专利名称：利用酵母表达系统生产菊糖果糖转移酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于生产菊糖果糖转移酶的酵母工程菌，本发明还涉及该工程菌的制备方法以及应用该工程菌生产菊糖果糖转移酶的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术：
*双果糖酐III (Difructose anhydride, DFAIII)是一种新型的非还原性双糖，在自然界中少量存在于菊苣、菊芋等植物中，少量出现于蜂蜜、咖啡等的加工过程中。其相对甜度为蔗糖的52%，而热量值却只有蔗糖的1/15(0. 263kcal/g);性质十分稳定，74%相对湿度下不吸湿，比蔗糖更难吸湿，具有取代传统甜味剂蔗糖的潜能。双果糖酐III对热和酸十分稳定，在一般食品加工条件下，几乎不会出现褐变或分解现象，能耐硬糖生产时的高温熬煮而不褐变。同时，双果糖酐III还具有良好的功能特性，如在消化道不吸收，且不产生能量，可作为一个甜味剂被用作减肥辅助治疗；作为一种增歧因子，可促进肠道微生物的生长，明显改善排便、利尿功能；作为促进矿物质元素吸收的功能性糖，可使得Ca、Mg、Zn、Cu等矿物质元素被人体吸收利用的程度大大提高，增进骨骼生长；在抗龋齿方面，其性质可与木糖醇、山梨醇相媲美，不被诱发蛀牙的口腔链球菌利用，也不产酸。这些优点使其在食品、保健、医疗领域中有广阔的应用前景。然而，双果糖酐III在自然界的含量极低，天然提取分离成本高，不适宜工业化生产的需求，而化学催化法有许多不利因素，例如形成许多副产物和化学污染物，而形成的许多副产物又使纯化步骤变得复杂。而生物法制备双果糖酐III的原料是菊糖，其来源广泛，价格低廉，转化率高，可达75%以上，属于天然产品，符合消费者追求天然产品的消费心理，因此采用生物转化技术生产双果糖酐III成为研究的热点。自1973年Uchiyama I首次从产脲节杆菌中发现菊糖果糖转移酶(Inulinfructotransferase, IFTase, EC 2. 4. I. 93),用生物转化法制备双果糖酐III的研究已经有30余年的历史，然而国内除本课题组筛得一株IFTase生产菌株并对其进行相关研究夕卜，国内仍无相关研究报道。国外关于菊糖果糖转移酶的分子生物学研究始于1997年，Sakurai等人率先将ArtAroAacter sp. H65-7的菊糖果糖转移酶基因转入大肠杆菌中，得到了首个菊糖果糖转移酶基因开放阅读框，并将其酶活由初始野生菌的胞外80 U/mL提高到胞内酶活170 U/mL。迄今为止仅有5株菌实现了 IFTase的原核表达系统的活性表达，分别为 Arthrobacter sp. H65—7、Arthrobacter sp. A~6> Arthrobacter globiformisCll-I^ Arthrobacter sp.^ Bacillus 5/ . Snu_70 并且仅 A globiformis Cll-I菊糖果糖转移酶在胞外有酶活检出，且酶活很低(1.5 U/mL)文献Haraguchi K，Mori S，Hayashi K. Cloning of inulin fructotransferase (DFA Ill-Producing) gene fromArthrobacter globiformis Cll-I [J]. Journal of Bioscience and Bioengineering,2000，89: 590-595.，其他该酶原核表达几乎都为胞内表达，这使IFTase酶的后期纯化工艺较为繁琐。同时，基因在原核表达中由于多为胞内表达，信号肽序列存在不能被有效识别并切割的问题，据推断这也是该酶原核表达活性较低的原因之一。此外，大肠杆菌是原核生物，其表达过程常产生毒素，其安全性存在一定问题。
毕赤酵母基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌，培养方便经济等特点。与大肠杆菌相比能够进行蛋白的翻译后修饰加工，包括信号肽加工、蛋白质折、二硫键形成、糖基化修饰等，可有效解决一些蛋白原核表达信号肽识别问题及胞内包涵体形成问题，并在一定程度上能增加酶的稳定性，也具有更高的安全性。目前，美国FDA已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的Gphelon制剂已获得FDA批准，所以该系统被认为是安全的。同时，毕赤酵母表达系统可以采用基础培养基发酵，仅提供酵母生长所需营养即可高密度发酵，细胞干重可达100 g/L。此外，酵母细胞自身分泌的蛋白很少，可有效简化分离纯化工艺。本发明首次实现了菊糖果糖转移酶基因在酵母中的分泌表达，获得能发酵生产具有较高安全性及生物活性的菊糖果糖转移酶的工程菌，具有重要的理论意义，为国内外菊糖果糖转移酶的真核表达进行了成功初探。同时本发明也具有实际应用价值，为菊糖果糖转移酶及功能性甜味剂DFA III工业化生产提供理论依据及应用潜力，也为功能性甜味剂的开发和研究提供广阔空间。
发明内容
本发明的目的是提供构建菊糖果糖转移酶酵母工程菌的方法。本发明的技术方案一种利用酵母表达系统生产菊糖果糖转移酶的方法，步骤为
(1)以金黄节杆菌ClrtAroAacteraurescens)SW,. 001为出发菌株,PCR法获得菊糖果糖转移酶基因，通过双酶切构建重组载体X-IFTase ；
所述重组载体 X-IFTase 为pPIC9K - IFTase、pPIC9 - IFTase、pPICZaA/B/C-IFTase 或 pGAPZaA/B/C - IFTase ；
(2)将重组载体X-IFTase经线性化后转化入毕赤酵母感受态细胞，并筛选鉴定阳性转化子，即构建得到产菊糖果糖转移酶酵母工程菌；
所述毕赤酵母菌株是GS115、X-33、KM71或SMD1168 ；
(3)工程菌液体发酵生产活性菊糖果糖转移酶。将菊糖果糖转移酶酵母工程菌经甲醇诱导表达，发酵上清液与菊糖进行反应HPLC法检测双果糖酐III生成情况以进行菊糖果糖转移酶活性鉴定，表明获得的酵母工程菌具有分泌生产具有活性的菊糖果糖转移酶的能力；
重组菌单菌落接种于BMGY培养基28-30°C、280 rpm培养至0D_=2_6，离心收集菌体用BMMY培养基重悬菌体使0D_=1左右，双层纱布封口 30°C、280 rpm摇瓶发酵，每24h向培养基添加100%甲醇至终浓度为0. 5%-1. 0%。获得的4 mg/mL G418-YPD阳性重组菌株60h发酵液产活性菊糖果糖转移酶粗酶活为 10. 3U/mL。步骤(I)中所述菊糖果糖转移酶基因为菊糖果糖转移酶全基因或根据酵母密码子偏好性改造的菊糖果糖转移酶基因。步骤(2)中所述重组载体线性化利用Sac I或Sal I进行酶切。
步骤(2)中所述转化毕赤酵母菌株细胞的方法采用电击转化或化学转化。步骤(3)中所述工程菌液体发酵培养基是BMGY/BMMY、BMG/BMM或YPD。从金黄节杆菌ClrtAroAacterSK8. 001提取菊糖果糖转移酶基因组DNA，用特异性引物PCR的方法扩增获得不包含信号肽部分的菊糖果糖转移酶基因，将该基因以EcoRl和I作为酶切位点构建表达载体，重组载体经过双酶切及基因测序鉴定，转化入酵母感受态细胞，通过组氨酸缺陷及抗性筛选及PCR验证获得阳性克隆，然后，利用甲醇诱导分泌表达菊糖果糖转移酶，从而实现菊糖为新型功能性甜味剂双果糖酐III的酶法制备，具有较好的工业化生产前景。该金黄节杆HArthrobacter aurescens) SK8. 001 在中国专利200810196709.8 “一株产菊糖果糖转移酶的菌株和用该酶生产双果糖酐III的方法”中进行了保藏和公开，保藏编号为CCTCC NO M 208120。本发明的有益效果本发明实现了菊糖果糖转移酶的酵母分泌表达，获得具有活 性的菊糖果糖转移酶，对于新型功能性甜味剂双果糖酐III的酶法工业化生产具有广泛的应用前景和意义。
图I重组质粒pPPIC9K_IFTase的构建示意图。用于酵母生产IFTase的PPIC9K-IFTase表达载体图
图2重组酵母诱导表达粗酶液SDS-PAGE。酵母重组菌经甲醇诱导各时间点的上清SDS-PAGE 图。图3重组菌IFTase粗酶活性检测的HPLC图谱。HPLC法检测重组菌IFTase粗酶活性(a)双果糖酐III标准品的HPLC图谱；(b)重组酵母发酵上清液与菊糖反应后的HPLC图谱。图4重组菌生产菊糖果糖转移酶发酵上清液酶活及菌体生长情况。
具体实施例方式
实施例I目的基因ift的获得(菌落PCR法)
模板的制备取一环金黄色节杆菌ArtAroAacter aurescens SK8. 001单菌落,溶于IOOii L灭菌水中，将菌悬液-20°C冷冻lOmin，再沸水浴lOmin，室温静置。取上清液3 ii L作为目的基因PCR模板，以包含I和I酶切位点的下列核苷酸序列作为引物，经PCR扩增得到不含信号肽序列的菊糖果糖转移酶DNA片段，S卩i/匕基因扩增引物
上游引物 Pl :5’ -CCGGAAITCGCCGAAGGCGCGAAGG-3’，
下游引物 P2 :5’ -ATAAGAATGCGGCCGCTCAGGGCGTGGGCCGA-3’，ift基因扩增体系(50 u L)
ddHaO|22 U L
模士_3u L
50uM上游引物TTI~
50tiM下游引物 IuL PremixTaiy 酶 23 y LPCR反应条件94°C预变性5min ;94°C变性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸90s，进行35个循环；最后72°C延伸lOmin。即以金黄节杆菌Cl rtAroAacterSK8. OOl为出发菌株，PCR法获得目的基因i/纟，其含有1233 bp，编码有410个氨基酸的序列，核苷酸序列为SEQ ID NO :1。实施例2重组载体pPIC9K_IFTase的构建
I、构建pPIC9K-IFTase重组载体将实施例I的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后进行DNA回收，对回收产物经限制性内切酶I和I进行双酶切，与经过同样双酶切的质粒pPIC9K在T4连接酶的作用下过夜连接，实现重组载体pPIC9K-IFTase的初步构建。2、DH5 a感受态细胞的制备挑取大肠杆菌DH5 a单菌落于LB液体培养基，37°C、200 rpm过夜培养，按3%接种量接种到新的IOOmL LB培养基37°C、200 rpm振荡培养，约Ih后间断取样，使OD6tltl=O. 35-0. 4。培养物冰上冷却lh，离心弃去上清，沉淀分别用冰预冷的IOOmM MgCl2及IOOmM CaCl2悬浮洗涤细胞，最终用85mM CaCl2 (溶于15%甘油)重悬细胞，分装获得DH5a感受态细胞，_80°C冷冻保存备用。3、重组载体pPIC9K- IFTase转化至DH5 a中将过夜连接后的重组载体pPIC9K_IFTase转化入DH5 a感受态细胞中，涂布含有50 U g/ mL氨苄霉素抗性的LB固体培养基，37°C培养18-24h初步获得阳性克隆。4、重组载体的双酶切验证经抗性培养基筛选得到阳性克隆分别挑取初步阳性克隆于含有50 U g/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中，37°C、200 rpm培养过夜，提取质粒，经限制性内切酶I和I双酶切质粒，根据电泳后的双酶切结果初步判断阳性克隆。5、对初步获得的重组载体pPIC9K-IFTase进行基因测序，结果表明pPC9K插入片段为一个含有1233 bp，编码有410个氨基酸的序列，成功构建重组载体pPIC9K-IFTase，其含有10503 bp，核苷酸序列为SEQ ID NO :2。实施例3菊糖果糖转移酶毕赤酵母重组菌筛选
I、毕赤酵母GS115感受态细胞的制备挑取GSl 15酵母单菌落于YH)液体培养基30°C、200 rpm过夜培养，按1%接种量扩大培养至0D_=1. 3-1. 5，分别用冰预冷的灭菌水及IM山梨醇溶液洗涤，最终以IM山梨醇分装获得毕赤酵母GS115感受态细胞。2、重组载体pPIC9K_IFTase电转化入毕赤酵母GSl 15感受态细胞将pPIC9K-IFTase质粒经I线性化后电转化入毕赤酵母GSl 15感受态细胞(电转化条件电压1500 V，电容25 U F，电阻200欧，转化时间4-10 msec)，涂布于MD平板，30°C培养2d至出现单菌落，以His缺陷型进行初步筛选可能的阳性重组菌。3、G418梯度抗性重组菌筛选将MD平板培养获得的可能阳性重组菌点接种于G418 10个浓度梯度的YH)平板获得不同拷贝数的pPIC9K-IFTase毕赤酵母重组菌，每个遗传霉素浓度为 0,0. 25,0. 5,0. 75,1. 0,1. 5,1. 75,2. 0,3. 0,4. O mg/mL，30°C培养 2d 至出现
单菌落。4、菌落PCR法鉴定重组酵母将经过G418抗性筛选的假定重组菌经过Lyticase酶消化、_20°C冷冻及室温化冻，菌体上清作为待PCR鉴定重组菌的模板，以通用引物5’AOX和3’ AOX为上下游引物进行菌落PCR，结果经琼脂糖凝胶电泳鉴定获得阳性菊糖果糖转移酶毕赤酵母重组菌。
PCR 鉴定体系(20 ii L)
ddHa0|8ti L '
模士_I- 2u L
50 u M5’AOX 上游引物 ~07T7l50 Ii M3’AOX 下游引物一 0. 4ti L :
PremixTaiy 酶IOyL
PCR反应条件94°C预变性5min ;94°C变性Imin，53°C退火Imin，72°C延伸90s，进行35
个循环；最后72°C延伸lOmin。
实施例4重组菌的诱导表达及活性检测
将实施例3获得的重组菌单菌落接种于BMGY培养基30°C、280 rpm培养至0D_=2_6，离心收集菌体用BMMY培养基重悬菌体使0D_=1左右，双层纱布封口 30°C、280 rpm摇瓶发酵，每24h向培养基添加100%甲醇至终浓度为0. 5%-1. 0%。不同时间收集菌体，进行SDS-PAGE鉴定蛋白及HPLC法酶活性测定。在未实行培养条件优化及合适拷贝筛选条件下，获得的4mg/mL G418-YPD阳性重组菌株发酵液粗酶活60h为10. 3U/mL。菊糖果糖转移酶活力定义在60°C、pH5. 5条件下每分钟产1.0 PM双果糖酐III所需的酶量为I个酶活力单位(U)。
权利要求
1.一种利用酵母表达系统生产菊糖果糖转移酶的方法，其特征在于步骤为 (1)以金黄节杆菌ClrtAroAacteraurescens)SW,. 001为出发菌株,PCR法获得菊糖果糖转移酶基因，通过双酶切构建重组载体X-IFTase ； 所述重组载体 X-IFTase 为pPIC9K - IFTase、pPIC9 - IFTase、pPICZaA/B/C-IFTase 或 pGAPZaA/B/C - IFTase ； (2)将重组载体X-IFTase经线性化后转化入毕赤酵母感受态细胞，并筛选鉴定阳性转化子，即构建得到产菊糖果糖转移酶酵母工程菌； 所述毕赤酵母菌株是GS115、X-33、KM71或SMD1168 ； (3)工程菌液体发酵生产活性菊糖果糖转移酶 将菊糖果糖转移酶酵母工程菌经甲醇诱导表达，发酵上清液与菊糖进行反应HPLC法 检测双果糖酐III生成情况以进行菊糖果糖转移酶活性鉴定，表明获得的酵母工程菌具有分泌生产具有活性的菊糖果糖转移酶的能力； 重组菌单菌落接种于BMGY培养基28-30°C、280 rpm培养至0D_=2_6，离心收集菌体用BMMY培养基重悬菌体控制使0D_=1，双层纱布封口 30°C、280 rpm摇瓶发酵，每24h向培养基添加100%甲醇至终浓度为0. 5%-1. 0% ； 获得的4 mg/mL G418-YPD阳性重组菌株60h发酵液产活性菊糖果糖转移酶粗酶活为10.3U/mL。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I)中所述菊糖果糖转移酶基因为菊糖果糖转移酶全基因或根据酵母密码子偏好性改造的菊糖果糖转移酶基因。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述重组载体线性化利用SacI或Sal I进行酶切。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述转化毕赤酵母菌株细胞的方法采用电击转化或化学转化。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述工程菌液体发酵培养基是BMGY/BMMY、BMG/BMM 或 YPD。
全文摘要
利用酵母表达系统生产菊糖果糖转移酶的方法，属于基因工程技术领域。本发明步骤包括(1)菊糖果糖转移酶基因(ift)的克隆，通过双酶切构建重组载体X-IFTase；(2)重组载体X-IFTase转化入毕赤酵母感受态细胞，营养缺陷型筛选及抗生素抗性筛选阳性转化子，即得产菊糖果糖转移酶酵母工程菌；(3)工程菌液体发酵分泌生产活性菊糖果糖转移酶。本发明实现了菊糖果糖转移酶的酵母分泌表达，获得具有活性的菊糖果糖转移酶，对于新型功能性甜味剂双果糖酐III的酶法工业化生产具有广泛的应用前景和意义。
文档编号C12N9/10GK102653739SQ201210187069
公开日2012年9月5日 申请日期2012年6月8日 优先权日2012年6月8日
发明者战荣荣, 江波, 沐万孟 申请人:江南大学