白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法
【专利摘要】本发明特别涉及白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法及其白菜型油菜花粉离体萌发培养液。一种白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其主要特点在于包括以下步骤：1）花粉采集：2）花粉离体萌发及花粉管生长；3）花粉活力的测定。本发明的优点是使用本发明提供的白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基，以BK为溶剂，包含组分有50 g·L-1 聚乙二醇6000、150 g·L-1 蔗糖、2mg·L-1赤霉素、10mg·L-1维生素B1，pH为6.5，35℃光照条件下培养，白菜型油菜花粉萌发率可达到75.3%，花粉管也能得到较好生长；由于添加了PEG，白菜型油菜花粉管生长较直，便于观察测量。
【专利说明】白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物花粉活力测定【技术领域】，特别涉及一种白菜型油菜花粉的离体萌 发液体培养基，以及利用该白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基测定白菜型油菜花粉活力 的方法。
【背景技术】
[0002] 白菜型油菜（Brassica rapa L.)为芸薹属作物二倍体基本种之一，早熟、耐寒而 且类型丰富，是我国栽培油菜的三大类型之一。白菜型油菜植株一般比较矮小，主根较发达 或不发达，侧根中等或发达。叶基部全抱茎。花淡黄至深黄，花瓣圆形、较大，开花时花瓣侧 迭或呈覆瓦状；花序中间花蕾低于开放的花朵；花药外向开裂。油菜花艳美蛟丽，能美化环 境，有较高的观赏价值，并含有丰富的花蜜，是发展养蜂业的良好蜜源。
[0003] 油菜是经济价值极高的作物，用油菜籽榨出的菜籽油，含有丰富的脂肪酸和多种 维生素，营养丰富，易于消化，是较理想的食用植物油。随着近代育种技术的提高，菜籽油的 油质随之得到提高，低毒低芥酸的新品种，逐渐被推广开来，用途也越来越广泛。冶金、机 械、橡胶、化工、油漆、制皂、医药等工业，都把菜籽油作为原料。油渣俗称菜子饼，富含蛋白 质、粗脂肪、氨基酸和矿物质元素，是上等有机肥料。菜子饼经过脱毒处理，还是极好的牲畜 精伺料。油采的采杆、枝叶、果壳等，含3%以上的粗蛋白质、0. 5%左右的粗脂肪以及少量糖 类物质，埋于土中，转化为有机质，可肥田养地，被农民称做"嫩茬"，也可粉碎成饲料，用来 发展养畜业。另外，油菜花粉，颗大质优，是上等营养品，被人称做"长寿者的最佳食品"
[0004] 鉴于白菜型油菜花粉作为白菜型油菜遗传资源的主要载体，因此，进行白菜型油 菜花粉活力测定的研宄，对白菜型油菜种质资源保存与创新、优良品种的选育具有非常重 要的理论和实践意义。目前，花粉活力测定的方法主要有显微镜形态观察法、无机酸检测 法、染色法、田间授粉检测法、离体萌发法等。
[0005] 形态观察法是依据不育花粉在生长过程中由于受到某些因素的影响，发育不完全 或不良的花粉粒形态常常呈畸形，而正常花粉有规则的外形。白菜型油菜正常花粉为椭圆 形，而不育花粉呈不规则形，根据形态可以鉴别花粉生活力。然而，贮藏一段时间的白菜型 油菜成熟花粉，贮藏过程中花粉活力会逐渐下降，由于白菜型油菜正常花粉在贮藏过程中 活力可能丧失，但形态并不发生明显变化；从而使得花粉粒形态观察法就不能鉴别贮藏后 正常花粉活力变化情况。
[0006] 无机酸法是靠经过无机酸处理后，花粉会出现萌发孔有膨胀外突起的现象来判断 花粉是否有活力，但花粉吸水后也会出现此现象，采用无机酸不能判断花粉是否真正具有 活力。
[0007] 染色法是通过使用染色试剂对花粉粒进行染色，依据颜色变化判断花粉活力的高 低，常用的染色试剂有I2-KI溶液、醋酸洋红和氯化三苯基四氮唑（TTC)等。而染色法测定 花粉活力实验重复性较差，会造成很大的实验误差，也不能准确测定花粉的实际活力高低。
[0008] 田间授粉法是根据果实和种子的形成情况来判断花粉生活力，虽然与实际生产最 为接近，反映最终的结实率，但其时间周期长，工作量大，并且易受到天气条件、时间地点的 影响，不利于生产，实际应用中采用较少。
[0009] 花粉离体萌发与花粉管生长测定结果较为稳定，更能反应花粉活力的实际状况。 但花粉离体萌发需要适宜的培养基，常用的培养基基本成分是糖和硼，蔗糖浓度一般为 10%?20%，硼酸为 0· 001%?0· 005%，pH 5. 5 ?6. 5。
[0010] 不同植物花粉萌发需要的培养基种类和浓度不同，二核型花粉较易萌发，在一般 基本培养基上培养即可，而三核型花粉较难萌发，要在基本培养基的基础上添加其它促进 花粉萌发的元素，如Ca2+，Mg2+，K+，PEG等成分。近年来，人们对十字花科植物花粉离体萌发 和花粉管生长进行了较多研宄，宋红霞等（PEG对胡萝卜花粉离体萌发的影响，2011 (06): 22-24.长江蔬菜；胡萝卜花粉离体萌发研宄，2010, 38 (4) :25-27,山西农业科学）认为 PEG6000对胡萝卜花粉离体萌发生长具有显著促进作用，且硼酸、Ca2+对胡萝卜花粉萌发有 促进作用；曹毅等报道了（甘蓝型油菜花粉离体培养，2010, 30 (2) :0399-0404,西北植物学 报）甘蓝型油菜花粉离体萌发的适宜培养基，赵艳玲等（萝卜离体花粉萌发与花粉管生长 影响因子研宄，2007年第一期，江苏农业科学）研宄了萝卜离体花粉萌发与花粉管生长的 影响因子。然而，关于白菜型油菜花粉离体萌发与花粉管生长的研宄国内外尚未见报道。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的在于，为避免现有技术的不足，提供一种白菜型油菜花粉的离体萌 发培养测定花粉活力的方法。在确定白菜型油菜花粉离体萌发培养体系的基础上，对白菜 型油菜花粉离体培养，可靠、有效的测定白菜型油菜花粉活力。
[0012] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种白菜型油菜花粉的离体萌发培 养测定花粉活力的方法，其主要特点在于包括以下步骤：
[0013] 1)花粉采集：
[0014] 选取发育正常、无病虫危害的健壮白菜型油菜植株，于白菜型油菜盛花期选取已 开花的花序，收集花粉；
[0015] 2)花粉离体萌发及花粉管生长：
[0016] 将花粉均匀撒在白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基上，30°C?40°C恒温培养； pH 为 6. 0 ?7. 0 ;
[0017] 花粉离体萌发培养15min?25min后部分花粉开始萌发，花粉萌发后花粉管长度 超过花粉粒直径，花粉管开始快速生长；
[0018] 3)花粉活力的测定：
[0019] 离体培养45min?Ih后，以花粉管长度大于花粉粒直径为花粉萌发标准，每处理 重复3次，每重复随机观察3?5个视野，每视野观察花粉数30?80粒，统计花粉萌发率， 花粉萌发率反应有生活力花粉所占比例。
[0020] 所述的白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其特征在于步骤还 包括有：
[0021] 4)用LeicaDM6000B全自动正置显微镜系统自带测微尺测量花粉管长度，每视野 随机测量10?15个花粉，每处理共测30?40个花粉管长度，计算其平均值，花粉离体萌 发花粉管生长情况反应花粉粒生理状况的优劣。
[0022] 所述的白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，所述的白菜型油 菜花粉离体萌发液体培养基，以BK为溶剂，其包含的组分有50g · Γ1?IOOg · LH的PEG 6000 (聚乙二醇 6000)、130g · I71 ?150g · L η的鹿糖、I. 5mg · L η?2. 5mg · L η的赤霉素 和 8. 5m g · L 1?IOmg · L 1的维生素 BI，pH 为 6. 0 ?7. 0。
[0023] 所述的白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，所述的BK的组成 为！H3BO 3(硼酸）IOOmg · L-1、Ca(NO3)2 · 4H20(硝酸钙）300mg · L-1、MgSO4 · 7H20(结晶硫酸 镁）200mg · Γ1和KNO 3 (硝酸钾）IOOmg · L'以蒸馏水为溶剂。
[0024] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0025] 1、白菜型油菜花粉在本发明提供的白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基上，35°C 光照条件下培养，白菜型油菜花粉萌发率可达到75. 3%，花粉管也能得到较好生长；由于 添加了 PEG，白菜型油菜花粉管生长较直，便于观察测量。
[0026] 2、利用白菜型油菜花粉离体萌发与花粉管生长测定技术测定花粉活力测定结果 稳定可靠，花粉萌发率反应有生活力花粉所占比例，花粉管生长的观察与测量反应花粉粒 生理状况的优劣，白菜型油菜花粉离体萌发与花粉管生长测定技术为白菜型油菜花粉活力 的测定提供了一种可靠、有效的方法.
【专利附图】
【附图说明】：
[0027] 图1.白菜型油菜花粉离体萌发生长随培养时间的变化情况
[0028] 图2.为pH6. 5时，白菜型油菜花粉在BK+150g · L-1的蔗糖+50g · L ―1的 PEG6000+2mg吨―1的赤霉素 +IOm g，L ―1的维生素 BI (35°C恒温）培养基上萌发40min后采 集的照片示意图。
[0029] 图3.为pH6. 5时，白菜型油菜花粉在BK+150g · L-1的蔗糖+50g · L ―1的 PEG6000+2mg吨―1的赤霉素 +IOm g，L ―1的维生素 BI (35°C恒温）培养基上萌发50min后采 集的照片示意图。
[0030] 图4.为pH6. 5时，白菜型油菜花粉在BK+150g · L-1的蔗糖+50g · L ―1的 PEG6000+2mg · L-1的赤霉素 +IOm g · L ―1的维生素 BI (35°C恒温）培养基上萌发Ih后采集 的照片示意图。
【具体实施方式】
[0031] 以下结合附图所示之最佳实例作进一步详述：
[0032] 实施例1 :见图1，一种白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其 主要特点在于包括以下步骤：
[0033] 1)花粉采集：
[0034] 选取发育正常、无病虫危害的健壮白菜型油菜植株，于白菜型油菜盛花期选取已 开花的花序，收集花粉；
[0035] 2)花粉离体萌发及花粉管生长：
[0036] 将花粉均匀撒在白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基上，30°C恒温培养；pH为 6. 0 ；
[0037] 花粉离体萌发培养15min后部分花粉开始萌发，花粉萌发后花粉管长度超过花粉 粒直径，花粉管开始快速生长；
[0038] 3)花粉活力的测定：
[0039] 离体培养45min后，以花粉管长度大于花粉粒直径为花粉萌发标准，每处理重复3 次，每重复随机观察3个视野，每视野观察花粉数不少于30粒，统计花粉萌发率，花粉萌发 率反应有生活力花粉所占比例。
[0040] 4)用LeicaDM6000B全自动正置显微镜系统自带测微尺测量花粉管长度，每视野 随机测量10个花粉，每处理共测30个花粉管长度，计算其平均值，花粉离体萌发花粉管生 长情况反应花粉粒生理状况的优劣。
[0041] 实施例2 : -种白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其主要特 点在于包括以下步骤：
[0042] 1)花粉采集：
[0043] 选取发育正常、无病虫危害的健壮白菜型油菜植株，于白菜型油菜盛花期选取已 开花的花序，收集花粉；
[0044] 2)花粉离体萌发及花粉管生长：
[0045] 将花粉均匀撒在白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基上，35°C恒温培养；pH为 6. 5 ；
[0046] 花粉离体萌发培养20min后部分花粉开始萌发，花粉萌发后花粉管长度超过花粉 粒直径，花粉管开始快速生长；
[0047] 3)花粉活力的测定：
[0048] 离体培养50min后，以花粉管长度大于花粉粒直径为花粉萌发标准，每处理重复3 次，每重复随机观察4个视野，每视野观察花粉数不少于50粒，统计花粉萌发率，花粉萌发 率反应有生活力花粉所占比例。
[0049] 4)用LeicaDM6000B全自动正置显微镜系统自带测微尺测量花粉管长度，每视野 随机测量12个花粉，每处理共测35个花粉管长度，计算其平均值，花粉离体萌发花粉管生 长情况反应花粉粒生理状况的优劣。
[0050] 实施例3 :-种白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其主要特 点在于包括以下步骤：
[0051] 1)与实施例1相同。
[0052] 2)花粉离体萌发及花粉管生长：
[0053] 将花粉均匀撒在白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基上，40°C恒温培养；pH为 7. 0 ；
[0054] 花粉离体萌发培养25min后部分花粉开始萌发，花粉萌发后花粉管长度超过花粉 粒直径，花粉管开始快速生长；
[0055] 3)花粉活力的测定：
[0056] 离体培养Ih后，以花粉管长度大于花粉粒直径为花粉萌发标准，每处理重复3次， 每重复随机观察5个视野，每视野观察花粉数80粒，统计花粉萌发率，花粉萌发率反应有生 活力花粉所占比例。
[0057] 4)用LeicaDM6000B全自动正置显微镜系统自带测微尺测量花粉管长度，每视野 随机测量15个花粉，每处理共测40个花粉管长度，计算其平均值，花粉离体萌发花粉管生 长情况反应花粉粒生理状况的优劣。
[0058] 实施例4 :所述的白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基，以BK为溶剂，其还包含组 分有 50g · I/1 的 PEG 6000 (聚乙二醇 6000)、130g · L -1 的蔗糖、I. 5mg · L 4的赤霉素和 8. 5m g .171的维生素 BI，pH为6.0。
[0059] 其中 BK 的组成为！H3BO3 (硼酸）IOOmg · L' Ca (NO3) 2 · 4H20 (硝酸钙）300mg · L' MgSO4 · 7H20 (结晶硫酸镁）200mg · Γ1和KNO 3 (硝酸钾）IOOmg · L'以蒸馏水为溶剂。
[0060] 实施例5 :所述的白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基，以BK为溶剂，其包含组 分有80g · Γ1的PEG 6000(聚乙二醇6000) UOOg · L-1的蔗糖、2. Omg · L-1的赤霉素和9m g .171的维生素 BI，pH为6. 5。
[0061] 其中BK的成分如实施例4.
[0062] 实施例6 :所述的白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基，以BK为溶剂，其包含组 分有IOOg · Γ1的PEG 6000(聚乙二醇6000)、150g · L-1的蔗糖、2. 5mg · L-1的赤霉素和 IOmg · L-1的维生素 Bl的BK培养液，pH为7. 0。
[0063] 其中BK的成分如实施例4.
[0064] 实验验证例：一种白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，
[0065] 1、白菜型油菜花粉的采集
[0066] 白菜型油菜花粉于某年10月初采自甘肃农业大学干旱生境重点实验室，采集方 法为：选取发育正常、无病虫危害的健壮植株，于盛花期选取已开花的花序，花蕾自然开放， 花粉从花药中散出，收集花粉备用。
[0067] 2、花粉离体萌发培养条件的筛选：
[0068] 2. 1花粉离体萌发培养基的筛选：
[0069] 培养基种类对植物花粉离体萌发有较大影响，不同植物花粉萌发的适宜培养基不 同。以BK培养基为基本培养基，在其基础上依次筛选合适浓度的PEG6000,蔗糖，GAjP VBl， 最后调节合适的pH。
[0070] BK 的组成为（mg · Γ1) :H3B03100mg · L' Ca(NO3)2 · 4H20 300mg · L1' MgSO4 · 7H20 200mg · Γ1和KNO 3100mg · L'以蒸馏水为溶剂。
[0071] 2.2PEG浓度筛选
[0072] PEG6000是一种高分子量化合物，主要起到渗透调节作用。把新鲜花粉分别均匀散 布在添加了 Og · L'50g · L'lOOg · L'150g · L'200g · Γ1 的 PEG6000 的 BK 培养基（BK 培养基是液体；这里的Og 代表不添加 PEG的BK培养基。没有再往BK中添加蒸馏水） 中，
[0073] 具体操作如下：（1)用lmol/L的NaOH调节上述不同PEG浓度培养基的pH至7. 0 ; (2)用移液枪吸取70 μ L培养基，轻轻滴在载玻片上形成球面状液滴，将两个雄蕊上的花粉 播种在球面培养基上，播种时不要搅动培养基，以免花粉粒沉入液体培养基底部，在萌发过 程中由于缺氧而影响实验结果，最好是将花粉粒均匀的铺在培养基上；（3)将上述载玻片 放入铺有两层湿润滤纸（保持一定的湿度，避免萌发时间太久培养基蒸发）的培养皿中，不 加盖玻片（以确保花粉萌发过程中有充足的氧气），盖紧培养皿盖子于35°C培养箱中培养 Ih后在显微镜下观察统计萌发数及花粉管长度。（4)以花粉管长度大于花粉粒直径为花粉 萌发标准，每处理重复3次，每重复随机观察3个视野，每视野观察花粉数不少于30粒，统 计花粉萌发率；同时用LeiCaDM6000B全自动正置显微镜系统自带测微尺测量花粉管长度， 每视野随机测量10个花粉，每处理共测30个花粉管长度，计算其平均值。试验重复三次。
[0074] 结果如表1所示，BK培养基中加入不同浓度的PEG6000,可明显提高白菜型油菜 花粉萌发率，其中添加50g · I^1PEGeOOO效果最为显著，花粉萌发率达到41.8% ;低浓度 PEG(50?150g · Γ1)促进花粉管生长，且随浓度增加，促进作用逐渐减弱，高浓度PEG(大 于200g · Γ1)抑制花粉管生长；在显微观察时还发现，在添加了低浓度PEG的培养基中，白 菜型油菜花粉管生长较直，而未加 PEG或加了高浓度PEG的培养基花粉管生长弯曲，常交织 在一起，不便观察测量。
[0075] 表1不同浓度PEG对花粉萌发生长的影响
[0076]
【权利要求】
1. 一种白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其特征在于包括以下步 骤： 1) 花粉米集： 选取发育正常、无病虫危害的健壮白菜型油菜植株，于白菜型油菜盛花期选取已开花 的花序，收集花粉； 2) 花粉离体萌发及花粉管生长： 将花粉均匀播种在白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基上，30°C?40°C恒温培养；pH 为 6. 0 ?7. 0 ; 花粉离体萌发培养15min?25min后部分花粉开始萌发，花粉萌发后花粉管长度超过 花粉粒直径，花粉管开始快速生长； 3) 花粉活力的测定： 离体培养45min?lh后，以花粉管长度大于花粉粒直径为花粉萌发标准，每处理重复 3次，每重复随机观察3?5个视野，每视野观察花粉数30?80粒，统计花粉萌发率，花粉 萌发率反应有生活力花粉所占比例。
2. 如权利要求1所述的白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其特征 在于步骤还包括有： 4) 用LeiCaDM6000B全自动正置显微镜系统自带测微尺测量花粉管长度，每视野随机 测量10?15个花粉，每处理共测30?40个花粉管长度，计算其平均值，花粉离体萌发花 粉管生长情况反应花粉粒生理状况的优劣。
3. 如权利要求1所述的白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法， 其特征在于所述的白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基，以BK为溶剂，其包含的组分 有 50g ? I71 ?100g ? L-1 的 PEG 6000 (聚乙二醇 6000)、130g ? L-1 ?150g ? L-1 的蔗糖、 1. 5mg ? L 1?2. 5mg ? L 1的赤霉素和8. 5m g ? L 1?10mg ? L 1的维生素 Bl，pH为6. 0? 7. 0〇
4. 如权利要求3所述的白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其特征 在于所述的 BK 的组成为：H3B03100mg .L'CaWO^ .4H20 300mg .L'MgSC^ .7H20 200mg .I71和KN03100mg ? L'以蒸馏水为溶剂。
【文档编号】C12Q1/02GK104480184SQ201410781780
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月16日 优先权日:2014年12月16日
【发明者】刘自刚, 张树娟, 孙万仓, 李学才, 方彦, 武军艳, 杨刚, 王月, 王凯音, 刘林波, 侯献飞, 马骊, 钱武, 杨建胜, 刘海卿 申请人:甘肃农业大学