专利名称：应用乳腺癌转移相关基因基因芯片建立筛选抗乳腺癌转移药物的方法
技术领域：
本发明涉及应用乳腺癌转移相关基因基因芯片和其它实验方法，用于筛选抗乳腺癌转移药物，属生物技术领域。
背景技术：
肿瘤转移是导致病人死亡的主要原因。然而，目前尚缺少有效的技术手段用于筛选和鉴定已经具有抗乳腺癌作用的药物是否具有抑制转移的作用。因此，建立新的快速、方便、准确、高通量和高效率的检测方法具有重要的意义。基因芯片技术已用于生物医学等各个领域，并取得了飞速的发展，为实现上述研究提供了可能。大量研究表明，基因芯片技术可用于多种临床药物的筛选，具有高通量和高效率等特点，同时可阐明药物作用的分子机制，能够发现药物作用的靶基因，从而为新药开发提供线索。
发明内容
应用自行制备的“乳腺癌转移相关基因基因芯片”结合其它实验方法筛选抗乳腺癌转移的药物。在筛选抗乳腺癌转移药物的同时，阐明药物的作用分子机制，确定药物作用的靶基因，为新药的开发提供线索。并结合我们建立的具有高转移倾向的人乳腺癌细胞系(LM-MCF-7细胞系，已获得申请国家发明专利，ZL03130264.5)和严重免疫缺陷(Severecombined immunodeficiency，SCID)的小鼠乳腺癌转移动物模型，进行细胞水平和动物水平的研究和验证。从而建立一套在分子水平、细胞水平和动物水平上互相结合相互验证的实验技术平台，用于快速高通量地筛选抗乳腺癌转移药物。
本发明的主要内容是1.首先在细胞水平上通过流式细胞仪观察候选抗癌药物抑制LM-MCF-7细胞增殖的有效浓度；2.通过“伤口愈合”实验观察候选抗肿瘤药物对LM-MCF-7细胞迁移能力的影响，初步筛选具有抑制乳腺癌细胞迁移作用的药物；3.应用乳腺癌转移相关基因基因芯片检测初步筛选的抗乳腺癌药物作用LM-MCF-7细胞后相关基因表达谱的变化，反向推测药物作用乳腺癌转移相关基因的靶基因。然后，应用Real-time PCR方法对变化的基因进行验证。如果LM-MCF-7细胞在药物作用后出现与乳腺癌转移正相关基因下调和/或与乳腺癌转移负相关基因上调，则表明该药物可能具有抑制乳腺癌细胞转移作用的分子基础；4.在上述基础上，将LM-MCF-7细胞接种SCID小鼠后，定时腹腔注射上述筛选的抗肿瘤转移药物，一定时间后处死动物进行病理观察。通过与对照组相比，在动物水平上进一步验证药物在动物水平对肿瘤转移是否具有抑制作用。
综合上述分子、细胞和动物水平观察的实验结果，筛选出具有抑制乳腺癌细胞转移作用的药物。一方面，从基因表达谱水平观察抗癌药物对肿瘤转移相关基因的影响；另一方面，从细胞水平和动物水平观察抗癌药物是否具有抑制肿瘤细胞迁移和转移的作用。进而，在筛选出具有抗乳腺癌转移作用药物的同时，也阐明了药物作用的基因靶点，有利于揭示其分子机制。
本发明的有益效果是1.应用乳腺癌转移相关基因基因芯片建立筛选抗乳腺癌转移药物的方法，可从分子水平上高通量地观察乳腺癌转移相关基因表达谱的变化，提供了大规模、高通量筛选肿瘤药物的技术平台；2.将建立的LM-MCF-7细胞系、基因芯片和相应的乳腺癌高转移动物模型相结合，应用该研究手段可筛选出抗乳腺癌转移药物。从不同水平阐明药物的抗乳腺癌转移作用，可使筛选出药物的作用更可靠。
附图简要说明
图1观察药物对LM-MCF-7细胞迁移能力的影响通过“伤口愈合”，观察阿霉素(ADM)、顺铂(DDP)、小檗胺(EBB)、足叶乙甙(VP-16)、盐酸平阳霉素(PYM)和异环磷酰胺(Ifo)分别作用LM-MCF-7细胞迁移能力变化的实验结果。
图2应用建立的乳腺癌转移相关基因基因芯片进行药物筛选实验的基因芯片结果图左侧A、B、C、D、E和F分别为抗肿瘤药物ADM，DDP，EBB，VP 16，PYM和Ifo，作用LM-MCF-7细胞后与乳腺癌转移相关基因基因芯片杂交的伪色图，cy5用红色表示，cy3用绿色表示。对于某一点的信号来讲，如果cy3信号较强，该点多显绿色；如果cy5信号较强，该点多显红色；如果强度相似，即显黄色。
图右侧是抗肿瘤药物ADM，DDP，EBB，VP 16，PYM和Ifo分别作用LM-MCF-7细胞后与乳腺癌转移相关基因基因芯片杂交的散点图，可以比较直观地看出在两个样品之间基因表达的差异情况。其中X轴和Y轴分别以两个样品的荧光信号强度值为坐标，图中每一个数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号，红色标记和绿色标记的数据点分别表示Y/X的Ratio值≥2和≤0.5，确定为表达有差异的基因，黑色标记表示Y/X的Ratio值在0.5和2之间，确定为表达基本无差异。
根据Ratio值≥2和≤0.5，顺铂作用LM-MCF-7细胞后可上调ERCC1基因，并下调PIK3C2B、PGK1、RAF1、AA262211、W30988、nck、STK15和H58873等基因。图3nck、PIK3C2B和PGK1三个基因的实时定量PCR扩增曲线和柱状图用Real-time PCR检测3.3μg/ml顺铂作用LM-MCF-7细胞对nck、PIK3C2B和PGK1基因表达的影响。对照组为不加药。每个样品重复三次，计算反应的Ct值，实验结果显示，顺铂可以显著抑制nck、PIK3C2B和PGK1三个基因的表达。
图3应用Real-PCR对基因芯片的部分结果进行验证nck、PIK3C2B和PGK1三个基因的实时定量PCR扩增曲线图。
图4动物实验结果观察抗肿瘤转移药物对乳腺癌LM-MCF-7细胞转移能力的抑制作用。接种27天SCID小鼠肿瘤生长状况A.接种肿瘤细胞注射药物的实验组小鼠；B.接种肿瘤细胞未注射药物的对照组小鼠。
具体实施例方式
实施例1 抗癌药物抑制肿瘤细胞增殖有效浓度的确定选用临床上应用的抗癌药物，如阿霉素(ADM，浙江海正药业股份有限公司)、顺铂(DDP，齐鲁制药有限公司)、小檗胺(EBB，北京东升制药厂)、足叶乙甙(VP-16，江苏恒瑞医药股份有限公司)、盐酸平阳霉素(PYM，哈尔滨博莱制药有限公司)和异环磷酰胺(Ifo，江苏恒瑞医药股份有限公司)等，作用LM-MCF-7细胞。首先在细胞水平上通过流式细胞仪观察所筛选的抗癌药物抑制肿瘤细胞增殖的有效浓度，具体方法如下(1)待测样本制成单细胞悬液，然后1000rpm离心5分钟，弃上清。
(2)用4℃预冷的70％乙醇固定，4℃保存，至少固定18小时。
(3)调整细胞浓度为106个细胞/ml，取1ml细胞悬液，用PBS洗三次，细胞重悬于1毫升PBS溶液中PI(碘化丙啶，Solarbio产品)染液中，37℃孵育30分钟即可进行流式分析。
(4)PI染液终浓度为50μg/ml，RNase A终浓度为20μg/ml。
(5)流式细胞仪检测以流式细胞仪检测的结果显示细胞增殖受到抑制、出现细胞凋亡时的浓度作为判断上述抗癌药物抑制肿瘤细胞增殖的有效浓度。
实施例2 抗癌药物抑制肿瘤细胞迁移作用的检测在检测出药物有效浓度后，应用“伤口愈合”实验观察药物对高转移倾向乳腺癌LM-MCF-7细胞迁移能力的影响，检测该药物是否具有抑制肿瘤细胞迁移的作用，具体方法如下a)将LM-MCF-7细胞接种在盖玻片上，用RPMI 1640培养基进行培养，培养基含有10％胎牛血清，青霉素100U/ml和硫酸链霉素100μg/ml，于培养箱37℃，5％CO2条件下培养过夜。换无血清培养12h，进行细胞同步化；b)用移液器枪头的枪尖在盖玻片上划线，用PBS小心的清洗细胞；c)加入上述有效浓度抗肿瘤药物作用，培养细胞12h；d)镜检照相，观察在药物作用下细胞迁移能力的变化。
应用ADM，EBB，DDP，VP-16，Ifo和PYM作用LM-MCF-7细胞后进行细胞划痕实验的实验结果见图1。
实施例3 应用建立的乳腺癌转移相关基因基因芯片对上述初筛药物进行筛选在上述研究获得了药物抑制LM-MCF-7细胞增殖的有效浓度和具有抑制细胞迁移的作用后，应用乳腺癌转移转移相关基因基因芯片对抗肿瘤转移药物做进一步的筛选，旨在检测细胞经过药物作用后与乳腺癌转移转移相关基因的基因谱表达变化，以此揭示药物在基因水平作用的靶点。具体方法如下提取经过药物作用12h细胞的总RNA，反转录为cDNA，对cDNA进行荧光标已，然后与肿瘤转移相关基因的基因芯片进行杂交(重复4次)，通过比较加药前后的细胞基因表达谱的变化进行分析。如果该药物具有上调肿瘤转移抑制基因和/或下调肿瘤转移促进基因的作用，即表明该药物具有抑制肿瘤转移的分子基础。
基因芯片检测结果分析步骤
1.数据筛选由于每个基因对应多个ratio值，对于删除弱信号点后的数据，很多基因的保留下来的ratio值彼此不同。选择保留的ratio值个数在4个以上的基因进行差异分析，以确保结果的可靠性。
2.对数变换对所有的ratio取以2为底数的对数，以减少数据的变异及增加数据分布的对称性。
3.t检验a)计算Log2(ratio)的均数(Lmean)、标准差(sd)。
b)根据公式t＝(Lmean)*(n^0.5)/sd计算t值，其中n为样本量。取t值的绝对值，并按照t值的绝对值进行降序排列。
c)根据t绝对值，做出统计学结论对于4个重复点，在95％的水准，|t＞3.182对应的基因为差异表达基因；在99％的水准，|t|＞5.841的基因为差异表达基因。
应用ADM，EBB，DDP，VP-16，Ifo和PYM作用LM-MCF-7细胞后进行上述基因芯片检测结果见图2。
实施例4 应用Real-time PCR对基因芯片的部分结果进行验证为了检测基因芯片结果的正确性，针对变化明显有意义的基因设计PCR引物，以上述cDNA为模板，进行Real-time PCR。我们在顺铂筛选出来的基因中选取了nck、PIK3C2B和PGK1三个基因进行Real-time PCR的验证。具体步骤如下1.总RNA的提取将LM-MCF-7细胞培养过夜，无血清培养12h，分成对照组和顺铂3.3μg/m组作用LM-MCF-7细胞12h，PBS洗细胞两次，每瓶细胞加入1ml Trizol于冰上裂解细胞，抽提细胞总RNA。
2.cDNA模板的获得用上述实验获得的两种总RNA作为模板，采用上海生工MMLV第一链cDNA合成试剂盒，并按试剂盒规定的流程操作。
3.Real-time PCR检测分别取上述两种总cDNA模板通过PCR手段检测顺铂对乳腺癌转移相关基因nck、PIK3C2B和PGK1的影响。用引物设计软件primer 5.0设计PCR引物。PCR体系、PCR反应条件和引物序列如表1，表2和表3所示。每个样品重复三次，获得nck、PIK3C2B和PGK1三个基因的实时定量PCR扩增曲线，计算反应的Ct值，实验结果显示，顺铂可以显著抑制nck、PIK3C2B和PGK1三个基因的表达。
表1.PCR反应体系
表2.PCR反应条件
表3.引物序列列表
Real-time PCR实验结果nck、PIK3C2B和PGK1三个基因的实时定量PCR扩增曲线图。见图3。
实施例5通过以上细胞水平和分子水平的筛选，可初步筛选出抗肿瘤药物是否具有抑制肿瘤转移的作用。为了进一步验证该药物抑制肿瘤转移的作用，进行动物水平的研究，观察所筛选的药物对高转移倾向乳腺癌LM-MCF-7细胞的抑制效果。从而进行药物疗效的综合评估。
具体方法如下将1×107个乳腺癌LM-MCF-7细胞接种SCID小鼠，以5只动物为1组，5天后动物成瘤。成瘤后将上述筛选的有效药物按临床用药的计量(mg/Kg)，腹腔注射SCID小鼠。根据小鼠的反应，每3-6天注射一次，达到小鼠可耐受药物毒性而存活的目的。30天后将SCID小鼠处死，取各个脏器及骨髓在福尔马林固定液中固定，做病理切片，观察肿瘤细胞转移情况。以未注射药物的SCID小鼠作为对照实验。
动物实验结果见图4。接种27天小鼠的肿瘤生长状况A.接种肿瘤细胞注射顺铂(注射的剂量为6mg/kg)的实验组小鼠；B.接种肿瘤细胞未注射药物的对照组小鼠。
权利要求
建立一种应用乳腺癌转移相关基因基因芯片筛选抗乳腺癌转移药物的实验方法，其特征在于它包括
1.建立一套研究方法用于筛选抗肿瘤转移药物，包括在细胞水平上应用高转移倾向乳腺癌LM-MCF-7细胞进行侯选药物的初步筛选，获得抑制细胞增殖的有效浓度并确定是否具有抑制细胞迁移的作用。然后，应用该浓度药物作用LM-MCF-7细胞12h后，提取细胞的总RNA，反转录为cDNA，对cDNA进行荧光标记，之后与我们建立的乳腺癌转移相关基因基因芯片进行分子杂交，通过比较加药前后的细胞基因表达谱的变化进行分析。如果获得该药物具有上调肿瘤转移抑制基因和/或下调肿瘤转移促进基因的效果，即表明该药物具有抑制肿瘤转移的分子基础。通过Real-time PCR技术，对基因芯片检测阳性结果进行验证。最后，进行动物实验，从动物整体水平观察药物抑制肿瘤转移的效果。
2.在筛选抗肿瘤转移药物抑制肿瘤转移效果的同时，基因芯片的应用提供了高通量快速有效的手段，揭示药物作用的靶基因，有助于阐明药物作用的分子机制，并可为新药开发提供线索。
全文摘要
本发明公开了一种应用乳腺癌转移相关基因基因芯片建立筛选抗乳腺癌转移药物的方法，与以往筛选抗肿瘤转移药物的方法相比，该方法包括首先在抗乳腺癌转移药物作用下，通过流式细胞仪观察候选抗癌药物抑制高转移倾向的乳腺癌LM－MCF－7细胞增殖的有效浓度；通过“伤口愈合”实验初步筛选出该药物是否具有抑制肿瘤细胞迁移的作用；然后，应用建立的“乳腺癌转移相关基因基因芯片”，在基因水平上观察乳腺癌转移相关基因表达谱的变化，反向推测抗乳腺癌转移药物的作用和作用的靶基因。最后，在动物水平上进一步验证药物对肿瘤转移是否具有抑制作用。上述方法一方面从基因表达谱水平观察抗癌药物对乳腺癌转移相关基因的影响；另一方面从细胞水平和动物水平观察抗癌药物是否具有抑制乳腺癌细胞迁移和转移的作用。进而，在筛选出具有抗乳腺癌转移作用药物的同时，也阐明了药物作用的基因靶点，有利于揭示其分子机制。
文档编号C12Q1/68GK1974789SQ200610130108
公开日2007年6月6日 申请日期2006年12月13日 优先权日2006年12月13日
发明者张晓东, 叶丽虹, 王长晔, 吴莲英 申请人:南开大学