专利名称：一种固定化酵母细胞的微胶囊制备方法
技术领域：
本发明涉及一种微胶囊制备方法，具体地说涉及一种固定化酵母细胞的微胶囊的制备方法。
背景技术：
酵母细胞固定化技术最早主要用在酿造工业，但随着基因工程技术的发展，酵母细胞作为基因重组的宿主细胞优势日益体现，因此，研究酵母细胞的固定化具有新的应用价值。目前，应用较多的是海藻酸盐固定化[文献1L.Kurillova，P.Gemeiner，A.Vikartovska，H.Mikova，M.Rosenbergand M.Ilavsky.Calcium pectate gel beads for cell entrapment.6.morphologyof stabilized and hardened calcium pectate gel beads with cells forimmobilized biotechnology.J.microencapsulation，2000，17(3)279-296]。但仍然存在许多问题，如海藻酸钙颗粒较大，影响溶质在固定化细胞凝胶中的扩散[文献2Viktor A.Nedovic，Bofana Obradovic，Ida Leskoosek-Cukalovic，Oliivera Trifunovic，Radofica Pesic，Branko Bugarski.Electrostaticgeneration of alginate microbeads loaded with brewing yeast.Processbiochemistry 2001，37(1)17-22]；细胞泄漏[文献3Yoshimitsu Uemura，NaokiHamakawa，Hidekazu Yoshizawa，Hiroki Ando，Kazuya Ijichi，and Yasuo Hatate.Effect of calcium alginate coating on the performance of immobilized yeastcells in calcium alginate beads.Chem.Eng.Comm.2000，1771-14]等。
发明内容
本发明针对上述问题提出在制备出小粒径海藻酸钙微胶珠的基础上，进一步处理制备成一种新型的酵母细胞固定化技术-海藻酸钠-聚赖氨酸/壳聚糖微胶囊。与传统的海藻酸钙固定化技术相比，本发明用大功率微胶囊制备仪[文献4马小军，任吉伦，何洋。大功率高压脉冲微胶囊制备仪。中国发明专利00253538.6]制备出粒径在500μm以下的微胶珠，产量为700ml/h，再在胶珠表面通过离子络合反应瞬间形成一层聚赖氨酸/壳聚糖微胶囊膜，最后用柠檬酸钠溶液将微胶囊内部海藻酸钙凝胶液化，使微胶囊内成液体环境。本发明的制备工艺特点是①条件温和，制备过程中酵母细胞损失很少，细胞活性保持100％；②由于聚赖氨酸/壳聚糖微胶囊膜的存在，与海藻酸钙胶珠相比，酵母细胞在培养过程中细胞泄漏明显减少；③由于微胶囊粒径小，降低了溶质的扩散距离；④微胶囊内为液体环境，有利于溶质在固定化细胞中的扩散；⑤选用的成膜材料综合了聚赖氨酸成膜强度高和壳聚糖价格低廉的优势；⑥用大功率微胶囊制备仪可以实现大规模制备酵母细胞的固定化载体。
本发明的原理是在原有海藻酸盐固定化细胞的基础上，通过大功率微胶囊制备仪，使均匀混合有酵母细胞的海藻酸钠溶液在高压静电场作用下，形成粒径在100-500μm可控，分布均匀的液滴，与钙溶液固化形成微胶珠。并在微胶珠表面通过离子络合反应瞬间形成一层聚赖氨酸/壳聚糖微胶囊膜。再用柠檬酸钠溶液置换出海藻酸钙凝胶中的钙，使微胶囊内液化成液体环境(见图1)。
本发明的制备方法中，其主要制步骤为1)通过大功率微胶囊制备仪，将均匀混合有酵母细胞的海藻酸钠溶液在高压静电场作用下，形成液滴；所述的酵母细胞包括啤酒酵母、热带假丝酵母、毕氏酵母等各种用于食品加工业的酵母细胞及各种能够表达外源基因的基因工程酵母细胞。
所述的海藻酸钠浓度在8-30g/L；所述的液滴其粒径在100-500μm可控，分布均匀，且具有良好的单分散性。
2)步骤1的液滴与钙溶液固化形成海藻酸钙微胶珠，并与聚赖氨酸/壳聚糖溶液反应成膜，在微胶珠表面形成一层聚赖氨酸/壳聚糖微胶囊膜；所述氯化钙浓度在0.05-0.3mol/L；所述聚赖氨酸/壳聚糖溶液中，聚赖氨酸分子量在1-10万，聚赖氨酸溶液浓度在0.1-10g/L；壳聚糖的脱乙酰度＞90％，粘均分子量在1-15万，壳聚糖溶液浓度在1-10g/L，pH在4.5-7.4；所述反应成膜时间在5-60分钟，膜厚在5-80μm范围内可控。
3)用柠檬酸钠溶液将步骤2制得的微胶囊内部海藻酸钙凝胶液化，使微胶囊内成液体环境；所述柠檬酸钠溶液浓度在0.01-0.10mol/L。
本发明提供的方法是在全生理条件下制备，其制备过程条件温和pH5.0-7.4；4-30℃；无剪切及振荡。制备过程中酵母细胞活性100％保持。
本发明系统中制备的固定化酵母细胞的聚赖氨酸/壳聚糖微胶囊在培养过程中细胞的泄漏率低于10％。
本发明制备的微胶囊粒径小于通常的固定化载体，且微胶囊内部为液体环境，极大改善了固定化载体的传质问题，使培养过程中囊中心区的酵母细胞仍然存活，保证酵母细胞的有效利用率。而且，由于微胶囊在原有海藻酸钙胶珠的基础上覆盖一层聚赖氨酸/壳聚糖微胶囊膜，减少了培养过程中酵母细胞泄漏现象的发生，提高酵母细胞固定化发酵的产率。另外，本发明提供的制备方法其产率高达700ml/h，初步实现规模化。
图1为本发明的制备过程示意图。
图2a为本发明制备的包埋有酵母细胞的海藻酸钠-聚赖氨酸/壳聚糖微胶囊显微镜照片。
图2b为本发明制备的包埋有酵母细胞的海藻酸钠-聚赖氨酸/壳聚糖微胶囊培养24小时后的显微镜照片。
具体实施例方式
例1请参照图1，将悬浮培养处于对数生长期的酵母菌GS115离心收集菌体，与15g/L的海藻酸钠溶液均匀混合。在大功率微胶囊制备仪的高压电场作用下滴入100mmol/L的氯化钙溶液中进行凝胶化反应30分钟，制备出粒径在300μm海藻酸钙凝胶珠，然后与0.5g/L的聚赖氨酸和5g/L壳聚糖的混合溶液成膜反应10分钟，生理盐水清洗3遍后55mmol/L柠檬酸钠溶液液化10分钟，生理盐水清洗3遍后制备出聚赖氨酸/壳聚糖微囊化酵母菌，囊膜厚为65μm。整个制备过程均在生理条件下完成，制备过程中酵母细胞存活率100％保持。
例2将配制的用于制备微胶囊膜的聚赖氨酸及壳聚糖溶液分别与酵母细胞充分接触30分钟后，稀释平板法测定其对酵母细胞活性的影响，结果表明与对照组相比与聚赖氨酸及壳聚糖接触后的活酵母细胞数未减少，证实聚赖氨酸及壳聚糖溶液对酵母细胞活性无影响。
例3将制备好的含有酵母细胞的海藻酸钠-聚赖氨酸/壳聚糖与海藻酸钙微胶珠置于YPD培养液中，摇瓶培养，28℃，180rpm，培养24小时后(参见图2a和图2b)，计算酵母细胞泄漏率。结果表明，海藻酸钠-聚赖氨酸/壳聚糖微胶囊组细胞的泄漏率比海藻酸钙微胶珠组降低3倍以上。
比较例文献2采用静电液滴法制备出粒径在250-2000μm的固定化酵母细胞的海藻酸钙胶珠。虽然解决了小粒径问题，但产率低(仅25.2ml/h)。本发明制备的固定化酵母细胞的海藻酸钙胶珠粒径在100-500μm范围可控，且制备效率高达700ml/h。
文献3通过制备双层海藻酸钙凝胶来减少细胞泄漏，虽然在解决细胞泄漏问题上有一定的效果，但制备的胶珠粒径在3mm，大粒径载体在培养过程中，载体中心部分的酵母细胞由于受传质阻力的影响无法获得充分的营养供应。本发明制备的固定化酵母细胞的海藻酸钠-聚赖氨酸/壳聚糖微胶囊既减少了细胞泄漏，又通过小粒径(可控制在100-500μm范围)和内部液体环境解决了传质问题。
权利要求
1.一种固定化酵母细胞的微胶囊制备方法，其主要步骤为a)通过大功率微胶囊制备仪，将均匀混合有酵母细胞的海藻酸钠溶液在高压静电场作用下，形成液滴；b)步骤a的液滴与钙溶液固化形成海藻酸钙微胶珠，并与聚赖氨酸/壳聚糖溶液反应成膜，在微胶珠表面形成一层聚赖氨酸/壳聚糖微胶囊膜；c)用柠檬酸钠溶液将步骤b制得的微胶囊内部海藻酸钙凝胶液化，使微胶囊内成液体环境；所述海藻酸钠浓度在8-30g/L；所述氯化钙浓度在0.05-0.3mol/L；所述聚赖氨酸分子量在1-10万，聚赖氨酸溶液浓度在0.1-10g/L；所述壳聚糖的脱乙酰度＞90％，粘均分子量在1-15万，壳聚糖溶液浓度在1-10g/L，pH在4.5-7.4；所述柠檬酸钠溶液浓度在0.01-0.10mol/L。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的酵母细胞包括啤酒酵母、热带假丝酵母、毕氏酵母及基因工程酵母菌。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的液滴其粒径在100-500μm。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中所述的海藻酸钙凝胶珠与聚赖氨酸/壳聚糖溶液反应成膜时间在5-60分钟。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中所述的聚赖氨酸/壳聚糖微胶囊膜厚为5-80μm。
全文摘要
一种固定化酵母细胞的海藻酸钠－聚赖氨酸/壳聚糖微胶囊制备方法，在原有海藻酸盐固定化细胞的基础上，通过大功率微胶囊制备仪，使均匀混合有酵母细胞的海藻酸钠溶液在高压静电场作用下，形成粒径在100－500μm可控，分布均匀的液滴，与钙溶液固化形成微胶珠。并在微胶珠表面通过离子络合反应瞬间形成一层聚赖氨酸/壳聚糖微胶囊膜。再用柠檬酸钠溶液置换出海藻酸钙凝胶中的钙，使微胶囊内液化成液体环境。本发明是在全生理条件下制备，其制备过程条件温和pH5.0－7.4；4－30℃；无剪切及振荡。制备过程中酵母细胞活性100％保持。在培养过程中细胞的泄漏率低于10％。
文档编号C12N11/02GK1616657SQ20031011815
公开日2005年5月18日 申请日期2003年11月10日 优先权日2003年11月10日
发明者马小军, 于炜婷, 雄鹰 申请人:中国科学院大连化学物理研究所