专利名称：裸子植物花粉的离体培养方法及其专用培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物花粉的离体培养方法及其专用培养基，特别是涉及一种裸子植物花粉的离体培养方法及其专用培养基。
背景技术：
花粉萌发是花粉吸水后，体积增大，内部膨压增加，使花粉内壁沿萌发孔处向外突出，形成花粉管的过程。启动花粉萌发是一个较复杂的过程，其萌发的基本条件需要有糖源、硼酸及矿质元素(如外源Ca)的参与。目前，已经成功离体培养了多种被子植物的花粉，如百合和烟草花粉的离体培养技术已经相当成熟，而对于裸子植物花粉离体培养的研究较少、技术较落后。
与被子植物花粉相比，裸子植物花粉在进化上具有较原始的特性，花粉萌发时间较长，花粉管生长缓慢(如松属植物花粉管生长速度小于1μm/h)，花粉管内细胞器的区域化不明显，细胞质和细胞器呈典型的布朗运动，花粉管细胞壁纤维素含量比较高，其初生壁在整个生长过程中都比较完整，没有次生壁和胼胝质衬层的形成，且无胼胝质塞存在。因此，裸子植物花粉的生长模式被认为是与被子植物不同的独立的一种模式，有待进一步深入研究。
花粉萌发后形成花粉管，花粉管的极性顶端生长是将雄配子体运输到子房的过程，在高等植物的有性生殖过程中起到重要作用，其生长过程涉及一系列的反应，通常被作为理想的研究细胞极性生长和细胞信号传导的模式体系。而花粉能否正常萌发和花粉管能否正常生长是进行上述各项研究工作的重要前提，但是迄今为止还没有离体培养裸子植物花粉的有效方法和技术，从而导致与裸子植物相关的生物学研究相对于被子植物而言比较滞后。
发明内容
本发明的目的是一种简便、高效的裸子植物花粉的离体培养方法及其专用培养基。
本发明所提供的用于裸子植物花粉离体培养的培养基，其配方为蔗糖120-150g，硼酸0.1-0.2g，氯化钙0.1-0.3g，用水定容至1000mL。
所述用于配制培养基的水优选为双蒸水，蔗糖、硼酸和氯化钙可选用市售商品。
本发明的第二个目的是提供一种裸子植物花粉的离体培养方法。
本发明所提供的裸子植物花粉的离体培养方法，是将裸子植物花粉在室温下水合20-30分钟后，置于上述专用培养基中培养16-72小时，花粉萌发，得到直径均匀、形态正常的花粉管。
为了获得更好的培养效果，所述培养环境是避光的。
所述花粉粒与培养基的质量份数比可为1∶8-10。
所述培养温度可为23-27℃。
所述对白皮松花粉的培养时间优选为70-72小时，其它裸子植物花粉的培养时间优选为16-18小时。
为了加快裸子植物花粉的萌发速率，可将加入花粉的培养液置于转速为100-120rpm的摇床上振荡培养。
培养结束后，可通过离心法收集花粉管；所述离心的转速可为500-1000rpm。
此外，可将收集的花粉管用质量百分浓度为12-15％的蔗糖溶液清洗2-3次，去除杂质。
本发明的方法对所用裸子植物花粉均适用，尤其适用于松杉纲植物的花粉，特别是白皮松、青杄、红松、油松、白杄等松科植物的花粉。
本发明提供了一种裸子植物花粉的离体培养方法及其专用培养基。培养基中的蔗糖是花粉粒萌发及花粉管壁合成的主要营养物质，并用于维持溶液的渗透压；硼酸可增加糖的吸收、运转和代谢，形成糖硼酸复合体，增加氧的吸收，并促进构成花粉管膜的成分果胶物质的合成，从而控制细胞壁的构建，此外，硼酸还可作为Ca2+诱导剂引导胞外Ca2+进入细胞内，形成花粉管顶端生长依赖的Ca2+梯度，三种培养基组分相互影响，协调作用，为花粉的萌发和生长提供必需的环境条件。用本发明的方法进行裸子植物花粉的离体培养，不仅快速、简单易行，而且培养效果好，可获得大量具有生活力的裸子植物花粉管，具有较大的实际应用价值。
下面结果具体实施例对本发明作进一步详细说明。
图1为离体培养的青杄花粉在明场显微镜下的观察结果图2为离体培养的白杄花粉在明场显微镜下的观察结果图3为离体培养的白皮松花粉在明场显微镜下的观察结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述百分比浓度均为质量百分比浓度。
实施例1、青杄和白杄花粉的离体培养一、配制培养基取蔗糖120g，硼酸(H3BO3)0.2g和氯化钙(CaCl2)0.3g，用水定容至1000mL，得到裸子植物花粉的离体培养基。
二、青杄和白杄花粉的离体培养用本发明的方法对青杄和白杄花粉进行离体培养，包括以下步骤1)将成熟的青杄和白杄的花粉粒室温下进行干燥后，-20℃保存备用；2)取步骤1)的花粉粒5mg，在室温下水合30分钟后，置于步骤一制备的5mL培养基中，在25℃、120rpm下振荡培养18小时；3)1000rpm离心，收集沉淀，弃上清，用12％蔗糖溶液和离心的方法清洗沉淀2次，得到青杆和白杄的花粉管。
将收集的青杄和白杄的花粉管转移到载玻片上，用甘油封片后置于明场显微镜下进行镜检，离体培养的青杄和白杄的花粉在明场显微镜下的观察结果分别如图1和图2所示(标尺＝20μm)，经统计，花粉的萌发率高达70％，其中有生活力的花粉管占90％以上，表明用本发明的培养基及培养方法可有效地对青杄和白杄的花粉进行离体培养。
实施例2、白皮松花粉的离体培养一、配制培养基取蔗糖150g，硼酸0.1g和氯化钙0.1g，用水定容至1000mL，得到裸子植物花粉的离体培养基。
二、白皮松花粉的离体培养用本发明的方法对白皮松花粉进行离体培养，包括以下步骤1)将成熟的白皮松花粉粒室温下进行干燥后，-20℃保存备用；2)取步骤1)的花粉粒5mg，在室温下水合20分钟后，置于步骤一制备的4mL培养基中，在27℃、100rpm的避光条件下振荡培养72小时；3)500rpm离心，收集沉淀，弃上清，用15％蔗糖溶液和离心的方法清洗沉淀3次，得到白皮松的花粉管。
将收集的白皮松的花粉管转移到载玻片上，用甘油封片后置于明场显微镜下进行镜检，离体培养的白皮松的花粉在明场显微镜下的观察结果分别如图3所示(标尺＝20μm)，经统计，花粉的萌发率高达90％，其中有生活力的花粉管占90％以上，表明用本发明的培养基及培养方法可有效地对白皮松的花粉进行离体培养。
权利要求
1.用于裸子植物花粉离体培养的培养基，其配方为蔗糖120-150g，硼酸0.1-0.2g，氯化钙0.1-0.3g，用水定容至1000mL。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于所述用于配制培养基的水为双蒸水。
3.一种裸子植物花粉的离体培养方法，是将裸子植物花粉在室温下水合20-30分钟后，置于权利要求1所述的培养基中培养16-72小时，花粉萌发，得到花粉管。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述培养环境是避光的。
5.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述花粉粒与培养基的质量份数比为1∶8-10。
6.根据权利要求3或4或5所述的培养方法，其特征在于所述培养温度为23-27℃。
7.根据权利要求3或4或5所述的培养方法，其特征在于所述白皮松花粉的培养时间为70-72小时，其它裸子植物花粉的培养时间为16-18小时。
8.根据权利要求3或4或5所述的培养方法，其特征在于所述花粉是在振荡条件下培养的，振速为100-120rpm。
9.根据权利要求3或4或5所述的培养方法，其特征在于培养结束后，用离心的方法收集花粉管，再将收集的花粉管用质量百分浓度为12-15％的蔗糖溶液清洗2-3次；所述离心的转速为500-1000rpm。
10.根据权利要求3或4或5所述的培养方法，其特征在于所述裸子植物为松杉纲植物；所述松杉纲植物为松科的白皮松、青杆、红松、油松或白杆。
全文摘要
本发明公开了一种裸子植物花粉的离体培养方法及其专用培养基。该培养基配方为蔗糖120－150g，硼酸0.1－0.2g，氯化钙0.1－0.3g，用水定容至1000ml。培养方法是将裸子植物花粉在室温下水合20－30分钟后，置于所述培养基中培养16－72小时，花粉萌发，得到花粉管。本发明的培养基为花粉的萌发和生长提供必需的环境条件。用本发明的方法进行裸子植物花粉的离体培养，不仅快速、简单易行，而且培养效果好，可获得大量具有生活力的裸子植物花粉管，具有较大的实际应用价值。
文档编号C12N3/00GK1869203SQ20061001208
公开日2006年11月29日 申请日期2006年6月1日 优先权日2006年6月1日
发明者林金星, 田翠婷, 吕洪飞 申请人:中国科学院植物研究所