专利名称：飞秒激光融合红发夫酵母细胞的方法
技术领域：
本发明提供了一种飞秒激光融合红发夫酵母细胞的方法，属于细胞融合技术。
背景技术：
虾青素是一种红色的次生类胡萝卜素，具有极强的生物抗氧化性，在医药，食品，化妆品及水产业等方面有着广阔的应用前景。红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)是利用生物技术生产天然虾青素的主要来源。目前红发夫酵母的虾青素高产株的选育主要是通过使用聚乙二醇(PEG)进行细胞融合的方法。
PEG在诱导细胞融合的有效浓度范围内对细胞毒性很大。PEG浓度低时，原生质体相互接触的紧密度不够，影响原生质体的粘接和融合，原生质体融合率较低；当浓度高时，PEG可能造成原生质体膜的大面积破坏或由于PEG本身的毒性引起细胞死亡。而且，通过PEG进行的细胞融合是群体细胞间的随机融合，这种融合不具备选择性。即融合并非仅发生在所要求的两个亲本之间，这也是使融合率降低的重要因素。另外，在PEG法中融合子的检出过程复杂。
已经有文献报道用激光进行细胞融合，所用激光均为长脉冲激光。采用长脉冲激光的进行细胞融合的作用机理是单光子吸收，当能量较小时，不足以对细胞膜产生作用，而当能量较大时，激光所产生的热效应会对细胞内部造成损伤，严重影响细胞活性。飞秒激光是脉冲宽度为飞秒(10-15s)量级的脉冲激光，其对细胞作用的机理是多光子吸收。飞秒激光的特点是具有极高的空间分辨率(～200nm)，因此飞秒激光可以对单个细胞进行精确的操作，其不会对焦点以外的细胞区域造成损伤，不影响整个细胞的活性。目前人们使用飞秒激光已经实现对单细胞穿孔转入外源基因、线粒体和叶绿体的切除和飞秒激光光镊对单细胞的捕捉等操作，但尚无飞秒激光用于细胞融合的报道，更无采用飞秒激光用于红发夫酵母的融合的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种飞秒激光融合红发夫酵母细胞的方法。该方法具有融合率高，融合后细胞的活性高，融合子易于检出以及能对整个融合过程进行实时监控和记录的优点。
本发明是通过以下技术方案加以实现的，一种飞秒激光融合红发夫酵母细胞的方法，该方法采用飞秒激光显微操作系统实施。所述飞秒激光显微操作系统包括飞秒脉冲激光器、光束耦合装置、倒置显微镜和监控系统。所述飞秒脉冲激光器为掺钛蓝宝石自锁模飞秒激光振荡级，输出脉冲重复频率大于70兆赫兹，脉冲宽度小于100飞秒；光束耦合装置包括一个焦距为150毫米的凸透镜、两个平面反射镜及可旋转偏振片和快门装置；倒置显微镜主体基于Olympus公司生物倒置显微镜；监控系统包括目镜以及与计算机相连的CCD相机，进行红发夫酵母细胞的融合，其特征在于包括以下过程1将收集的对数生长期的红发夫酵母细胞，置于含有30～70mmol/L二硫苏糖醇和20～60mmol/L乙二胺四乙酸的pH为7.2的磷酸盐缓冲液中，于18～25℃处理10～30min，离心分离，收集红发夫酵母细胞。
2将经步骤1预处理后的细胞加入到由质量百分比为1～4％的葡聚糖酶、0.8mol/L氯化钾和0.02mol/L氯化钙的水溶液组成的pH为8的高渗酶液中，于18～25℃处理5～20小时，离心分离，用含0.8mol/L氯化钾和0.02mol/L氯化钙的水溶液洗涤去除葡聚糖酶，收集红发夫酵母原生质体。
3将步骤2所制得的红发夫酵母原生质体转到含有质量百分比为1～10％的聚乙二醇、0.8mol/L氯化钾和0.02mol/L氯化钙的pH为7.2的磷酸盐缓冲液组成的溶液中，红发夫酵母原生质体浓度为2.5～12.5×106/mL。向融合液中加入荧光素双醋酸酯(FDA)，融合液中的荧光素双醋酸酯浓度为0.1mg/ml。将融合液加入融合池后，置于显微镜的载物台上。
4在荧光显微镜下观察原生质体的荧光，选择一个荧光强的红发夫酵母原生质体作为融合目标1。对所选中的目标1红发夫酵母原生质体施加功率为5～20mW的激光，捕捉固定。再选择另一个荧光强的红发夫酵母原生质体作为融合目标2，由计算机控制显微镜的载物台的作前后和左右移动，使目标1和目标2两个红发夫酵母原生质体的靠近，实现目标1和目标2两个红发夫酵母原生质体接触。然后，再控制显微镜的载物台的前后和左右移动，使激光焦点所在的轴线与目标1和目标2的红发夫酵母原生质体细胞膜紧密接触的区域对中，再调节物镜焦距，使光束焦点在上下轴线方向与目标1和目标2的两原生质体细胞膜紧密接触的区域对中后，采用功率为50～100mW的飞秒光束，照射细胞膜紧密接触区域达67.5～250ms，并由显微镜目镜或通过CCD对整个融合过程进行实时观察。
5待目标1和目标2两个红发夫酵母原生质体经过150～180分钟后，融合成一个大的细胞后，再用玻璃微管将此由融合得到的细胞转移至由10g/L葡萄糖、5g/L蛋白冻、3g/L酵母粉、3g/L麦芽汁和质量百分比为1.5％的琼脂组成的固体培养基平板上，22℃培养，观察，当平板上出现菌落时说明细胞成活，融合成功。
本发明的主要优点是能够在单细胞水平进行选择性细胞融合，细胞融合率远高于PEG法；由于使用光镊预先选择活性较大的细胞，更因为飞秒激光的高分辨率，激光作用时对细胞内部没有损伤，融合子的再生率也较高；另外，本方法能对整个融合过程进行实时监控，便于融合子的检出以及在单细胞水平作进一步的分析。
图1-为实例1中已经完成接触的两个红发夫酵母原生质体的照片。
图2-为实例1中两个紧密接触的红发夫酵母原生质体在经过飞秒激光照射处理后的第23分钟，两个红发夫酵母原生质体已经发生部分融合的照片。
图3-为实例1中两个紧密接触的红发夫酵母原生质体在经过飞秒激光照射处理后的第90分钟，两个红发夫酵母原生质体的融合已经完成一半的照片。
图4-为实例1中两个紧密接触的红发夫酵母原生质体在经过飞秒激光照射处理后的第160分钟，两个红发夫酵母原生质体已经融合成一个大的细胞的照片。
具体实施例方式下面结合实例对本发明作进一步说明实例1调整飞秒脉冲激光器，使其进入锁模状态，产生输出脉冲重复频率大于70兆赫兹，脉冲宽度小于100飞秒的飞秒脉冲激光光束。通过调整光束耦合装置中的平面反射镜调节飞秒脉冲激光光束的方向，使其光轴与显微镜成像光路的光轴完全重合，将飞秒脉冲激光光束耦合进入显微镜中。
将收集的对数生长期的红发夫酵母细胞，置于含有50mmol/L二硫苏糖醇和40mmol/L乙二胺四乙酸的pH为7.2的磷酸盐缓冲液中，于22℃处理10min，离心分离，收集红发夫酵母细胞。
将预处理后的细胞加入到由质量百分比为1％的葡聚糖酶、0.8mol/L氯化钾和0.02mol/L氯化钙的水溶液组成的pH为8的高渗酶液中，于22℃静止处理20小时，离心分离，用含0.8mol/L氯化钾和0.02mol/L氯化钙的水溶液洗涤去除葡聚糖酶，收集红发夫酵母原生质体。
将制得的红发夫酵母原生质体转到含有质量百分比为10％的聚乙二醇、0.8mol/L氯化钾和0.02mol/L氯化钙的pH为7.2的磷酸盐缓冲液组成的溶液中，红发夫酵母原生质体浓度为2.5×106/mL。向融合液中加入荧光素双醋酸酯(FDA)，融合液中的荧光素双醋酸酯浓度为0.1mg/ml。将融合液加入融合池置显微镜的载物台上。
在荧光显微镜下观察原生质体的荧光，选择一个荧光强的红发夫酵母原生质体作为融合目标1。对所选中的目标1红发夫酵母原生质体施加激光，实现光镊对该目标1红发夫酵母原生质体捕捉固定。再选择另一个荧光强的红发夫酵母原生质体作为另一融合目标2，由计算机控制显微镜的载物台的前后和左右移动，实现目标1和目标2两个红发夫酵母原生质体的靠近，直至目标1和目标2两个红发夫酵母原生质体接触。接触后，再控制显微镜的载物台的前后和左右移动，使激光焦点所在的轴线与目标1和目标2的红发夫酵母原生质体细胞膜紧密接触的区域对中，再调节物镜焦距，使光束焦点在上下轴线方向与目标1和目标2的两原生质体细胞膜紧密接触的区域对中后，采用功率为50mW的飞秒激光光束，照射细胞膜紧密接触区域250ms。激光的功率由调整耦合装置中的旋转偏振片控制，光束的作用时间由整耦合光路中的快门控制。由显微镜目镜或通过CCD对整个融合过程进行实时观察，并通过图像采集装置记录细胞融合的全过程。
待目标1和目标2两个红发夫酵母原生质体已经融合成一个大的细胞，即融合过程基本完成后，用玻璃微管将此由融合得到的细胞转移至由10g/L葡萄糖、5g/L蛋白冻、3g/L酵母粉、3g/L麦芽汁和质量百分比为1.5％的琼脂组成的固体培养基平板上，22℃培养，观察细胞生长情况。
实例2收集对数生长期的红发夫酵母细胞，用50mmol/L的二硫苏糖醇和40mmol/L的乙二胺四乙酸配制成的预处理液，22℃处理15min。转入含2％葡聚糖酶的高渗酶液中22℃振荡处理7小时，收集原生质体。
使融合液中原生质体浓度为5×106/mL，PEG重量百分比浓度为10％。采用功率为50mW的光束，照射细胞膜紧密接触的区域250ms。
实例3收集对数生长期的红发夫酵母细胞，用30mmol/L的二硫苏糖醇和50mmol/L的乙二胺四乙酸配制成的预处理液，23℃处理20min。转入含2％葡聚糖酶的高渗酶液静止中23℃处理16小时，收集原生质体。
使融合液中原生质体浓度为10×106/mL，PEG为重量百分比浓度5％。采用功率为55mW的光束，照射细胞膜紧密接触的区域125ms。
实例4收集对数生长期的红发夫酵母细胞，用60mmol/L的二硫苏糖醇和50mmol/L的乙二胺四乙酸配制成的预处理液，23℃处理15min。转入含1％葡聚糖酶的高渗酶液中23℃振荡处理15小时，收集原生质体。
使融合液中原生质体浓度为10×106/mL，PEG为重量百分比浓度5％。采用功率为55mW的光束，照射细胞膜紧密接触的区域125ms。
实例5
收集对数生长期的红发夫酵母细胞，用60mmol/L的二硫苏糖醇和50mmol/L的乙二胺四乙酸配制成的预处理液，25℃处理10min。转入含1％葡聚糖酶的高渗酶液中23℃振荡处理15小时，收集原生质体。
在融合液中原生质体浓度为12×106/mL，PEG为重量百分比浓度5％。采用功率为55mW的光束，照射细胞膜紧密接触的区域125ms。
实例6收集对数生长期的红发夫酵母细胞，用30mmol/L的二硫苏糖醇和50mmol/L的乙二胺四乙酸配制成的预处理液，23℃处理15min。转入含2％葡聚糖酶的高渗酶液静止中23℃处理16小时，收集原生质体。
使融合液中原生质体浓度为12.5×106/mL，PEG为重量百分比浓度1％。采用功率为60mW的光束，照射细胞膜紧密接触的区域125ms。
权利要求
1.一种飞秒激光融合红发夫酵母细胞的方法，该方法采用飞秒激光显微操作系统实施，所述飞秒激光显微操作系统包括飞秒脉冲激光器、光束耦合装置、倒置显微镜和监控系统；所述飞秒脉冲激光器为掺钛蓝宝石自锁模飞秒激光振荡级，输出脉冲重复频率大于70兆赫兹，脉冲宽度小于100飞秒；光束耦合装置包括一个焦距为150毫米的凸透镜、两个平面反射镜及可旋转偏振片和快门装置；倒置显微镜主体基于奥林巴斯公司生物倒置显微镜；监控系统包括目镜以及与计算机相连的CCD相机，进行红发夫酵母细胞的融合，其特征在于包括以下过程1)将收集的对数生长期的红发夫酵母细胞，置于含有30～70mmol/L二硫苏糖醇和20～60mmol/L乙二胺四乙酸的pH为7.2的磷酸盐缓冲液中，于18～25℃处理10～30min，离心分离，收集红发夫酵母细胞；2)将经步骤1)预处理后的细胞加入到由质量百分比为1～4％的葡聚糖酶、0.8mol/L氯化钾和0.02mol/L氯化钙的水溶液组成的pH为8的高渗酶液中，于18～25℃处理5～20小时，离心分离，用含0.8mol/L氯化钾和0.02mol/L氯化钙的水溶液洗涤去除葡聚糖酶，收集红发夫酵母原生质体；3)将步骤2)所制得的红发夫酵母原生质体转到含有质量百分比为1～10％的聚乙二醇、0.8mol/L氯化钾和0.02mol/L氯化钙的pH为7.2的磷酸盐缓冲液组成的溶液中，红发夫酵母原生质体浓度为2.5～12.5×106/mL，向融合液中加入荧光素双醋酸酯，融合液中的荧光素双醋酸酯浓度为0.1mg/ml，将融合液加入融合池后，置于显微镜的载物台上；4)在荧光显微镜下观察原生质体的荧光，选择一个荧光强的红发夫酵母原生质体作为融合目标1，对所选中的目标1红发夫酵母原生质体施加功率为5～20mW的激光，捕捉固定，再选择另一个荧光强的红发夫酵母原生质体作为另一融合目标2，由计算机控制显微镜的载物台的前后和左右移动，实现目标1和目标2两个红发夫酵母原生质体的靠近，直至目标1和目标2两个红发夫酵母原生质体接触，再控制显微镜的载物台的前后和左右移动，使激光焦点所在的轴线与目标1和目标2的红发夫酵母原生质体细胞膜紧密接触的区域对中，再调节物镜焦距，使光束焦点在上下轴线方向与目标1和目标2的两原生质体细胞膜紧密接触的区域对中后，采用功率为50～100mW的飞秒光束，照射细胞膜紧密接触区域67.5～250ms；5)待目标1和目标2两个红发夫酵母原生质体经过150～180分钟后，融合成一个大的细胞后，再用玻璃微管将此由融合得到的细胞转移至由10g/L葡萄糖、5g/L蛋白冻、3g/L酵母粉、3g/L麦芽汁和质量百分比为1.5％的琼脂组成的固体培养基平板上，22℃培养，观察，当平板上出现菌落时说明细胞成活，融合成功。
全文摘要
本发明公开了一种飞秒激光融合红发夫酵母原生质体的方法，属于细胞融合技术。该方法采用飞秒激光显微操作系统实施，其过程包括，对数期红发夫酵母用含二硫苏糖醇和乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液预处理；用由葡聚糖酶、氯化钾和氯化钙的水溶液组成的酶液，制原生质体；将原生质体与聚乙二醇、氯化钾、氯化钙和磷酸盐缓冲液组成融合液，并加入荧光素双醋酸酯；以5～20mW的光镊为工具，实现荧光较强两目标原生质体接触；调整激光光束的焦点对准两原生质体细胞膜紧密接触区，50～100mW照射67.5～250ms；两目标原生质体完全融合后，分离，培养。本发明细胞融合率高，融合后细胞的活性高，融合子易于检出以及能对融合过程进行实时监控和记录。
文档编号C12N15/04GK1970748SQ20061012992
公开日2007年5月30日 申请日期2006年12月7日 优先权日2006年12月7日
发明者邢岐荣, 巩继贤, 李寰宇, 田震, 赵学明, 柴路, 王清月 申请人:天津大学