一种固定化细胞及其应用的制作方法
【专利摘要】一种固定化细胞及其应用，该固定化细胞采用以下方法制成，包括以下步骤：(1)碳纤维预处理；(2)制备细胞种子菌；(3)固定化细胞：可采用以下三种方法之一进行，(a)预处理的短切碳纤维成球之后，与细胞接触，制成成球碳纤维载体固定化细胞；(b)菌种先生长繁殖到12～24h后，再与成球碳纤维载体接触，制成成球碳纤维载体固定化细胞；(c)预处理过的短切碳纤维成球与细胞生长繁殖同步进行，制成成球碳纤维载体固定化细胞。本发明之固定化细胞是成球颗粒，具有总表面积大、机械强度高、发酵稳定性好以及便于操作等优点，适宜连续化使用，更适合于进行多酶体系连续反应，尤其可高效多批次发酵生产木糖醇，在生物发酵工业中具有广泛的发展前途，成球碳纤维载体在细胞的固定化领域中也具有很大的应用范围。
【专利说明】—种固定化细胞及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种固定化细胞及其应用。
【背景技术】
[0002]固定化细胞是在固定化酶的基础上发展起来的新技术，即利用化学或物理手段将游离细胞定位于限定的空间区域并使其保持活性和可以反复使用的一种基础技术。固定化细胞保持了细胞的生命活动能力，它不但比游离细胞的发酵更具有优越性，而且比固定化酶有更多的优点，比如:它免除了破碎细胞来提取胞内酶的手续，降低制备成本；细胞生长停滞时间短，细胞多，反应快，抗污染能力强，可以连续发酵，反复使用，应用成本低；酶在细胞内的环境中稳定性较高，完整细胞固定化后，酶活力的损失较少等。
[0003]目前，在细胞固定化方法中，应用最广的是包埋法，包埋法的载体主要是有机高聚物。在包埋技术发展的初期，以使用聚丙烯酰胺等合成高聚物为主，如今已逐渐转向使用毒性小，不会损害细胞的海藻酸盐、卡拉胶及琼脂等天然聚合物。但是天然聚合物抗微生物分解性能较差，机械强度较低。吸附法也是常用的细胞固定化方法之一，吸附法具有两大优点，即简单及合乎细胞的生理条件。当载体与细胞悬浮液混合后，细胞便吸附在载体的表面。因为载体是惰性的，且没有化学试剂参与过程，所以被固定的细胞系处在与悬浮细胞相同的生理条件下，这样就不会影响细胞的生长，也不会影响细胞的特性和活力。吸附法固定化细胞的性能关键因素取决于选取的固定化载体材料和固定化所采用的方法。其中，固定化载体材料作为固定化细胞的一部分，载体材料的结构和性能对固定化细胞的各种性能都有着巨大直接的影响。细胞固定化对载体材料的要求很高，目前，细胞使用的固定化载体材料的主要有:有机高分子载体、无机载体、复合载体三种。有机高分子载体具有很强的灵活性，可根据不同类型的细胞来设计与之相匹配的载体材料，并且也具有较大的强度、对微生物的腐蚀有较强的抵抗力，但传质性能较差，这对细胞固定时对细胞活性的影响较大。无机载体具有一些有机材料不具备的优点，例如，稳定性好、机械强度高、对微生物无毒性、不易被微生物所分解、耐酸碱、成本低、寿命长等；但固定化效率一般来说比较低。复合载体具有从反应体系中易分离和回收、操作简便、成本较低的优点；但技术发展得还不成熟。当前，细胞固定化所需载体成本高，并且载体也不能在固定化过程中重复使用，颗粒状的固定化方法制作也困难，从而导致固定化细胞技术工业推广困难。因此，设计、开发和制备性能优异可控的载体材料已成为固定化细胞研究的热点之一。
[0004]碳纤维是一种含碳量在95%以上的高强度、高模量纤维的新型纤维材料，具有生物相容性好、化学性能稳定，高比表面积、耐高温等优良性能，这些特点决定碳纤维以及活性炭纤维具备成为良好的细胞固定化载体的特性。目前，碳纤维类材料作为固定化载体的优越性已逐渐被越来越多的研究人员所重视。但是碳纤维材料作为细胞固定化载体的研究和应用仅限于考量固定化效果方面的研究。碳纤维作为固定化载体的材料特性与细胞的固定化机制及相互作用关系几乎没有报道，尤其是载体的成球制备方法和固定化细胞更是研究的甚少。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是，提供一种固定化细胞及其应用，该固定化细胞具有总表面积大、机械强度高、反复利用次数多以及便于操作的优点，可应用于多批次发酵生产木糖醇。
[0006]本发明解决其技术问题采用的技术方案是:
[0007]本发明之一种固定化细胞，可采用以下方法制成，包括以下步骤:
(1)碳纤维预处理:将碳纤维切成长度为0.3cm?0.8cm短切碳纤维放入有机溶剂中浸泡3?5h，过滤或离心回收上清液，用相当于3?5倍碳纤维体积的水对短切碳纤维进行清洗，然后将清洗后的短切碳纤维浸泡于体积大于3倍碳纤维体积的沸水浴中处理3?5h后，用水清洗，烘干，取出备用；
(2)制备细胞种子菌:在无菌条件下，将细胞接种到斜面培养基上，在温度为28?32°C的条件下培养20?30h，形成种子菌；
(3)固定化细胞:可采用以下三种方法之一进行，(a)先将步骤(I)中备用的短切碳纤维，以投入量为2.0?20g/L投入无菌种子培养液中，放置于摇床中，控制摇床转速为120rpm?220rpm,摇动0.5?4h,可控成球，即得成球碳纤维载体；然后将步骤(2)中制备的细胞种子菌以2%?8%接种到上述含成球碳纤维载体的无菌种子培养液中，放置于摇床中，在28?32°C,控制摇床转速为120rpm?220rpm,摇动4?24h,即得成球碳纤维载体固定化细胞；或
(b)先将步骤(2)中制备的细胞种子菌以2%?8%接种无菌种子培养液中，放置于摇床中，在28?32°C控制摇床转速为120rpm?220rpm，摇动12?24h，即得扩大培养的细胞种子菌；然后将步骤(I)中备用的短切碳纤维，以投入量为2.0?20g/L投入上述含扩大培养的细胞种子菌的种子培养液中，然后放置于摇床中，控制摇床转速为120rpm?220rpm,摇动0.5?4h，可控固定化，即得成球碳纤维载体固定化细胞；或
(c)先将步骤(I)中备用的短切碳纤维，以投入量为2.0?20g/L投入无菌种子培养液中，然后迅速以2%?8%接种量接种步骤(2)制备的细胞种子菌中，放置于摇床中，控制摇床转速为120rpm?220rpm,摇动12?24h,可控固定化，即得成球碳纤维载体固定化细胞。
[0008]对于采用以上三种固定化方法之一得到固定化细胞均是是通过对预处理过的短切碳纤维投入时间的改变来引起对细胞固定化时间的改变可控制得。方案(a)是预处理过的短切碳纤维成球之后，与细胞接触的为已成球的固定化载体，对细胞固定化效果的影响；方案(b)则是生长繁殖之后的菌种，在与成球的固定化载体接触之后，对细胞固定化效果的影响；方案(C)则是利用预处理过的短切碳纤维成球与细胞生长繁殖同步进行，对细胞固定化效果的影响。三种方案是为了更显著的表现出成球碳纤维固定化载体的在细胞固定化效果上的优势。
[0009]进一步，所述制备方法的步骤(I)中，将碳纤维切成长度为0.4?0.6cm短切碳纤维放入丙酮中浸泡4h，过滤或离心回收上清液，用相当于5倍碳纤维体积的蒸馏水对短切碳纤维进行清洗，然后将清洗后的短切碳纤维浸泡于体积6倍碳纤维体积的沸水浴中处理4h后，用蒸馏水清洗，烘干，取出备用。
[0010]进一步，所述制备方法的步骤(I)中，所述短切碳纤维选自2k碳纤维、3k碳纤维、6k碳纤维、24k碳纤维、补强布中的任一种。
[0011]进一步，所述短切碳纤维选自6k碳纤维。
[0012]进一步，所述制备方法的步骤(3)中，将备用的短切碳纤维，以等量方式每隔
0.5?5分钟投入一次，共投放3?5次。
[0013]进一步，所述制备方法的步骤(3)中，所述短切碳纤维投入量为2.5?15g/L ;在250mL摇瓶中，所述含无菌种子培养液的量相当于10-50倍碳纤维体积。
[0014]进一步,步骤(3)中,所述细胞种子菌的接种量为5%。
[0015]本发明之一种固定化细胞在多批次发酵生产木糖醇中的应用。
[0016]进一步，其特征在于，在第一批发酵结束时保留所有成球碳纤维球团及20%?30%的发酵液，同时加入新配制的补液进行第二批的发酵，同样在第二批发酵结束时再次保留所有成球碳纤维球团及20%?30%的发酵液，加入新配制的补液进行第三批的发酵，以此类推进行十批发酵。
[0017]本发明提出的碳纤维自成球方案，其成球状态受到一些参数的改变而发生变化:
(1)成球大小的改变
碳纤维自成球的大小主要与碳纤维的加入方法有关。若一次性将2.0?20g/L的碳纤维投入到液体中，然后放入120rpm?220rpm的摇床内摇动0.5?4h后,可能会形成的大小不均一的球团；反之，若将碳纤维分成若干等分，每隔2分钟投入至液体中，在同等条件下将会形成图1所示大小均一的小球团。
碳纤维的长短和投入量对碳纤维成球的大小也有一定影响，碳纤维长度和投入量的参数分别在0.4?0.7cm和10?15g/L的条件下,形成大小均一的较小球团。而碳纤维长度大于0.7cm或投入量超过15g/L时,会形成较大型的球团。
(2)成球圆扁的改变
碳纤维成球的形态有的较为饱满圆滑，而有的则扁平一些。影响成球圆扁形态的主要因素是容器内液体的加入量。若加液量多于5倍碳纤维体积，则生成较扁的碳纤维球团，球团高径比H/D = 0.6/1?1/0.6 ;而加液量少于3倍碳纤维体积，所生成的碳纤维球团高径比为H/D = 1/0.4?0.4/1 ;若加液量刚刚能将球覆盖，碳纤维成球形态较圆滑，球团高径比为H/D = 1/0.8?0.8/1。另一个影响碳纤维成球圆扁程度的相关因素为液体环境的粘度，在无菌水、含水培养液、含水含菌种培养液中，三者粘度依次增高，在粘度较高的含水含菌种培养液环境下，成球较扁一些，在粘度较低的无菌水中则较为饱满，但差别不显著。
(3)成球数量的改变
碳纤维的成球数量与其投入量有关，在投入量为2.0?15g/L的范围内，成球的数量随着投入量的增加而增加。此外，碳纤维长度也会对成球数量造成影响，在投入量相同的条件下，选择长度较短的碳纤维所生成的球团数量较多。
(4)成球均一性的改变
碳纤维成球的均一'丨生对固定化效果有一定影响，成球均一'I"生的改变主要与加入方法、加入的液体量有关，液体的加入量应刚好能覆盖成球碳纤维，且投入碳纤维时分开等量投入，成球的圆扁控制在高径比为H/D = 1/0.8?0.8/1左右，使得小球能达到最佳圆滑饱满程度，并在水中分布均匀。
(5)碳纤维种类所引起的成球差异通过投入不同种类的碳纤维，包括2k碳纤维、3k碳纤维、6k碳纤维、24k碳纤维、补强布等，发现不同种类的碳纤维在可控成球方面具有不同的形态特征。在所选碳纤维种类中，纤维束较少的碳纤维所成球更加圆滑，但数量较少；而纤维束较多的碳纤维数量较多，但也有可能会形成较大的球团。
[0018]本发明利用碳纤维可控成球这一技术，主要通过物理吸附法使细胞吸附在碳纤维表面固定，形成固定化细胞。其中，碳纤维材料，无论是活性炭纤维还是改性后的碳纤维，其在固定化应用中所使用的固定方法多通过自身物理吸附性对细胞进行固定。其优势在于，可通过改变条件，控制碳纤维在液体环境下的成球效果；利用成球的碳纤维载体，对细胞进行固定化。
[0019]本发明之固定化载体碳纤维具有可控成球的现象，机理在于碳纤维受到范德华力、静电排斥力和空间斥力和疏水力的作用达到平衡、相互制约，并且形成聚结态。同时又受到摇床所给的撞击力、向心力和水的压力作用而形成球状。碳纤维载体的成球大小、圆扁、数量等受到碳纤维自身和外部环境的影响。
[0020]本发明之固定化细胞是成球颗粒，具有总表面积大、抗拉强度高、发酵稳定性好以及便于操作等优点，适宜连续使用，更适合于进行多酶体系连续反应，尤其可高效多批次发酵生产木糖醇，在生物发酵工业中具有广泛的发展前途，成球碳纤维载体在细胞的固定化领域中也具有很大的应用范围。本发明在制备固定化细胞时，操作简单，固定化过程温和，原料廉价易得，成本低。实验证明，在连续发酵过程中，成球碳纤维固定化载体的比表面积可达14m2/g,细胞的固定化效率超过33%,成球碳纤维载体的固定化效率大于1.2g/g,细胞固定化载体的抗拉强度在3500兆帕以上，成球碳纤维载体固定化细胞可连续发酵使用10次仍保持良好性能，木糖醇的产率可达70%以上(以初始木糖计)。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为可控成球的碳纤维载体固定化细胞。
【具体实施方式】
[0022]下面结合实施例，对本发明的具体的实施方式进一步详细描述。以下实施例是用来进一步说明本发明的内容，而不限制本发明的保护范围。对于本发明所涉及的相关内容及所做的修改，均属于本发明保护范围。
[0023]实施例1:成球碳纤维固定化假丝酵母细胞发酵木糖醇
[0024]将6k碳纤维短切成0.5cm的长度，然后进行预处理:在丙酮中浸泡4h后，过滤回收清液，用相当于5倍碳纤维体积的蒸馏水对短切碳纤维进行清洗，然后将清洗后的短切碳纤维浸泡于体积6倍碳纤维体积的沸水浴中处理4h后，取出短切碳纤维，用蒸馏水冲洗干净，放入风箱烘干，取出备用。
[0025]成球碳纤维载体固定化细胞的种子培养液:木糖(20g/l),葡萄糖(20g/l),酵母浸粉(10g/l)，硫酸镁(0.04g/l)，磷酸氢钾(0.4g/l)，pH 为 4.0 ?5.5。
[0026]成球碳纤维载体固定化细胞的发酵培养液:木糖(80g/l),葡萄糖(15g/l),酵母浸粉(8g/l)，pH为4.0?5.0，首先将培养液在121 °C的高温下灭菌20min，得到菌体发酵培养液留作备用；然后按照20%的装液量分别加入到三组250ml摇瓶中，并对三组摇瓶分别进行如下操作:
(1)在含发酵培养液的摇瓶投入10g/L的备用预处理碳纤维后，放入摇床中摇动4h，使碳纤维形成大小均一、高径比为1/0.6?0.6/1的球团；之后对含已成球培养液进行接种，接种量为5%,接着放入转速为180rpm的摇床中，按照每48h为一批进行连续发酵十批。
(2)将一个含发酵培养液的摇瓶按照5%的接种量进行接种，待24h菌种成长后取出，然后按照10g/L的投入量投入备用预处理碳纤维，接着放入转速为ISOrpm的摇床中，按照每48h为一批进行连续发酵十批。
(3)将一个含发酵培养液的摇瓶按照10g/L的投入量投入备用预处理碳纤维后，迅速按照5 %的接种量进行接种，然后放入转速为ISOrpm的摇床中，按照每48h为一批进行连续发酵十批。
其中每批次发酵结束时需进行换液:在第一批发酵结束时保留所有成球碳纤维球团及约30%的发酵液，同时加入新配制的补液进行第二批的发酵。同样在第二批发酵结束时再次保留所有成球碳纤维球团及约30%的发酵液，加入新配制的补液进行第三批的发酵。以此类推进行十批发酵，并对发酵产率和固定化效率进行检测。
[0027]每次所得产物的固定化效果及木糖醇得率通过以下方法测定:
(1)固定化效率的测量方法采用的是重量法:细胞/酶的固定化效率计算为固定菌重/总菌重或固定酶重/总酶重);而载体固定化效率计算为固定菌重/载体重量(g/g);
(2)木糖醇测定方法采用国标法
(3)成球碳纤维载体的抗拉强度的测定:依据国标6B3354-82，利用电子拉伸机进行测定。
[0028]本实施例中测得连续发酵过程中，成球碳纤维载体的固定化效率1.0?1.2g/g，细胞的固定化效率为33?35%，成球碳纤维载体固定化细胞可连续发酵使用10次，木糖醇的产率可达70?72% (以初始木糖计)；本实施例测得细胞固定化载体的抗拉强度为3500兆帕。
【权利要求】
1.一种固定化细胞，其特征在于，可采用以下方法制成，包括以下步骤: (1)碳纤维预处理:将碳纤维切成长度为0.3cm?0.8cm短切碳纤维放入有机溶剂中浸泡3?5h，过滤或离心回收上清液，用相当于3?5倍碳纤维体积的水对短切碳纤维进行清洗，然后将清洗后的短切碳纤维浸泡于体积大于3倍碳纤维体积的沸水浴中处理3?5h后，用水清洗，烘干，取出备用； (2)制备细胞种子菌:在无菌条件下，将细胞接种到斜面培养基上，在温度为28?32°C的条件下培养20?30h，形成种子菌； (3)固定化细胞:可采用以下三种方法之一进行，(a)先将步骤(1)中备用的短切碳纤维，以投入量为2.0?20g/L投入无菌种子培养液中，放置于摇床中，控制摇床转速为120rpm?220rpm,摇动0.5?4h,可控成球，即得成球碳纤维载体；然后将步骤(2)中制备的细胞种子菌以2%?8%接种到上述含成球碳纤维载体的无菌种子培养液中，放置于摇床中，在28?32°C,控制摇床转速为120rpm?220rpm,摇动4?24h,即得成球碳纤维载体固定化细胞；或 (b)先将步骤(2)中制备的细胞种子菌以2%?8%接种无菌种子培养液中，放置于摇床中，在28?32°C，控制摇床转速为120rpm?220rpm，摇动12?24h，即得扩大培养的细胞种子菌；然后将步骤(1)中备用的短切碳纤维，以投入量为2.0?20g/L投入上述含扩大培养的细胞种子菌的种子培养液中，然后放置于摇床中，控制摇床转速为120rpm?220rpm,摇动0.5?4h，可控固定化，即得成球碳纤维载体固定化细胞；或 (c)先将步骤(1)中备用的短切碳纤维，以投入量为2.0?20g/L投入无菌种子培养液中，然后迅速以2%?8%接种量接种步骤(2)制备的细胞种子菌中，放置于摇床中，控制摇床转速为120rpm?220rpm,摇动12?24h,可控固定化，即得成球碳纤维载体固定化细胞。
2.根据权利要求1所述的固定化细胞，其特征在于，所述制备方法的步骤(1)中，将碳纤维切成长度为0.4?0.6cm短切碳纤维放入丙酮中浸泡4h，过滤或离心回收上清液，用相当于5倍碳纤维体积的蒸馏水对短切碳纤维进行清洗，然后将清洗后的短切碳纤维浸泡于体积6倍碳纤维体积的沸水浴中处理4h后，用蒸馏水清洗，烘干，取出备用。
3.根据权利要求1或2所述的固定化细胞，其特征在于，所述制备方法的步骤(1)中，所述短切碳纤维选自2k碳纤维、3k碳纤维、6k碳纤维、24k碳纤维、补强布中的任一种。
4.根据权利要求3所述所述的固定化细胞，其特征在于，所述短切碳纤维选自6k碳纤维。
5.根据权利要求1?3之一所述的固定化细胞，其特征在于，所述制备方法的步骤(3)中，将备用的短切碳纤维，以等量方式每隔0.5?5分钟投入一次，共投放3?5次。
6.根据权利要求1?3之一所述的固定化细胞，其特征在于，所述制备方法的步骤(3)中，所述短切碳纤维投入量为2.5?15g/L ;在250mL摇瓶中，所述含无菌种子培养液的量相当于10?50倍碳纤维体积。
7.根据权利要求1?3之一所述的固定化细胞，其特征在于，步骤(3)中，所述细胞种子菌的接种量为5%。
8.根据权利要求1?7之一所述的固定化细胞在多批次发酵生产木糖醇中的应用。
9.根据权利要求7所述的固定化细胞在多批次发酵生产木糖醇中的应用，其特征在于，在第一批发酵结束时保留所有成球碳纤维球团及20%?30%的发酵液，同时加入新配制的补液进行第二批的发酵，同样在第二批发酵结束时再次保留所有成球碳纤维球团及20%?30%的发酵液，加入新配制的补液进行第三批的发酵，以此类推进行十批发酵。
【文档编号】C12N11/14GK104404025SQ201410651984
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】王乐, 王金水, 尹艳丽, 胡元森 申请人:河南工业大学