专利名称：一种新型米根霉固定化发酵载体单元及使用方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵用载体，尤其涉及一种米根霉发酵生产L-乳酸的发酵载体。
背景技术：
目前，利用米根霉发酵生产L-乳酸是目前工业生产光学纯L-乳酸的主要方法，发酵方式主要分为游离发酵和固定化发酵([l]Lorenzo M. L. D., Crystallization behavior of poly (L-lactic acid). European Polymer J. 2005,41: 569 — 575; [2]Maas, R.H.， Bakker R.R., Eggink G"Lactic acid production from xylose by the fungus朋/z甲w o，ae, Appl. Microbiol.Biotechnol., 2006,72: 861-868)。其中固定化发酵有菌体密度高、反应速率快、稳定性好、使用寿命长、可重复利用、便于实现催化剂与发酵液分离等优点，越来越引起研究者们的关注。
目前的固定载体类型主要有纤维吸附([3]宁尚勇，李十中，真菌固定床反应器发酵L(+)-乳酸的初步研究，食品与发酵工业，2006， 32(3):22-25; [4]张定丰，林建平，金志华，岑沛霖，用于固定化米根霉发酵生产L-乳酸的转盘反应器及其放大，化学工程，2004， 32 (1): 34-37)，海藻酸盐凝胶包埋([5]出处Hang Y., Hamamci H., Woodams E.E.,Production of L(+)-lactic acid by 7 /z/zopws o，ae immobilized in calcium alginate gels,Biotechnol Lett.,1989, 11:119-120)，聚氨酯吸附([6]陈育如，夏黎明，岑沛霖，聚氨酯吸附固定米根霉发酵L-乳酸的优化，南京师范大学学报(工程技术版)，2002， 2( 1): 52-55)等。纤维式载体又由于其来源广泛、价格低廉、固定效果优良等被广泛研究。
以纤维为载体的反应器有床式反应器([7] A.Tay and S.T.Yang， Production of L(+)-lacticacid from glucose and starch by immobilized cells of朋/zopws in a rotating fibrous bedbioreactor,Biotechnol.Bioeng., 2002， 80:1-12)、转盘式反应器(见文献[4])等。
但它们共同的缺陷在于(1)需要大量的动力消耗；(2)当扩大试验时，所有参数和指标难以重现，甚至无法达到。主要原因在于反应器中的菌体载体与反应器尺寸成比例，但是发酵动力学及流体力学的影响却没有对应的比例关系，使得优化数据难以重现，从而
难以扩大工业化。
发明内容
为了克服现有的纤维式固定发酵反应器扩大时，载体与反应器扩大相应比例难以控
制的困难，本发明专利提供一种固定化发酵载体以及使用方法，该载体不仅能在三角瓶中进行小型平行筛选实验，而且能进行组合和改造，在现有的柱式及罐式反应器中扩大试验。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是
一种新型米根霉固定化载体单元，它以不锈钢网片为支撑骨架，形成六枝杈星状骨架结构，以棉布为表面材料，包裹在不锈钢网片表面，形成六枝杈星状载体单元。
发酵时，只需直接将所述载体单元灭菌后置于发酵装置内的发酵液中，细胞就会吸附固定在棉布上；所述发酵装置采用三角瓶、柱式反应器或发酵罐，使用同样大小的载体单元，并根据发酵的直径及装液深度，选取相应数量的载体单元。多个载体单元之间上下串联，长度与反应器中的装液深度一致。根据反应器直径可以增加载体单元串的数量，将其纵向连接、平行排列，达到对发酵空间的最大化利用。
本发明的有益效果是，采用以棉布纤维为载体、不锈钢支架作支撑的固定化发酵载体结构，达到米根霉菌丝层既均匀生长又能维持六枝星状空间结构。载体单元采用了六枝杈星状载体单元，可以在三角瓶、柱式反应器、发酵罐中使用同样大小的发酵单元，唯一改变的只是所用载体单元的数量，在米根霉的形态控制和产率提高方面有显著效果。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。图l是本发明的载体单元。A是未包裹棉布前的不锈钢网片图，B为棉布包裹后的水平截面图，C为载体单元的三维图。
图2载体单元上下连接成串的示意图。图3载体单元平行排列成布置的示意图。
图中1、不锈钢网片，2、棉布，3、载体单元，4、载体单元串，5、发酵罐。
具体实施例方式
(一) 载体单元的制作和使用，参见图l、图2和图3:
新型米根霉固定化载体单元是以不锈钢网片1为支撑骨架，形成六枝杈星状骨架结构，以棉布2为表面材料，包裹在不锈钢网片1表面，形成六枝杈星状载体单元3。
具体制作中，可以先制得长2至3cm，宽0.5cm不锈钢网片1，再将棉布2包裹于表面，最后将三片网片的中心点合并，得到六枝之间的固定夹角为60。的载体单元3。
使用时，载体单元的大小相同，根据发酵容器的直径及装液深度，选取相应数量的载体单元。参见图2，从长度方向上，多个载体单元之间可以上下串联，形成载体单元串4，使长度与反应器中的装液深度一致。参见图3，从宽度方向上，根据发酵罐5的直径可以增加载体单元串4的数量，将其平行排列，达到对发酵空间的最大化利用。
(二) 三角瓶中实验
实例l:将米根霉菌种As 3. 3462的孢子悬液接种至250ml三角瓶(含有50ml种子培养基，巳经单独灭菌的三个载体单元)，孢子浓度为107ml，在30。C， 180rpm摇床条件下培养。6小时以后，培养基中无孢子存在，表明已经完全吸附在载体表面。24小时以后，将载体单元用无菌水冲洗，再转移至发酵培养基(80g/L葡萄糖)。48小时以后，葡萄糖消耗至零，L-乳酸浓度达到最大(49.5g/L)。同等条件下游离发酵的终产物浓度为30g/L,发酵时间为72小时。载体实验与同等条件下的游离发酵相比，产物浓度提高了 66. 7%，得率提高了 154%。(三) 生物反应柱中实验
实例l:将八个载体单元上下串联至15厘米，长度等于与200tnl的生物反应柱中的装 液深度。实验开始之前，载体单元串与反应器一起空罐灭菌。隔夜放置以后，装入种子培 养基，在12rC条件下，灭菌30分钟。在3(TC下，将米根霉As 3.3462孢子悬液注入培 养基.浓度为107ml。静置5-6小时，开始通入氧气，通气比为0.5vvm。 24小时后，菌 丝层明显，发酵液中无可见的菌球或菌丝，检测出乳酸浓度2.4gZL。将种子培养基放出， 并用无菌水冲洗载体串，再将培养基换为发酵培养基(80g/L葡萄糖)，并用NaOH调节pH。 36小时以后，葡萄糖浓度降节零，乳酸浓度达到最大(40g/L)。载体实验与游离发酵相 比，产物浓度提高了33%,得率提高了 166.6%。
将反应柱继续进行分批填料的半连续发酵，在前5批(IO天)中，该体系的发酵最终 产物浓度都超过35g/L。而游离发酵因为生长形态为菌丝菌团，难以与菌液分离，只能进 行单批实验。
(四) 发酵罐中实验
实例l:将三串载体串(每串含有八个载体单元)平行置于1L生物发酵罐中。实验丌
始之前，载体串与发酵罐一起空罐灭菌。隔夜放置以后，装入种子培养基(50g/L葡萄糖)， 在121XJ条件下，灭菌30分钟。在3(TC.下，将米根霉As 3.3462孢子悬液注入培养基， 浓度为106,/ml。静置5-6小时，开始通入氧气，通气比为O. 5vvm。 24小时后，菌丝层明 显，发酵液中无可见的菌球或菌丝，检测出乳酸浓度3. lg/L。将种子培养基放出，并用 无菌水冲洗载体串，再将培养基换为发酵培养基(80g/L葡萄糖)，并用NaOH调节pH。 96 小时以后，葡萄糖浓度降至零，乳酸浓度达到最大(68.8g/L)。载体实验与游离发酵相比， 产物浓度提高了 129. 3%,得率提高了 72. 2%。
将发酵罐继续进行分批填料的半连续发酵，在前6批(24天)中，该体系的发酵最终 产物浓度都超过56g/L，得率超过70%。
权利要求
1、一种新型米根霉固定化载体单元，其特征在于，它以不锈钢网片为支撑骨架，形成六枝杈星状骨架结构，以棉布为表面材料，包裹在不锈钢网片表面，形成六枝权星状载体单元。
2、 根据权利要求1所述的新型米根霉固定化载体单元，其特征在于，相邻的枝杈夹角均为60。。
3、 根据权利要求1或2所述的新型米根霉固定化载体单元，其特征在于，所述不 锈钢网片为矩形。
4、 根据权利要求1或2所述的新型米根霉固定化载体单元，其特征在于，所述形 成六枝杈星状结构一个枝杈的不锈钢网片长2至3厘米，宽0. 5至1厘米。
5、 权利要求l所述米根霉固定化载体单元的使用方法，其特征在于，发酵时，只需 直接将所述载体单元灭菌后置于发酵装置内的发酵液中，细胞就会吸附固定在棉布上； 所述发酵装置采用三角瓶、柱式反应器或发酵罐，使用同样大小的载体单元，并根据发 酵的直径及装液深度，选取相应数量的载体单元。
6、 根据权利要求5所述米根霉固定化载体单元的使用方法，其特征在于，根据反应 器的装液深度，多个载体单元之间从长度方向上上下串联，长度与反应器中的装液深度 一致；根据反应器的直径，多个载体单元之间在宽度方向上平行排列，达到空间的最大 利用。
全文摘要
本发明提出一种新型米根霉固定化载体单元，它以不锈钢网片为支撑骨架，形成六枝杈星状骨架结构，以棉布为表面材料，包裹在不锈钢网片表面，形成六枝杈星状载体单元。发酵时直接将所述载体单元灭菌后置于发酵装置内的发酵液中，细胞就会吸附固定在棉布上；在三角瓶、柱式反应器、发酵罐中，均可以根据反应器形状和尺寸，通过串联或增加载体数量达到筛选和放大的实验目的。
文档编号C12N11/12GK101624589SQ20091010357
公开日2010年1月13日 申请日期2009年4月10日 优先权日2009年4月10日
发明者杨尚天, 珍 王, 王远亮 申请人:重庆大学