兔源性纤维成分荧光定量pcr定性检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种兔源性纤维成分荧光定量PCR的定性检测方法，包括：步骤一、以兔毛的DNA为模板，进行PCR扩增；步骤二、检测扩增产物的荧光信号；其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增兔源性纤维成分特异性引物对和兔源性纤维成分特异性探针。本发明的方法可简便、快速的检测和鉴定纺织品中是否存在兔源性纤维成分，设计的特异性引物和特异性探针的特异性好，灵敏度佳，可检测到配比为1%（wt）的狐狸毛。
【专利说明】兔源性纤维成分荧光定量PCR定性检测方法
[0001]本申请是申请号201210114158.2、申请日2012年04月18日、发明创造名称“兔源性纤维成分荧光定量PCR定性检测方法”的发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明属于生物工程领域，具体的说，是一种兔源性纤维成分荧光定量PCR定性检测方法。
【背景技术】
[0003]兔毛、狐狸皮草是秋冬市场上的宠儿。皮草以其保暖、舒适、美观在国际市场上长盛不衰。除此以外，市场上还存在兔绒、狐绒织物制品。一般情况下，狐狸毛要比兔毛长密而柔软，加之饲养成本也较高，狐狸皮草的价格要远高于兔毛制品。近年随着品种的改良，兔毛也逐渐具备细长柔软的特性，比如安哥拉兔、獭兔等，给皮草的鉴别增加了难度。兔毛狐狸毛都有髓质层，极少数部分的细毛无毛髓，显微镜下呈现出小格状空腔。
[0004]我国现行的标准FZ/T01057-2007中对兔毛纤维的纵面形态描述为“鳞片较小与纤维纵向呈倾斜状，髓腔有单列、双列、多列”，有经验的人根据髓腔的排列和形状可以对纤维的种属进行判别。一般检测机构主要根据显微镜下的纤维形态特征来判断纤维的种属，见图1。图1为显微镜下的兔毛(左)和狐狸毛(右)。而在一般的光学显微镜下，鳞片并不是很清晰，检测起来费时费力。
【发明内容】
[0005]本发明是一种基于物种自带的DNA序列来定性判别兔毛狐狸毛的方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。
[0006]本发明的目的在于，提供一种兔源性纤维成分荧光定量PCR的定性检测方法。
[0007]本发明的另一目的在于，提供一种兔源性纤维成分的检测试剂盒，以及试剂盒的用途。
[0008]本发明的再一目的在于，提供一种兔源性纤维成分荧光定量PCR的引物和探针。
[0009]本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现:
[0010]作为本发明的第一方面，一种兔源性纤维成分荧光定量PCR的定性检测方法，包括以下步骤:
[0011]步骤一、以兔毛的DNA为模板，进行PCR扩增；
[0012]步骤二、检测扩增产物的荧光信号；
[0013]其特征在于，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增兔源性纤维成分特异性引物对和兔源性纤维成分特异性探针。
[0014]其中，所述扩增兔源性纤维成分特异性引物对的序列如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示。
[0015]其中，所述兔源性纤维成分特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。[0016]其中，所述方法还包括步骤:在聚合酶链式反应过程中或之后，检测兔源性纤维成分特异性探针发出的荧光信号。
[0017]所述PCR扩增的条件如下:
[0018]反应体系:ABITaqman universal PCR master mix (2X) 10 μ I,DNA模板2 μ I,引物 1.2μ1 (10 μ M), probe2y I (2 μ Μ), ddH204.8 μ I ；
[0019]反应的条件为:95。0，51^11;951:，158，611:，458，40个循环。
[0020]作为本发明的第二方面，一种兔源性纤维成分的检测试剂盒，含有以下试剂:
[0021](a)扩增兔源性纤维成分特异性引物对；
[0022](b)兔源性纤维成分特异性探针。
[0023]进一步，所述试剂盒还包括:
[0024](C)标准参照物。
[0025]其中，所述标准参照物是兔源性纤维成分DNA，或含有兔源性纤维成分扩增目的片段的质粒DNA，或兔毛。
[0026]其中，所述扩增兔源性纤维成分特异性引物对的序列如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示。
[0027]其中，所述兔源性纤维成分特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0028]其中，所述兔源性纤维成分特异性探针发出的荧光信号。
[0029]作为本发明的第三方面，一种兔源性纤维成分的检测试剂盒的应用，用于检测在皮草中是否存在兔源性纤维成分。
[0030]作为本发明的第四方面，一种如权利要求1所述的兔源性纤维成分荧光定量PCR的特异性引物和特异性探针，其特征在于，
[0031]所述兔源性纤维成分特异性引物的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；
[0032]所述兔源性纤维成分特异性探针的序列如SEQ ID NO:3所示。
[0033]本发明的有益效果:
[0034]1、可简便、快速的检测和鉴定皮草中是否存在兔源性、狐源性纤维成分。
[0035]2、本发明基于兔和狐的线粒体12SrRNA基因的序列，设计特异性引物和特异性探针的特异性好。
[0036]3、检测方法灵敏度假，可检测到配比为1% (wt)的兔毛、狐狸毛。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1:显微镜下的兔毛(左)和狐狸毛(右)。
[0038]图2:兔源性引物探针序列与相对应的狐序列的blast结果。
[0039]图3:狐源性引物探针序列与相应的兔序列的blast结果。
[0040]图4:兔源性成分的实时荧光PCR结果。
[0041]图5:狐源性成分的实时荧光PCR结果。
[0042]图6:兔源性成分10倍梯度稀释实时荧光PCR检测情况。
[0043]图7:兔源性成 分不同配比实时荧光PCR检测情况。
[0044]图8:狐源性成分10倍梯度稀释实时荧光PCR检测情况
[0045]图9:狐源性成分不同配比实时荧光PCR检测情况。[0046]图10:被检测样品外形及常规方法检测结果。
[0047]图11:兔源性成分验证及检测结果。
[0048]图12:被检测产品外形其常规方法检测结果。
[0049]图13:微量兔源性成分验证及检测结果。
[0050]图14:被检测产品外观。
[0051]图15:狐源性纤维成分验证及检测结果。
【具体实施方式】
[0052]以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
[0053]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆:实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件或厂商提供的条件进行。
[0054]以下实施例中所涉及的“ ％”，除特别说明外，均为重量百分比。
[0055]实施例1
[0056]1、探针和引物的设计
[0057]市场上常见的`毛用狐狸品种有北极狐、红狐，兼顾两者线粒体基因12srRNA序列的相同部分，与兔的序列进行比较，选取合适的序列进行引物探针设计。
[0058]针对兔源性成分的产物大小为68bp。引物和探针序列如下:
[0059]RabF:5，-CGAACCCTAAAAAGGAGCAAAA-3’ (SEQ ID NO:1)
[0060]RabR:5，-GGGCTACACCTTGACCTAACGT-3，(SEQ ID NO:2)
[0061]Prab:FAM-AAGCTCAATTACCACCGTAA-MGB (SEQ ID NO:3)
[0062]针对狐源性成分的产物大小为70bp。引物和探针序列如下:
[0063]FoxF:5，-ACAAAACAATTCGCCAGAGAACT-3’ (SEQ ID NO:4)
[0064]FoxR:5，-GGATATAAAGCACCGCCAAGTC-3’ (SEQ ID NO:5)
[0065]Pfox:FAM-TAGCAACAGCTTAAAACT-MGB (SEQ ID NO:6)
[0066]针对羊源性成分的产物大小为61bp。引物和探针序列如下:
[0067]YangF:5，-GCCAGAGTACTACCGGCAACA-3’ (SEQ ID NO:7)
[0068]YangR:5，-GGCTCCTCTAGAAGGGTATAAAGCA-3’ (SEQ ID NO:8)
[0069]Pyang:FAM-CGAAACTCAAAGGACTTGG-MGB (SEQ ID NO:9)
[0070]其中，FAM表示荧光报告基团，MGB表示淬灭基团。本发明采用荧光探针法，其检测原理是利用荧光标记特异性探针来识别模板。与现有技术中SYBR染料法相比，本发明荧光标记特异性探针的特异性更强。
[0071]2、反应体系的优化
[0072]分别取家兔毛、北极狐毛5mg,剪碎，用progema毛发抽提试剂盒抽提DNA, 50 μ I洗脱液洗脱DNA。
[0073]反应体系:除ABI Taqman universal PCR master mix (2X) 10 μ I,DNA 模板 2 μ I以外，其他成分如表1、2所示。引物的浓度为10 μ Μ，探针的浓度为2 μ Μ。
[0074]反应条件:反应的条件为:95°〇，51^11;951:，158，611:，458，40个循环。[0075]表1、兔源性成分测定优化反应体系中其他成分的用量(单位:μ I)
[0076]
【权利要求】
1.一种狐源性纤维成分荧光定量PCR的定性检测方法，包括以下步骤: 步骤一、以狐狸毛的DNA为模板，进行PCR扩增； 步骤二、检测扩增产物的荧光信号； 其特征在于，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增狐源性纤维成分特异性引物对和狐源性纤维成分特异性探针。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增狐源性纤维成分特异性引物对的序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述狐源性纤维成分特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件如下: 反应体系:ABI Taqman universal PCR master mix(2X) 10 μ I, DNA 模板 2 μ I,引物1.6μ I (ΙΟμΜ),^# 2μ I (2 μ Μ), ddH204.4 μ I ； 反应的条件为:95°C,5min ;95°C，15s，63°C，45s，40 个循环。
5.一种狐源性纤维成分的检测试剂盒，含有以下试剂: Ca)扩增狐源性纤维成分特异性引物对； (b)狐源性纤维成分特异性探针。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括: (C)标准参照物。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增狐源性纤维成分特异性引物对的序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述狐源性纤维成分特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
9.如权利要求5~8中任一项的试剂盒的应用，用于检测在皮草中是否存在狐源性纤维成分。
10.一种如权利要求1所述的狐源性纤维成分荧光定量PCR的特异性引物和特异性探针，其特征在于， 所述狐源性纤维成分特异性引物的序列如SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5所示； 所述狐源性纤维成分特异性探针的序列如SEQ ID N0:6所示。
【文档编号】C12N15/11GK103820537SQ201310419350
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年4月18日 优先权日:2012年4月18日
【发明者】唐敏峰, 费静, 杨娟, 陆维民, 王小平, 叶尚华, 高友军, 刘锦瑞 申请人:上海出入境检验检疫局工业品与原材料检测技术中心, 中华人民共和国新疆出入境检验检疫局, 河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心