专利名称：固定化酵母细胞进行酒精发酵的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种利用固定化酵母细胞进行酒精发酵的生产方法。具体的说是一种以聚乙烯醇复合凝胶为载体的固定化酵母细胞进行酒精发酵的生产方法。
背景技术：
固定化细胞是将具有生物活性的细胞限制在一定的空间内仍能保持其特有的生物特性(如繁殖和生长代谢)，并可重复使用的一门高新技术。
将酵母细胞固定在载体中，经增殖培养后，用于酒精发酵生产中。与传统游离细胞酒精发酵相比具有酵母细胞生长繁殖速度快、细胞数多、抗杂菌能力强、发酵效率高等特点，并可大大加快发酵速度，缩短发酵周期，有效提高设备利用率，提高酒精产量和降低成本，可获得比传统工艺更大的经济效益。
近年来，期刊文献和专利公报已公布了多种利用聚乙烯醇(PVA)进行微生物细胞的固定化。如中国专利CN1302863公布了一种聚乙烯醇固定化酶/微生物的方法，是将聚乙烯醇、海藻酸钠、丙烯酰胺与水的混合，制成聚乙烯醇溶液，对酶/微生物进行固定化，其中丙烯酰胺作为交联剂。中国专利CN1076488公布了聚乙烯醇微生物或酶固定化载体的制备方法，是将微生物或酶PVA溶液混合后，置于饱和硼酸溶液中，短时间内使其形成球体，随即将该球体与磷酸盐溶液接触，使其充分硬化，而制成微生物或酶固定化载体。上述方法虽可获得强度较好的固定化细胞，但在实际操作中存在着制备工序复杂、能源消耗较大及成本较高等问题。
发明内容
本发明目的是提供一种利用固定化酵母细胞进行酒精发酵的生产方法。
本发明包括下列步骤将10毫升10％的酵母菌悬浮液加入到90毫升9％的聚乙烯醇复合凝胶溶液中，搅拌均匀后倒入培养皿中铺成平板，然后在-20℃～-30℃下冷冻处理24～48小时，成型后取出切成块状，外形尺寸为12mm×10mm×12mm；然后在12波美度(°Be′)的麦芽汁培养基中增殖培养20～48小时，麦芽汁培养基为40％的麦芽汁与60％的玉米糖化醪，培养温度为27℃～32℃，摇床转速为100r/min；待增殖好后，将固定化酵母按6～8％的载体添加量加入到16勃力克斯(Bx)的玉米糖液(起始pH4.5～4.8)中进行固定化酵母间歇式或半连续酒精发酵。
固定化酵母在麦芽汁培养基中增殖培养的时间为36小时，培养温度为30℃±1。固定化酵母的载体添加量为7％。
本发明固定化细胞的载体是以聚乙烯醇、硼砂、顺丁烯二酸酐及丙三醇为主要原料合成的，其中所用的聚乙烯醇是由醋酸乙烯单体经聚合、醇化而成的水溶性高分子聚合物，其碱化度为95％以上，聚合度1750±50。若聚合度过低则胶体不稳定，不易成型，过高则粘度升高，造成载体孔隙率降低，影响包埋效果。
本发明所制的固定化酵母具有化学稳定性好，机械强度高，无毒、无副作用，有较好的生物相容性，制备简单，成本低廉等特点。较传统酵母酒精发酵具有抗杂菌能力强，发酵效率高等优势。
图1是本发明的工艺流程图。
具体实施例方式
下面的实施例可以使本领域的技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1固定化细胞的载体——聚乙烯醇(PVA)复合凝胶的合成方法(已于2004年申请专利，申请号2004100388085)如下，将9克聚乙烯醇缓慢溶解到100毫升85℃～95℃的热水中，边加边搅拌，待聚乙烯醇完全溶解后，加入4毫升的丙三醇，搅拌均匀，然后在不断搅拌的同时加入已溶解好的1克的硼砂(用1∶1的热水溶解)，边加边搅拌，进行凝胶化处理，交联时间为2～15分钟，然后缓慢地加入1克的顺丁烯二酸酐(用1∶1的热水溶解)，不断搅拌，直至凝胶溶液中无絮状凝固物为止，所得透明、略带乳白色的粘稠溶胶，即为聚乙烯醇复合凝胶。
将10mL10％的酵母菌悬浮液加入到90mL9％的PVA复合凝胶溶液中，搅拌均匀后倒入培养皿中铺成平板，然后在-20℃下冷冻处理48h，成型后取出切成块状，外形尺寸为12mm×10mm×12mm，然后在12b波美度(°Be′)的麦芽汁培养基中摇床(转速100r/min)培养36h，麦芽汁培养基为40％的麦芽汁和60％的玉米糖化醪，培养温度为30℃±1。待增殖好后，将固定化酵母按7％的载体添加量加入到16勃力克斯(Bx)的糖液(起始pH值4.5～4.8)中进行固定化酵母间歇式酒精发酵。结果表明增殖后酵母细胞数可达到1.2×109个/g，酒精发酵产率达到12％，载体强度较好，抗杂菌能力强，发酵周期27～33h，可连续重复使用200d以上。
对比例A重复实施例1，有以下不同点将10mL10％的酵母菌悬浮液加入到90mL8％、10％、11％、12％的PVA复合凝胶溶液中。在实施例1中同样条件下测定，结果显示增殖酵母细胞数达到1×109个/g、9.2×108个/g、8.9×108个/g、8.8×108个/g，酒精发酵产率分别为11.3％、11％、9.8％、9.7％。
对比例B重复实施例1，有以下不同点将固定化酵母按3％、5％、9％和12％的载体添加量加入到16Bx的糖液(起始pH值4.5～4.8)中进行固定化酵母间歇式酒精发酵。在实施例1中同样的条件下测定，结果显示酒精发酵产率分别为6.3％、10.6％、11.1％、10.3％。
对比例C重复实施例1，有以下不同点将10mL8％、12％、15％和20％的酵母菌悬浮液加入到90mL9％的PVA复合凝胶溶液中。结果显示增殖后酵母细胞数可达到0.96×109个/g、1.1×109个/g、0.89×109个/g、0.84×109个/g，酒精发酵产率分别为11.2％、10.9％、9.8％、9.1％。
实施例2将10mL10％的酵母菌悬浮液加入到90mL9％的PVA复合凝胶溶液中，搅拌均匀后倒入培养皿中铺成平板，在-20℃下冷冻处理24h后，切成12mm×10mm×12mm的小块，然后在12波美度(°Be′)的麦芽汁培养基中摇床(转速100r/min)培养36h，麦芽汁培养基为40％的麦芽汁和60％的玉米糖化醪，培养温度为30℃±1。待增殖好后，将固定化酵母按7％的载体添加量加入到16勃力克斯(Bx)的糖液(起始pH值4.5～4.8)中进行固定化酵母间歇式酒精发酵。结果表明增殖后酵母细胞数可达到0.96×109个/g，酒精发酵产率11.4％，连续重复使用200d。这可能是由于冷冻时间较少而造成载体的孔径和空袭率较小，进而影响到酵母细胞在载体中的增殖速度，效果不如实施例1。
通过本发明实施例与对比例的比较，说明本发明所制的固定化酵母产品具有较好的机械性能，制备简单，成本低廉等特点。较传统酵母酒精发酵具有抗杂菌能力强，发酵效率高等特点。可有效地提高设备利用率、酒精产量和降低成本。
权利要求
1.一种固定化酵母细胞进行酒精发酵的生产方法，它包括下列步骤将10毫升10％的酵母菌悬浮液加入到90毫升9％的聚乙烯醇复合凝胶溶液中，搅拌均匀后倒入培养皿中铺成平板，然后在-20℃～-30℃下冷冻处理24～48小时，成型后取出切成块状，外形尺寸为12mm×10mm×12mm；然后在12波美度(°Be′)的麦芽汁培养基中增殖培养20～48小时，麦芽汁培养基为40％的麦芽汁与60％的玉米糖化醪，培养温度为27℃～32℃，摇床转速为100r/min；待增殖好后，将固定化酵母按6～8％的载体添加量加入到16勃力克斯(Bx)的玉米糖液(起始pH4.5～4.8)中进行固定化酵母间歇式或半连续式酒精发酵。
2.按照权利要求1的方法，其中固定化酵母在麦芽汁培养基中增殖培养的时间为36小时，培养温度为30℃±1。
3.按照权利要求1或2的方法，其中固定化酵母的载体添加量为7％。
全文摘要
本发明公开了一种固定化酵母细胞进行酒精发酵的生产方法。它包括下列步骤将10毫升10％的酵母菌悬浮液加入到90毫升9％的聚乙烯醇复合凝胶溶液中，搅拌均匀后倒入培养皿中铺成平板，然后在－20℃～－30℃下冷冻处理24～48小时，成型后取出切成块状，外形尺寸为12mm×10mm×12mm；然后在12波美度(°Be′)的麦芽汁培养基中增殖培养20～48小时，麦芽汁培养基为40％的麦芽汁与60％的玉米糖化醪，培养温度为27℃～32℃，摇床转速为100r/min；待增殖好后，将固定化酵母按4～8％的载体添加量加入到16勃力克斯(Bx)的玉米糖液(起始pH4.5～4.8)中进行固定化酵母间歇式或半连续式酒精发酵。本发明所制的固定化酵母具有操作稳定性好，机械强度高，无毒、无副作用，制备简单，成本低廉等特点。
文档编号C12P7/06GK1837370SQ200510041888
公开日2006年9月27日 申请日期2005年3月25日 优先权日2005年3月25日
发明者周剑平, 王治业, 龚伟中, 杨晖, 晁开, 魏甲乾, 宋洁 申请人:甘肃省科学院生物研究所