专利名称：脱落细胞保存固定液及细胞薄层涂片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞保存固定液，具体涉及脱落细胞保存固定液；本发明还涉及使用这种保存固定液处理的细胞薄层涂片的制作方法。
背景技术：
活细胞具有生理功能、生物学活性和固有的细胞形态及结构，在很多方面具有应用价值。但是，若将其脱离原来的生存环境放置，细胞的生理功能和生物学活性以及细胞的形态及结构就会发生改变，常规方法是对细胞进行冷冻保存。但冷冻保存需要购买专门的冷冻设备，而且，由于冷冻、解冻工序必然会对细胞产生显著的损害，从而导致细胞形态、结构的变异变形。因此，对于脱落细胞的常规检查，冷冻保存不是最好的方法。
据报道，如果将细胞悬浮液放在含有醇和螯合剂的溶液中，在约37℃条件下细胞能够保存约3个星期。
目前美国新柏氏(Tinpreper TCT)厂家生产的保存液(PresetverCytTMSlution)是和其机器Tinpreper-2000配套使用的试剂，但它的价格昂贵，为了降低成本，许多与TCT配套的细胞保存液应运而生，如申请号为200610017591.9，名称为《脱落细胞保存液》的中国发明专利，公开了一种脱落细胞保存液，它由以下按体积份计的成分组成甲醇或乙醇40～60份、磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液20～40份、甲醛或丙酮5～10份、乙二胺四乙酸二钾或乙二胺四乙酸二钠5～10份。该脱落细胞保存液的原材料为普通生化试剂，从而降低了TCT耗材的价格。其次可以减少初次出血标本不满意率，降低重新处理标本所带来的耗材的消耗和时间的浪费；由于穿透力强使细胞固定充分，尽可能保持细胞在原始状态下固定。
现有的制作细胞薄层涂片有两种技术一是液基薄层细胞技术(TCT技术)，它是将获取的细胞加入保存液中，通过机器自动负压吸引、转移的方法直接在玻璃片上制作薄层细胞涂片，其优点是机器自动制片，缺点是每次只能制作一张薄片且制片时间长、机器费用高，维修复杂等；二是LPT技术，是将细胞悬液直接滴在玻璃片上制作成涂片，其优点是无需特殊设备，操作简单，其缺点是未将获取的细胞全部用于制作涂片，容易造成细胞重叠，不利于观察诊断。
发明内容
本发明将公开一种细胞分离效果好、杂质溶解度高、细胞固化效果好和细胞粘片率高的脱落细胞保存固定液，本发明还将公开使用这种保存固定液处理的细胞薄层涂片的制作方法。
本发明脱落细胞保存固定液，它包括下述配比以体积份计的组分 甲醇10-15份； 乙醇10-15份；丙三醇1-2份； 聚乙二醇1-2份；甲醛10-12份；冰醋酸0.5-1份； 质量浓度为0.85-0.9％的氯化钠10-20份； 磷酸缓冲液33-68.5份。
所述甲醇、乙醇、丙三醇、聚乙二醇、甲醛、冰醋酸和氯化钠至少为化学纯的试剂；其中，甲醇的体积浓度为≥99％，乙醇的体积浓度为≥99％，丙三醇的体积浓度为≥99％，聚乙二醇的分子量可为180-220，甲醛的体积浓度可为37-40％，冰醋酸的体积浓度为≥99％；所述氯化钠的纯度≥99％； 所述磷酸缓冲液的pH值最好为6.3-6.5。
本发明还包括细胞薄层涂片的制作方法，步骤如下 1)将采集的样本置于脱落细胞保存固定液中振荡、静置后转入离心机进行离心处理； 2)倒出上层清液，直至离心管中的剩余物为1-2ml，再将其摇匀，得到细胞悬浮液； 3)取0.5-1ml细胞悬浮液放入制片杯中，用细胞制片机制成细胞薄层涂片； 其中，所述脱落细胞保存液包括下述配比以体积份计的组分 甲醇10-15份； 乙醇10-15份；丙三醇1-2份； 聚乙二醇1-2份；甲醛10-12份；冰醋酸0.5-1份； 质量浓度为0.85-0.9％的氯化钠10-20份； 磷酸缓冲液33-68.5份。
所述甲醇、乙醇、丙三醇、聚乙二醇、甲醛、冰醋酸和氯化钠至少为化学纯的试剂；其中，甲醇的体积浓度为≥99％，乙醇的体积浓度为≥99％，丙三醇的体积浓度为≥99％，聚乙二醇的分子量可为180-220，甲醛的体积浓度可为37-40％，冰醋酸的体积浓度为≥99％；所述氯化钠的纯度≥99％； 所述磷酸缓冲液的pH值最好为6.3-6.5； 上述制作方法步骤1)中，所述振荡的时间最好为10-20分钟，以使细胞完全分离；所述静置的时间最好为10-30分钟，以使细胞充分固定，同时使杂质溶解完全；所述离心处理时的转速可为2000转/分，时间最好为5-8分钟；步骤3)中，所述细胞制片机中的细胞过滤装置为在滤纸或吸水纸的中空部分粘有100-200目的滤网。
本发明脱落细胞保存固定液使用的都是普通化学试剂，从而降低了TCT耗材的价格；它能溶解95％以上的红细胞、细胞碎片和小粘液丝，提高了细胞的分离效果，从而提高了后序的制片效果，使薄层细胞片背景清晰、杂质少，细胞分布均匀；此外，由于在保存液中加入了甲醛，从而大大提高了细胞的固化效果；细胞变形率低，能保持原有的形态粘附在载玻片上。
本发明细胞薄层涂片的制作方法，由于采用了上述脱落细胞保存固定液处理脱落细胞，细胞的粘附率高且不易脱片；而在制片过程中采用了中空部分粘有滤网的滤纸或吸水纸，不仅除去了大量的杂质，还使制成的薄层涂片细胞分布均匀，有利于观察诊断，从而大大提高了阳性检出率。
具体实施例方式 实施例1细胞保存固定液的配制 以下所用到的试剂均为化学纯。
取10ml体积浓度为99％的甲醇、15ml体积浓度为100％的乙醇、2ml体积浓度为99％的丙三醇、2ml分子量为180的聚乙二醇、10ml体积浓度为37％的甲醛、0.5ml体积浓度为100％的冰醋酸、10ml质量浓度为0.9％的氯化钠和68.5ml pH值为6.3的磷酸缓冲液混合均匀即得到本发明脱落细胞保存固定液。
实施例2细胞保存固定液的配制 以下所用到的试剂均为分析纯。
取15ml体积浓度为99％的甲醇、15ml体积浓度为99％的乙醇、1ml体积浓度为99％的丙三醇、2ml分子量为200的聚乙二醇、12ml体积浓度为40％的甲醛、1ml体积浓度为99％的冰醋酸、20ml质量浓度为0.85％的氯化钠和34ml pH值为6.5的磷酸缓冲液混合均匀即得到本发明脱落细胞保存固定液。
实施例3细胞薄层涂片的制作方法 1)将采集的样本置于10ml实施例2所述的脱落细胞保存固定液中振荡20分钟，再静置10分钟后倒入离心管中以2000转/分8分钟； 2)倒出上层清液，直至离心管中的剩余物为1-2ml，再将其摇匀，得到细胞悬浮液； 3)取0.5ml细胞悬浮液放入制片杯中，用含有中空部分粘有100目滤网的滤纸的细胞制片机，制成细胞薄层涂片。
权利要求
1.一种脱落细胞保存固定液，其特征在于它包括下述配比以体积份计的组分
甲醇10-15份； 乙醇10-15份；丙三醇1-2份；
聚乙二醇1-2份；甲醛10-12份；冰醋酸0.5-1份；
质量浓度为0.85-0.9％的氯化钠10-20份；
磷酸缓冲液33-68.5份。
2.根据权利要求1所述的脱落细胞保存固定液，其特征在于所述磷酸缓冲液的pH值为6.3-6.5。
3.一种细胞薄层涂片的制作方法，步骤如下
1)将采集的样本置于脱落细胞保存固定液中振荡、静置后转入离心机进行离心处理；
2)倒出上层清液，直至离心管中的剩余物为1-2ml，再将其摇匀，得到细胞悬浮液；
3)取0.5-1ml细胞悬浮液放入制片杯中，用细胞制片机制成细胞薄层涂片；
其中，所述脱落细胞保存液包括下述配比以体积份计的组分
甲醇10-15份； 乙醇10-15份；丙三醇1-2份；
聚乙二醇1-2份；甲醛10-12份；冰醋酸0.5-1份；
质量浓度为0.85-0.9％的氯化钠10-20份；
磷酸缓冲液33-68.5份。
4.根据权利要求3所述的细胞薄层涂片的制作方法，其特征在于所述磷酸缓冲液的pH值为6.3-6.5。
5.根据权利要求3或4所述的细胞薄层涂片的制作方法，其特征在于步骤3)中，所述细胞制片机设有细胞过滤装置。
6.根据权利要求5所述的细胞薄层涂片的制作方法，其特征在于所述细胞过滤装置为在滤纸或吸水纸的中空部分粘有滤网。
7.根据权利要求6所述的细胞薄层涂片的制作方法，其特征在于所述滤网为100-200目。
8.根据权利要求3或4所述的细胞薄层涂片的制作方法，其特征在于步骤1)中，所述振荡的时间为10-20分钟。
9.根据权利要求3或4所述的细胞薄层涂片的制作方法，其特征在于步骤1)中，所述静置的时间为10-30分钟。
10.根据权利要求3或4所述的细胞薄层涂片的制作方法，其特征在于步骤1)中，所述离心处理时的转速为2000转/分，时间为5-8分钟。
全文摘要
本发明将公开一种脱落细胞保存固定液及使用这种保存固定液处理的细胞薄层涂片的制作方法。所述脱落细胞保存液包括下述配比以体积份计的组分甲醇10-15份；乙醇10-15份；丙三醇1-2份；聚乙二醇1-2份；甲醛10-12份；冰醋酸0.5-1份；质量浓度为0.85-0.9％的氯化钠10-20份；磷酸缓冲液33-68.5份。一种细胞薄层涂片的制作方法，步骤如下1)将采集的样本置于脱落细胞保存固定液中振荡、静置后转入离心机进行离心处理；2)倒出上层清液，直至离心管中的剩余物为1-2ml，再将其摇匀，得到细胞悬浮液；3)取0.5-1ml细胞悬浮液放入制片杯中，用细胞制片机制成细胞薄层涂片。
文档编号C12N11/00GK101182506SQ20071005046
公开日2008年5月21日 申请日期2007年11月7日 优先权日2007年11月7日
发明者元 叶, 张美艳, 韦华生 申请人:曾思恩, 周 杰