一种基于微载体细胞的细胞固定相及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于微载体细胞的细胞固定相及其制备方法，将细胞培养于微载体表面，经多聚甲醛固定后，以微载体培养的细胞连同支撑其生长的微载体作为固定相，湿法装柱制备细胞色谱柱。应用该方法制备固定相，操作简单，反应条件温和，且易于放大，该固定相具有细胞的特性，且保持了细胞原有的基本特性，药物的受体也保持基本的空间结构，应用此法制备的细胞固定相可应用于药物筛选，提高药物筛选的特异性。
【专利说明】一种基于微载体细胞的细胞固定相及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞膜色谱【技术领域】，涉及一种基于微载体的细胞固定相及其制备方法。
【背景技术】
[0002]细胞膜色谱法（CMC)是贺浪冲教授及其课题组于1996提出的一种生物亲和色谱法，适用于中药复杂体系中活性成分的筛选和分离，该方法是以硅胶为载体，将细胞膜与硅胶混合以后填充色谱柱，制备细胞膜色谱柱，结合高效液相色谱法筛选中药材中的活性成分，药物筛选的靶点为细胞膜上的受体，细胞膜色谱可以直接从中药提取的复杂成分中识别出可以与药物靶点作用的活性成分，是一种快速高效的筛选方法。然而，细胞膜色谱也存在一些缺陷，CMC法用的是自然生物膜（组织细胞），膜受体的密度较小，柱效较低，色谱柱寿命通常比较短，其分离的重现性和精密度得不到保证，自然生物膜存在有多种活性蛋白， 药物可能与多种受体或通道蛋白结合，尚不能完全模拟体内复杂环境以及机体内其他系统对药物发挥药效作用的影响。
[0003]微载体是指直径是60-250 u m,能够适用于贴壁型细胞生长的微球，细胞培养最早使用离子交换凝胶作为载体，开始于19世纪60年代末期，轻微搅动即可悬浮在培养基中， 这种微载体带有电荷，利于细胞贴附于载体上进行生长繁殖。载体处于悬浮状态时，这样既可大大增加细胞附着面积，又使细胞能与培养基充分接触，进而有利于细胞的生长，因此能达到大量培养细胞的目的。微载体选择应以利于细胞贴壁生长，又无毒性为原则，然而离子交换凝胶作为载体存在许多缺点，如在一定程度上对细胞有毒性，对培养基的PH也有一定影响，因而近年来对载体进行了改良，目前使用的载体主要有三种类型，它们都是带有不同基团的葡聚糖交联而成的大分子，分别为I、II、111型Cytopore (Cytodexl、2、3)。由于微载体所带有的基团不同，就决定了它们之间的差异，I型载体是整个载体带正电荷，II型仅表面带有正电荷，III型不带有电荷，其外表面被胶原层包裹，同样适于细胞附着和生长。 Cytopore微载体的大孔结构促进细胞向微球内生长,小孔提供尽可能多的营养成分。这种特点可帮助需要高循环率和高营养的细胞生长。微载体比离子交换凝胶有明显的优点：① 大小和表面性质更适宜细胞生长；②具有一定的透明度，便于显微镜观察无毒性，适于各类细胞附着生长。
[0004]微载体培养技术是一种新兴的大规模细胞培养技术，具有比表面积大，兼有悬浮培养和贴壁培养等优点，放大容易，在微球表面培养细胞可以在较短时间内得到大量的细胞，且细胞传代只需要添加新的微载体，基本上可避免细胞在胰酶消化过程中受到的损伤， 因此微载体培养细胞技术是非常方便和有意义的。
【发明内容】
[0005]本发明解决的问题在于提供一种基于微载体细胞的细胞固定相及其制备方法，该固定相具有单一细胞的特性，且保持了细胞原有的基本特性，药物的受体也保持基本的空间结构。
[0006]本发明是通过以下技术方案来实现：
[0007]—种基于微载体细胞的细胞固定相，其特征在于，包括色谱柱，色谱柱中填充有作为色谱固定相的微载体细胞；所述的微载体细胞是将贴壁生长于微载体表面的细胞，通过交联链固定于微载体表面而得到的。
[0008]所述的微载体为葡聚糖凝胶制备的微载体Cytodex，所述的细胞为细胞膜上表达有能够与药物结合的受体的细胞，所述的交联链是利用多聚甲醛与细胞中的蛋白质末端基团之间形成交联链，而固定于微载体表面。
[0009]所述微载体细胞通过湿法装入色谱柱中。
[0010]一种基于微载体细胞的细胞固定相的制备方法，包括以下操作：
[0011]I)将微载体置于娃化的培养容器中，活化后灭菌,然后加入DMEM培养基过夜,临用前吸弃原培养基，换37°C温热的DMEM培养基，制成微载体悬液；
[0012]2)将微载体悬液置入培养容器中，接种细胞悬液,然后加入DMEM培养液；将培养容器直立于CO2培养箱中培养2~3h,去除旋转摇动I~2min ;之后每I~2小时摇一次, 每12~24h更换一次培养基；
[0013]3)待细胞贴壁生长于微载体后，取处于对数期贴壁生长于微载体上的细胞悬液， 加入质量浓度4%的多聚甲醛溶液，室温固定15~30min后，将细胞通过交联链固定于微载体表明，得到微载体细胞；
[0014]4)将微载体细胞作为色谱固定相，湿法装入色谱柱中，得到用于药物筛选的细胞色谱柱。
[0015]所述的微载体为葡聚糖凝胶制备的微载体Cytodex,直径为100~250 ii m,其活化为：将微载体置于硅化的容器中，用PH=7. 4的PBS冲液洗涤后，更换新鲜的PBS浸泡过夜；
[0016]活化后的灭菌为高压灭菌，灭菌后换新鲜的培养基浸泡过夜，临用前吸弃原培养基，换37°C温热的DMEM培养基，并调整微载体的含量为10~20mg/ml。
[0017]所述的DMEM培养基中还添加有0. 3mg/l的G418，以及体积浓度10%的FBS。
[0018]所述的容器的硅化为：将容器洗净烘干，浸泡于质量浓度5%的二甲基硅油-乙酸乙酯溶液中均匀硅化4h后，捞起空干，以超纯水洗3次并浸泡过夜，烘干备用。
[0019]所述的细胞接种是将细胞密度为I X IO5~I X IO7个/ml的细胞悬液，吸取2~ 5ml接种到已加入微载体悬液的培养瓶中，再加入10~15ml的DMEM培养基，终体积为15~ 20ml o
[0020]所述的多聚甲醛溶液是用PBS配制的，加入多聚甲醛溶液后，多聚甲醛与细胞中的蛋白质末端基团之间形成交联链，将贴壁生长于微载体上的细胞固定于微载体表面。
[0021]所述的基于微载体细胞的细胞固定相在筛选载体细胞能够保留药物中的应用。
[0022]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0023]本发明提供的基于微载体细胞的细胞固定相及其制备方法，以贴壁生长的细胞代替CMC法中的细胞膜，以微载体培养的细胞连同支撑其生长的微载体作为固定相，免去了原来制备细胞膜和硅胶结合的过程，该固定相具有单一细胞的特性，且保持了细胞原有的基本特性，药物的受体也保持基本的空间结构。所制备的细胞固定相可以提高药物筛选的特异性，对阐明药物作用机理具有重要的意义；可应用于筛选载体细胞能够保留的药物。
4[0024]本发明提供的基于微载体细胞的细胞固定相及其制备方法，将细胞培养于微载体表面，利用微载体培养细胞，容易实现细胞的固定化，比表面积较大，为细胞提供了适宜的生长空间，放大容易；而且微载体适宜贴壁细胞在其表面的生长，且透明便于在显微镜下观察细胞的状态。
[0025]本发明提供的基于微载体细胞的细胞固定相及其制备方法，经多聚甲醛固定后， 以微载体培养的细胞连同支撑其生长的微载体作为固定相，湿法装柱制备细胞色谱柱。固定后的细胞保持了正常细胞的基本特性和蛋白结构，更能有效模拟体内的环境。将固定后的细胞作为固定相填装制备色谱柱可以更为深入的研究药物与受体的相互作用。而且其操作简单，反应条件温和，且易于放大。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图I显微镜下观察细胞在Cytodex上的生长状态；其中A为空载体Cytodex，B为 FGFR4细胞；
[0027]图2电镜下观察的细胞固定相；A为空载体Cytodex，B为FGFR4细胞；
[0028]图3大黄素在固定化ECV304细胞色谱固定相上保留色谱图；a为大黄素（空白微载体)，b为大黄素(长有细胞的微载体)，c为甲醇(作为对照）；峰I为大黄素峰。
【具体实施方式】
[0029]本发明提供的基于微载体细胞的细胞固定相，包括色谱柱，色谱柱中填充有作为色谱固定相的微载体细胞；所述的微载体细胞是将贴壁生长于微载体表面的细胞，通过交联链固定于微载体表面而得到的。这样以贴壁生长的细胞代替CMC法中的细胞膜，以微载体培养的细胞连同支撑其生长的微载体作为固定相，免去了原来制备细胞膜和硅胶结合的过程，该固定相具有单一细胞的特性，且保持了细胞原有的基本特性，药物的受体也保持基本的空间结构。应用此法制备的细胞固定相可以提高药物筛选的特异性，对阐明药物作用机理具有重要的意义。
[0030]所提供的基于微载体细胞的细胞固定相的制备方法，包括以下操作：
[0031]I)将微载体置于娃化的培养容器中，活化后灭菌,然后加入DMEM培养基过夜，临用前吸弃原培养基，换37°C温热的DMEM培养基，制成微载体悬液；
[0032]2)将微载体悬液置入培养容器中，接种细胞悬液,然后加入DMEM培养液；将培养容器于直立于CO2培养箱中培养2~3h,去除旋转摇动I~2min ;之后每I~2小时摇一次，每12~24h更换一次培养基；
[0033]3)待细胞贴壁生长于微载体后，取处于对数期贴壁生长于微载体上的细胞悬液， 加入质量浓度4%的多聚甲醛溶液，室温固定15~30min后，将细胞通过交联链固定于微载体表明，得到微载体细胞；
[0034]4)将微载体细胞作为色谱固定相，湿法装入色谱柱中，得到用于药物筛选的细胞色谱柱。
[0035]下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0036]实施例I[0037]基于微载体细胞的FGFR4细胞色谱柱的制备，包括以下操作：
[0038]1)微载体的处理
[0039]玻璃器皿的前处理：将所有用于微载体前处理使用的玻璃器皿洗净烘干，浸泡于 5%的二甲基硅油-乙酸乙酯溶液中均匀硅化4h后，捞起空干，以超纯水洗3次并浸泡过夜， 烘干备用。
[0040]微载体Cytodex的处理：称取0. 2g微载体Cytodex置于娃化的烧杯中，用20mL无钙镁的PBS(PH=7. 4)洗涤2次，换新鲜的PBS浸泡过夜，高压灭菌，吸弃PBS，换新鲜的DMEM 培养基(含0. 3mg/l的G418，10%的FBS)浸泡过夜，临用前吸弃原培养基，换37°C温热的培养基适量，并调整瓶内培养基的含量为20mg/ml。
[0041]培养瓶表面的处理：将硅化好的培养瓶高压灭菌后备用，临用前用培养基润洗。
[0042]2)细胞接种
[0043]①将处理好的微载体悬液5mL加到处理好的培养瓶中。
[0044]②取生长状态良好的成纤维生长因子受体（FGFR4)细胞，用胰蛋白酶消化成细胞悬液，计数，调整细胞密度为I X IO5个/ml，吸取5ml接种到已加入微载体的培养瓶中，再加入15ml的培养基。
[0045]③将培养瓶直立于CO2培养箱中2h后,取出旋转摇动Imin,之后每2小时摇一次， 每24h更换一次培养基。
[0046]3)细胞培养过程观察
[0047]在细胞微载体培养的过程中，进行持续的、动态的观察，并且记录细胞生长过程中出现的变化包括细胞形态，数量以及细胞移动情况的变化。
[0048]显微镜下观察细胞在Cytodex上的生长状态如图I所示，可见看到细胞在Cytodex 上生长良好。
[0049]4)微载体表面细胞的固定
[0050]取处于对数期贴壁生长于微载体表面的FGFR4细胞，室温固定15min，即得细胞固定相。
[0051]电镜下观察的细胞固定相如图2所示，可以看到细胞均被固定在微载体的表面上。
[0052]5)色谱柱的制备
[0053]取固定好的微载体细胞作为色谱固定相，湿法装入预先制备好的色谱柱中，即得 FGFR4细胞色谱柱。
[0054]实施例2
[0055]与实施例I不同之处在于，用人脐静脉血管内皮细胞（ECV304)代替成纤维细胞生长受体（FGFR4)细胞，ECV304细胞用DMEM培养基培养，其他操作按照实施例I制备ECV304 细胞色谱柱。
[0056]进一步，用所制备的ECV304色谱柱分析大黄素在ECV304细胞色谱上的保留，具体如下：
[0057]大黄素对照品溶液的配制：取大黄素适量，加甲醇溶解并定容至10ml，得浓度为
0.5mg/ml o
[0058]流动相：0.8%NaH2P04-0 . 9 74%Na2HP04 (20 : 80)，其中每 100ml 加 NaClO. 432g ；
6[0059]色谱柱：10mmX1mm ;
[0060]流速：0.2ml/min ;检测波长：254nm。
[0061]检测结果如图3所示，其中a为大黄素（空白微载体)，b为大黄素(长有细胞的微载体)，c为甲醇(作为对照）；峰I为大黄素峰。可以看到所制备的ECV304色谱柱能够对大黄素具有一定的保留，从而在其洗脱后出现波峰。
[0062]上述检测表明本发明所制备的基于微载体细胞的细胞固定相，具有单一细胞的特性，且保持了细胞原有的基本特性，药物的受体也保持基本的空间结构。可以应用于筛选载体细胞能够保留的药物。
【权利要求】
1.一种基于微载体细胞的细胞固定相，其特征在于，包括色谱柱，色谱柱中填充有作为色谱固定相的微载体细胞；所述的微载体细胞是将贴壁生长于微载体表面的细胞，通过交联链固定于微载体表面而得到的。
2.如权利要求1所述的基于微载体细胞的细胞固定相，其特征在于，所述的微载体为葡聚糖凝胶制备的微载体Cytodex，所述的细胞为细胞膜上表达有能够与药物结合的受体的细胞，所述的交联链是利用多聚甲醛与细胞中的蛋白质末端基团之间形成交联链，而固定于微载体表面。
3.如权利要求1所述的基于微载体细胞的细胞固定相，其特征在于，所述微载体细胞通过湿法装入色谱柱中。
4.一种基于微载体细胞的细胞固定相的制备方法，其特征在于，包括以下操作：1)将微载体置于硅化的培养容器中，活化后灭菌，然后加入DMEM培养基过夜，临用前吸弃原培养基，换37°C温热的DMEM培养基，制成微载体悬液；2)将微载体悬液置入培养容器中，接种细胞悬液，然后加入DMEM培养液；将培养容器直立于CO2培养箱中培养2~3h,去除旋转摇动I~2min ;之后每I~2小时摇一次,每 12~24h更换一次培养基；3)待细胞贴壁生长于微载体后，取处于对数期贴壁生长于微载体上的细胞悬液，加入质量浓度4%的多聚甲醛溶液，室温固定15~30min后，将细胞通过交联链固定于微载体表明，得到微载体细胞；4)将微载体细胞作为色谱固定相，湿法装入色谱柱中，得到用于药物筛选的细胞色谱柱。
5.如权利要求4所述的基于微载体细胞的细胞固定相的制备方法，其特征在于，所述的微载体为葡聚糖凝胶制备的微载体Cytodex，直径为100~250 u m，其活化为：将微载体置于硅化的容器中，用PH=7. 4的PBS冲液洗涤后，更换新鲜的PBS浸泡过夜；活化后的灭菌为高压灭菌，灭菌后换新鲜的培养基浸泡过夜，临用前吸弃原培养基，换 37°C温热的DMEM培养基，并调整微载体的含量为10~20mg/ml。
6.如权利要求4或5所述的基于微载体细胞的细胞固定相的制备方法，其特征在于，所述的DMEM培养基中还添加有0. 3mg/l的G418，以及体积浓度10%的FBS。
7.如权利要求4或5所述的基于微载体细胞的细胞固定相的制备方法，其特征在于，所述的容器的硅化为：将容器洗净烘干，浸泡于质量浓度5%的二甲基硅油-乙酸乙酯溶液中均匀硅化4h后，捞起空干，以超纯水洗3次并浸泡过夜，烘干备用。
8.如权利要求4所述的基于微载体细胞的细胞固定相的制备方法，其特征在于，所述的细胞接种是将细胞密度为I X IO5~I X IO7个/ml的细胞悬液，吸取2~5ml接种到已加入微载体悬液的培养瓶中，再加入10~15ml的DMEM培养基，终体积为15~20ml。
9.如权利要求4所述的基于微载体细胞的细胞固定相的制备方法，其特征在于，所述的多聚甲醛溶液是用PBS配制的，加入多聚甲醛溶液后，多聚甲醛与细胞中的蛋白质末端基团之间形成交联链，将贴壁生长于微载体上的细胞固定于微载体表面。
10.权利要求1所述的基于微载体细胞的细胞固定相在筛选载体细胞能够保留药物中的应用。
【文档编号】C12Q1/02GK103525801SQ201310419338
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月13日 优先权日:2013年9月13日
【发明者】王嗣岑, 贺浪冲, 黄静, 张涛, 张 杰, 李西玲, 魏芬 申请人:西安交通大学