一种利用多菌株固定化细胞组合物连续生产4-羟基肉桂醇的方法
【专利摘要】本发明涉及多菌株固定化细胞组合物连续生产4?羟基肉桂醇的方法。该方法所用A菌株为重组菌株E.coli M15?4Cl?CCR，B菌株为重组菌株E.coli M15?CAD；具体操作步骤如下：1、菌株培养；2、菌株的固定化，分别制得A菌株固定化细胞颗粒和B菌株固定化细胞颗粒；3、固定化细胞连续生产4?羟基肉桂醇。本发明采用现代生物工程技术进行4?羟基肉桂醇的生产，将多菌株固定化细胞组合物连续生产的方法运用于植物然代谢物的合成，具有重要的实践意义。同时建立了4?羟基肉桂醇的高效液相色谱串联质谱检测方法，为这类芳香族聚合物提供更有效的分析手段。
【专利说明】
-种利用多菌株固定化细胞组合物连续生产4-哲基肉桂醇的 方法
技术领域
[0001]本发明属于酶工程技术领域，具体设及采用细胞固定化技术生产4-径基肉桂醇的 方法。
【背景技术】
[000^ 4-径基肉桂醇是一类植物天然代谢物，包括香豆醇，咖啡醇，松柏醇和芥子醇。它 们是多种植物次生代谢物生物合成的中间体，如香兰素、木脂素等。其中香豆醇，松柏醇和 芥子醇是木质素的=个基本组成单元，对于水分运输、机械支持和植物病原体防御有重要 作用。此外，运类醇还有重要的医药价值。例如，松柏醇还是合成水飞劑宾的重要中间体，可 用于治疗肝脏疾病。研究4-径基肉桂醇类物质对于探究与其相关的生物合成和加工过程十 分必要，是研究开发生物医学类药物至关重要的一步。
[0003] 从植物中直接提取运类醇的方法具有一定的局限性，如较长的生长周期，繁琐的 分离步骤，低产率，W及易受环境因素影响等。利用化学合成法生产存在操作步骤繁琐、产 率低、副产物多和难于纯化等问题。利用微生物固定化细胞生产醇是化学合成法的另一种 替代方法。与传统的合成技术相比较，细胞固定化技术具有W下主要优点：（1)细胞密度高， 反应速度加快，有较高的生产能力；（2)细胞被固定化后，不会产生流失现象，分离纯化过程 中菌体细胞易分离；（3)可W多次重复使用或连续使用；（4)对外界环境缓冲作用大，细胞不 受剪切效应影响，对抗污染能力提高；巧)无需辅酶再生，节约成本。
[0004] 现有固定化技术研究很多，但多研究局限于单一菌株的固定化。4-径基肉桂醇生 产工艺设及巧巾主要的酶和相关技术过程:4-香豆酸:辅酶A连接酶(4化)将4-径基肉桂酸转 化为4-径基肉桂酸辅酶A衍生物，肉桂酷辅酶A还原酶(CCR)将4-径基肉桂酸辅酶A衍生物转 化为4-径基肉桂醒，肉桂醇脱氨酶(CAD)将4-径基肉桂醒转化为4-径基肉桂醇。本发明将4- 径基肉桂醇生产相关微生物分别固定化，形成多菌株固定化细胞组合物连续生产的方法， 提高了生产效率。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有4-径基肉桂醇制备工艺上的不足，采用细胞固定化技术将4-径基 肉桂醇生产相关的微生物菌株固定，形成多菌株固定化细胞组合物连续生产的方法，并且 建立了 4-径基肉桂醇的高效液相色谱串联质谱检测方法。
[0006] 多菌株固定化细胞组合物连续生产4-径基肉桂醇(香豆醇，咖啡醇和松柏醇）的方 法，具体操作步骤如下： 1、菌株培养 所用菌株为A菌株和B菌株； A菌株为重组菌株怎M15-4C1-CCR，诱导后能高效表达融合双功能酶4C1-CCR，具 有4C1和CCR两种酶的催化活力，可将4-径基肉桂酸转化为4-径基肉桂醒； B菌株为重组菌株怎.CO^ M15-CAD;诱导后能高效表达CAD,可将4-?基肉桂醒转化为 4-径基肉桂醇； LB固体培养基，Wg/L计，膜蛋白腺10，酵母提取物5，NaCl 10，pH7.5，氨节青霉素0.1，卡 那霉素0.025 ; LB液体培养基，Wg/L计，膜蛋白腺10，酵母提取物5，化Cl 10，琼脂粉15， pH7.5，氨节青霉素0.1，卡那霉素0.025; 1.1、 A菌株的培养，将重组菌株怎.M15-4C1-CCR接种于LB固体培养基，活化;挑取 重组菌株单菌落接种于30mL含10化g/mL氨节青霉素和25yg/mL卡那霉素的LB液体培养基 中，于37° C、200巧m振荡培养过夜;取30mL培养液转接于IL含10化g/mL氨节青霉素和25iig/ mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37° C、200rpm振荡培养至控制0D600为0.6;向培养物中加 入诱导物异丙基-e-D-硫代半乳糖巧IPTG至终浓度0.4mmol/l，于28° C、200巧m诱导培养化； 1.2、 B菌株的培养，将重组菌株怎.M15-CAD接种于LB固体培养基，活化;挑取重组 菌株单菌落接种于30mL含10化g/mL氨节青霉素和25yg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于 37°(：、200巧111振荡培养过夜;取301111培养液转接于比含10化肖/血氨节青霉素和254肖/血卡那 霉素的LB液体培养基中，于37°C JOOrpm振荡培养至控制0D600为0.6;向培养物中加入诱导 物异丙基-e-D-硫代半乳糖巧IPTG至终浓度0.4mmol/l，于28° C、200巧m诱导培养地； 2、 菌株的固定化 2.1、 细胞的离屯、洗涂:取A菌株菌液1L、B菌株菌液1L，在转速4000rpm/min条件下，离 屯、15min，倾去上清液，用IOmL 0.9%生理盐水悬浮细胞，制得A菌株细胞悬浮液和B菌株细胞 悬浮液； 2.2、 取A菌株细胞悬浮液IOmL和B菌株细胞悬浮液IOmL,与75mL 2%的海藻酸钢溶液均 匀混合，使用注射器滴入150mL 2%的化Cl2溶液中，固定化细胞颗粒直径2.5mm，4°C冰箱放 置12h使其充分固化，倾去上清液，加入无菌水洗涂2次，制得A菌株固定化细胞颗粒和B菌株 固定化细胞颗粒，置于4° C冰箱中备用； 3、 固定化细胞连续生产4-径基肉桂醇 3.1、 IOOmL反应体系组成：IOOmL含A菌株固定化细胞颗粒和B菌株固定化细胞颗粒的LB 液体培养基，终浓度为ImM的底物4-径基肉桂酸(分别为香豆酸、咖啡酸和阿魏酸）；反应混 合物于37°C、200巧m避光振荡反应2-lOh，反应后混合物用等体积乙酸乙醋萃取，有机相用 于产物分析； 3.2、 产物通过高效液相色谱串联质谱法进行分析。反相高效液相色谱柱为ZORBAX 300SB-C18柱（2.1X150mm，3.5皿；Agilent，San化Clara，CA，USA)，流动相为乙腊， 流速0. 10~0.15 mL/min，梯度洗脱的具体条件见表1，检测波长为280皿;质谱为配备ESI 源的离子阱质谱化CQ DECA XP MAX),质谱检测的具体条件见表2; 表1.分离底物4-径基肉桂酸和产物4-径基肉桂醇的高效液相色谱流动相梯度洗脱条 件
产物产率的计算:产率(％)=任/Cs X 100% 式中任为反应后4-径基肉桂醇的浓度，Cs为反应前底物的浓度； 香豆醇、咖啡醇、松柏醇的产率分别为53.7%，22.1，56.4%。
[0007]本发明与现有的技术相比，具有如下的优点： (1) 利用多菌株固定化细胞进行多酶体系的协同反应，实现了从酸到醇的连续生产； (2) 采用重组DNA技术所构建的4C1-CCR酶分子，保留了 4C1酶分子和CC贿每分子各自的 酶活性，解除了细胞膜对中间产物(4-径基肉桂酸CoA衍生物)进出细胞的阻碍； (3) 与固定化酶法相比较，免去了破碎细胞提取酶的步骤，无需辅酶再生，节约了成本， 简化了设备投资； (4) 固定化细胞可W重复使用，减化游离细胞培养过程，还减少了营养基质的浪费，并 且对外界环境缓冲作用大，细胞不受剪切效应影响，对抗污染能力提高； (5) 与化学合成法相比较，简化了 4-径基肉桂醇的生产工艺，直接将底物投入到固定化 细胞培养液中，大大减少了副产物的生成。
【附图说明】
[000引图1为本发明实施例1中利用重组菌株全细胞催化生产香豆醇的高效液相色谱图 W及质谱图。A:反应初始时刻，底物香豆酸(SI)的高效液相色谱图；B:反应一段时间后，底 物香豆酸（SI)和产物香豆醇(PO的高效液相色谱图；C:香豆酸（SI)的二级质谱图；D:香豆 醇(Pl)的二级质谱图； 图2为本发明实施例2中利用重组菌株全细胞催化生产咖啡醇的高效液相色谱图W及 质谱图。A:反应初始时刻，底物咖啡酸(S2 )的高效液相色谱图；B:反应一段时间后，底物咖 啡酸（SI)和产物咖啡醇(P2)的高效液相色谱图；C:咖啡酸（S2)的二级质谱图；D:咖啡醇 (P2)的二级质谱图； 图3为本发明实施例3中利用重组菌株全细胞催化生产松柏醇的高效液相色谱图W及 质谱图。A:反应初始时刻，底物阿魏酸(S3)的高效液相色谱图；B:反应一段时间后，底物阿 魏酸（SI)和产物松柏醇(P3)的高效液相色谱图；C:阿魏酸（S3)的二级质谱图；D:松柏醇 (P3)的二级质谱图。
【具体实施方式】
[0009]下述下面结合实施例，进一步阐述对本发明： 实施例1 1、 菌株培养 所用菌株为A菌株和B菌株； A菌株为重组菌株怎M15-4C1-CCR，诱导后能高效表达融合双功能酶4C1-CCR，具 有4C1和CCR两种酶的催化活力，可将4-径基肉桂酸转化为4-径基肉桂醒； B菌株为重组菌株怎M15-CAD;诱导后能高效表达CAD，可将4-径基肉桂醒转化为 4-径基肉桂醇； LB固体培养基，Wg/L计，膜蛋白腺10，酵母提取物5，NaCl 10，pH7.5，氨节青霉素0.1，卡 那霉素0.025 ; LB液体培养基，Wg/L计，膜蛋白腺10，酵母提取物5，化Cl 10，琼脂粉15， pH7.5，氨节青霉素0.1，卡那霉素0.025; 1.1、 A菌株的培养，将重组菌株怎.M15-4C1-CCR接种于LB固体培养基，活化;挑取 重组菌株单菌落接种于30mL含10化g/mL氨节青霉素和25yg/mL卡那霉素的LB液体培养基 中，于37° C、200巧m振荡培养过夜;取30mL培养液转接于IL含10化g/mL氨节青霉素和25iig/ mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37° C、200rpm振荡培养至控制0D600为0.6;向培养物中加 入诱导物异丙基-e-D-硫代半乳糖巧IPTG至终浓度0.4mmol/l，于28° C、200巧m诱导培养化； 1.2、 B菌株的培养，将重组菌株怎.M15-CAD接种于LB固体培养基，活化;挑取重组 菌株单菌落接种于30mL含10化g/mL氨节青霉素和25yg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于 37°(：、200巧111振荡培养过夜;取301111培养液转接于比含10化肖/血氨节青霉素和254肖/血卡那 霉素的LB液体培养基中，于37°C JOOrpm振荡培养至控制0D600为0.6;向培养物中加入诱导 物异丙基-e-D-硫代半乳糖巧IPTG至终浓度0.4mmol/l，于28° C、200巧m诱导培养地； 2、 菌株的固定化 2.1、 细胞的离屯、洗涂:取A菌株菌液1L、B菌株菌液1L，在转速4000rpm/min条件下，离 屯、15min，倾去上清液，用IOmL 0.9%生理盐水悬浮细胞，制得A菌株细胞悬浮液和B菌株细胞 悬浮液； 2.2、 取A菌株细胞悬浮液IOmL和B菌株细胞悬浮液IOmL,与75mL 2%的海藻酸钢溶液均 匀混合，使用注射器滴入150mL 2%的化Cl2溶液中，固定化细胞颗粒直径2.5mm，4°C冰箱放 置12h使其充分固化，倾去上清液，加入无菌水洗涂2次，制得A菌株固定化细胞颗粒和B菌株 固定化细胞颗粒，置于4° C冰箱中备用； 3、 固定化细胞连续生产香豆醇 3.1、 IOOmL反应体系组成：IOOmL含A菌株固定化细胞颗粒和B菌株固定化细胞颗粒的LB 液体培养基，终浓度为ImM的底物香豆酸;反应混合物于37° C、200rpm避光振荡反应2-lOh， 反应后混合物用等体积乙酸乙醋萃取，有机相用于产物分析； 3.2、 产物通过高效液相色谱串联质谱法进行分析。反相高效液相色谱柱为ZORBAX 300SB-C18柱（2.1X150mm，3.5皿；Agilent，San化Clara，CA，USA)，流动相为乙腊， 流速0. 10~0.15 mL/min，梯度洗脱的具体条件见表3,检测波长为280皿;质谱为配备ESI 源的离子阱质谱化CQ DECA XP MAX),质谱检测的具体条件见表4; 亲3. A离底物吞巧瞒巧产物吞巧酶的高谢漏姑伤谱流动姑梯底雜脱条件
' 产物利用'高效液相色谱和M谱联用法进占检测，如图1所示，香i酸和香豆醇的出峰时' 间分别为 25.41min 和 16.35min; 产物产率的计算:产率(％)=任/Cs X 100% 式中任为反应后香豆醇的浓度，Cs为反应前底物的浓度;香豆醇的产率为53.7%。
[0010] 实施例2 1、菌株培养 所用菌株为A菌株和B菌株； A菌株为重组菌株怎M15-4C1-CCR，诱导后能高效表达融合双功能酶4C1-CCR，具 有4C1和CCR两种酶的催化活力，可将4-径基肉桂酸转化为4-径基肉桂醒； B菌株为重组菌株怎M15-CAD;诱导后能高效表达CAD，可将4-径基肉桂醒转化为 4-径基肉桂醇； LB固体培养基，Wg/L计，膜蛋白腺10，酵母提取物5，NaCl 10，pH7.5，氨节青霉素0.1，卡 那霉素0.025 ; LB液体培养基，Wg/L计，膜蛋白腺10，酵母提取物5，化Cl 10，琼脂粉15， pH7.5，氨节青霉素0.1，卡那霉素0.025; 1.1、 A菌株的培养，将重组菌株怎.M15-4C1-CCR接种于LB固体培养基，活化;挑取 重组菌株单菌落接种于30mL含10化g/mL氨节青霉素和25yg/mL卡那霉素的LB液体培养基 中，于37° C、200巧m振荡培养过夜;取30mL培养液转接于IL含10化g/mL氨节青霉素和25iig/ mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37° C、200rpm振荡培养至控制0D600为0.6;向培养物中加 入诱导物异丙基-e-D-硫代半乳糖巧IPTG至终浓度0.4mmol/l，于28° C、200巧m诱导培养化； 1.2、 B菌株的培养，将重组菌株怎.M15-CAD接种于LB固体培养基，活化;挑取重组 菌株单菌落接种于30mL含10化g/mL氨节青霉素和25yg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于 37°(：、200巧111振荡培养过夜;取301111培养液转接于比含10化肖/血氨节青霉素和254肖/血卡那 霉素的LB液体培养基中，于37°C JOOrpm振荡培养至控制0D600为0.6;向培养物中加入诱导 物异丙基-e-D-硫代半乳糖巧IPTG至终浓度0.4mmol/l，于28° C、200巧m诱导培养4h; 2、 菌株的固定化 2.1、 细胞的离屯、洗涂:取A菌株菌液1L、B菌株菌液1L，在转速4000rpm/min条件下，离 屯、15min，倾去上清液，用IOmL 0.9%生理盐水悬浮细胞，制得A菌株细胞悬浮液和B菌株细胞 悬浮液； 2.2、 取A菌株细胞悬浮液IOmL和B菌株细胞悬浮液IOmL,与75mL 2%的海藻酸钢溶液均 匀混合，使用注射器滴入150mL 2%的化Cl2溶液中，固定化细胞颗粒直径2.5mm，4°C冰箱放 置12h使其充分固化，倾去上清液，加入无菌水洗涂2次，制得A菌株固定化细胞颗粒和B菌株 固定化细胞颗粒，置于4° C冰箱中备用； 3、 固定化细胞连续生产咖啡醇 3.1、 IOOmL反应体系组成：IOOmL含A菌株固定化细胞颗粒和B菌株固定化细胞颗粒的LB 液体培养基，终浓度为ImM的底物咖啡酸;反应混合物于37° C、200rpm避光振荡反应2-lOh， 反应后混合物用等体积乙酸乙醋萃取，有机相用于产物分析； 3.2、 产物通过高效液相色谱串联质谱法进行分析。反相高效液相色谱柱为ZORBAX 300SB-C18柱（2.1X150mm，3.5皿；Agilent，San化Clara，CA，USA)，流动相为乙腊， 流速0. 10~0.15 mL/min，梯度洗脱的具体条件见表5,检测波长为280皿;质谱为配备ESI 源的离子阱质谱化CQ DECA XP MAX),质谱检测的具体条件见表6; 表5.分离底物咖啡酸和产物咖啡醇的高效液相色谱流动相梯度洗脱条件
产物利用高效液相色谱和质谱联用法进行检测，如图2所示，咖啡酸和咖啡醇的出峰时 间分别为10.28min和6.65min; 产物产率的计算:产率(％)=任/Cs X 100% 式中任为反应后咖啡醇的浓度，Cs为反应前底物的浓度;咖啡醇的产率为22.1%。
[00川实施例3 1、菌株培养 所用菌株为A菌株和B菌株； A菌株为重组菌株怎.CO^ M15-4C1-CCR，诱导后能高效表达融合双功能酶4C1-CCR，具 有4C1和CCR两种酶的催化活力，可将4-径基肉桂酸转化为4-径基肉桂醒； B菌株为重组菌株怎M15-CAD;诱导后能高效表达CAD，可将4-径基肉桂醒转化为 4-径基肉桂醇； LB固体培养基，Wg/L计，膜蛋白腺10，酵母提取物5，NaCl 10，pH7.5，氨节青霉素0.1，卡 那霉素0.025 ; LB液体培养基，Wg/L计，膜蛋白腺10，酵母提取物5，化Cl 10，琼脂粉15， pH7.5，氨节青霉素0.1，卡那霉素0.025; 1.1、 A菌株的培养，将重组菌株怎.M15-4C1-CCR接种于LB固体培养基，活化;挑取 重组菌株单菌落接种于30mL含10化g/mL氨节青霉素和25yg/mL卡那霉素的LB液体培养基 中，于37° C、200巧m振荡培养过夜;取30mL培养液转接于IL含10化g/mL氨节青霉素和25iig/ mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37° C、200rpm振荡培养至控制0D600为0.6;向培养物中加 入诱导物异丙基-e-D-硫代半乳糖巧IPTG至终浓度0.4mmol/l，于28° C、200巧m诱导培养化； 1.2、 B菌株的培养，将重组菌株怎.M15-CAD接种于LB固体培养基，活化;挑取重组 菌株单菌落接种于30mL含10化g/mL氨节青霉素和25yg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于 37°(：、200巧111振荡培养过夜;取301111培养液转接于比含10化肖/血氨节青霉素和254肖/血卡那 霉素的LB液体培养基中，于37°C JOOrpm振荡培养至控制0D600为0.6;向培养物中加入诱导 物异丙基-e-D-硫代半乳糖巧IPTG至终浓度0.4mmol/l，于28° C、200巧m诱导培养地； 2、 菌株的固定化 2.1、 细胞的离屯、洗涂:取A菌株菌液1L、B菌株菌液1L，在转速4000rpm/min条件下，离 屯、15min，倾去上清液，用IOmL 0.9%生理盐水悬浮细胞，制得A菌株细胞悬浮液和B菌株细胞 悬浮液； 2.2、 取A菌株细胞悬浮液IOmL和B菌株细胞悬浮液IOmL,与75mL 2%的海藻酸钢溶液均 匀混合，使用注射器滴入150mL 2%的化Cl2溶液中，固定化细胞颗粒直径2.5mm，4°C冰箱放 置12h使其充分固化，倾去上清液，加入无菌水洗涂2次，制得A菌株固定化细胞颗粒和B菌株 固定化细胞颗粒，置于4° C冰箱中备用； 3、 固定化细胞连续生产松柏醇 3.1、 IOOmL反应体系组成：IOOmL含A菌株固定化细胞颗粒和B菌株固定化细胞颗粒的LB 液体培养基，终浓度为ImM的底物阿魏酸;反应混合物于37° C、200rpm避光振荡反应2-lOh， 反应后混合物用等体积乙酸乙醋萃取，有机相用于产物分析； 3.2、 产物通过高效液相色谱串联质谱法进行分析。反相高效液相色谱柱为ZORBAX 300SB-C18柱（2.1X150mm，3.5皿；Agilent，San化Clara，CA，USA)，流动相为乙腊， 流速0. 10~0.15 mL/min，梯度洗脱的具体条件见表7,检测波长为280皿;质谱为配备ESI 源的离子阱质谱化CQ DECA XP MAX),质谱检测的具体条件见表8; 亲7_ 4V离底物耐魂酸巧产物换曲酶的高谢漏相伤谱流动相梯底浊脱条化
' 产物利用高效液相色谱和质谱联用法进行检测，如图3所示，阿魏酸和松柏醇的出峰时I 间分别为 32.40min 和 23.24min; 产物产率的计算:产率(％)=任/Cs X 100% 式中任为反应后松柏醇的浓度，Cs为反应前底物的浓度;松柏醇的产率为56.4%。
【主权项】
1.多菌株固定化细胞组合物连续生产4-羟基肉桂醇的方法，其特征在于具体操作步骤 如下： 1、 菌株培养 所用菌株为A菌株和B菌株； A菌株为重组菌株Ecoii M15-4C1-CCR，诱导后能高效表达融合双功能酶4C1-CCR，具 有4C1和CCR两种酶的催化活力，可将4-羟基肉桂酸转化为4-羟基肉桂醛； B菌株为重组菌株i coii Ml5-CAD;诱导后能高效表达CAD，可将4-羟基肉桂醛转化为 4-羟基肉桂醇； LB固体培养基，以g/L计，胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH7.5，氨苄青霉素0.1，卡 那霉素0.025 ; LB液体培养基，以g/L计，胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，琼脂粉15， PH7.5，氨苄青霉素0.1，卡那霉素0.025; 1.1、 A菌株的培养，将重组菌株E M15-4C1-CCR接种于LB固体培养基，活化;挑取 重组菌株单菌落接种于30mL含100yg/mL氨苄青霉素和25yg/mL卡那霉素的LB液体培养基 中，于37° C、200rpm振荡培养过夜;取30mL培养液转接于1L含100yg/mL氨苄青霉素和25yg/ mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37° C、200rpm振荡培养至控制0D600为0.6;向培养物中加 入诱导物异丙基硫代半乳糖苷IPTG至终浓度0.4mmol/L,于28° C、200rpm诱导培养8h; 1.2、 B菌株的培养，将重组菌株E Ml5-CAD接种于LB固体培养基，活化;挑取重组 菌株单菌落接种于30mL含100yg/mL氨节青霉素和25yg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于 37°C、200rpm振荡培养过夜;取30mL培养液转接于1L含100yg/mL氨苄青霉素和25yg/mL卡那 霉素的LB液体培养基中，于37°C、200rpm振荡培养至控制0D600为0.6;向培养物中加入诱导 物异丙基硫代半乳糖苷IPTG至终浓度0.4mmol/L,于28° C、200rpm诱导培养4h; 2、 菌株的固定化 2.1、 细胞的离心洗涤:取A菌株菌液1L、B菌株菌液1L，在转速4000rpm/min条件下，离 心15min，倾去上清液，用10mL 0.9%生理盐水悬浮细胞，制得A菌株细胞悬浮液和B菌株细胞 悬浮液； 2.2、 取A菌株细胞悬浮液10mL和B菌株细胞悬浮液10mL，与75mL 2%的海藻酸钠溶液均 匀混合，使用注射器滴入150mL 2%的CaCl2溶液中，固定化细胞颗粒直径2.5mm，4°C冰箱放 置12h使其充分固化，倾去上清液，加入无菌水洗涤2次，制得A菌株固定化细胞颗粒和B菌株 固定化细胞颗粒，置于4° C冰箱中备用； 3、 固定化细胞连续生产4-羟基肉桂醇 3.1、 100mL反应体系组成：100mL含A菌株固定化细胞颗粒和B菌株固定化细胞颗粒的LB 液体培养基，终浓度为ImM的底物4-羟基肉桂酸(分别为香豆酸、咖啡酸和阿魏酸）；反应混 合物于37°C、200rpm避光振荡反应2-10h，反应后混合物用等体积乙酸乙酯萃取，有机相用 于产物分析； 3.2、 产物通过高效液相色谱串联质谱法进行分析 反相高效液相色谱柱为201^4乂 30058-(：18柱（2.1\150 111111，3.5 4111;厶8丨161^， Santa Clara，CA，USA)，流动相为乙腈，流速0. 10~0.15 mL/min，梯度洗脱的具体条件见 表1，检测波长为280 nm;质谱为配备ESI源的离子阱质谱(LCQ DECA XP MAX)，质谱检测的 具体条件见表2; 表1.分离底物4-羟基肉桂酸和产物4-羟基肉桂醇的高效液相色谱流动相梯度洗脱条 件表2. 3种底物4-羟基肉桂酸和3种产物4-羟基肉桂醇质谱检测条件产物产率的计算:产率(％)=〇>/β X 100% 式中〇>为反应后4-羟基肉桂醇的浓度，Cs为反应前底物的浓度； 香豆醇、咖啡醇、松柏醇的产率分别为53.7%，22.1，56.4%。
【文档编号】C12N11/10GK105925625SQ201610413615
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】盖颖, 刘淑欣, 蒋湘宁
【申请人】北京林业大学, 盖颖