酵母细胞固定化的强化方法

专利名称：：酵母细胞固定化的强化方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物工程
技术领域：
的方法，特别是一种酵母细胞固定化的强化方法，用于生物酒精发酵。技术背景固定化细胞技术是近十几年来迅速发展起来的生物工程新技术，固定化细胞应用于发酵工业可以达到反复使用、连续操作、节省成本以及简化产物分离纯化等优点。目前常用的细胞固定化的方法为结合法，交联法和包埋法三大类，随着固定化技术的发展，对固定化的方法的研究越来越广泛，一般认为包埋法比其他方法具有较好的优势。就包埋法而言海藻酸钠一CaCl2包埋是一种常见的固定化细胞的包埋方法，一方面，它的方法简单，固定化的成本低，另一方面它的活性高，无毒性。但是海藻酸盐制成的固定化酵母的化学和机械稳定性较差，尤其是在含多价阴离子(磷酸盐，柠檬酸盐、硫酸盐等)以及在较高浓度的电解质(K+、Na+等)溶液中不稳定，易变软，裂口、甚至溶解；特别是在其应用于酒精发酵生产中，由于菌体的繁殖和C02产生颗粒更容易破碎，影响使用寿命；另外在机械搅拌式、流化床等反应器中，还容易出现搅伤，破碎等等方面的问题。这些问题的存在一定程度上限制固定化技术应用于发酵生产酒精的发展。经现有技术的文献检索发现，中国专利申请号96119159.7，发明
专利名称：一种固定化酵母干凝胶珠及制造方法，该专利涉及酒精和啤酒的发酵技术，现有的海藻酸钙凝胶包埋法，它的不足之处是凝胶珠粒很小，载体易丧失机械强度，该发明采用液下分离成型法，在氯化钙溶液下面设置喷管口，混合母液从喷管口喷出而成型，这种湿凝胶珠，直径可以达30mm，处理后直径可达18mm，单粒抗压强度可达30-100kg/粒，质地坚硬致密，因而解决了珠粒崩裂和不稳定而解体的散失两大问题，而且这种干凝胶珠，粒度大、强度高、活性好、寿命长，适合与企业常规设备发酵使用。但是这种方法工艺较为复杂，不利于固定化酵母生产酒精成本的降低，同时其抗压强度过大，质地过于致密，固定化酵母发酵过程中传质阻力较大，发酵反应速率较低。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种酵母细胞固定化的强化方法，使其具有方法较为简单，获取凝胶粒子的强度适中发酵稳定性较好以及在此基础之上使用寿命较长的特点。本发明在应用固定化酵母制取生物酒精的生产中，具有降低生产成本，提高燃料酒精应用的可行性的作用。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明在现有的海藻酸钙固定化酵母粒子形成后，将固定化粒子通过三亚乙基四胺处理，然后再通过戊二醛处理，形成强化的固定化酵母粒子，该固定化酵母粒子具有良好的化学强度，化学强度指标可达95.32%，同时还具有良好的物理强度，物理强度指标可以达132.3kg/cm2。而且该粒子发酵性能稳定、使用寿命较长。本发明具体步骤如下步骤一，用无菌水配制0.5%-1.0%(V/V)的三亚乙基四胺水溶液和0.5%-1.0%(V/V)戊二醛水溶液。步骤二，将制备好的固定化酵母粒子放置于上述0.5%-1.0%的三亚乙基四胺溶液120min-60min后，用无菌水洗净。步骤三，将步骤二中处理好的固定化酵母粒子放置于上述0.5%-1.0%的戊二醛水溶液中8min-4min后，用无菌水洗净。步骤四，将步骤三中处理好的固定化酵母粒子置于无菌水中贮存待用。本发明在常规的固定化酵母粒子的造粒的基础之上，通过不同的化学试剂进行浸泡处理，以达到在不降低固定化粒子内酵母活性、不增加粒子体积，提高了固定化酵母粒子的抗盐性能和机械强度，在一定程度上解决了目前固定化酵母粒子发酵制取生物酒精的工艺中，固定化粒子易出现开裂、层脱、破碎、使用寿命短的问题；该固定化酵母粒子化学强度指标可达95.32%，物理强度指标可以达132.3kg/cm2。连续8批次在搅拌式生物反应器中连续发酵，酒精得率保持稳定增加趋势，8批后酒精得率可达94.49以上。另外，在实际的工业生产中不需要改动工艺流程中的其他设备，有利于现行固定化粒子生产生物酒精的工艺改进，降低酒精生产成本。具体实施方式下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。本发明在实际操作中，首先采用现有技术制备圆球形固定化酵母粒子，具体可以采用以下的方法(1)，配制液态培养基，通过无菌操作，接入酵母菌种i-2环，置于3rc恒温水浴振荡器，振荡培养培养24h，通过镜检计数发酵液中酵母个数达108个/1111时即可。所述液态培养基，其100克中含有葡萄糖5.(m(W/W)，酵母膏0.5呢(W/W)，蛋白胨0.5%(W/W)，KH2P040.1%(W/W)，MgS047H200.1%瞎)和93.8%的蒸馏水。(2)，配制浓度为2%-3"/。(W/W)的海藻酸钠溶液，置于7(TC恒温水浴锅加热30min，待海藻酸钠完全溶解，置于无菌室静置冷却，待溶液中气泡排净即可。(3)，配制浓度为2y。(W/W)的CaCl2溶液，灭菌后静置冷却待用，即为酵母液体培养基。(4)，将培养好的酵母液体培养基和海藻酸钠溶液按照1:10(V/V)的比例混合均匀，通过玻璃注射器将上述混合溶液连续滴入CaCl2溶液中，形成圆球形固定化酵母粒子。(5)，将步骤四得到固定化酵母粒子置于CaCl2溶液中固化12h，然后转移到无菌水中贮存。然后将上述的固定化酵母粒子进行以下本发明方法的处理(6)，用无菌水配制0.5%(V/V)的三亚乙基四胺水溶液和0.5%(V/V)戊二醛水溶液。(7),将步骤五制备好的固定化酵母粒子置于步骤六配制的0.5%的三亚乙基四胺溶液120min后，用无菌水洗净。(8),将步骤七中处理好的固定化酵母粒子，置于步骤六配制的0.5%的戊二醛水溶液中8min后，用无菌水洗净。(9)，将步骤八中处理好的固定化酵母粒子置于无菌水中贮存待用。实例1本实施例的固定化酵母粒子化学强度性能(一)材料1、菌种南阳酵母(SaccharomycescerevisiaeCICC1308，中国工业微生物保藏中心)；2、海藻酸钠，CP级；3、氯化钙，AR纯；4、三亚乙基四胺，CP级；5、戊二醛25%溶液BR级；6、培养基(1)固体培养基葡萄糖琼脂培养基；(2)液体培养基葡萄糖培养基；(3)发酵培养基白砂糖配制溶液，含糖量10%;7、粒子造粒装置玻璃注射器。8、仪器设备Unic2000型分光光度计(尤尼柯仪器有限公司)、显微镜、振荡器冰箱以及其它一些化学分析仪器。(二)方法1、固定化酵母粒子的制备(1)配制液态培养基，通过无菌操作，接入酵母菌种i-2环，置于3rc恒温水浴振荡器，振荡培养培养24h，通过镜检计数发酵液中酵母个数达108个/ml时即可。(2)配制浓度为2%-3。/。(V/V)的海藻酸钠溶液，置于7(TC恒温水浴锅加热30min，待海藻酸钠完全溶解，置于无菌室静置冷却，待溶液中气泡排净即可。(3)配制浓度为2y。(V/V)的CaCl2溶液，灭菌后静置冷却待用。(4)将培养好的酵母液体培养基和海藻酸钠溶液按照l:10(V/V)的比例混合均匀，通过玻璃注射器将上述混合溶液连续滴入CaCl2溶液中，形成圆球形固定化酵母粒子。(5)将固定化酵母粒子置于CaCl2溶液中固化12h，按后转移到无菌水中贮存。(6)用无菌水配制0.5y。(V/V)的三亚乙基四胺水溶液和0.5呢(V/V)戊二醛水溶液。(7)将制备好的固定化酵母粒子置于(6)配制的0.5免(V/V)的三亚乙基四胺溶液120min后，用无菌水洗净。(8)将(7)中处理好的固定化酵母粒子，置于(6)配制0.5M(V/V)的戊二醛水溶液中8min后，用无菌水洗净。(9)将(8)中处理好的固定化酵母粒子置于无菌水中贮存待用。2、化学强度的测定用50ml清水洗涤强化处理后的固定化酵母粒子50g，通过布式漏斗过滤，同时保留清夜，用分光光度计在660ran下测定清液的浑浊度，然后将粒子置于50ml，0.lmo1/1，pH=7.0的磷酸盐的缓冲溶液中，经振荡器在250r/min转速下振荡3小时后用分光光度计测定溶液混浊度，用后者与前者的比值(G/%)作为判别固定化酵母细胞被磷酸盐解体的程度，用此作为衡量固定化酵母颗粒的化学强度的指标。(三)实例结果经测定，通过本实施例制得的固定化酵母粒子的化学强度指标平均值为95.32%，而同比不经本实施例步骤6-8制得的固定化酵母粒子的化学强度指标平均值为43.79%。实例2本实施例的固定化酵母粒子物理强度性能(一)材料1、菌种南阳酵母(Saccha簡ycescerevisiaeCICC1308,中国工业微生物保藏中心)；2、海藻酸钠，CP级；3、氯化钙，AR纯；4、三亚乙基四胺，CP级；5、戊二醛25%溶液BR级；6、培养基(1)固体培养基葡萄糖琼脂培养基；(2)液体培养基葡萄糖培养基；(3)发酵培养基白砂糖配制溶液，含糖量10%(W/W);7、粒子造粒装置玻璃注射器。8、仪器设备物性测试仪(TA-XT型,StableMicrosystems)等。(二)方法1、固定化酵母粒子的制备(1)配制液态培养基，通过无菌操作，接入酵母菌种i-2环，置于3rc恒温水浴振荡器，振荡培养培养24h，通过镜检计数发酵液中酵母个数达108个/ml时即可。(2)配制浓度为2y。-3y。(V/V)的海藻酸钠溶液，置于7(TC恒温水浴锅加热30min，待海藻酸钠完全溶解，置于无菌室静置冷却，待溶液中气泡排净即可。(3)配制浓度为2。/。(V/V)的CaCl2溶液，灭菌后静置冷却待用。(4)将培养好的酵母液体培养基和海藻酸钠溶液按照l:10(V/V)的比例混合均匀，通过玻璃注射器将上述混合溶液连续滴入CaCl2溶液中，形成圆球形固定化酵母粒子。(5)将固定化酵母粒子置于CaCl2溶液中固化12h，按后转移到无菌水中贮存。(6)用无菌水配制0.5%(V/V)的三亚乙基四胺水溶液和0.5%(V/V)戊二醛水溶液。(7)将制备好的固定化酵母粒子置于(6)配制的0.5%(V/V)的三亚乙基四胺溶液120min后，用无菌水洗净。(8)将(7)中处理好的固定化酵母粒子，置于(6)配制0.5%(V/V)的戊二醛水溶液中8min后，用无菌水洗净。(9)将(8)中处理好的固定化酵母粒子置于无菌水中贮存待用。2、物理强度的测定随机选取IO粒固定化酵母粒子，用吸水纸吸干表面的水分，至于物性测试仪平台上，在形变范围2ram内测定其可承受的最大压力。(三)实例结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>物理强度(kg/cm2)132.3130.7122.5118.2116.4114.3104.1103.8101.0实例3本实施例的固定化酵母发酵葡萄糖溶液制取酒精(一)材料1、菌种南阳酵母(SaccharomycescerevisiaeCICC1308，中国工业微生物保藏中心)；2、海藻酸钠，CP级；3、氯化钙，AR级；4、葡萄糖，AR级；5、三亚乙基四胺，CP级；6、戊二醛25%溶液，BR级；7、培养基(1)固体培养基葡萄糖琼脂培养基；(2)液体培养基葡萄糖培养基；(3)发酵培养基葡萄糖配制，含糖量10%(W/W);8、粒子造粒装置玻璃注射器。9、发酵系统250ml三角瓶和恒温水浴振荡器。(二)方法1、固定化酵母粒子的制备(1)配制液态培养基，通过无菌操作，接入酵母菌种i-2环，置于3rc恒温水浴振荡器，振荡培养培养24h，通过镜检计数发酵液中酵母个数达1(T个/ml时即可。(2)配制浓度为2y。-3《(V/V)的海藻酸钠溶液，置于7(TC恒温水浴锅加热30min，待海藻酸钠完全溶解，置于无菌室静置冷却，待溶液中气泡排净即可。(3)配制浓度为2。/。(V/V)的CaCl2溶液，灭菌后静置冷却待用。(4)将培养好的酵母液体培养基和海藻酸钠溶液按照l:10(V/V)的比例混合均匀，通过玻璃注射器将上述混合溶液连续滴入CaCL溶液中，形成圆球形固定化酵母粒子。(5)将固定化酵母粒子置于CaCl2溶液中固化12h，按后转移到无菌水中贮存。(6)用无菌水配制0.8y。(V/V)的三亚乙基四胺水溶液和0.8呢(V/V)戊二醛水溶液。(7)将制备好的固定化酵母粒子置于(6)配制的0.8M(V/V)的三亚乙基四胺溶液80min后，用无菌水洗净。(8)将(7)中处理好的固定化酵母粒子，置于(6)配制0.87。(V/V)的戊二醛水溶液中6min后，用无菌水洗净。(9)将(8)中处理好的固定化酵母粒子置于无菌水中贮存待用。2、分批式发酵取33g处理好的并增殖后的固定化酵母，加入250ml三角瓶中，同时添加10%的葡萄糖发酵培养基，在恒温水浴振荡器中，恒温32'C，转速150r/min发酵7h发酵成熟。(三)实例结果通过本发明制得的固定化酵母粒子用于10%葡萄糖培养基酒精发酵后的酒精浓度为5.0%(v/v)，发酵后残糖浓度为0.12mg/ml。实例4本实施例的固定化酵母发酵白砂糖溶液制取酒精(一)材料1、菌种南阳酵母(SaccharomycescerevisiaeCICC1308，中国工业微生物保藏中心)；2、海藻酸钠，CP级；3、氯化钙，AR级；4、白砂糖，食用一级品；5、三亚乙基四胺，CP级；6、戊二醛25%溶液，BR级；7、培养基-(1)固体培养基葡萄糖琼脂培养基；(2)液体培养基葡萄糖培养基；(3)发酵培养基白砂糖配制，含糖量10%;8、粒子造粒装置玻璃注射器。9、发酵系统250ml三角瓶和恒温水浴振荡器。(二)方法1、固定化酵母粒子的制备(1)配制液态培养基，通过无菌操作，接入酵母菌种i-2环，置于3rc恒温水浴振荡器，振荡培养培养24h，通过镜检计数发酵液中酵母个数达108个/ml时即可。(2)配制浓度为2y。-3《(V/V)的海藻酸钠溶液，置于70。C恒温水浴锅加热30min，待海藻酸钠完全溶解，置于无菌室静置冷却，待溶液中气泡排净即可。(3)配制浓度为2n/。(V/V)的CaCl2溶液，灭菌后静置冷却待用。(4)将培养好的酵母液体培养基和海藻酸钠溶液按照l:10(V/V)的比例混合均匀，通过玻璃注射器将上述混合溶液连续滴入CaCl2溶液中，形成圆球形固定化酵母粒子。(5)将固定化酵母粒子置于CaCl2溶液中固化12h，按后转移到无菌水中贮存。(6)用无菌水配制LO。/。(V/V)的三亚乙基四胺水溶液和1.0。/。(V/V)戊二醛水溶液。(7)将制备好的固定化酵母粒子置于(6)配制的1.0M(V/V)的三亚乙基四胺溶液60min后，用无菌水洗净。(8)将(7)中处理好的固定化酵母粒子，置于(6)配制1.(m(V/V)的戊二醛水溶液中4min后，用无菌水洗净。(9)将(8)中处理好的固定化酵母粒子置于无菌水中贮存待用。2、分批式发酵取33g处理好的并增殖后的固定化酵母，加入250ml三角瓶中，同时添加10%白砂糖发酵培养基，在恒温水浴振荡器中，恒温32'C，转速150r/min，发酵7h，实验重复进行5次。(三)实例结果~乙醇浓度/y。(v/v)残糖浓度/(mg/ml)批次批次IIIIIIIVVIIIIIIIVV6.06.86.16.56.34.956.637.207.205,51实例5本实施例的固定化酵母发酵甜高粱茎秆汁液制取酒精(一)材料1、菌种南阳酵母(SaccharomycescerevisiaeCICC1308，中国工业微生物保藏中心)；2、海藻酸钠，CP级；3、氯化钙，AR级；4、白砂糖，食用一级品；5、三亚乙基四胺，CP级；6、戊二醛25%溶液，BR级；7、培养基(1)固体培养基葡萄糖琼脂培养基；(2)液体培养基葡萄糖培养基；(3)发酵培养基白砂糖配制，含糖量10%;8、粒子造粒装置玻璃注射器。9、发酵系统5L智能发酵罐。(二)方法1、固定化酵母粒子的制备(1)配制液态培养基，通过无菌操作，接入酵母菌种i-2环，置于3rc恒温水浴振荡器，振荡培养培养24h，通过镜检计数发酵液中酵母个数达1(T个/ml时即可。(2)配制浓度为2y。-3y。(v/v)的海藻酸钠溶液，置于7crc恒温水浴锅加热30min，待海藻酸钠完全溶解，置于无菌室静置冷却，待溶液中气泡排净即可。(3)配制浓度为2。/。(V/V)的CaCl2溶液，灭菌后静置冷却待用。(4)将培养好的酵母液体培养基和海藻酸钠溶液按照l:10(V/V)的比例混合均匀，通过玻璃注射器将上述混合溶液连续滴入CaClr溶液中，形成圆球形固定化酵母粒子。(5)将固定化酵母粒子置于CaCl2溶液中固化12h，按后转移到无菌水中贮存。(6)用无菌水配制0.5y。(V/V)的三亚乙基四胺水溶液和0.5W(V/V)戊二醛水溶液。(7)将制备好的固定化酵母粒子置于(6)配制的0.5y。(V/V)的三亚乙基四胺溶液120min后，用无菌水洗净。(8)将(7)中处理好的固定化酵母粒子，置于(6)配制0.5。/。(V/V)的戊二醛水溶液中8min后，用无菌水洗净。(9)将(8)中处理好的固定化酵母粒子置于无菌水中贮存待用。2、反应器发酵取1155g处理好的并增殖后的固定化酵母，加入5L的搅拌式生物智能发酵罐，同时添加配制好的甜高粱茎秆汁液，在恒温水浴振荡器中，恒温32°C，转速150r/min，进行发酵，实验连续重复8次。(三)实例结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>此外，海藻酸钙为高分子化合物，三亚乙基四胺和戊二醛和其的反应可以近似的看成如下过程三亚乙基四胺+海藻酸钙——A戊二醛+A-BA，B为反应生成的聚合物。根据化学反应速率方程^"a=}=—A'C三亚乙基四胺'G海藻酸钙所以A的生成量M=-A:.C三亚乙基四胺C海藻酸拷-f其中浓度比较大，可以认为是定值，因此聚合物A的生成量和三亚乙基四胺的浓度及反应时间成正比，因此縮小三亚乙基四胺的浓度一倍，需要延长反应时间1倍。同时根据试验，高浓度的三亚乙基四胺对酵母有一定的毒害，因此，限定三亚乙基四胺的浓度为0.5%-1.0%，处理时间为120min-60min。同样的道理，限定戊二醛的浓度为0.5%-1.0%，处理时间为8min-4min。权利要求1、一种酵母细胞固定化的强化方法，其特征在于，在海藻酸钙固定化酵母粒子形成后，将固定化酵母粒子通过三亚乙基四胺处理，然后再通过戊二醛处理，形成强化的固定化酵母粒子。2、根据权利要求1所述的酵母细胞固定化的强化方法，其特征是，具体步骤如下步骤一，用无菌水配制体积比为0.5%-1.0%的三亚乙基四胺水溶液和体积比为0.5%-1.0%戊二醛水溶液；步骤二，将制备好的固定化酵母粒子放置于上述0.5%-1.0%的三亚乙基四胺溶液后，用无菌水洗净；步骤三，将步骤二中处理好的固定化酵母粒子放置于上述0.5%-1.0%的戊二醛水溶液后，用无菌水洗净；步骤四，将步骤三中处理好的固定化酵母粒子置于无菌水中贮存待用。3、根据权利要求2所述的酵母细胞固定化的强化方法，其特征是，所述步骤二中，放置时间为120min-60min。4、根据权利要求2所述的酵母细胞固定化的强化方法，其特征是，所述步骤三中，放置时间为8min-4min。全文摘要本发明涉及一种生物工程
技术领域：
的酵母细胞固定化的强化方法。本发明在海藻酸钙固定化酵母粒子形成后，固定化粒子通过三亚乙基四胺处理，然后再通过戊二醛处理，形成强化的固定化酵母粒子，该固定化酵母粒子具有良好的化学强度，化学强度指标可达95.32％，同时还具有良好的物理强度，物理强度指标可以达132.3kg/cm²。而且该粒子发酵性能稳定、使用寿命较长。文档编号C12N1/16GK101117632SQ20071004369公开日2008年2月6日申请日期2007年7月12日优先权日2007年7月12日发明者刘荣厚,飞沈申请人:上海交通大学