0.5M Tris-HCl pH8.0)中分别放5min。然后转到2×SSC(0.3M NaCl，0.03M柠檬酸三钠)中漂洗一下，把膜放到干净滤纸上，室温晾干。
e.80℃，烘膜2hr.，用保鲜膜包好后放于4℃备用。
4)预杂交按以下成分配制预杂交液

预杂交液配制好后，将保存于4℃的膜取出放入预杂交液中，42℃，40rpm，预杂交4hr.以上。
5)标记探针取4μL浓度为20ng/μL的DNA探针加入26μL水中，在沸水中变性5min，接着冰浴5min，然后依次加入以下成分5×标记缓冲液(试剂盒中提供)10μLdATP、dGTP、dTTP(每种1.5mM)2μLBSA(10mg/ml) 2μLKlenow片段(5U/μL) 1μLα-32P-dCTP(10μCi/μL)5μL加入上述成分后，在37℃标记4hr.左右。其中，5×标记缓冲液的成分如下250mM Tris-HCL(pH8.0)、25mM MgCl2、10mM DTT、1M HEPES(pH6.6)和6碱基随机脱氧核苷酸引物。
6)杂交将标记好的探针在沸水中变性10min，在冰上迅速冷却后加入预杂交液中。在42℃，40rpm条件下杂交16-20小时。
7)洗膜和压X光片以及阳性克隆的挑选杂交结束后，加入洗膜缓冲液1(2×SSC，0.5％SDS)，42℃，40rpm洗1hr.。然后再分别用缓冲液2(1×SSC，0.1％SDS)和缓冲液3(0.2×SSC)，65℃，40rpm各洗1hr.。洗膜结束后，用干净滤纸吸去膜上的大部分液体，然后用保鲜膜将膜包裹后压在X光片之下。根据X光片上影像在膜上标出阳性斑的位置。然后再将膜放入对应编号的培养平板上，缺口和平板上的牙签对齐。根据膜上的标号挑出含阳性斑的培养基放入1.5ml离心管中，加入1ml灭菌1×lambda稀释液，室温放置1-2hr.，使噬菌体从培养基上扩散出来，然后12000rpm离心10分钟，收集上清液，用于下一轮筛选。经过3轮筛选和验证，共得到7个阳性单克隆(图2A-图2D)。
4、λ噬菌体DNA提取1)将7个阳性单克隆分别铺板，每个阳性克隆铺两个200mm平板。当每个平板的表面几乎完全被噬菌斑覆盖时，取出平板并直接加入15ml的lambda稀释缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.4，100mM NaCl，10mM MgSO4)，室温放置1-2hr.，使噬菌体从上层培养基中扩散出来。
2)将lambda稀释缓冲液从培养皿中移入50ml离心管中，4℃，8000rpm离心20min，除去细菌碎片。
3)将上清移入一新的离心管中，加入RNaseA(终浓度为2μg/ml)，DNase(终浓度为1μg/ml)，37℃消化30min。
4)加PEG8000(终浓度为10％)，NaCl(终浓度为1M)于lambda稀释缓冲液中，充分混匀，冰浴1hr.以上。
5)4℃，11000rpm，离心10min。弃上清，收集管壁上噬菌体颗粒。
6)加1ml 1×lambda稀释缓冲液重悬噬菌体，并将重悬后噬菌体分装到1.5ml离心管中(500μL/管)。向每管中加RNaseA至终浓度1μg/ml，DNaseI至终浓度5μg/ml，37℃消化20min。
7)加EDTA至终浓度20mM，终止酶反应；然后加入蛋白酶K至终浓度为100μg/ml，破坏噬菌体外壳蛋白，同时将RNase A和DNase消化掉，加SDS至终浓度0.5％，65℃水浴1小时。
8)等体积苯酚、氯仿抽提两次，氯仿抽提一次。
9)上清加入等体积的异丙醇，沉淀lambda DNA。
10)70％乙醇洗涤沉淀，抽干后溶于适量TE缓冲液，取少量电泳检测，其余-20℃保存备用。
5、Lambda噬菌体DNA酶切分析与亚克隆片段测序取7个阳性克隆中的1个λ噬菌体DNA用多种酶进行单酶切和双酶切分析，它们的组合如下1.Sal I/XbaI，2.Sal I/Kpn I，3.Sal I/HindIII，4.Sal I/BamH I，5.Sal I/EcoRV，6.EcoR I，7.BamH I，8.Sal I，9.HindIII，10.Sal I/Sma I。
单酶切体系10×缓冲液(试剂盒中提供) 5μLLambda DNA30μL限制性内切酶 6μL灭菌水定容至50μL。
双酶切体系10×缓冲液(试剂盒中提供)5μL
Lambda DNA30μL限制性内切酶I 5μL限制性内切酶II5μL灭菌水定容至50μL。
将酶切产物电泳、转膜后用筛选文库的探针进行杂交，具体步骤如下1、电泳及转膜1)将酶解完全的DNA每管加入5μl 10×loading buffer(70％甘油，0.5×TBE，0.2％SDS，20mM EDTA，0.2％溴酚蓝)，混匀。样品于1×TAE(40mM Tris-乙酸，1mM EDTA)电泳缓冲液，0.8％琼脂糖凝胶，在40cm电泳槽中100v电压下使得所有样品从点样孔进入凝胶，然后在30v恒压下，电泳16hr.。
2)将电泳后的凝胶切去多余胶边，并切一小角以表明方向，置于0.25M HCl中轻摇15min。
3)将一磁盘加入0.4M NaOH溶液，架上一块玻璃板，上放4层宽于凝胶的吸水纸，两头浸于液体中，滤纸间不能有气泡。
4)胶用蒸馏水冲洗后，点样孔向下置于滤纸之上，排尽其间气泡，胶块四周放好隔水条。
5)剪长宽比胶块大1mm的尼龙膜(Hybond-N+，Amersham)，置于0.4M NaOH中均匀浸透后铺于胶上，再铺上四张与膜相同大小的滤纸，其间均不能有气泡。
6)加数层纸巾，其上压一块玻璃板及750g重物，吸印20～24小时。
7)吸印完毕后，用铅笔做标记，2×SSC(0.3M NaCl，0.03M柠檬酸，pH7.0)浸泡10分钟。
8)将膜移至滤纸上，超净台吹干。
9)将膜夹于滤纸和两块玻璃之间，于80℃烘箱中烘1～2小时，用保鲜膜包裹，4℃保存备用。
2、杂交转膜完毕之后的杂交方法与筛选玉米基因组文库时所用的杂交方法完全相同，杂交所用的探针也是筛选文库时所用的探针。酶切结果如图3A所示，酶切结果表明所用的几种限制性内切酶对λ噬菌体DNA的酶切都比较完全，不同大小的条带基本都已分开。酶切片段的杂交结果如图3B所示，根据已知的ZmGLU1基因cDNA序列可知在距起始密码子2.1kb处有一SalI切点，要得到5’侧翼序列至少大于2kb，并且尽可能长些，但太长了又不容易做亚克隆，故选取1.Sal I/Xba I双酶切的约4kb阳性条带(箭头所示)回收并亚克隆到pGEM-3Zf(-)的SalI和XbaI酶切位点之中，由联合基因公司完成此4kb序列中的5’端的约2kb的测序，测序结果表明该2kb片段全长为1907bp，其中有1735bp是ZmGLU1基因起始密码ATG上游的5’侧翼序列，另外的172bp序列为ZmGLU1基因序列。将1907bp的序列提交GenBank中进行比对，其中3’端172bp序列与ZmGLU1 cDNA序列同源性为100％，5’端序列未发现任何同源序列。说明所得到的1735bp序列确为ZmGLU1基因的5’侧翼序列，并且是新发现的序列。
实施例2、ZmGLU1启动子的克隆及其真核表达载体的构建及转化烟草一、ZmGLU1启动子的克隆及其真核表达载体的构建1、从ZmGLU1基因5’侧翼序列中扩增ZmGLU1启动子根据测序得到的ZmGLU1基因的5’侧翼序列设计了2条引物P1735-F和P1735-R。以连接在测序载体上的4kb序列为模板，通过PCR扩增方法从ZmGLU1基因5’侧翼序列中扩增出一条1735bp左右的片段。
扩增体系10×缓冲液(试剂盒中提供) 5μLdNTP混合物(每种10mM) 1μLP1735-F(10μM)1μLP1735-R(10μM)1μLTaq酶(5U/μL) 0.5μL模板(浓度为10ng/μL) 0.5μL灭菌水定容至50μL扩增条件为94℃ 5min94℃ 1min，55 ℃ 30s，72℃ 2min(30个循环)72℃ 10min4℃保存。
将用引物P1735-F与P1735-R扩增得到的片段命名为ZmGLU1P(序列1，1735bp)。
将扩增出的ZmGLU1P片段连接到pGEM-T Easy测序载体上。测序结果与所得的1907bpZmGLU1基因的5’侧翼序列比较，一致性为100％，表明扩增没有出现错配。
2、真核表达载体的构建根据引物P1735-F和P1735-R两端设计的酶切位点，用XbaI和NcoI将ZmGLU1P片段从pGEM-T Easy载体切下，把酶切后回收的ZmGLU1P片段与经XbaI和NcoI酶切的pCAMBIA3301载体片段相连。将连接产物转化DH5a菌株中，提取质粒DNA，用XbaI和NcoI酶切鉴定。将构建好的载体命名为p3301-ZmGLU1P。
二、转化烟草大量提取构建的表达载体(p3301-ZmGLU1P)的质粒DNA，取20μL(约1μg)转化农杆菌LBA4404感受态细胞，在28℃、YEB培养基(含卡那霉素Kan 100μg/ml，链霉素Sm 125μg/ml)上培养两天。各挑选两个克隆做菌液PCR鉴定，均扩增出目标条带。
将含有表达载体的农杆菌接种于YEB培养基(含卡那霉素100μg/ml，链霉素125μg/ml)，28℃振荡培养至OD600为0.6-0.8，室温离心10分钟(4000rpm)。沉淀用MS盐溶液(pH7.0)悬浮，并稀释至原体积的30倍。取烟草无菌苗叶片，切去叶片边缘和主脉，将叶片切成约0.4×0.6cm2左右大小，放入制备好的菌液中浸泡5-10min，用无菌滤纸吸干表面菌液，转入表面铺有一层滤纸的MS固体培养基(含3mg/L 6-BA，0.2mg/L NAA，pH 5.8)中，28℃暗培养。三天后，转入MS筛选培养基(含3mg/L 6-BA，0.2mg/L NAA，含卡那霉素100μg/ml，噻孢霉素250μg/ml，pH 5.8)中，28℃光照培养，每日光照12-16小时。每2周继代一次，每次将变黄的叶片或愈伤组织丢掉，大的愈伤组织切割成小块，经2-3次继代后，培养的愈伤组织陆续分化出幼苗。将幼苗转移入罐头瓶装的MS固体培养基(含卡那霉素100μg/ml，链霉素125μg/ml，pH 5.8)中，28℃光照培养，待其根系发育完全后，移栽到温室中。
实施例3、烟草转基因后代的分子检测及ZmGLU1P启动子活性的检测一、烟草转基因后代的分子检测1、烟草总DNA小量提取取烟草幼嫩叶片150mg左右于1.5ml离心管中，研成粉末。加800μL 65℃预热的SDS裂解缓冲液(0.1M Tris-HCl，0.05M EDTA，0.5M NaCl，1％SDS)，振荡混匀。65℃水浴20分钟，加入250μL 5MKAc，冰浴5分钟，4℃、12000rpm离心10分钟。取上清于另一1.5ml离心管中，4℃、12000rpm再离心5分钟。将上清转入另一干净离心管，加 600μL异丙醇，充分混匀，4℃ 12000rpm离心15分钟。最后用70％乙醇清洗沉淀2次，真空干燥后，加80μL灭菌重蒸水溶解DNA。
2、PCR检测根据gusA基因的序列设计一对引物GUS-F和GUS-R，用这对引物检测用SDS法提取的转基因烟草DNA。其中，PCR反应体系组成如下10×缓冲液 2.5μLdNTP混合物(每种10mM) 0.5μLP45F(浓度为10μM)0.5μLP46R(浓度为10μM)0.5μLTaq酶(浓度为5U/μL) 0.5μL转基因烟草总DNA(浓度为20ng/μL) 1μL灭菌水 定容至25μL。
PCR检测结果表明阳性烟草植株与待检测烟草植株的株数比为74％。
二、β-葡萄糖苷酶基因启动子活性的检测将PCR检测结果为阳性的烟草植株，提取其6-8片叶小苗的根、茎、茎基和叶，花的萼片、花瓣、花柄、雌蕊和雄蕊，完全伸张开的成熟叶片，开花后20天的未成熟种子和成熟种子的总蛋白，定量检测gusA基因编码蛋白β-葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase)的活性，分析ZmGLU1P的组织特异性驱动活性。取开花后0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50天的果实和萌发后0，1，2，3，4，5，6，7，9，11，13，15天的种子(幼苗)的总蛋白，定量检测gusA基因编码蛋白β-葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase)的活性，分析ZmGLU1P在果实发育和种子萌发过程中的驱动活性变化。具体步骤如下1、标准曲线的制作用反应终止液(0.2mol/L Na2CO3)将4-MU(4-甲基伞形酮)配制成0.00、6.25、12.50、50.00、100.00、250.00、500.00、1000.00pmol的系列标准浓度，通过测定它们的荧光强度，作出一条标准曲线。
2、总蛋白提取与蛋白浓度的测定1)取0.1g材料于1.5ml离心管中，加入液氮，研成粉末。
2)加600μL酶提取液(0.05M pH7.0磷酸缓冲液，0.1％SDS，0.01MpH8.0 EDTA，20％甲醇，0.1％Triton X-100，0.1％巯基乙醇)，在13000rpm 4℃离心10min，取上清于一新的离心管中，-20℃保存备用。
3)取上清，用考马斯亮蓝G250法测定蛋白的含量。
3、β-葡萄糖苷酸酶的酶促反应及其荧光定量1)取50μL含GUS的上清，加入到450μL 37℃预热的检测液(2mmol/L 4-MUG溶液)中，迅速充分混匀。
2)立刻取出50μL加入到950μL反应终止液(0.2mol/L Na2CO3)，将该管作为酶促反应的0点。
3)分别在10min、20min、30min、45min和60min从反应液中取出50μL，转入950μL的反应终止液中。
4)酶促反应结束后，用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm下，测定不同时间点的荧光值。
5)根据测定的荧光值以及参与反应的总蛋白，求出GUS活性，GUS活性＝单位时间内反应生成的MU/蛋白量(单位nmol4-MU.min-1.mg-1蛋白)。
β-葡萄糖苷酶基因启动子驱动的β-葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase)活性测定及与CaMV 35S启动子驱动的β-葡萄糖苷酸酶活性比较结果如图4所示，表明(1)ZmGLU1基因起始密码子ATG上游1907bp的序列(ZmGLU1P)足以启动报告基因gusA表达。(2)ZmGLU1P驱动的gusA基因在小苗的根中表达活性最强，比35S启动子在相同组织中的驱动活性强大约3倍，在叶、叶柄、茎、雄蕊、花柄、萼片中的活性比35S稍低，但在成熟种子中的表达量却只有35S启动子在成熟种子中的1/30，是它本身在未成熟种子中的1/50，萌发的幼苗的1/300(图4A)。(3)开花后10天内启动子在果实中活性变化不明显，随后随着果实的发育，启动子活性急剧下降，到35天的时候下降到非常低的水平，大概是开花期的五十分之一。而随着种子的萌发，启动子活性又很快升高，萌发11天后的幼苗中活性达到最高，是成熟种子的300倍(图4B)。以上结果充分说明ZmGLU1P启动子是一个在小苗根中和幼苗中表达活性很强，但在成熟种子特异性微量表达的启动子。
序列表<110>中国农业大学<120>一种β-葡萄糖苷酶基因启动子及其应用<130>
<160>1<170>Patent In version 3.3<210>1<211>1907<212>DNA<213>玉米属玉米(Zea mays L.)<400>1atgtatgcct ctgcaatgga agcctcaatt ttgcatttat ttctacattt ctttcgaata 60gtatttagac atctctcgat tggatagcac caacgtccct gcactggccc cccattcgtg120cctcataggg gagatgaaga atcaaatgct gcattggatt gaagaagcca ggtggaaata180tcttctcaag ctcacggcca tgtttagtga tcattttcaa atttcgagta catatgatat240catgacatgt ggataagtgg acaagtttca tgattttcaa attttatcac agctttctcg300aaacattttc aaaattttta ttacagcctg tacatatgat atcatgacac gtggacaagt360ttcatgattt tctgactttg tttgtatttt atataatttt taaacatgta gatggcaagt420tcacggccat gtttagtgag catgttgctc gaagtttctg gtccgctcct gaaatcggtc480gtaacttatg ctaagtaaca tgaatatcat ttttgcatga acggtttttc aagtttcgag540tgacctgcag ttcaaatctg gattttccgg agaaattcaa ataaacgaat taaatctact600aacgattgaa aactctgtta taattgtcca caaatgatac atgtaggttt acatagtgca660ggaatatacc acaaaaagtt tgggagacaa aatctaaaaa ataaaaatat gctttgccga720gtgtccaagg aagacactcg gcaaagagtt ctttgccgag tgccaaccat cggccctcgg780
caaaggctga cgaccgttag ctttaggacg gccgctgacg atcctttgtc gagcgccacc 840gttgtcgagt gtttgacact cggcaaagag atctttgccg agagttctcc tgtgccgagt 900gtcctgcact cggtaaacca gctcgttacc gagagcagga gtttaccgag tggctctcgg 960caaagtcgcc tttgccgagt gcccgacaaa aggcactcgg caaagctgcc gcattcggca1020aagcctgcaa ttccggtagt gttttaccac gttgacaaaa aaaatgaaga aatccgatat1080tttagtcatt atggatatgg cgcggtgtca aatcggtata gtcataatcc tttccatagg1140attgtcccat gctcgacaca ttaacactaa gtttatccct gaataacacg gctacctcca1200tcctaatctt ttctattgat caattgccta tttttaaggc gcagttgttc ttggccgtat1260ctgtggagat gattttttta aagacgtcca actctagcta gctagtccgt gtatgtgaac1320ggtgttaggt agtcattgga tccgttgact atatttgtaa aggtggtagc cgttcttttt1380aattttaacg ccgctgggaa gaaattaaac gtggtacatc tatgtatcgt tttcttaaca1440gtgatataat aatatactat cattgcatgc gtccgcaatt gctctctcgc ggctcgttct1500accgtgggaa gaagagctga cccgtcgccg ccccacatgc atacgatgcg tccttatctg1560tcgcggctcg tgcaaacgcg gggcgggctg agcgccccag cccaccactt gcaccacttg1620catttactta attagttcat aacacatcac atctgtatct tacattatct ttaaaaaaat1680gattcacaca ttatttatat atgagatata ataagtttcc aggaagcatc tttggcgact1740tacgtacgtg tatcagagac atggagtgat aaactattgg gcaaccattt agcaatccta1800gctagccagc tcgtctataa atagatgcat cagctccact tggtctacac acttcacaag1860cagctcaaag ctctagttct agctagctag caaagggggg gaaaatg 190权利要求
1.一种玉米β-葡萄糖苷酶基因启动子，具有下述核苷酸序列序列表中SEQ ID NO1或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO1所示的DNA序列杂交的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶基因启动子的载体。
3.由权利要求2所述载体转化的宿主细胞。
4.权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶基因启动子在植物基因工程中的应用。
5.权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶基因启动子在玉米基因工程中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种β－葡萄糖苷酶基因启动子及其应用。该启动子具有下述核苷酸序列序列表中SEQ ID NO1或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本发明的β－葡萄糖苷酶基因启动子可启动报告基因gusA在植物的幼苗和小苗根系中特异性高效表达，表达水平高于双子叶植物基因工程中常用的CaMV35S启动子。该启动子可用于植物基因工程，特别是用于在植物幼苗和小苗根系中表达特定的目的基因。
文档编号C12N15/82GK101082047SQ20061001206
公开日2007年12月5日 申请日期2006年5月31日 优先权日2006年5月31日
发明者王国英, 頋日良, 赵丽, 张颖 申请人:中国农业大学