大叶相思花粉采集、贮藏以及离体培养活力检测技术的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种大叶相思花粉采集、贮藏以及离体培养活力检测技术，包括如下步骤：早晨采集当天开新鲜的大叶相思花序装入硫酸纸袋中，放入25℃～30℃室内阴干；待第二天早晨10点以后花药大量爆裂时收集花粉，用筛子过筛；将收集好的花粉置于小玻璃瓶中，加入干燥变色硅胶，抽真空，蜡封；将封好的花粉置于25℃～-25℃下贮藏；花粉萌发：将贮藏的花粉置于液体培养基中，25℃～35℃下萌发。本发明方法解决了大叶相思花粉的收集、贮藏和萌发等技术难题，可以显著提高大叶相思花粉的萌发率，-20℃下贮藏1年的大叶相思花粉仍然有48%的萌发率，对相思的人工杂交授粉以及种子园人工授粉提高种子产量和质量具有非常重要的意义。
【专利说明】大叶相思花粉采集、贮藏以及离体培养活力检测技术
【技术领域】
[0001]本发明属于植物杂交育种领域，具体涉及一种提高大叶相思花粉萌发率的方法。
【背景技术】
[0002]大叶相思(Jcaciaauriculiformis)系含羞草科(Mimosaceae)金合欢属(AcaciaMill.)的植物。天然分布在南玮5°?17。，原产于澳大利亚昆士兰、巴布亚新几内亚南部和西部、伊里安岛、印度尼西亚基岛。大叶相思生物量大，材质优良，可用作纸浆材、建筑材、家具用材等；具固氮作用，可用于改良土壤、荒山绿化等。然而，金合欢属树种普遍存在着结实率低的现象，大叶相思也不例外，这是制约其种植业进一步发展的关键问题之一。大叶相思结实低，且花期极易受台风、寒害等不良气候影响，造成产量低而不稳，从而限制了大叶相思的发展。花期人工辅助授粉促进座果率，提高种子产量，是较为有效的解决措施。花粉采集、贮藏、活力测定技术，是实现该措施必须的技术环节。因此，开展相思树植物的生殖生物学领域的研宄具有重要意义。
[0003]花粉是种子植物的雄配子体，在有性繁殖中发挥着重要的作用。花粉的萌发、花粉管生长是植物有性生殖的重要环节，包含许多复杂的生理过程。花粉以花粉管为通道输送精子完成受精过程，花粉的萌发和花粉管生长是实现受精作用的关键。
[0004]金合欢属(Acacia)树种普遍存在着结实率低的现象，大叶相思(Acaciaauri culi formi s A.Cunn.ex Benth.)也不例外，这是制约其种植业进一步发展的关键问题之一。大叶相思结实低，且花期极易受雨水、台风等不良气候影响，造成产量低而不稳，从而限制了大叶相思的发展。花期人工辅助授粉促进座果率，提高种子产量，是较为有效的解决措施。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供大叶相思花粉采集、贮藏以及离体培养活力检测技术。
[0006]本发明所采取的技术方案是:
大叶相思花粉采集、贮藏以及离体培养活力检测技术，包括如下步骤:
(1)花粉采集:早晨采集当天开新鲜的大叶相思花序装入硫酸纸袋中，放入25°c?30°C室内阴干，待第二天早晨10点以后花药大量爆裂时收集花粉，用花粉筛过筛；
(2)花粉贮藏:将收集好的花粉置于小玻璃瓶中，加入干燥变色硅胶，抽真空，蜡封，将封好的花粉置于25°C?一 25°C下贮藏；
(3)花粉萌发:将贮藏的花粉置于液体培养基中，25°C?35°C下萌发。
[0007]作为优选的:步骤(1)是在早晨露水未干前采集当天开的新鲜花序。
[0008]作为优选的:步骤(1)将收集的花序置于28°C恒温室中，平铺在硫酸纸上阴干。
[0009]作为优选的:步骤(1)中，花粉用200目的筛子过筛。
[0010]作为优选的:步骤(2)将花粉置于5°C或一 20°C下贮藏。
[0011]步骤(3)所述的液体培养基由蔗糖、硼酸和水配置而成。
[0012]作为优选的:步骤(3)所述的液体培养基的组成为:100?200g/L蔗糖，100?300mg/L硼酸，余量为水。
[0013]进一步优选的:所述液体培养基的组成为:200g/L蔗糖，300 mg/L硼酸，余量为水。
[0014]作为优选的:步骤(3)中，花粉于30°C恒温下萌发。
[0015]本发明的有益效果是:
1、本发明大叶相思花粉采集方法，在恒温室阴干时控制时间掌握，观察到花药完全爆裂时再进行刷粉过筛，解决了大叶相思花粉细小不易收集这一难题。
[0016]2、本发明大叶相思花粉贮藏方法，分别放置在不同的环境中贮藏，通过花粉活力检测，检测出随着贮藏时间不断增长，在_20°C的环境下贮藏的花粉活力最强，解决了大叶相思花粉贮藏这一难题。
[0017]3、本方法采用的液体培养基中含有20%蔗糖、300ppm的硼酸配制而成，液体稳定可靠，特别适合大叶相思花粉离休培养。
[0018]4、在载玻片凹槽上滴1-2滴液体培养基，将收集好的大叶相思花粉掸置液体培养基上，花粉可以与氧气直接接触，且花粉分布均匀，从而大叶相思树花粉能够正常萌发。这一操作要点解决了相思树花粉离体培养发芽关键技术。
[0019]5、本方法对大叶相思树花粉采集、贮藏、离休培养和活力检测，方法简单、迅速且可操作性强等特点，数据科学可靠，并可完全定量，对于提高大叶相思树育种效率具有较高的实际应用价值，可有效解决现有相思树种子园自然结荚率低的问题，提高种子园的产量和质量，使种子园能够有效地发挥其应有的功能，极大地发挥相思树树种的经济效益、社会效益和生态效益。
[0020]
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1:用于花粉收集的大叶相思花序；
图2:收集的大叶相思花粉；
图3:收集当天的大叶相思花粉培养24小时检测结果；
图4:-20°C贮藏1月的大叶相思花粉培养24小时检测结果；
图5:-20°C贮藏1年的大叶相思花粉培养24小时检测结果。
【具体实施方式】
[0022]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0023]实施例1
在8月上旬大叶相思树花开时节，于8点前采集新鲜的花序置于硫酸纸袋中，在28°C恒温室中平铺阴干，待观察到花药完全爆裂后，第二天上午10点之后刷粉过筛备用，在载玻片的凹槽上滴加适宜的液体培养基(200g/L蔗糖+300 mg/L硼酸)1-2滴，将收集好的花粉分别掸在液体培养基上，将载玻片放入培养皿中培养，培养皿中放入两张湿润滤纸，保持培养温度30°C。培养3，6，9，12，24后，用光学显微镜观察花粉的萌发数，花粉管长度以及花粉管条数。当天收集的大叶相思花粉，在培养24小时后可观察到花粉萌发率为94%，花粉管长度最长可达到花粉直径的6倍，一粒花粉最多可以萌发出6条花粉管。收集的大叶相思的花粉纯净度很高，几乎没有其他杂质。图1为用于花粉收集的大叶相思花序。图2为光学显微镜下的收集的大叶相思的花粉。图3为收集当天的大叶相思花粉离体培养活力检测结果Ο
[0024]实施例2
大叶相思花粉离体萌发过程中，在载玻片的凹槽上滴加适宜的液体培养基(200g/L蔗糖+300 mg/L硼酸)1-2滴，将收集好以及在室温中、5°C、_20°C环境中贮藏了 1月的花粉反别掸在液体培养基上，将载玻片放入培养皿中培养，培养皿中放入两张湿润滤纸，保持培养温度30°C。培养3，6，9，12，24后，用光学显微镜观察花粉的萌发数，花粉管长度以及花粉管条数。保存1月的大叶相思花粉，在室温下贮藏、5°C贮藏、_20°C贮藏之后培养24小时后的花粉萌发率依次为28%、42%、63%，花粉管长度最长可达到花粉直径的3倍，一粒花粉最多可以萌发出3条花粉管。图4为-20°C贮藏1月的大叶相思花粉离体培养活力检测结果。
[0025]实施例3
大叶相思花粉离体萌发过程中，在载玻片的凹槽上滴加适宜的液体培养基(200g/L蔗糖+300 mg/L硼酸)1-2滴，将收集好以及在室温中、5°C、_20°C环境中贮藏了 1周、1月、1年的花粉反别掸在液体培养基上，将载玻片放入培养皿中培养，培养皿中放入两张湿润滤纸，保持培养温度30°C。培养3，6，9，12，24后，用光学显微镜观察花粉的萌发数，花粉管长度以及花粉管条数。保存1年的大叶相思花粉，在室温下贮藏、5°C贮藏、_20°C贮藏之后培养24小时后的花粉萌发率依次为13%、28%、48%，花粉管长度最长可达到花粉直径的2倍，一粒花粉最多可以萌发出2条花粉管。图5为-20°C贮藏1年的大叶相思花粉离体培养活力检测结果。
【权利要求】
1.大叶相思花粉采集、贮藏以及离体培养活力检测技术，包括如下步骤: (1)花粉采集:早晨采集当天开新鲜的大叶相思花序装入硫酸纸袋中，放入25°c?30°C室内阴干，待第二天早晨10点以后花药大量爆裂时收集花粉，用筛子过筛； (2)花粉贮藏:将收集好的花粉置于小玻璃瓶中，加入干燥变色硅胶，抽真空，蜡封，将封好的花粉置于25°C?一 25°C下贮藏； (3)花粉萌发:将贮藏的花粉置于液体培养基中，25°C?35°C下萌发。
2.根据权利要求1所述的大叶相思花粉采集、贮藏以及离体培养活力检测技术，其特征在于:步骤(I)是在早晨露水未干前采集当天开的新鲜花序。
3.根据权利要求1所述的大叶相思花粉采集、贮藏以及离体培养活力检测技术，其特征在于:步骤(I)将收集的花序置于28°C恒温室中，平铺在硫酸纸上阴干。
4.根据权利要求1所述的大叶相思花粉采集、贮藏以及离体培养活力检测技术，其特征在于:步骤(I)中，花粉用200目的筛子过筛。
5.根据权利要求1所述的大叶相思花粉采集、贮藏以及离体培养活力检测技术，其特征在于:步骤(2)将花粉置于5°C或一 20°C下贮藏。
6.根据权利要求1所述的大叶相思花粉采集、贮藏以及离体培养活力检测技术，其特征在于:步骤(3)所述的液体培养基由蔗糖、硼酸和水配置而成。
7.根据权利要求6所述的大叶相思花粉采集、贮藏以及离体培养活力检测技术，其特征在于:步骤(3)所述的液体培养基的组成为:100?200g/L蔗糖，100?300 mg/L硼酸，余量为水。
8.根据权利要求7所述的大叶相思花粉采集、贮藏以及离体培养活力检测技术，其特征在于:所述液体培养基的组成为:200g/L蔗糖，300 mg/L硼酸，余量为水。
9.根据权利要求1所述的大叶相思花粉采集、贮藏以及离体培养活力检测技术，其特征在于:步骤(3)中，花粉于30°C恒温下萌发。
【文档编号】C12Q1/02GK104498426SQ201410778864
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月15日 优先权日:2014年12月15日
【发明者】詹妮, 黄烈健 申请人:中国林业科学研究院热带林业研究所