一种L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物制药领域，涉及一种L-天冬氨酸β_脱羧酶产生菌的高通量筛 选方法。
【背景技术】
[0002] L-天冬氨酸β -脱羧酶（Asd)，又称L-天冬氨酸1-脱羧酶，能催化脱去L-天冬 氨酸的羧基，生成L-丙氨酸（L-Ala)。L-丙氨酸在医药和食品工业上的应用相当广泛，随 着需求量的增加和发酵工业的发展，L-丙氨酸的生产方法由蛋白质水解提取法、发酵法发 展到酶法生产，即利用L-天冬氨酸β -脱羧酶将L-天冬氨酸脱羧生成L-丙氨酸。用Asd 转化生产L-Ala可分为游离细胞法和固定化细胞转化法。日本已经在1982年用卡拉胶固 定Pseudomonas, dacunhae细胞用于L-Asp连续生产L-Ala。国内刘景晶等（参见高丽娟等 人于2007年在《工业微生物》37 (5) :54-59中发表的文章）用卡拉胶固定含有Asd活性的 Pseudomonas, dacunhae 细胞，在 ρΗ6· 2 ~ρΗ7· 25 范围内和底物浓度为 0· 4mol/L_0. 5mol/L 时，固定化细胞表现出最高酶活力。
[0003] 然而在L-丙氨酸酶法转化过程中，脱羧反应使反应液pH值不断上升，偏离了酶反 应的最适pH值范围，导致细胞的酶活力降低，这对工艺过程控制和生物反应器提出更高要 求。由于海洋微生物具有陆生微生物无法比拟的生态群落结构多样性和物种多样性，所以 从海洋环境中筛选具有特殊耐受性质的生物酶产生菌是目前微生物领域研究的特点，本发 明基于该理念，建立了从海洋生境中快速筛选L-天冬氨酸β -脱羧酶的高通量方法，并且 筛选的菌株具有耐碱性能，在细胞生产过程中避免了繁琐pH值控制步骤。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种L-天冬氨酸β -脱羧酶产生菌的高通量筛选方法。
[0005] 本发明所提供的L-天冬氨酸β -脱羧酶产生菌的高通量筛选方法，具体而言，可 包括如下步骤：
[0006] 1)采用富集培养基对样品中的微生物进行富集培养与初步分离；
[0007] 2)将步骤1)分离得到的单菌落穿刺接种微孔板初筛半固体培养基，培养后根据 培养基的浑浊程度筛选L-天冬氨酸β -脱羧酶产生菌；
[0008] 3)将步骤2)初筛得到的菌株接种微孔板液体培养，收集菌体进行生物转化，采用 纸层析法分析生成的L-丙氨酸含量，得到L-天冬氨酸β -脱羧酶高产菌株；
[0009] 4)将步骤3)复筛得到的高产菌株进行摇瓶发酵培养，收集菌体进行生物转化，然 后氧化显色法测定L-天冬氨酸β -脱羧酶酶活性。
[0010] 在上述方法中，步骤1)中，所述微生物样品来自海绵、珊瑚、海底淤泥，所述富集 培养基含有质量百分含量1 % _2 %的NaCl ;
[0011] 步骤2)中，所述初筛半固体培养基含有质量百分含量0. 05 %的CaCl2 ;
[0012] 步骤3)中，所述生物转化的操作方式为：将步骤2)初筛得到的菌株接种到复筛 培养基，20°C -37°C恒温培养后离心收集菌体，与生物转化液混合，混合物20°C -37°C孵育 12-24小时；
[0013] 步骤4)中，所述生物转化的操作方式为：将步骤3)复筛得到的菌株接种到摇瓶发 酵培养基，20°C -37°C恒温培养后离心收集菌体，与生物转化液混合，混合物20°C -37°C孵 育12-24小时；
[0014] 在上述方法中，步骤1)中所述富集培养的方式为：将微生物样品用富集培养基洗 涤三次，然后接种到富集培养基，温度20°c -37°c、转速100-200转/分钟振荡培养2-4天； 所述富集培养基各组分的质量百分含量为：牛肉膏0. 5%，蛋白胨1%，酵母粉0. 2%，ΚΗ2Ρ04 0· 05%，Κ2ΗΡ04 · H20 0· 14%，NaCl 1. 5%，pH 8. 5-9. 0。
[0015] 步骤3)中，所述复筛培养基各组分的质量百分含量为：葡萄糖3%，蛋白胨1%，酵 母粉 0· 2%，NaCl 1. 5%，ΚΗ2Ρ04 0· 05%，Κ2ΗΡ04 · H20 0· 14%，MgS04 · 7H20 0· 03%，CaCl2 0· 05%，pH8. 5-9. 0。
[0016] 步骤4)中，所述摇瓶发酵培养基各组分的质量百分含量为：葡萄糖3%，蛋白胨 1%，酵母粉 0.2%，NaCl 1.5%，ΚΗ2Ρ04 0 . 05%，Κ2ΗΡ04·Η20 0.14%，MgS04*7H20 0.03%， CaCl20. 05%, pH 8. 5-9. 0〇
[0017] 步骤3)与步骤4)中，所述生物转化液各组分的质量百分含量为：L-天冬氨酸 2%，ΚΗ 2Ρ040· 05%，Κ2ΗΡ04 · H20 0· 14%，ρΗ8· 5-9. 0。
[0018] 本发明的再一个目的是提供一种L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的初筛半固体 培养基。所述初筛半固体培养基各组分的质量百分含量为：L-天冬氨酸2%，葡萄糖3%， 蛋白胨 1%，酵母粉 0.2%，NaCl 1.5%，ΚΗ2Ρ04 0 . 05%, Κ2ΗΡ04·Η20 0.14%，MgS04*7H20 0. 03%，CaCl2 0. 05%，琼脂0. 8%，pH8. 5-9. 0 ;将所述初筛半固体培养基分装于96孔酶标 板，制得初筛半固体培养基孔板。
[0019] 所述初筛半固体培养基在对耐碱L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选中 的应用也属于本发明的保护范围。
[0020] 本发明提供的L-天冬氨酸β -脱羧酶产生菌高通量筛选方法，可以用于快速筛选 具有耐碱性能的L-天冬氨酸β -脱羧酶产生菌，以解决酶法生产L-A la过程中pH值不断 上升酶活性降低的问题，省略工艺过程不断调节pH值步骤；该高通量筛选方法填补了目前 国内在该方面研究的空白，同时也为同类生物酶产生菌的高通量筛选提供参考。
【具体实施方式】
[0021] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂 等，如无特殊说明，均可从商业途径购买。
[0022] 实施例1 L-天冬氨酸β -脱羧酶产生菌的筛选
[0023] -、样品中微生物的富集与分离
[0024] 富集培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，酵母粉0.2%，ΚΗ2Ρ04 0 . 05%，Κ2ΗΡ04·Η20 0· 14%，NaCl 1· 5%，pH 7· 0-7. 2,121°C灭菌 20min，冷却后备用；
[0025] 分离培养基平板：牛肉膏0.5%，蛋白胨l%，NaCl 1.5%，琼脂2%，pH 8.5-9. 0， 121°C灭菌20min，然后倒平皿制作分离平板，20mL/皿，冷却凝固后待用；
[0026] 1、采样
[0027] 文献报道海洋微生物具有陆生微生物无法比拟的生态群落结构多样性和物种多 样性，故选取了烟台黄海海域作为采样地点，采集了海绵、珊瑚、海底淤泥等共10个样品。
[0028] 2、富集
[0029] 样品取回实验室后，将样品用100mL富集培养基洗涤三次，然后置于1000mL无菌 三角瓶中，温度30°C、转速150转/分钟振荡培养3d，该步骤可将样品中的微量微生物进行 富集培养。
[0030] 3、平板分离
[0031] 将富集后的菌液用无菌生理盐水十倍梯度稀释后涂布分离培养基平板，30°C培养 3d，作为筛选L-天冬氨酸β -脱羧酶产生菌的菌种资源库。
[0032] 二、96微孔板穿刺培养初筛
[0033] 1、初筛培养基孔板的制备
[0034] 初筛半固体培养基配方：L-天冬氨酸2%，葡萄糖3%，蛋白胨1 %，酵母粉0. 2%， NaCll. 5%，ΚΗ2Ρ04 0· 05%，Κ2ΗΡ04 · Η20 0· 14%，MgS04 · 7Η20 0· 03%，CaCl2 0· 05%，琼脂 0. 8%, pH 8. 5-9. 0〇
[0035] 将初筛半固体培养基121°C灭菌20min，冷却至50°C左右，然后采用96孔酶标板制 备初筛培养基孔板，即向酶标板的每个微孔中加入300 μ L初筛培养基，冷却凝固后备用。
[0036] 2、穿刺培养初筛
[0037]用无菌牙签从步骤一涂布的分离平板中逐个挑取单菌落，穿刺接种初筛培养基孔 板，总共接种480株，30°C培养16h，观察微孔中培养基的透明度，L-天冬氨酸β -脱羧酶产 生菌所在的微孔培养基变浑浊，根据浑浊程度判定L-天冬氨酸β -脱羧酶的活性。
[0038] 其实验原理为：穿刺菌株所产生的L-天冬氨酸β-脱羧酶作用于培养基中的 L-天冬氨酸，脱羧产生的C02，在半固体培养基中呈离子态C032，C0 32与培养基中的Ca2+反 应生成难溶的CaC03，可使培养基变浑浊，故可根据浑浊程度粗略判定L-天冬氨酸β -脱羧 酶的活性，该法快速简捷，可在96微孔板中实现高通量的初筛。
[0039] 本实施例选取了 24株浑浊度较高的菌株，进入下一步的复筛。
[0040] 三、24孔板液体培养结合纸层析复筛
[0041] 1、复筛培养基孔板的制备
[0042] 复筛培养基配方：葡萄糖3%，蛋白胨1%，酵母粉0. 2%，NaCl 1.5%，ΚΗ2Ρ04 0· 05 %，Κ2ΗΡ04 · Η20 0· 14 %，MgS04 · 7Η20 0· 03 %，CaCl2 0· 05 %，ρΗ8· 5-9. 0。
[0043] 将复筛培养基121°C灭菌20min，冷却后向24孔细胞培养板的每个微孔中加入 500 μ L复筛培养基即得复筛培养基孔板。
[0044] 2、生物转化
[0045] 生物转化液：L-天冬氨酸 2%，ΚΗ2Ρ04 0· 05