专利名称：中国葡萄属野生种秦岭葡萄抗黑痘病候选基因序列及应用的制作方法
技术领域：
本发明明涉及葡萄常规杂交育种、分子标记辅助育种、基因定位与作图及基因克隆的方法与技术，特别涉及中国葡萄属野生种秦岭葡萄抗黑痘病候选基因序列及其应用。
背景技术：
葡萄黑痘病(Elsinoe ampelina(de bary)shear)原产欧洲和北非，是危害欧洲葡萄的重要真菌病害之一。目前，对于黑痘病的防治，主要以化学防治为主，但是，化学防治不仅增加生产成本，造成环境污染，还可能引起葡萄病害生理小种的变异及病原菌的抗药性，同时降低葡萄及其加工产品(葡萄酒、葡萄干等)的产量和品质。大量科学研究和生产实践证明，利用植物自身抗病性，培育抗病、优质葡萄新品种是最经济有效的措施之一。中国是葡萄属植物重要的起源地之一，我国的野生葡萄资源不仅抗病，而且和欧洲葡萄杂交亲和性好，可以有效地将抗病基因与欧洲葡萄品质性状相结合，引入中国野生葡萄抗病基因育种，不仅受到国内研究者，而且受到国外学者的高度重视，所以中国野生葡萄是迄今公认的抗病育种种质资源。
植物能对特定的病原微生物进行识别并产生抗性，这是由抗病基因决定的。基因对基因假说认为，抗病基因是病原微生物致病基因的受体，能与致病因子复合物通过一系列信号传导起始抗病反应，如发生过敏性反应、细胞壁增厚、坏死斑的出现以及防卫基因的表达等。抗病基因根据编码的蛋白质结构上的异同，可以将除Hm1外的其他基因分为4大类，即含有核苷酸结合位点(NBS)和富含亮氨酸重复(LRR)的胞内受体蛋白基因；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(STK)基因；含有胞外LRR结构的跨膜受体蛋白基因以及同时含有胞外LRR和胞内STK结构的跨膜受体蛋白基因，这些不同植物来源的抗病基因在结构上的保守性暗示了利用同源序列法分离抗病基因的潜在可能性，其中小麦抗叶锈病基因Lr10的分离是利用同源序列法进行抗病基因分离的首次成功报道。
发明内容
本发明的目的在于，提供中国葡萄属野生种秦岭葡萄抗黑痘病候选基因基因序列及其应用。
本发明是在对中国葡萄属野生种进行抗病性鉴定，获得秦岭葡萄(V.qinlingensis P.C.He)略阳-4抗病种质的基础上，采用同源序列克隆法分离秦岭葡萄抗黑痘病候选基因片段，进行序列同源性分析，为进一步利用cDNA末端快速扩增技术获得抗病基因全长序列奠定基础。
为了实现上述目的，本发明首次采用抗病基因同源序列技术进行中国葡萄属野生种秦岭葡萄抗黑痘病(Elsinoe ampelina(de bary)shear)候选基因克隆，获得了抗黑痘病候选基因DNA片段5个，其大小介于513bp～525bp之间。以该核苷酸序列为基础，可以进行秦岭葡萄抗黑痘病基因标记辅助育种，用作葡萄育种中检测葡萄抗黑痘病基因的探针；可以根据这些片段在中国野生葡萄秦岭葡萄与欧洲葡萄杂种后代中的分离情况，进行抗黑痘病基因定位与作图；可以根据这些片段设计特异引物，采用cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)(Frohman et al，Proc.Natl.Acad.Sci，1988)克隆中国葡萄野生种秦岭葡萄略阳-4抗黑痘病基因，为通过基因工程改良葡萄品种的抗病性奠定基础。
图1是中国葡萄属野生种秦岭葡萄抗黑痘病特异DNA片段的获得及在杂交后代中的分离情况图谱，其中，M.DGL 2000，1.略阳-4，2-9.秦岭葡萄X粉红玫瑰杂交F1代；图2～图6是本发明获得的中国葡萄属野生种秦岭葡萄略阳-4(1)、略阳-4(2)、略阳-4(3)、略阳-4(4)、略阳-4(5)抗黑痘病候选基因序列。
以下结合附图和发明人给出的实施例对本发明作进一步详细说明。
具体实施例方式
本发明获得的中国葡萄属野生种秦岭葡萄抗黑痘病候选基因序列具体操作步骤如下A.采用改进的CTAB法(西北植物学报，王西平等，2003，23(3)473-476)提取中国葡萄属野生种秦岭葡萄略阳-4叶片基因组DNA。
B.根据抗病基因N、L6及RPS2位于P-环(P-loop)上的GVGKTT，及位于基因弱疏水区上的GLPLAL保守结构域设计简并PCR引物5‘GGDGTD GGN AAR ACW AC 3’与5‘CAA CGC TAG TGG CAA TCC 3’，引物由大连Takara公司合成。在25μl PCR反应体积中加入PCR buffer(含Mg2+)2.5μl，dNTP 0.5μl，模板DNA 100ng，引物1 1.5μl，引物2 1.5μl，Taq DNA聚合酶1U(5U/μl)，用双蒸水补被齐体积至25μl，加入25.0μl矿物油。PCR扩增程序为94℃ 2min，94℃ 1min；50℃ 1min，72℃2min共35个循环；72℃，10min。取反应产物6.0μl跑1.5％琼脂糖凝胶电泳(5V·cm-1)约40min，获得了一条长度约为500bp的DNA特异带(图1)。
C.用DNA胶回收试剂盒将获得的一条约500bp左右的DAN条带回收，连接pGEM-T easy载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有Amp(100μg·ml-1)和X-gal/IPTG的LB平板上培养，蓝、白斑筛选鉴定挑选白色菌落培养。用UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒回收质粒，用EcoR I酶切鉴定有外源DNA片段插入的阳性克隆。将阳性克隆送大连宝生生物公司测序，测序结果表明，DNA特异片段的大小介于513bp～525bp之间，获得中国葡萄属野生种秦岭葡萄抗黑痘病候选基因序列5个(图2-图6)。
以下是发明人给出的实施例。
实施例1
以保存于西北农林科技大学葡萄种质资源圃已进行抗黑痘病鉴定的中国野生葡萄秦岭葡萄(贺普超等，中国农业科学，1991；Wang Y et al，HortScience，1998；Wang Y et al，Vitis，1995)与欧洲葡萄粉红玫瑰、加利酿的种间杂交后代189株为试材，采用改良的CTAB法提取基因组DNA，根据获得的抗黑痘病候选基因序列设计特异引物，进行PCR扩增，据特异DNA片段在杂种材料中的表现情况(图1)，对照上述葡萄材料的抗黑痘病田间鉴定结果，获得与秦岭葡萄抗黑痘病基因紧密连锁的DNA片段和抗黑痘病基因DNA片段。
实施例2用保存于西北农林科技大学葡萄种质资源圃的中国葡萄属野生种秦岭葡萄略阳-4、平利-5(贺普超等，中国农业科学，1991；Wang Y et al，HortScience，1998；Wang Y et al，Vitis，1995)与欧洲葡萄优良品种赤霞珠、黑大粒、高墨等杂交，获得抗黑痘病杂种植株。采用改良的CTAB法提取上述葡萄材料基因组DNA，根据实施例1获得的与秦岭葡萄抗黑痘病基因紧密连锁的DNA片段设计引物，对上述葡萄材料基因组DNA进行PCR扩增，凡扩增产物出现DNA特异片段的杂种材料，为抗黑痘病杂种植株，或者是抗黑痘病基因的携带者，这些可以用做进一步抗病品种选育的材料和种质。
实施例3采用田间自然鉴定、田间接种鉴定对实施例2的葡萄杂种材料进行抗黑痘病鉴定，获得抗病杂种与感病杂种。据实施例2获得的与抗黑痘病基因紧密连锁的DNA片段设计的引物，对上述葡萄杂种材料进行PCR扩增，据DNA片段在杂种中的扩增与分离情况，结合田间鉴定结果，利用MAPMAKER软件进行秦岭葡萄抗黑痘病基因定位与作图，获得抗病基因连锁图谱，为进一步通过图谱克隆分离抗黑痘病基因鉴定基础。
实施例4将实施例1获得的中国葡萄属野生种秦岭葡萄抗黑痘病基因部分DNA片段序列，用DNASTAR软件设计特异5’RACE引物GSP1与3’RACE引物GSP2，用改进的SDS/酚法(果树学报，张今今等，2003，20(3)178-181)提取中国葡萄属野生种秦岭葡萄略阳-4、平利-5叶片总RNA，逆转录分别合成5’RACE与3’RACE cDNA第一链。用5’RACE引物GSP1与3’RACE引物GSP2分别进行5’RACE与3’RACE PCR扩增。将5’RACE PCR产物与3’RACE PCR产物分别进行1.2％琼脂糖凝胶电泳获得5’RACE与3’RACE全长序列。分别回收5’RACE与3’RACE全长序列并连接T载体。克隆、测序后，进行序列同源性分析，据5’RACE与3’RACE序列重叠区域合并成完整的cDNA全长序列，从而克隆了中国葡萄属野生种秦岭葡萄抗黑痘病基因，获得秦岭葡萄抗黑痘病基因序列。
基因序列中国葡萄属野生种秦岭葡萄(V.qinlingensis P.C.He)略阳-4抗黑痘病候选基因序列秦岭葡萄 略阳-4(1)1GGTGTAGGCA AGACAACGCT CGCACGGCTG GTTTACAATG ATGATTTGGC CCAAAATTTT61 GACCTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATC TGGAGAATAT AACAAAAGCA121 ATTCTCAATT CGGTGTTAAA TTCTGATGCA AGTGGGTCTT TGGACTTCCA ACAAGTTCAA181 AGGAAATTGA CAGACACGTT AGCAGGGAAA ACTCTTTTAC TCATTCTAGA TGACGTGTGG241 AACGGAAATT ATTGTAATTG GGATCGTTTG CGGGCTCCTT TGAGTGTGGT GGCAAAAGGA301 AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACGCAATAAA AATGTTGCAT TGATGATGGG AGCTCCCCAG361 AATGTTCATG AAATAAACCC TTTATCTGAA GATGATTGTT GGTCTGTGTT TCAGAAGCAT421 GCATTTGAAC ATAGAAATAT CAATGATCAT CCGAACCTGG AGTCCATTGG TAGGAAAATT481 GTTGCCAAAT GTGGTGGATT GCCACTAGCG TTG秦岭葡萄 略阳-4(2)1GGGGTAGGGA AGACTACGCT CGCACGGCTG GTTTACAATG ATGATTTGGC CCAAAATTTT61 GACCTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATC TGGAGAATAT AACAAAAGCA121 ATTCTCAATT CGGTGTTAAA TTCTGATGCA AGTGGGTCTT TGGACTTCCA ACAAGTTCAA181 AGGAAATTGA CAGACACGTT AGCAGGGAAA ACTCTTTTAC TCATTCTAGA TGACGTGTGG241 AACGGAAATT ATTGTAATTG GGATCGTTTG CGGGCTCCTT TGAGTGTGGT GGCAAAAGGA301 AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACGCAATAAA AATGTTGCAT TGATGATGGG AGCTCCCCAG361 AATGTTCATG AAATAAACCC TTTATCTGAA GATGATTGTT GGTCTGTGTT TCAGAAGCAT421 GCATTTGAAC ATAGAAATAT CAATGATCAT CCGAACCTGG AGTCCATTGG TAGGAAAATT481 GTTGCCAAAT GTGGTGGATT GCCACTAGCG TTG秦岭葡萄 略阳-4(3)1GGGGTGGGGA AGACAACGCT CGCACGGCTG GTTTACAATG ATGATTTGGC CCAAAATTTT61 GACCTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATC TGGAGAATAT AACAAAAGCA121 ATTCTCAATT CGGTGTTAAA TTCTGATGCA AGTGGGTCTT TGGACTTCCA ACAAGTTCAA181 AGGAAATTGA CAGACACGTT AGCAGGGAAA ACTCTTTTAC TCATTCTAGA TGACGTGTGG241 AACGAAAATT ATTGTAATTG GGATCGTTTG CGGGCTCCTT TGAGTGTAGT GGCAAAAGGA301 AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACGCAATAAA AATGTTGCAT TGATGATGGG AGCTCCCCAG361 AATGTTCATG AACTAAACCC TTTATCTGAA GATGATTGTT GGTCTGTGTT TGAGAAGCAT421 GCATTTGAAC ATAGAAATAT CAATGATCAT CCGAACCTGG AGTCCATTGG TAGGAAAATT481 GTTGCCAAAT GTGGTGGATT GCCACTAGCG TTG秦岭葡萄 略阳-4(4)1GGTGTGGGTA AGACAACGCT CGCACGGCTG GTTTACAATG ATGATTTGGC CCAAAATTTT61 GACCTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATC TGGAGAATAT AACAAAAGCA121 ATTCTCAATT CGGTGTTAAA TTCTGATGCA AGTGGGTCTT TGGACTTCCA ACAAGTTCAA181 AGGAAATTGA CAGACACGTT AGCTGGGAAA ACTCTTTTAC TCATTCTAGA TGACGTGTGG241 AACGGAAATT ATTGTAATTG GGATCGTTTG CGGGCTCCTT TGAGTGTGGT GGCAAAAGGA
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权利要求
1.中国葡萄属野生种秦岭葡萄抗黑痘病候选基因序列，其特征在于，包括秦岭葡萄略阳-4的5个抗黑痘病候选基因序列，它们分别是秦岭葡萄略阳-4(1)基因序列1GGTGTAGGCA AGACAACGCT CGCACGGCTG GTTTACAATG ATGATTTGGC CCAAAATTTT61 GACCTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATC TGGAGAATAT AACAAAAGCA121 ATTCTCAATT CGGTGTTAAA TTCTGATGCA AGTGGGTCTT TGGACTTCCA ACAAGTTCAA181 AGGAAATTGA CAGACACGTT AGCAGGGAAA ACTCTTTTAC TCATTCTAGA TGACGTGTGG241 AACGGAAATT ATTGTAATTG GGATCGTTTG CGGGCTCCTT TGAGTGTGGT GGCAAAAGGA301 AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACGCAATAAA AATGTTGCAT TGATGATGGG AGCTCCCCAG361 AATGTTCATG AAATAAACCC TTTATCTGAA GATGATTGTT GGTCTGTGTT TCAGAAGCAT421 GCATTTGAAC ATAGAAATAT CAATGATCAT CCGAACCTGG AGTCCATTGG TAGGAAAATT481 GTTGCCAAAT GTGGTGGATT GCCACTAGCG TTG秦岭葡萄略阳-4(2)基因序列1GGGGTAGGGA AGACTACGCT CGCACGGCTG GTTTACAATG ATGATTTGGC CCAAAATTTT61 GACCTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATC TGGAGAATAT AACAAAAGCA121 ATTCTCAATT CGGTGTTAAA TTCTGATGCA AGTGGGTCTT TGGACTTCCA ACAAGTTCAA181 AGGAAATTGA CAGACACGTT AGCAGGGAAA ACTCTTTTAC TCATTCTAGA TGACGTGTGG241 AACGGAAATT ATTGTAATTG GGATCGTTTG CGGGCTCCTT TGAGTGTGGT GGCAAAAGGA301 AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACGCAATAAA AATGTTGCAT TGATGATGGG AGCTCCCCAG361 AATGTTCATG AAATAAACCC TTTATCTGAA GATGATTGTT GGTCTGTGTT TCAGAAGCAT421 GCATTTGAAC ATAGAAATAT CAATGATCAT CCGAACCTGG AGTCCATTGG TAGGAAAATT481 GTTGCCAAAT GTGGTGGATT GCCACTAGCG TTG秦岭葡萄略阳-4(3)基因序列1GGGGTGGGGA AGACAACGCT CGCACGGCTG GTTTACAATG ATGATTTGGC CCAAAATTTT61 GACCTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATC TGGAGAATAT AACAAAAGCA121 ATTCTCAATT CGGTGTTAAA TTCTGATGCA AGTGGGTCTT TGGACTTCCA ACAAGTTCAA181 AGGAAATTGA CAGACACGTT AGCAGGGAAA ACTCTTTTAC TCATTCTAGA TGACGTGTGG241 AACGAAAATT ATTGTAATTG GGATCGTTTG CGGGCTCCTT TGAGTGTAGT GGCAAAAGGA301 AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACGCAATAAA AATGTTGCAT TGATGATGGG AGCTCCCCAG361 AATGTTCATG AACTAAACCC TTTATCTGAA GATGATTGTT GGTCTGTGTT TGAGAAGCAT421 GCATTTGAAC ATAGAAATAT CAATGATCAT CCGAACCTGG AGTCCATTGG TAGGAAAATT481 GTTGCCAAAT GTGGTGGATT GCCACTAGCG TTG秦岭葡萄 略阳-4(4)基因序列1GGTGTGGGTA AGACAACGCT CGCACGGCTG GTTTACAATG ATGATTTGGC CCAAAATTTT61 GACCTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATC TGGAGAATAT AACAAAAGCA121 ATTCTCAATT CGGTGTTAAA TTCTGATGCA AGTGGGTCTT TGGACTTCCA ACAAGTTCAA181 AGGAAATTGA CAGACACGTT AGCTGGGAAA ACTCTTTTAC TCATTCTAGA TGACGTGTGG241 AACGGAAATT ATTGTAATTG GGATCGTTTG CGGGCTCCTT TGAGTGTGGT GGCAAAAGGA301 AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACGCAATAAA AATGTTGCAT TGATGATGGG AGCTCCCCAG361 AATGTTCATG AAATAAACCC TTTATCTGAA GATGATTGTT GGTCTGTGTT TCAGAAGCAT421 GCATTTGAAC ATAGAAATAT CAATGATCAT CCGAACCTGG AGTCCATTGG TAGGAAAATT481 GTTGCCAAAT GTGGTGGATT GCCACTAGCG TTG秦岭葡萄略阳-4(5)基因序列1GGTGTGGGTA AGACAACTCT GGCCAAAAAA GTTTACGACA ACCAGAGAGT GGTGGGACAC61 TTCGATTGCC ATGCTTGGGT CACTGTGTCT CAATCATTCA AGATGGAGGA GCTACTACGG121 AACATGACAA AGAAATTCTA TCAGGGAAGA AAGGAAGCAG TTCCTGAGGG TATCGATACA181 ATAGACGAGA TGTCACTGAT TTCCTTAATC AGGCAGTATT TACAAGATAA AAGGTATGTG241 GTTGTTTTTG ATGATGTATG GAAACTAGAT TTCTGGGGAT TTATTAAATA TGGTTTACCA301 GAAAATGGAA ACGGCAGTAG GATAATAATC ACTACACGTA ATGATGAGGT AGCCTCTTCC361 TGCAAAGAGT CGTCATTTGA TTACATCCAC AAGCTGCAAC CCCTGTCCCC AAAGAGTTCC421 TGGGAACTCT TTTGCAAGAA GACATTCCAG GGTGGATGTC CTCCAGAATT GGAGAAACTG481 TCTCTTCATA TTGTCAAAAG ATGTGGAGGA TTGCCACTAG CGTTG。
2.中国葡萄属野生种秦岭葡萄抗黑痘病候选基因序列，包括秦岭葡萄略阳-4的5个抗黑痘病候选基因序列，在进行秦岭葡萄抗黑痘病标记辅助育种，用作葡萄育种中检测秦岭葡萄抗黑痘病基因的探针，以及抗病基因定位与作图、克隆中国葡萄属野生种秦岭葡萄抗黑痘病基因的应用。
全文摘要
本发明涉及葡萄常规杂交育种、分子标记辅助育种、基因定位与作图及基因克隆的方法与技术。本发明采用抗病基因同源序列法(Resistant geneanalogus，RGAs)获得中国葡萄属野生种秦岭葡萄(V.qinlingensis P.C.He)略阳－4抗黑痘病候选基因DNA片段5个，对这些片段克隆测序后，其大小介于513bp～525bp之间。以这些序列为依据，可以进行秦岭葡萄抗黑痘病标记辅助育种，用作葡萄育种中检测秦岭葡萄抗黑痘病基因的探针；可以根据这些片段在中国葡萄属野生种秦岭葡萄与欧洲葡萄杂种后代中的分离情况，进行抗黑痘病基因定位与作图；也可以采用cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends，RACE) (Frohman et al，Proc.Natl.Acad.Sci，1988)克隆秦岭葡萄抗黑痘病基因，为通过基因工程改良葡萄品种的抗病性奠定基础。
文档编号C12N15/82GK1683535SQ20051004175
公开日2005年10月19日 申请日期2005年3月7日 优先权日2005年3月7日
发明者王跃进, 王西平 申请人:西北农林科技大学