一种莴苣花粉离体萌发培养基及测定花粉活力的方法
【专利摘要】本发明公开了一种莴苣花粉离体萌发培养基及测定花粉活力的方法，以蒸馏水为溶剂，其包含的组分为ME3，PEG4000和蔗糖。步骤：（1）采集花粉：选取当天开放的花序，移入盛有清水的保鲜袋，带回室内；（2）花粉离体液体培养基的制备；（3）花粉的撒布及培养：将载有液体培养基的载玻片水平放置于实验台上，用镊子摘除头状花絮的花瓣，剥开聚药花蕊取出花药，将花药在培养基表面滑动使花粉单层、均匀地散落分布在培养基表面上，花粉管生长；（4）花粉活力的测定：离体培养后，观察、统计花粉萌发率，花粉萌发率反应有生活力花粉所占比例。不仅快速、简单易行，培养效果好，获得大量具有生活力的萌发花粉，有效测定花粉活力，具有较大的实际应用价值。
【专利说明】一种莴苣花粉离体萌发培养基及测定花粉活力的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于蔬菜植物花粉活力测定【技术领域】，特别涉及一种莴苣花粉离体萌发液体培养基，还涉及利用该液体培养基离体培养莴苣花粉萌发测定花粉活力的方法。
【背景技术】
[0002]莴苣(Lactucasativa L.)属于菊科(Compositae)、莴苣属(Lactuca)—、二年生草本植物，原产于地中海沿岸，喜冷凉气候，不耐高温。莴苣中碳水化合物含量较低，无机盐和维生素含量丰富，尤其较多的烟酸，对于高血压、心脏病患者有利尿、降血压等的作用。因此，莴苣被世界各地广泛栽培，已经成为人们喜爱的主要蔬菜。
[0003]近年来，随着消费者对莴苣需求增加，促使对高品质、优经济性状莴苣材料的需求也迅速增加，然而，单靠现存的莴苣资源已不能满足需求，在此情况下，各地普遍开展了莴苣种质资源基础研究。丰富的种质资源是进行莴苣遗传研究和种质改良的物质基础，具有特艺性状莴苣种质的研究鉴定及其保存是科学开展良种培育的前提。鉴于莴苣花粉作为莴苣遗传资源的主要载体，因此，进行莴苣花粉活力测定的研究，对莴苣种质资源保存与创新、优良品种的选育非常重要的理论和实践意义。
[0004]花粉萌发是花粉吸收营养后，体积增大，内部膨压增加，使花粉内壁沿萌发孔处向外突出，形成花粉管的过程。启动花粉萌发是一个较复杂的过程，其萌发的基本条件需要糖源、硼酸及矿质元素的参与。花粉离体萌发与花粉管生长测定花粉活力测定结果较为稳定，能较准确反映花粉活力的实际情况。但花粉离体萌发需要适宜的培养基，常用的培养基基本成分为糖和硼酸。蔗糖是糖的主要来源，浓度一般为10% - 20% ;硼酸为0.001% -0.005%, pH5.5 — 6.5。近年来研究表明基本培养基中添加Ca2+，Mg2+，K+，PEG等促进花粉萌发的元素可有效促进较难萌发花粉萌发。赵洪波等人为PEG对菊花花粉离体萌发生长具有显著促进作用。目前，已经成功离体培养出多种植物的花粉，如百合、烟草等离体培养技术已经相当成熟，而对于菊科的莴苣花粉离体培养研究较少。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是在于提供了一种莴苣花粉的离体萌发培养基，该培养基为液体培养基，配制简单，花粉萌发所需时间短，30分钟后就可以观察到莴苣花粉萌发想象，2小时后可以清晰观察到花粉的萌发，是一种高效培养莴苣花粉萌发的液体培养基。
[0006]本发明的另一个目的是在于提供了一种液体培养基离体培养莴苣花粉萌发测定花粉活力的方法，方法易行，操作简便，在确定莴苣花粉离体萌发培养体系的基础上，对莴苣花粉离体培养，准确、有效的测定莴苣花粉活力。
[0007]为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施:
[0008]一种莴苣花粉离体萌发液体培养基，以蒸馏水为溶剂，其包含的组分为ME3, 170 -190g.L-1 的 PEG4000 和 90 — IlOg.I71 的蔗糖，pH 为 5.8 — 6.0。
[0009]Monnior 培养基(ME3 培养基)，聚乙二醇(PEG),英文名 polyethylene glycol。[0010]所述ME3 的组分为:硝酸钾(KNO3) 950 — 1050mg.L'氯化铵(NH4Cl) 261.25 —288.75mg ?I/1、四水硝酸钙(CaNO3.4Η20) 1520 — 1680mg.171、磷酸二氢钾(KH2PO4) 80.75 —89.25mg.L' 氯化钾(KCl) 166.25 — 183.75mg.L' 七水硫酸镁(MgSO4.7H20) 475 —525mg.L'碘化钾(ΚΙ) 0.83mg.L'硼酸(H3BO3) IOOmg.L'五水硫酸铜(CuSO4.5H20)0.025mg.L' 二水钥酸钠(Na2MoO4.2H20) 0.25mg.L' 六水氯化钴(CoCl2.6H20)0.025mg 吨' 乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA) 7.45mg.L'七水硫酸亚铁(FeSO4.7Η20) 0.025、盐酸批卩多醇(Vb6) 1.0mg.L—1和盐酸硫胺(Vbi) 1.0mg.I/1。
[0011]一种莴苣花粉离体萌发液体培养基的制备方法，其步骤如下:
[0012]1.根据所述配方配置一系列母液(表I):大量元素(浓缩20倍)、微量元素(浓缩200倍)、铁盐(浓缩200倍)，有机物(浓缩200倍)。在制备这4种母液的时候，按比例准确称取每种成分，并使每种成分分别溶解于蒸馏水，然后再把他们彼此混合，定容到1L，贮存于玻璃瓶中，置冰箱保存备用，其中配制铁盐母液时将FeSO4.7Η20和Na2EDTA分别置于450ml蒸馏水中，78-82°C条件下加热并不断搅拌使之充分溶解，然后将七水硫酸亚铁(FeSO4.7H20)和乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)这2种溶液混合，加蒸馏水到最终容积1L，贮存于棕色玻璃瓶中，置冰箱保存备用。
[0013]2.称取 180g PEG4000 和 IOOg 蔗糖，分别置于 IOOOmL (PEG4000)和 500mL (蔗糖)玻璃烧杯中，分别加入500ml和250ml蒸馏水使PEG和蔗糖充分溶解，将充分溶解后的蔗糖溶液混入PEG4000溶液中，充分混合均匀。按照大量元素、微量元素、铁盐、有机成分分别为50ml、5ml、5ml、5ml的顺序加入PEG和鹿糖混合液,然后用蒸懼水定容至最终体积(1L)，充分混合均匀。
[0014]3.最后用1mol.L-1的NaOH或1mol.L-1的HCl调整pH值至5.8 — 6.0，获得花粉离体液体培养基。
[0015]表IME3培养基母液配制
[0016]
【权利要求】
1.一种莴苣花粉离体萌发液体培养基，以蒸馏水为溶剂，其特征在于:其包含的组分为 ME3,170 — 190g. 1 的 PEG4000 和 90 — IlOg. 1 的蔗糖，pH 为 5.8 — 6.0 ; 所述ME3的组分为:硝酸钾950 — 1050mg. 1、氯化铵261.25 — 288.75mg.L'四水硝酸钙 1520 - 1680mg.L'磷酸二氢钾 80.75 — 89.25mg.L'氯化钾 166.25 —183.75mg.L—1、七水硫酸镁 475 — 525mg.L—1、碘化钾 0.83mg.L'硼酸 IOOmg.L'五水硫酸铜0.025mg.L'二水钥酸钠0.25mg.L—1、六水氯化钴0.025mg.L'乙二胺四乙酸二钠7.45mg.L_\七水硫酸亚铁0.025、盐酸吡卩多酉享1.0mg.L—1和盐酸硫胺1.0mg.L—1 ； 一种莴苣花粉离体萌发液体培养基的制备方法，其步骤如下: A、配置母液:大量元素、微量元素、铁盐，有机物，在制备母液的时候，按比例称取每种成分，使每种成分分别溶解于蒸馏水，然后混合，定容到1L，贮存于玻璃瓶中，置冰箱保存备用，其中配制铁盐母液时将FeSO4.7Η20和Na2EDTA分别置于450ml蒸馏水中，78-82°C条件下加热并搅拌溶解，将FeSO4.7H20和Na2EDTA溶液混合，加蒸馏水到最终容积1L，贮存于棕色玻璃瓶中，置冰箱保存备用； B、称取180gPEG4000和IOOg蔗糖，分别置于IOOOmL:PEG4000和500 mL:蔗糖玻璃烧杯中，分别加入500ml和250ml蒸馏水使PEG和蔗糖溶解，将溶解后的蔗糖溶液混Λ PEG4000溶液中，混合均匀，按照大量元素、微量元素、铁盐、有机成分分别为50ml、5ml、5ml、5ml的顺序加入PEG和鹿糖混合液,然后用蒸懼水定容至最终体积1L,混合均匀； C、最后用Imol.I/1的NaOH或Imol. 1的HCl调整pH值至5.8 — 6.0,获得花粉离体液体培养基。
2.权利要求1所述的一种液体培养基离体培养莴苣花粉萌发测定花粉活力的方法，其步骤如下: (1)采集花粉: 选取发育正常、无病虫害、生长健壮的植株，于莴苣盛花期选取当天开放的花序，连同花枝一起采取，移入盛有清水的保鲜袋，带回实验室内； (2)花粉离体液体培养基的制备: 以蒸馏水为溶剂，所含组分为:硝酸钾950 — 1050mg.L—1、氯化铵261.25 一`288.75mg.L' 四水硝酸钙 1520 — 1680mg.L'磷酸二氢钾 80.75 — 89.25mg.L4、氯化钾 166.25 - 183.75mg.L'七水硫酸镁 475 — 525mg.L'碘化钾 0.83mg.L'硼酸IOOmg.L—1、五水硫酸铜0.025mg.L'二水钥酸钠0.25mg.L'六水氯化钴0.025mg.L'乙二胺四乙酸二钠7.45mg.L—1、七水硫酸亚铁0.025mg.L'盐酸吡卩多醇1.0mg.L—1和盐酸硫胺 1.0mg.L—1、聚乙二醇 4000170 — 190g.L-1、蔗糖 90 — IlOg.L—1，混合均匀，调节 pH值至 5.8 - 6.0 ； (3)花粉的撒布及培养: 将载有液体培养基的载玻片水平放置于实验台上，用镊子摘除头状花絮的花瓣，剥开聚药花蕊取出花药，夹住花药下方花丝，将花药在培养基表面滑动使花粉单层、均匀地散落分布在培养基表面上，在300 - 400Mmol.π 2 ?s—1光强光照条件下、相对空气湿度90%、24 —26°C恒温培养箱中恒温培养，花粉离体萌发培养28 - 32 min后部分花粉开始萌发，花粉萌发后花粉管长度超过花粉粒直径，花粉管开始生长； (4)花粉活力的测定:离体培养l_3h后，以花粉管长度大于花粉粒直径作为花粉萌发的标准，每次观察三个视野，每个视野观察花粉数不少于30粒，统计花粉萌发率，重复三次取平均值为花粉萌发率测定结果，花粉萌 发率反应有生活力花粉所占比例。
【文档编号】C12Q1/02GK103451147SQ201310423290
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】张润花, 周国林, 王斌才, 汪爱华, 黄兴学, 姚芳, 胡侦华, 邓耀华, 林处发 申请人:武汉市蔬菜科学研究所