利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法，以糖蜜为原料，采用固定化米曲霉发酵经酸解预处理的糖蜜。本发明通过前期对糖蜜进行酸处理，一方面可除掉糖蜜中不利于微生物生长代谢的胶体、重金属、亚硝酸盐等杂质，另一方面可促使糖蜜中的蔗糖转化为易于被微生物利用的葡萄糖、果糖等单糖。采用固定化米曲霉进行发酵，提供了一种新的固定化方法和发酵条件，以缩短发酵周期、提高菌种发酵能力，一定程度上控制了菌体的过度生长，也可以重复利用，并且还具有抗杂菌能力强的优点。总之，本发明综合利用甘蔗糖业副产物生产曲酸，具有成本低廉、步骤简单、容易掌控等优点，可有效解决目前曲酸需求增加而产量低、成本高的问题。
【专利说明】利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于有机酸生产【技术领域】，尤其涉及一种利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法。
【背景技术】
[0002]糖蜜是制糖行业生产过程的副产物，糖膏经过反复蒸煮结晶后剩余的一种深褐色的粘稠的液体，它含有丰富的糖类、蛋白质、维生素、生物素、胺类、色素、酚类等可溶性物质。糖蜜成分中含有蔗糖30%?40%、转化糖12%?24%、胶体9%?11%、灰分10%?20%，营养丰富，是一种可再生资源，具有巨大的应用潜力。我国是仅次于巴西和印度的世界第三甘蔗种植大国，南方糖厂拥有非常丰富的甘蔗糖蜜资源。据国家统计局统计，2011年广西甘蔗的种植面积为1547万亩，甘蔗产量5700万吨，按照每吨甘蔗产生0.03吨糖蜜计算，广西全区各糖厂产生的糖蜜就多达170多万吨。
[0003]糖蜜用途广泛:早期糖蜜与其他辅料混合制成舔块，应用于饲料行业；生产焦糖色素的原料；蔗糖分的重提取；糖蜜中含有大量的可发酵性糖以及微生物生长所需各种微量元素，还可代替淀粉、葡萄糖等原料用于发酵工业生产。国内外利用糖蜜发酵获得的产品主要有:酒精、味精、柠檬酸、酵母、氨基酸、核糖核酸、抗生素、氢气等。在我国，糖蜜主要用于酒精发酵和酵母生产，而随着糖价的不断攀升，糖蜜价格也逐渐升高，酒精生产成本相应提高，此外，高COD和BOD的酒精废液对环境威胁巨大。因此，亟待进一步探索糖蜜的综合利用途径。
[0004]曲酸(Kojic acid)，学名5-羟基-2-羟甲基-1，4-吡喃酮，是曲霉属的某些菌株以糖类为原料，经好氧发酵 生产的一种弱酸性次级代谢产物。曲酸具有较强的抗菌、抗氧化、与金属离子螯合和抑制酪氨酸酶活性的作用，也是制备增香剂麦芽酚和乙基麦芽酚的工业原料，因此，曲酸作为稳定剂、保鲜剂、护色剂、增香剂、多酚氧化酶抑制剂、农作物生长促进剂、杀虫剂和祛斑剂等被广泛用于食品加工、化妆品、医药、香料生产和农作物生产的诸多领域。
[0005]我国从上世纪80年代才开始研究曲酸产品并进行了多年研究，1997年以前，该产品一直依赖进口。目前，国内多以淀粉质为原料进行生物发酵合成曲酸，然后对发酵液进行提取精制。2001年国内曲酸需求量在25吨左右。随着产品市场的日渐成熟，尤其是在食品添加剂和化妆品方面的广泛应用，市场对曲酸的需求日益剧增。曲酸的应用方向研究已日趋成熟，增加产量和降低生产成本已经成为现阶段科技攻关的主要方向。
[0006]固定化技术是利用物理或化学手段将游离的微生物(细胞)或酶定位于限定的空间区域，并使其保持活性且能反复利用的一种技术。它具有处理效率高、稳定性强、无二次污染、能耗低以及菌种高纯高效、生物浓度高、反应易于控制、丧失活性可恢复等优点，因而越来越受到人们的重视。固定化技术最早应用于醋酸的生产，随着技术的发展，针对米曲霉的固定化技术也应运而生，与游离细胞发酵工艺相比较，米曲霉固定化技术在发酵生产中的应用有利于实现工业生产连续化和生提高产效率，尤其能有效地解除产物抑制型发酵过程中产物的抑制效应。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是提供一种成本低廉、步骤简单、容易掌控的利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法。
[0008]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法，以糖蜜为原料，采用固定化米曲霉发酵经酸解预处理的糖蜜。
[0009]上述利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法，包括以下步骤:
[0010](I)米曲霉孢子的制备；
[0011](2)米曲霉孢子悬浮液的制备；
[0012](3)将米曲霉孢子固定到聚氨酯泡沫(低密度海绵)载体上；
[0013](4)固定化米曲霉的准备；
[0014](5)糖蜜的酸处理；
[0015](6)固定化米曲霉接种到以糖蜜为原料的培养基中进行发酵产酸。
[0016]步骤(I)按以下操作进行:将米曲霉孢子划线接种到PDA试管斜面培养基上，在温度为30°C条件下培养4天，再将米曲霉孢子划线接种到PDA试管斜面培养基上培养，同法反复传代3?4代活化菌种，待孢子完全覆盖菌丝表面，即得。
[0017]步骤(2)按以.下操作进行:用无菌生理盐水将步骤(I)获得的米曲霉孢子洗脱下来，孢子洗脱液在超声清洗仪中处理10s，充分打散孢子，再经4层纱布过滤除去菌丝体，将种子培养基缓慢加入到经过滤的孢子悬浮液中，使最终的孢子浓度为IO7?IO6个/mL，即得。
[0018]步骤(3)按以下操作进行:采用边长为2?6_的正方体聚氨酯泡沫载体，高温高压灭菌，冷却；将步骤(2)获得的孢子悬浮液按体积比1: 2与固定化载体混合，反复按压载体，使悬浮液填充载体内部；30°C条件静置下培养24h，待孢子萌发、生长并缠绕在载体上后，用无菌生理盐水反复冲洗3?4次，除去未固定的菌丝体，即得。
[0019]步骤(4)按以下操作进行:按照体积比2: 5的接种量将步骤(3)获得的固定化米曲霉添加到种子培养基中，种子培养基装液量为100mL/250mL三角瓶，30°C条件下，200rpm摇瓶培养3?4d，形成固定化菌体，过滤，保留固定化菌体，即得。
[0020]步骤(5)按以下操作进行:糖蜜与水按照体积比1:1进行混合稀释稀释，再用质量浓度为10%的稀硫酸调节糖蜜稀释液pH至3.0,95?100°C保温lOmin，静置过夜，取上清液；用质量浓度为15%的石灰乳回调上清液pH至6.0，40°C保温10min，4000rpm离心lOmin，取上清液，备用。
[0021]步骤(6)按以下操作进行:在三角摇瓶中进行曲酸发酵生产，发酵培养基的装液量为40?60mL/250mL，固定化菌体按照发酵培养基体积的5?15% (V/V)添加，发酵温度为28?30°C，摇床转速为180?220rpm，发酵10天；发酵培养基为用水稀释过的步骤(5)获得的酸处理过的糖蜜，调节糖蜜中总糖浓度为60?100g/L，调节pH4.0?6.0，高温高压灭菌，菌体接种前，向无菌培养基中添加一定体积的无水乙醇，发酵培养基中的乙醇浓度控制在 20mL/L。
[0022]种子培养基含有蔗糖60g/L、酵母膏 5g/L、KH2P04lg/L、KC10.5g/L、MgSO4 ? 7H200.5g/L、乙醇 20mL/L, pH6.0。
[0023]针对目前曲酸需求增加而产量低、成本高的问题，发明人建立了一种利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法:以糖蜜为原料，采用固定化米曲霉发酵经酸解预处理的糖蜜。本发明通过前期对糖蜜进行酸处理，一方面可除掉糖蜜中不利于微生物生长代谢的胶体、重金属、亚硝酸盐等杂质，另一方面可促使糖蜜中的蔗糖转化为易于被微生物利用的葡萄糖、果糖等单糖。采用固定化米曲霉进行发酵，提供一种新的固定化方法和发酵条件，以缩短发酵周期、提高菌种发酵能力，一定程度上控制了菌体的过度生长，也可以重复利用，并且还具有抗杂菌能力强的优点。总之，本发明综合利用甘蔗糖业副产物生产曲酸，具有成本低廉、步骤简单、容易掌控等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是本发明利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0025]实验材料
[0026]PDA试管斜面培养基(g/L):马铃薯200，蔗糖20，琼脂粉20。
[0027]种子培养基(g/L):蔗糖60，酵母膏 5，KH2PO4I，KC10.5,MgSO4 *7H200.5 ;乙醇 20mL/L, pH6.00
[0028]发酵培养基:用水稀释酸处理过糖蜜，调节糖蜜中总糖浓度60?100g/L，调节pH4.0?6.0，高温高压灭菌。菌体接种前，向无菌培养基中添加一定体积的无水乙醇，培养基中的乙醇浓度控制在20ml/L。
[0029]菌种:米曲霉(Aspergill`us oryzae) GIM3.423,购自广州微生物研究所。
[0030]糖蜜:取自南宁糖业股份有限公司明阳糖厂。
[0031]以250mL三角瓶摇瓶发酵为例，参考图1的工艺流程图，具体说明本发明固定化米曲霉发酵糖蜜制备曲酸工艺。
[0032]实施例1
[0033](I)米曲霉孢子的制备
[0034]将冷冻保藏的米曲霉孢子划线接种到PDA试管斜面培养基上，在温度为30°C条件下培养4天，再将米曲霉孢子划线接种到PDA试管斜面培养基上培养，同法反复传代3?4代活化菌种，待孢子完全覆盖菌丝表面。
[0035](2)米曲霉孢子悬浮液的制备
[0036]用无菌生理盐水将步骤(I)获得的生长成熟的米曲霉孢子洗脱下来，孢子洗脱液在超声清洗仪中处理10s，充分打散孢子，再经4层纱布过滤除去菌丝体，将种子培养基缓慢加入到经过滤的孢子悬浮液中，使最终的孢子浓度为IO7?IO6个/mL。
[0037](3)将米曲霉孢子固定到聚氨酯泡沫(低密度海绵)载体上
[0038]采用边长为2mm的正方体聚氨酯泡沫载体，高温高压灭菌，冷却；将步骤(2)获得的孢子悬浮液按体积比1: 2与固定化载体混合，反复按压载体，使悬浮液填充载体内部；30°C条件静置下培养24h，待孢子萌发、生长并缠绕在载体上后，用无菌生理盐水反复冲洗3?4次，除去未固定的菌丝体。[0039](4)固定化米曲霉的准备
[0040]按照体积比2: 5的接种量将步骤(3)获得的固定化米曲霉添加到种子培养基中，种子培养基装液量为100mL/250mL三角瓶，30°C条件下，200rpm摇瓶培养3?4d，形成固定化菌体，呈球形，嫩白色，表面光滑，且已具备产酸能力，过滤，保留固定化菌体。
[0041](5)糖蜜的酸处理
[0042]糖蜜与水按照体积比1:1进行混合稀释，再用质量浓度为10%的稀硫酸调节糖蜜稀释液pH至3.0，95?100°C保温lOmin，静置过夜，取上清液；用质量浓度为15%的石灰乳回调上清液pH至6.0,40°C保温lOmin, 4000rpm离心IOmin,取上清液,备用。
[0043](6)固定化米曲霉接种到以糖蜜为原料的培养基中进行发酵产酸
[0044]发酵培养基:用水稀释酸处理过糖蜜，调节糖蜜中总糖浓度60g/L，调节pH4.0，高温高压灭菌，按照20mL/L浓度添加乙醇。
[0045]在三角瓶中进行发酵，发酵培养基的装液量为40mL/250mL，固定化菌体按照发酵培养基体积的5%添加，发酵温度为28°C，摇床转速为180rpm，发酵10天。
[0046]经三氯化铁比色法测定，发酵液中曲酸浓度为6.183g/L。
[0047]实施例2
[0048]其它同实施例1，聚氨酯泡沫(低密度海绵)载体的边长改为4mm，用水稀释酸处理过的糖蜜，使糖蜜总糖浓度降至80g/L，调节pH5.0，高温高压灭菌。发酵液装液量为50mL/250mL三角瓶，固定化菌体接种量为10% (V/V)，温度30°C，摇床转速200转/min，发酵10天。`
[0049]经三氯化铁比色法测定，发酵液中曲酸浓度为8.387g/L。
[0050]实施例3
[0051]其它同实施例1，聚氨酯泡沫(低密度海绵)载体的边长改为6mm，用水稀释酸处理过的糖蜜，使糖蜜总糖浓度降至100g/L，调节pH6.0，高温高压灭菌。发酵液装液量为60mL/250mL三角瓶，固定化菌体接种量为15% (V/V)，温度32°C，摇床转速220rpm，发酵10天。
[0052]经三氯化铁比色法测定，发酵液中曲酸浓度为7.795g/L。
【权利要求】
1.一种利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法，其特征在于以糖蜜为原料，采用固定化米曲霉发酵经酸解预处理的糖蜜。
2.根据权利要求1所述的利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)米曲霉抱子的制备； (2)米曲霉孢子悬浮液的制备； (3)将米曲霉孢子固定到聚氨酯泡沫载体上； (4)固定化米曲霉的准备； (5)糖蜜的酸处理； (6)固定化米曲霉接种到以糖蜜为原料的培养基中进行发酵产酸。
3.根据权利要求2所述的利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法，其特征在于步骤(I)按以下操作进行:将米曲霉孢子划线接种到PDA试管斜面培养基上，在温度为30°C条件下培养4天，再将米曲霉孢子划线接种到PDA试管斜面培养基上培养，同法反复传代3?4代活化菌种，待孢子完全覆盖菌丝表面，即得。
4.根据权利要求3所述的利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法，其特征在于步骤(2)按以下操作进行:用无菌生理盐水将步骤(I)获得的米曲霉孢子洗脱下来，孢子洗脱液在超声清洗仪中处理10s，充分打散孢子，再经4层纱布过滤除去菌丝体，将种子培养基缓慢加入到经过滤的孢子悬浮液中，使最终的孢子浓度为IO7?IO6个/mL，即得。
5.根据权利要求 4所述的利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法，其特征在于步骤(3)按以下操作进行:采用边长为2?6mm的正方体聚氨酯泡沫载体，高温高压灭菌，冷却；将步骤(2)获得的孢子悬浮液按体积比1: 2与固定化载体混合，反复按压载体，使悬浮液填充载体内部；30°C条件静置下培养24h，待孢子萌发、生长并缠绕在载体上后，用无菌生理盐水反复冲洗3?4次，除去未固定的菌丝体，即得。
6.根据权利要求5所述的利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法，其特征在于步骤(4)按以下操作进行:按照体积比2: 5的接种量将步骤(3)获得的固定化米曲霉添加到种子培养基中，种子培养基装液量为100mL/250mL三角瓶，30°C条件下，200rpm摇瓶培养3?4d，形成固定化菌体，过滤，保留固定化菌体，即得。
7.根据权利要求6所述的利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法，其特征在于步骤(5)按以下操作进行:糖蜜与水按照体积比1:1进行混合稀释，再用质量浓度为10%的稀硫酸调节糖蜜稀释液PH至3.0，95?100°C保温lOmin，静置过夜，取上清液；用质量浓度为15%的石灰乳回调上清液pH至6.0,40°C保温lOmin, 4000rpm离心IOmin,取上清液,备用。
8.根据权利要求7所述的利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法，其特征在于步骤(6)按以下操作进行:在三角摇瓶中进行曲酸发酵生产，发酵培养基装液量为40?60mL/250mL,固定化菌体按照发酵培养基体积的5?15%添加，发酵温度为28?30°C，摇床转速为180?220rpm，发酵10天；所述发酵培养基为用水稀释过的步骤(5)获得的酸处理过的糖蜜，调节糖蜜中总糖浓度为60?100g/L，调节pH4.0?6.0，高温高压灭菌，菌体接种前，向培养基中添加一定体积的无水乙醇，使发酵培养基中的乙醇浓度达到20mL/L。
9.根据权利要求8所述的利用固定化米曲霉发酵糖蜜生产曲酸的方法，其特征在于:所述种子培养基含有蔗糖 60g/L、酵母膏 5g/L、KH2P04lg/L、KC10.5g/L、MgSO4 ? 7H200.5g/L、乙醇 20mL/L, pH6.0 。
【文档编号】C12P17/06GK103436567SQ201310423387
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】孙卫东, 李军委, 唐艳琼, 戴莉, 唐湘毅 申请人:广西大学