选择结合性物质固定化载体的制作方法

专利名称：选择结合性物质固定化载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及固定与被检物质选择性结合的物质(本说明书中称为“选择结合性物质”)的载体。
背景技术：
已经开始研究各种生物的遗传信息解析，迅速确定了与以人类基因为代表的多数基因及其碱基序列、或基因序列所编码的蛋白质及由上述蛋白质二次构成的糖链有关的信息。可以采用各种方法研究已经明确了序列的基因、蛋白质、糖链等高分子的功能。作为主要方法，对于核酸，可以采用Northern杂交或Southern杂交等方法利用各种核酸/核酸间的互补性研究各种基因与其生物功能表达之间的关系。对于蛋白质，可以采用以Western杂交为代表的方法利用蛋白质/蛋白质间的反应研究蛋白质的功能及表达。
近年来，作为一次性解析多个基因表达的方法，开发了称为DNA微阵列法(DNA芯片法)的新型分析法以及方法论，而受到关注。上述方法均是基于核酸/核酸间杂交反应的核酸检测·定量法，在上述方面，原理与现有方法相同，在基于蛋白质/蛋白质间、糖链/糖链间、糖链/蛋白质间的蛋白质或糖链检测·定量中也可以应用。上述技术的最大特征为使用在称为微阵列或芯片的玻璃平面基板片上高密度地整列固定了多条DNA片段或蛋白质、糖链的试样。作为微阵列法的具体使用法，例如，可以举出以下方法使将研究对象细胞的表达基因等用荧光色素等标记得到的样品杂交在平面基板片上，使互补的核酸(DNA或RNA)结合，用高析像度解析装置高速读取该部位的方法，或检测基于电化学反应的电流值等应答的方法。由此可以迅速地推定样品中的各种基因量。
例如，特表平10-503841号公报(权利要求书)中，作为用于将核酸固定在基板上的技术，公开了下述方法等载玻片等平坦的基板上涂布聚-L-赖氨酸、氨基硅烷等，使用称为测位仪(spotter)的点样装置，将各核酸固定。
另外，例如，特开2001-108683号公报(权利要求书及实施例)公开了以下方法作为DNA芯片中使用的核酸探针(固定在基板上的核酸)，从可以用现有的数百～数千碱基长度的cDNA及其片段降低检测时的出错率、且可以容易地采用合成机进行合成的理由出发，使用低聚DNA(低聚DNA是指碱基数为10～100碱基的DNA)。此时，低聚DNA与玻璃基板以共价键键合。
除此之外，作为DNA芯片中使用的玻璃以外的基板的材料，提出了几种关于树脂制基板的方案。例如，特开2001-337089号公报(第17段)中公开了作为基板使用由聚甲基丙烯酸甲酯构成的聚合物的内容。但是，特开2001-337089号公报中并未描述具体的DNA固定化方法。另外，特开2003-130874号公报(第12段)中也给出了同样的描述，但是并未说明具体的DNA固定化方法。特开2002-71693号公报(第7段)中公开利用碱处理使丙烯酸纤维等具有腈基的纤维衍生成为具有羧基的纤维，使上述羧基和DNA等结合进行固定的方法。但是，丙烯酸纤维以聚丙烯腈为主成分，因此存在材料本身的自身荧光强，不适合用作基板的问题。而且，特开2002-71693号公报(第7段)中公开了使聚甲基丙烯酸酯与丙烯酸、甲基丙烯酸共聚而衍生成为具有羧基的纤维，使上述羧基与DNA结合的方法，上述方法因基板(载体)表面的羧基量少，能够固定的DNA量变少，结果存在无法充分得到表示杂交的信号的问题。

发明内容
本发明想要解决的问题如下所述。首先，在平坦的玻璃基板上固定低聚DNA时存在下述问题。即，1)进行杂交时，玻璃为亲水性的，在固定了探针DNA的斑点以外的部分也容易非特异性地吸附检体DNA，用称为扫描仪的装置进行荧光检测时，也检测到上述非特异性地吸附的检体，使噪声变大；2)由于玻璃为刚体，因此基于妨碍了与其共价键合的低聚DNA空间自由度的推测理由，与检体DNA的杂交效率低，因此信号强度弱，结果出现S/N比不充分的问题。
本发明想要解决的问题为提供一种能够结实地且在杂交效率良好的状态下将DNA固定在树脂制基板上的载体。并且提供一种能够防止上述S/N恶化、固定了检测灵敏度高的选择结合性物质的载体。
即，本发明涉及一种选择结合性物质固定化载体，是固定了选择结合性物质的载体，其特征为，该载体的表面由低自身荧光树脂构成，用碱或酸处理上述聚合物的表面，生成羧基后固定选择结合性物质。
另外，本发明涉及一种选择结合性物质固定化载体，是在载体表面固定了选择结合性物质的选择结合性物质固定化载体，其特征为，载体表面具有包含下述通式(1)表示的结构单元的聚合物，用碱或酸处理上述聚合物的表面后，固定选择结合性物质。
(通式(1)的R1、R2、R3表示烷基、芳基或氢原子。)根据本发明，能够提供一种非特异性检体的吸附少、且杂交效率良好、S/N比良好的固定了选择结合物质的载体。


图1表示在PMMA表面固定选择结合性物质时的反应流程。
图2是本发明的载体的模式图。
图3是本发明的载体的剖面模式图。
图4表示微阵列定位用夹具的具体例。
图5是载体凹凸部的剖面图。
图6是具有支持体层和选择结合性物质固定化层的载体的概念图。
图7表示在玻璃表面固定选择结合性物质时的反应流程。
具体实施例方式
下面，说明本发明的选择结合性物质的固定化载体。
本发明的选择结合性物质的固定化载体为了固定选择结合性物质，具备以下特征载体表面由低自身荧光树脂构成。且用碱或酸处理表面，生成羧基。此处，低自身荧光树脂是指使用Axon Instruments社的GenePix 4000B，在激发波长为532nm、光电倍增管的增益设定为700、激光功率为33％的条件下对厚度为1mm的干净平板进行测定时，荧光强度为1000或1000以下的树脂。不满足上述条件的树脂检测时的S/N恶化，因此并不优选。作为上述树脂，例如可以举出下述通式(1)表示的聚合物。
另外，本发明的选择结合性物质的固定化载体是在用于固定选择结合性物质的载体表面具有包含下述通式(1)表示的结构单元的聚合物的固体。
(通式(1)的R1、R2、R3表示烷基、芳基或氢原子。)作为上述聚合物，可以使用均聚物或共聚物。上述聚合物使用至少一种类型的单体作为原料，上述单体以能够参与聚合的双键及能够参与缩聚的官能团、以及酮或羧酸、或上述物质的衍生物的形态存在。另外，上述聚合物更优选具有通式(1)的结构。
另外，上述聚合物为共聚物时，通式(1)表示的结构单元的含量优选为总单体单元的10％或10％以上。通式(1)表示的结构单元的含量如果为10％或10％以上，则可以按照下述说明的步骤在表面生成大量羧基，大量固定探针核酸，结果进一步提高了S/N比。
本发明中，聚合物是指数均聚合度为50或50以上的物质。上述聚合物的数均聚合度的优选范围为100～1万。特别优选为200或200以上、5000或5000以下。需要说明的是数均聚合度可以使用GPC(凝胶渗透色谱法)、按常规方法测定聚合物的分子量而容易地测定。
通式(1)中，R1及R2表示烷基、芳基或氢原子，可以分别相同，也可以不同。上述烷基可以为直链状，也可以为支链状，碳原子数优选为1～20。上述芳基的碳原子数优选为6～18、进一步优选为6～12。官能团X为从O、NR3或CH2中任意选择。R3为与上述R1及R2同样地定义的官能团。
作为包含上述各种官能团的聚合物的优选例，例如有聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲基丙烯酸乙酯(PEMA)或聚甲基丙烯酸丙酯等聚甲基丙烯酸烷基酯(PAMA)等。上述物质中，从容易采用注塑成形或热压成形(hot emboss)法成形、且玻璃化温度较高方面考虑，最优选聚甲基丙烯酸甲酯。而且，还可以使用聚乙酸乙烯酯、聚甲基丙烯酸环己酯或聚甲基丙烯酸苯酯等。另外，也可以使用组合了上述聚合物的构成要素、或在上述聚合物的构成要素中增加了其他的一种或多种聚合物的构成要素的结构的共聚物。作为上述其他的聚合物，有聚苯乙烯等。
在共聚物的情况下，作为各构成要素之比的范围，含有羰基的单体、例如甲基丙烯酸烷基酯的比例优选为10摩尔％或10摩尔％以上。由此，可以在表面生成大量羧酸，固定大量探针核酸，结果进一步提高了S/N比。在聚合物的结构单元中，该单体的比例更优选为50摩尔％或50摩尔％以上。
而且，本发明中，为了在含有至少具有1个通式(1)表示的结构单元的聚合物的载体上固定选择结合性物质，必须用碱或酸对其实施前处理。由此，可以在载体表面形成羧基。作为在载体表面生成羧基的方法，不仅可以单独采用以碱、酸等进行处理的方法，而且也可以组合使用在加热中进行的超声波处理、将载体暴露在氧等离子体、氩等离子体、放射线中的方法等。上述方法中，从载体的损伤少、容易实施方面考虑，优选将载体浸渍在增高了温度的碱或酸中，由此在表面生成羧基。作为具体例，可以将载体浸渍在氢氧化钠或硫酸的水溶液(优选浓度为1N～20N)中，优选在30℃～80℃的温度下保持1小时～100小时。
采用上述方法是否在载体表面生成羧基可以用XPS(X射线光电子分光法)加以确认。具体而言，使用含氟的标记化试剂(例如三氟乙醇)将羧基用氟标记。然后，可以考虑相对于标记后的试样中的Cls、Fls峰面积强度的反应率，推定官能团量。而且，为了提高精度，可以用TOF-SIMS(飞行时间型二次离子质量分析法)观察经三氟乙醇标记的试样表面的氟分布，由此确认载体表面是否生成羧基。
如果由此在载体表面生成羧基，则以此为引物，对载体侧进行生物素或抗生物素蛋白修饰，对选择结合性物质进行抗生物素蛋白或生物素修饰，利用抗生物素蛋白·生物素的相互作用将选择结合性物质固定在载体上的方法；或使载体侧与乙二胺等连接体反应，再使上述连接体与选择结合性物质反应，进行固定。但是，采用上述方法时，由于进行2步反应，因此因反应收率的关系，容易使能够固定在载体上的选择结合性物质减少。因此，优选使载体的羧基与选择结合性物质的官能团直接反应，将选择结合性物质固定。即，使载体表面的羧基与选择结合性物质的氨基或羟基经共价键固定。一般而言，为了促进上述结合反应，优选使用二环己基碳二亚胺、N-乙基-5-苯基以异噁唑鎓(isooxazolium)-3’-磺酸酯等各种缩合剂。上述化合物中，从毒性小、比较容易从反应体系中除去方面考虑，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)是用于选择结合性物质和载体表面的羧基的缩合反应的最有效缩合剂之一。除此之外，作为有效的缩合剂，有4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基-吗啉氯化物(DMT-MM)。上述EDC等缩合剂可以与选择结合性物质的溶液混合使用，也可以将表面生成了羧基的载体预先浸渍在EDC溶液中，将表面的羧基活化。
使用上述缩合剂，使载体表面的羧基和选择结合性物质的氨基反应时，利用酰胺键将载体表面和选择结合性物质固定；使载体表面的羧基和选择结合性物质的羟基反应时，利用酯键将载体表面和选择结合性物质固定。使包含选择结合性物质的试样作用于载体时的温度优选为5℃～95℃、更优选为15℃～65℃。处理时间通常为5分钟～24小时、优选为1小时或1小时以上。另外，用于固定选择结合性物质的流程如图1所示。(图1中的1表示PMMA基板，2表示选择结合性物质(DNA)。)利用上述方法，将选择结合性物质固定在聚合物表面，由于斑点部分以外存在负电荷的羧基，因此能够抑制检体(代表性的DNA)的非特异性吸附，而且，能够利用共价键结实地、且高密度地固定选择结合性物质，而且，与玻璃相比，被固定的选择结合性物质的空间自由度高，基于上述推定理由，能够获得与检体杂交效率高的载体。空间自由度高的优点特别是在被固定的选择结合性物质以称作低聚DNA的碱基长度为10碱基～100碱基的DNA为目标时，能够赋予显著提高与检体的杂交效率的特性。
但是，用含有通式(1)表示的结构单元的聚合物制作载体时，与玻璃、陶瓷、金属等相比，可以通过使用注塑成形方法或热压成形法等而更简单地大量生产具备微细形状的载体。此处，就固定选择结合性物质的载体的形状进行说明。优选方案为在本发明的固定选择结合性物质的载体上存在凹凸部，在凸部上表面固定选择性结合物质。通过采用上述构造，在检测时，不必如下所述地检测非特异性地吸附的检体，因此噪声小，结果能够提供一种S/N良好的固定选择结合性物质的载体。而且，对于凹凸部上多个凸部的高度，优选使凸部上表面的高度大致相同。此处，高度大致相同是指满足下述条件的高度在高度多少不同的凸部表面固定选择结合性物质，使其与荧光标记后的被检体反应，然后，在用扫描仪扫描时，其信号水平的强度差不存在问题。具体而言，高度大致相同是指高度差小于100μm。而且，优选在本发明的载体上设置平坦部。具体例如图2、图3所示。11为平坦部，并且，在12表示的凹凸部的凸部上表面固定选择结合性物质(例如核酸)。因此，该凹凸部的凸部分的上表面优选实质上为平坦的。此处，凸部上表面实质上为平坦是指不存在50μm以上的凹凸。而且，凹凸部的凸部的上表面高度和平坦部分的高度大致相同。此处，平坦部和凹凸部的高度大致相同是指在用扫描仪扫描时不产生信号水平降低等问题的高度。具体而言，高度差大致相同是指凹凸部的凸部上表面的高度和平坦部的高度差小于100μm。
即，通常，微阵列使被荧光标记的检体与固定在载体上的选择结合性物质反应，用称为扫描仪的装置读取荧光。扫描仪构成如下将作为激发光的激光光线通过物镜，使激光光线会聚。会聚的光照射微阵列的表面，使激光光线的焦点定位在微阵列表面。在上述条件下直接扫描物镜或微阵列本身，由此读取微阵列发出的荧光。
使用上述扫描仪扫描本发明的在凸部上表面固定了选择结合性物质的载体时，能够发挥不易检测非特异性地吸附在凹凸部的凹部的检体DNA的荧光(噪声)的效果。其理由为激光光线的焦点会聚在凸部上表面，因此激光光线并未聚焦在凹部。反过来说，固定了选择结合性物质的多个凸部内，最高的凸部上表面高度和最低的凸部上表面高度差优选为50μm或50μm以下。其原因在于如果凸部上表面的高度存在上述范围以外的不均，则可能因扫描仪的焦点深度的关系而无法测定正确的荧光强度。
另外，固定了选择结合性物质的多个凸部内，最高的凸部上表面的高度和最低的凸部上表面的高度差只要为50μm或50μm以下即可，更优选为30μm或30μm以下，特别优选高度相同。另外，本申请中的相同高度也包括生产等时出现的不均引起的误差。
另外，固定了选择结合性物质的多个凸部是指固定了作为数据必需的选择结合性物质(例如核酸)的部分，排除仅固定了虚设(dummy)的选择结合性物质的部分。
另外，通常调整扫描仪焦点的方法如下所述。即，在扫描仪将激发光的焦点会聚在微阵列的表面时，使激发光的焦点会聚在微阵列的一角，或如图4所示，将微阵列定位在夹具上，使激光光线的焦点对准微阵列表面。然后，在上述条件下直接扫描微阵列整体。(图4中的13表示微阵列、14表示物镜、15表示激发光、16表示用于将微阵列定位在夹具上的弹簧。)因此，特别优选在本发明的载体上设置凹凸部和平坦部。具体例如图2、图3所示。11为平坦部，且、在12表示的凹凸部的凸部上表面固定选择结合性物质(例如核酸)。并且，凹凸部的凸部上表面的高度和平坦部分的高度差优选为50μm或50μm以下。如果如上所述地进行设定，则扫描固定了选择结合性物质的载体时，可以使激发光的焦点暂且对准平坦部上表面，或将平坦部定位在夹具上。即，扫描仪的焦点定位变得容易。由此，由于将激发光的焦点对准平坦部，因此优选使固定了选择结合性物质的凸部的上表面平坦，且、凸部上表面的高度和平坦部的高度差为50μm或50μm以下。
凸部上表面的高度和平坦部的高度差如果大于50μm，则发生下述问题。即，由于将激发光的焦点调整到平坦部的上表面，因此如果凸部上表面的高度不同，则凸部上表面的激发光焦点模糊，最差情况为完全检测不到选择结合性物质与检体反应产生的荧光。同样的情况在未设置高度与凸部上表面相同的平坦部时也能够出现。
另外，凸部的上表面不平坦时，凸部上表面的激发光焦点大小出现不均，结果在1个凸部上表面内检测到的荧光强度出现不均。如果出现上述情况，则难以进行下述解析。本申请的情况下，不出现上述问题，能够获得良好的信号(荧光)。
另外，凸部上表面的高度和平坦部分的高度差只要为50μm或50μm以下即可，更优选为30μm或30μm以下，最优选凸部上表面的高度与平坦部分的高度相同。另外，本申请中相同的高度也包括生产等产生的不均引起的误差。
另外，本发明中，并非在平面状的载体上点样选择结合性物质，而是仅在凹凸部分的凸部上表面固定选择结合性物质。因此，凸部上表面以外的部分即使非特异性地吸附检体试样，由于在凸部上表面以外的部分激发光的焦点模糊，因此不会检测到不希望的非特异性吸附的检体试样发出的荧光。因此，噪声变小，结果发挥S/N变好的效果。
为了制作上述形状的载体，鉴于生产率优选采用注塑成形法。为了采用注塑成形法制作上述形状的载体，必须有模型，作为上述模型的制作方法， 如果采用LIGA(Lithographie GalvanoformungAbformung)工序制作模型，则能够制成成形后载体容易脱模的模型，因此是优选的。
另外，凸部上表面的面积优选大致相同。由此，可以使固定了多种选择结合性物质的部分的面积相同，因此有利于下述解析。此处，凸部上部的面积大致相同是指凸部中最大的上表面面积除以最小的上表面面积的值为1.2或1.2以下。
凸部上表面的面积没有特别限定，从能够减少选择结合性物质量和操作的容易性方面考虑优选为4mm2或4mm2以下、10μm2或10μm2以上。
凹凸部的凸部高度优选为0.01mm或0.01mm以上、1mm或1mm以下。如果凸部的高度低于0.01mm，则将检测到斑点以外部分的非特异性地吸附的检体试样，结果S/N变差。另外，凸部的高度如果为1mm以上。则可能产生凸部容易折断、破损等问题。
另外，优选至少在凸部的侧面设置导电性材料。由此，例如，设置对置电极，在对置电极和上述导电性材料之间施加电流、电压，由此，在核酸的情况下，能够使杂交高速化。涂布导电性材料的优选区域为凹部的全部、凸部的侧面全部。其具体例如图5所示。(图5中的21表示凸部上表面，22表示导电膜，23表示绝缘膜。)作为施加电压的范围，在电流流过的情况下，优选在0.01V或0.01V以上、2V或2V以下的范围内。特别优选的范围是0.1V或0.1V以上、1.5V或1.5V以下。由此，在施加大电压时，水发生电解，有时对表面的选择结合性物质产生不良影响。导电性材料的材质没有特别限定，可以举出碳、镁、铝、硅、钛、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锡、锆、铌、钼、钯、银、铪、钽、钨、铂、金、不锈钢或上述物质的混合物或导电性聚合物。其中，特别优选使用铂、金、钛。作为上述导电性材料的膜的制作方法，可以举出蒸镀、溅镀、CVD、电镀等。
如上所述地在凸部涂布导电性材料时，在凸部的上表面之外，更优选设置绝缘材料的层。如果存在绝缘材料的层，则电流流过时，可以使被检体仅存在于凸部的上表面。作为绝缘材料的材料，可以举出金属的氧化物(例如、Al-O、SiO2、TiO2、VO、SnO、Cr-O、Zn-O、GeO2、Ta2O5、ZrO2、Nb-O、Y2O3等)、氮化物(Al-N、Si3N4、TiN、Ta-N、Ge-N、Zr-N、NbN等)、硫化物(ZnS、PbS、SnS、CuS)、绝缘性聚合物。
采用上述方法得到的选择结合性物质固定化载体可以在固定选择结合性物质后，进行适当处理。例如也可以通过进行热处理、碱处理、表面活性剂处理等，使被固定的选择结合性物质改性。
另外，通常选择结合性物质固定化载体使被荧光标记的检体和固定在载体上的选择结合性物质发生杂交反应，用称为扫描仪的装置读取荧光。扫描仪将作为激发光的激光光线通过物镜，使激光光线会聚。但是，载体表面产生自身荧光时，上述发光成为噪声，导致检测精度降低。为了防止上述情况的发生，优选使具有通式(1)的结构单元的聚合物呈黑色，或在其中含有激光照射时不发光的物质，使表面呈黑色，由此能够降低载体自身产生的自身荧光。通过使用上述载体，在检测时，能够降低载体发出的自身荧光，因此噪声小，结果能够提供一种S/N比良好的固定选择结合性物质的载体。
此处，载体为黑色是指在可见光(波长为400nm～800nm)范围内，载体的黑色部分的光谱反射率不具有特定的光谱图案(特定的峰等)，一律为较低值，并且，载体的黑色部分的光谱透射比也不具有特定的光谱图案，一律为较低值。
作为上述光谱反射率、光谱透射比的值，优选使可见光(波长为400nm～800nm)范围内的光谱反射率为7％或7％以下，同波长范围内的光谱透射比为2％或2％以下。另外，此处所称光谱反射率是指在符合JIS Z8722条件C的照明·受光光学体系中测定载体发出的正反射光时的光谱反射率。
作为处理成黑色的方法，可以通过使载体中包含黑色物质而实现，作为上述黑色物质的优选例，可以使用炭黑、石墨、钛黑、苯胺黑、Ru、Mn、Ni、Cr、Fe、CO及Cu的氧化物、Si、Ti、Ta、Zr及Cr的碳化物等黑色物质。
除了单独含有上述黑色物质外，也可以混合含有2种或2种以上的物质。在上述黑色物质中，优选含有炭黑、石墨、钛黑，从容易均匀地分散在聚合物中方面考虑，特别优选使用炭黑。
另外，作为载体的形状，如果在由玻璃、金属等不易发生热变形的材料构成的支持体层上设置由至少具有1个通式(1)表示的结构单元的聚合物构成的选择结合性物质固定化层，则可以防止热或外力引起的载体形状变化，因此是优选的。作为其他支持体层，可以使用聚碳酸酯、聚酰亚胺、聚酰胺等能够耐受较高温度的树脂等。其概念图如图6所示。(2表示选择结合性物质(DNA)，3表示支持体层(玻璃)，4表示选择结合性物质固定化层(PMMA)。)作为支持体层，优选玻璃，或铁、铬、镍、钛、不锈钢等金属。另外，为了改善上述支持体层和选择结合性物质固定化层的密合性，优选对支持体层表面实施在氩气、氧气、氮气中进行的等离子体处理或采用硅烷偶合剂进行的处理。作为上述硅烷偶合剂，可以举出3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基二乙氧基甲基硅烷、3-(2-氨基乙基氨基丙基)三甲氧基硅烷、3-(2-氨基乙基氨基丙基)二甲氧基甲基硅烷、3-巯基丙基三甲氧基硅烷、二甲氧基-3-巯基丙基甲基硅烷等。作为在支持体层上设置选择结合性物质固定化层的方法，可以将聚合物溶解在有机溶剂中，采用旋涂法或浸渍法等公知方法进行设置。更简单的方法为用粘合剂贴合在支持体层上。
此处，“选择结合性物质”是指可以与被检物质直接或间接地选择性结合的物质，作为代表例，可以举出核酸、蛋白质、糖类及其他抗原性化合物。核酸可以为DNA或RNA，也可以为PNA。由于具有特定碱基序列的单链核酸能够与具有与该碱基序列或其中的一部分互补的碱基序列的单链核酸选择性杂交、结合，因此属于本发明中所称“选择结合性物质”。另外，作为蛋白质，可以举出抗体及Fab片段或F(ab’)2片段之类抗体的抗原结合性片段、及各种抗原。抗体或其抗原结合性片段与对应的抗原选择性结合，抗原与对应的抗体选择性结合，因此属于“选择结合性物质”。作为糖类，优选多糖类，可以举出各种抗原。另外，也可以固定蛋白质或糖类以外的具有抗原性的物质。本发明中使用的选择结合性物质可以为市售品，也可以为从生物细胞等中取得的物质。作为“选择结合性物质”，特别优选核酸。上述核酸中，称为低聚核酸的长度为10碱基～100碱基的核酸可以用合成机容易地人工合成，另外，核酸末端的氨基修饰容易，因此容易固定在载体表面，是优选使用的。从不足20碱基时杂交的稳定性低方面考虑，更优选20～100碱基。为了保持杂交的稳定性，特别优选在40～100碱基的范围内。
作为使用本发明载体的测定方法中采用的被检物质，可以举出需要测定的核酸，例如病原菌或病毒等的基因、或遗传疾病的病源基因等以及上述基因中的一部分、具有抗原性的各种生物体成分、病原菌或病毒等的抗体等，但是并不限定于上述物质。另外，作为包含上述被检物质的检体，可以举出血液、血清、血浆、尿、粪便、骨髓液、唾液、各种组织液等体液、或各种饮食品及上述物质的稀释品等，但是并不限定于上述物质。另外，作为被检物质的核酸可以将从血液或细胞中按常规方法提取的核酸进行标记，也可以以该核酸为模板，采用PCR等核酸扩增法进行扩增。在后者的情况下，能够大幅度提高测定灵敏度。以核酸扩增产物为被检物质时，在被荧光物质等标记的核苷三磷酸的存在下进行扩增，由此可以标记扩增核酸。另外，在被检物质为抗原或抗体时，可以采用常规方法直接标记作为被检物质的抗原或抗体，也可以在使作为被检物质的抗原或抗体与选择结合性物质结合后，洗涤载体，使与该抗原或抗体发生抗原抗体反应的标记后的抗体或抗原反应，测定结合在载体上的标记。
可以与现有方法完全相同地进行使固定化物质和被检物质相互作用的工序。根据杂交的核酸的链长、或参与免疫反应的抗原及/或抗体的种类等适当选择反应温度及时间，核酸杂交时，通常在50℃～70℃左右反应1分钟～十几小时，进行免疫反应时，通常在室温～40℃左右反应1分钟～数小时左右。
实施例利用下述实施例更详细地说明本发明。但是本发明不限定于下述参考例1将透明的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)板((株)KURARAY制；COMOGLASS挤压板，厚度1mm，平均分子量15万，即，数均聚合度为1500)用乙醇和纯水充分洗涤后，在10N的氢氧化钠水溶液中，70℃下浸渍12小时。然后，按纯水、0.1N HCl水溶液、纯水的顺序进行洗涤。以实施了上述碱处理的板和未实施碱处理的板为试样，使用含氟的标记化试剂(三氟乙醇)，在气相状态下对试样表面的羧基进行标记。然后，使用单色化的Al Kα1，2射线(1486.6eV)，在X射线径为1mm、光电子逃逸角90°的条件下，进行XPS测定，考虑相对于Cls、Fls峰面积强度的反应率，推定羧基。结果，羧基量在未实施碱处理的试样的情况下为0.0013(总碳量中羧基碳的比例)，进行了碱处理的试样的情况下为0.0015，确认表面的羧基量增多。
另外，利用TOF-SIMS(飞行时间型二次离子质量分析)测定上述2种用三氟乙醇标记了表面的羧基的试样表面的氟量和分布时，得到以下结果。即，比较2种试样时确认氢氧化钠处理品的19F-或69CF3-强于未处理品，氢氧化钠处理品的羧基多于未处理品。具体而言，未处理品中相当于F-的质量数19的离子的计数为8000，氢氧化钠处理品为25000。另外，对应于CF3-的质量数69的离子的计数未处理品为1200，而氢氧化钠处理品为7000。而且，利用TOF-SIMS对两试样表面的氟分布进行二维测定时，对于氢氧化钠处理品，在19F-的离子像中可见局部存在的分布(可见30μm～40μmφ的圆形或30μm～40μm宽的条纹状离子强度较弱的区域)。由上述结果推测，对于进行了碱处理的样品，表面的羧基具有局部存在的分布。而在未处理品中，19F-的离子像中未确认有特别局部存在的分布。另外，二种试样中均未确认在31CH3O-的离子像中有局部存在的分布，上述31CH3O-的离子像被认为是甲氧基产生的。
实施例1(DNA固定化载体的制作)将透明的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)板((株)KURARAY制；COMOGLASS挤压板，厚度1mm，平均分子量15万，即，数均聚合度为1500)在10N的氢氧化钠水溶液中、65℃下浸渍12小时。然后，按纯水、0.1N HCl水溶液、纯水的顺序进行洗涤。由此，将板表面的PMMA的侧链水解，生成羧基。另外，使用Axon Instruments社的GenePix 4000B，在激发波长为532nm、光电倍增管的增益设定为700、激光功率为33％的条件下进行测定时，该板(未进行碱处理)的自身荧光强度为650。
(探针DNA的固定化)合成序列编号1(70碱基，5’末端氨基化)、序列编号2(60碱基，5’末端氨基化)、序列编号3(40碱基，5’末端氨基化)、序列编号4(20碱基，5’末端氨基化)的DNA。上述序列编号1～4的DNA的5’末端被氨基化。
将上述DNA溶解在纯水中，使浓度为0.27nmol/μl，制成贮存液。在基板上点样时，用PBS(将NaCl 8g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KCl 0.2g、KH2PO40.2g溶解在纯水中，加水至11后添加pH调节用盐酸制成的溶液，pH5.5)，使探针最终浓度为0.027nmol/μl，并且为了使载体表面的羧基与探针DNA末端的氨基缩合，添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，使其最终浓度为50mg/ml。然后，取出上述混合溶液约200nl，将其点样在基板上。即，在PMMA基板上将4种探针分别点样在1个部位。然后，将基板放入密闭的塑料容器中，在37℃、湿度100％的条件下培养20小时左右，用纯水进行洗涤。上述反应流程如图1所示。
(检体DNA的调整)作为检体DNA，使用具有能与上述DNA固定化基板杂交的碱基序列的序列编号8的DNA(968碱基)。调整方法如下合成序列编号5和序列编号6的DNA。将其溶解在纯水中，使浓度为100μM。然后，准备pKF3质粒DNA(TAKARA-BIO(株)产品编号3100)(序列编号72264碱基)，以其为模板，以序列编号5及序列编号6的DNA为引物，利用PCR反应(Polymerase ChainReaction)进行扩增。
PCR的条件如下所述。即，加入ExTaq 2μl、10×ExBuffer 40μl、dNTP Mix 32μl(以上为TAKARA-BIO(株)制产品编号RR001A中的附属产品)、序列编号5的溶液2μl、序列编号6的溶液2μl、模板(序列编号7)0.2μl，用纯水加至总量为400μl。将上述混合液分在4个微管中，使用热循环控制装置进行PCR反应。利用乙醇沉淀对其进行纯化后，将其溶解在40μl的纯水中。取出PCR反应后的溶液的一部分，用电泳进行确认时，确认扩增后的DNA的碱基长度约为960碱基，序列编号8(968碱基)被扩增。
然后，溶解9碱基的随机引物(TAKARA-BIO(株)制；产品编号3802)，使浓度为6mg/ml，在上述PCR反应后进行了纯化的DNA溶液中加入2μl。将上述溶液加热到100℃后，在冰上迅速冷却。在上述溶液中添加Klenow Fragment(TAKARA-BIO(株)制；产品编号2140AK)附属的缓冲液5μl、dNTP混合物(dATP、dTTP、dGTP的浓度分别为2.5mM，dCTP的浓度为400μM)2.5μl。再加入Cy3-dCTP(Amersham Pharmacia Biotic制；产品编号PA53021)2μl。在上述溶液中加入10U的Klenow Fragment，在37℃下培养20小时，得到被Cy3标记的检体DNA。需要说明的是标记时由于使用随机引物，因此检体DNA的长度存在不均。最长的检体DNA成为序列编号8(968碱基)。另外，取出检体DNA的溶液，用电泳进行确认时，在相当于960碱基的附近出现最强带，在对应于碱基长度比其短的区域内呈现轻微拖尾的状态。然后，利用乙醇沉淀对其进行纯化、干燥。
将上述被标记的检体DNA溶解在400μl的1重量体积％BSA(牛血清白蛋白)、5×SSC(5×SSC是指将NaCl 43.8g、柠檬酸三钠水合物22.1g溶解在纯水中，加至11制成的溶液。另外，将NaCl 43.8g、柠檬酸三钠水合物22.1g溶解在纯水中，加至51形成的溶液标记为1×SSC，上述溶液的10倍浓缩液标记为10×SSC，5倍稀释液标记为0.2×SSC。)、0.1重量体积％SDS(十二烷基硫酸钠)、0.01重量体积％鲑精子DNA的溶液(各浓度均为最终浓度)中，制成杂交用溶液。
(杂交)在上述得到的固定了探针DNA的基板上，使上述检体DNA杂交。具体而言，在预先准备的固定了探针核酸的载体上滴加杂交用溶液10μl，在其上覆盖盖玻片。另外，将盖玻片的周围用纸带密封，使杂交溶液不会干燥。将其放入塑料容器中，在65℃、湿度100％的条件下培养10小时。培养后，将盖玻片剥离，然后进行洗涤、干燥。
(测定)为了检测是否进行杂交，用荧光显微镜(奥林巴斯光学)观察杂交后的基板上的荧光。在全部的探针部分均观察到表示杂交的荧光发光。另外，随碱基数增至40、60、70，斑点上的荧光和背景之差变大。即，随着探针的碱基数变长，S/N比提高。
然后，为了进行定量，将上述处理后的载体放置在DNA芯片用扫描仪(Axon Instruments社的GenePix 4000B)中，在激光输出功率为33％、光电倍增管的增益为500的状态下进行测定。其结果如表1所示。此处，荧光强度是指斑点内荧光强度的平均值，噪声是指斑点周围(未点样DNA的部分)的荧光强度的平均值。
比较例1在实施例1的基板并非PMMA而是玻璃的情况下进行试验。
将载玻片在10N NaOH水溶液中浸渍1小时后，用纯水充分洗涤。然后，将APS(3-氨基丙基三乙氧基硅烷；信越化学工业(株)制)以2重量体积％的比例溶解在纯水中后，将上述载玻片浸渍1小时，从上述溶液中取出后，在110℃下干燥10分钟。由此，在玻璃表面导入氨基。
然后，将5.5g的琥珀酸酐溶解在1-甲基-2-吡咯烷酮335ml中。在1M的50ml硼酸钠(加入硼酸3.09g和pH调节用氢氧化钠，用纯水加至50ml得到的溶液，pH8.0)中添加上述琥珀酸溶液。将上述玻璃基板在上述混合液中浸渍20分钟。浸渍后，用纯水洗涤并干燥。由此，使玻璃基板表面的氨基和琥珀酸酐反应，在玻璃表面导入羧基。将其用作DNA固定化用基板。再按与实施例1同样的顺序将碱基序列1～4的DNA固定在上述玻璃基板上。上述反应流程如图7所示(图7中，2表示选择结合性物质(DNA)，5表示玻璃基板)。然后，按与实施例1同样的顺序进行杂交。在与实施例1相同的条件下用荧光显微镜进行观察。
用荧光显微镜进行观察时，玻璃基板中探针部分为40碱基或40碱基以上时也观察到发光。但是，与基板为PMMA时相比，比较例的3个玻璃基板的荧光强度明显微弱。而且，为了进行定量，用扫描仪测定上述基板的荧光强度。其结果与实施例1一并示于表1。由表1的结果可知，玻璃基板的荧光微弱，且噪声也较大，S/N比变差。
另外，使用市售的其他导入了氨基的载玻片，按与上述相同的流程进行至DNA的固定、杂交。所使用的载玻片为DNA微阵列用涂布载玻片高密度氨基导入型(松浪硝子工业(株)制；产品编号SD00011)和MAS涂布载玻片(松浪硝子工业(株)制；产品编号S081110)。同样地进行测定，结果为即使使用上述载玻片，S/N比也比以PMMA为基板时差。其结果如表1所示。
表1

比较例2(载玻片的调整)与比较例1同样地使用3-氨基丙基三乙氧基硅烷，在载玻片的表面导入氨基。然后，与比较例1同样地使用琥珀酸酐，在载玻片的表面导入羧基后，用乙腈洗涤，减压下干燥1小时。将干燥后的末端导入了羧基的玻璃基板在EDC(955mg)及N-羟基琥珀酰亚胺(575mg)的乙腈(50ml)溶液中浸渍2小时，用乙腈洗涤，减压下干燥1小时，得到N-羟基琥珀酰亚胺经酯键导入表面的玻璃基板。
(DNA的固定化)使用与实施例1同样的5’末端进行了氨基化的DNA，将其分散在0.1M碳酸缓冲液(pH9.3)中得到水性溶液(DNA的浓度为0.027nmol/μl)，将200nl上述水性溶液点样在上述得到的玻璃基板上。随后将固定化后的玻璃基板在25℃、湿度90％的环境中放置1小时后，将上述玻璃基板依次用0.1重量体积％SDS和2×SSC的混合溶液洗涤2次、用0.2×SSC水溶液洗涤1次。然后，将上述洗涤后的玻璃基板在0.1M甘氨酸水溶液(pH10)中浸渍1小时30分钟后，用蒸馏水洗涤，在室温下干燥，得到固定了DNA片段的玻璃基板。
(检测)采用与实施例1的杂交实验相同的顺序及检体DNA进行杂交。结果如表2所示。可知与实施例1的基板为PMMA时相比S/N比并不充分。
表2

实施例2(DNA固定化载体的制作)在平均分子量为15万的PMMA中按3重量％的比例混合炭黑，采用铸塑法制造厚度为1mm的黑色基板。将上述黑色PMMA基板在10N的氢氧化钠水溶液中于65℃下浸渍12小时。将其按纯水、0.1N的HCl水溶液、纯水的顺序进行洗涤。需要说明的是使用Axon Instruments社的GenePix 4000B，在激发波长为532nm、光电倍增管的设定增益为700、激光功率为33％的条件下进行测定时，该板(未进行碱处理)的自身荧光强度为250。使用4种与实施例1相同的探针DNA，按同样的操作顺序，制造黑色化的DNA固定化载体。
另外制作同样的基板，测定上述黑色基板的光谱反射率和光谱透射比时，光谱反射率在可见光区域(波长为400nm～800nm)的任一波长下均为5％或5％以下。另外，在同范围的波长下，透射率为0.5％或0.5％以下。光谱反射率、光谱透射比在可见光区域中均不具有特定的光谱图案(峰等)，光谱一律平坦。需要说明的是光谱反射率使用搭载了符合JIS Z 8722的条件C的照明·受光光学体系的装置(美能达照相机制、CM-2002)，测定测定载体发出的正反射光时的光谱反射率。
(检体DNA的调整及杂交)采用与实施例1同样的检体DNA调整法及杂交法进行。
(测定)在与实施例1相同的条件下，用扫描仪进行荧光测定。表3给出用扫描仪进行观察得到的结果。与实施例1同样地随着碱基数增加，荧光强度增加。另外，与实施例1的结果相比背景减少。由此，确认将基板制成黑色时，噪声减低，进一步提高了S/N比。
表3

实施例3采用比较例1的顺序制作表面导入了3-氨基丙基三乙氧基硅烷的载玻片。在其上旋涂溶解在氯仿中的PMMA，在100℃下保持15分钟、在115℃下保持1小时，制成由支持体层(玻璃)/选择结合性物质固定化层(PMMA)构成的载体。另外，旋涂后的PMMA的厚度约为20μm。
然后，将上述载体在10N的NaOH中浸渍10小时，在PMMA的表面生成羧基。与实施例1同样地固定探针DNA、调整检体DNA、杂交、测定荧光强度。此时，得到与实施例1相同的结果。另外，实施例1中，若干基板弯曲，本实施例的载体未见弯曲。
另外，即使同样地旋涂实施例2中使用的分散了炭黑的PMMA，也能够得到与实施例2相同的荧光强度和噪声，在上述情况下也未见载体弯曲。
实施例4PMMA表面生成羧基时，代替10N的NaOH水溶液，使用10N的硫酸，除此之外进行与实施例1相同的实验。结果得到与实施例1同样的结果。
实施例5制备苯乙烯和MMA(甲基丙烯酸甲酯)的共聚物。制成的聚合物组成为MMA 10mol％、苯乙烯90mol％。上述共聚物的具体制备方法为将MMA和苯乙烯按1∶9(摩尔比)的比例溶解在脱水甲苯中后，以MMA和苯乙烯总摩尔数的1/1000的比例加入AIBN(偶氮二异丁腈)，在氮气气氛中，60℃下保持1小时、65℃下保持3小时、90℃下保持20小时。然后，利用乙醇沉淀、过滤进行纯化。
纯化后的聚合物的组成用NMR(nuclear magnetic resonance)进行确认。另外，用GPC测定上述聚合物的分子量，计算数均聚合度的结果为1100。
然后，用铸塑法将纯化后的聚合物制成厚度为1mm左右的板状。固定化的DNA仅为序列编号2的DNA，除此之外进行与实施例1相同的实验。然后，在与实施例1相同的条件下，用扫描仪进行荧光测定。结果，荧光强度为5200，噪声为150，即使MMA的含量为10％，与比较例1、比较例2相比，S/N比也得以提高。另外，使用Axon Instruments社的GenePix 4000B，在激发波长532nm、光电倍增管的设定增益为700、激光功率为33％的条件下，测定未实施碱处理的平板时，上述板的自身荧光强度为750。
比较例3制备聚苯乙烯的均聚物，采用铸塑法制成厚度为1mm左右的板状。使用该板，与实施例1同样地进行实验，完全未观察到表示探针DNA与检体DNA杂交的荧光。
实施例6(DNA固定化载体的制作)使用作为公知方法的LIGA(Lithographie GalvanoformungAbformung)工序，制造注塑成形用模型，利用注塑成形法得到具有下述形状的PMMA制基板。另外，本实施例中使用的PMMA的平均分子量为15万，在PMMA中按1重量％的比例含有炭黑(三菱化学制#3050B)，基板为黑色。测定上述黑色基板的光谱反射率和光谱透射比时，光谱反射率在可见光区域(波长为400nm～800nm)的任一波长下均为5％或5％以下，另外，同范围的波长下，透射率为0.5％或0.5％以下。光谱反射率、光谱透射比在可见光区域中均不具有特定的光谱图案(峰等)，光谱一律平坦。另外，光谱反射率使用搭载了符合JIS Z 8722的条件C的照明·受光光学体系的装置(美能达照相机制，CM-2002)，测定载体发出的正反射光时的光谱反射率。
基板形状的大小为纵76mm、横26mm、厚度1mm，除了基板的中央部分外，表面平坦。在基板中央，设置直径10mm、深度为0.2mm的凹陷部分，在凹陷之中，设置64(8×8)个最上部的直径为0.2mm、高度为0.2mm的凸部。需要说明的是凸部的最低部(凸部的基部)直径为0.23mm，凸部制成锥形，以使注塑成形后的基板容易脱模。测定凹凸部分的凸部上表面的高度(64个凸部的高度的平均值)与平坦部分的高度差时，结果为3μm或3μm以下。另外，测定64个凸部上表面的高度不均(最高的凸部上表面的高度和最低的凸部上表面的高度差)、以及凸部上表面的高度的平均值和平坦部上表面的高度差时，结果分别为3μm或3μm以下。而且，凹凸部的凸部间距(从凸部中央部至相邻的凸部中央部的距离)为0.6mm。
将上述PMMA基板在10N的氢氧化钠水溶液中、65℃下浸渍12小时。将其依次用纯水、0.1N的HCl水溶液、纯水进行洗涤，在基板表面生成羧基。另外，使用Axon Instruments社的GenePix 4000B，在激发波长为532nm、光电倍增管的设定增益为700、激光功率为33％的条件下测定本实施例中使用的带有炭黑的PMMA平板时，该板的自身荧光强度为250。
(探针DNA的固定化)然后，合成序列编号2(60碱基，5’末端氨基化)的DNA。上述DNA的5’末端被氨基化。将上述DNA溶解在纯水中，使其浓度为0.27nmol/μl，制成贮存液。在基板上点样时，用PBS(pH5.5)，使探针的最终浓度为0.027nmol/μl，并且为了使载体表面的羧基与探针DNA末端的氨基缩合，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，使最终浓度为50mg/ml。然后，用玻璃制移液管吸取上述混合溶液，在显微镜下，将上述探针DNA点样在PMMA基板的凸部上的4部位。然后，将上述基板置于密闭的塑料容器中，在37℃、湿度100％的条件下培养20小时左右，然后用纯水进行洗涤。
(检体DNA的调整)与实施例1同样地进行。
(杂交)取出10μl在上述“检体DNA的调整”阶段中调整后的DNA溶液，在其中添加30μl的1重量体积％BSA、5×SSC、0.1重量体积％SDS、0.01重量体积％鲑精子DNA溶液，使总量为40μl(即，与实施例1或2相比，检体的浓度为1/4，检体总量与实施例1相同)。然后，将其滴加在固定了上述DNA的载体的凹凸部分，谨慎地覆盖盖玻片。然后，用纸带将盖玻片的周围密封，使杂交溶液不会干燥。即，使检体DNA的分子量与实施例1或比较例1相同。将其放入塑料容器，在湿度100％、温度65℃的状态下培养10小时。培养后，剥离盖玻片，进行洗涤、干燥。
(测定)在与实施例1相同的条件下，用扫描仪进行荧光测定。其结果如表4所示。
表4

由此可知，荧光强度与实施例2大致相同，噪声远低于实施例2。
实施例7然后，在凸部的高度不均的情况下进行实验。用砂纸研磨实施例6中使用的PMMA的注塑成形品的凸部，在凸部上表面设置高度差。即，分别制作存在比其他凸部上表面(作为基准的凸部)低30μm的凸部(4个部位)的载体(载体A)、存在比其他凸部上表面低50μm的凸部(4个部位)的载体(载体B)。需要说明的是上述载体的低部以外的凸部(作为基准的凸部)上表面的高度与平坦部分的高度差为3μm或3μm以下。与实施例6同样地调整点样的探针DNA。然后，在作为基准的凸部上表面的4个部位、在较低的凸部上表面的4个部位与实施例6同样地点样探针DNA溶液。再与实施例6同样地调整杂交用DNA、进行杂交，测定也与实施例6同样地进行。作为基准的凸部上表面的荧光强度平均值及其周围噪声的平均值、高度低的凸部上表面的荧光强度平均值及其周围噪声的平均值如表5所示。
表5

由此可知，即使凸部的高度存在不均(50μm或50μm以下)，与比较例相比，也能够获得足够大的S/N。
实施例8就对凸部上表面与平坦部存在差异的情况进行进一步研究。用砂纸研磨实施例6中使用的PMMA的注塑成形品的平坦部，制作平坦部上表面和凸部上表面的高度差为30μm(载体C)、50μm(载体D)的2种载体。即，载体C的凸部高度比平坦部的高度高30μm。与实施例6同样地调整点样的探针DNA、在凸部上表面点样探针DNA溶液、调整杂交用DNA、进行杂交，与实施例6同样地进行测定。需要说明的是在上表面点样DNA溶液的凸部在各基板上存在4个部位。然后，求出点样DNA形成的斑点(4个部位)的荧光强度和其周围的噪声(4个部位)的平均值。其结果如表6所示。
表6

由此可知，即使平坦部上表面和凸部上表面的高度存在差异(50μm或50μm以下)，与比较例相比，能够得到足够大的S/N。
实施例9用铸塑法制作聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸苯酯的平板，将其在10N的氢氧化钠水溶液中、50℃下浸渍10小时。然后，按纯水、0.1N HCl水溶液、纯水的顺序进行洗涤。由此，将板表面的聚合物的侧链水解，生成羧基。
与实施例1同样地进行探针DNA的固定化(其中，固定化的探针DNA仅为60碱基长度)、检体DNA的调整、杂交、测定。其结果如表7所示。
表7

由此可知，与比较例相比能够获得足够大的S/N。
实施例10(DNA固定化载体的制作)制作与实施例6相同的基板。然后，采用溅镀法在上述基板上制作50nm的Ni-Cr(组成为Ni8Cr2)。另外，准备在每10mL氯仿中按1g的比例溶解上述基板(未设置Ni-Cr膜)的粉碎物得到的溶液。然后，采用旋涂法涂布上述溶液，在Ni-Cr膜上制作由黑色的PMMA膜构成的绝缘层。然后，用研磨机除去凸部上表面的绝缘层、Ni-Cr膜后，浸渍在65℃的10N NaOH溶液后，按纯水、0.1N的HCl水溶液、纯水的顺序进行洗涤。然后，与实施例6同样地进行探针DNA的固定化、检体DNA的调整。
(杂交)在盖玻片上蒸镀铬5nm、金100nm。用钎料在其上焊接金线。另外，在预先准备的固定了核酸的载体的凹凸部分加入杂交用溶液50μl，使盖玻片的金面朝向载体的凹凸部分，覆盖上述盖玻片。此时，为了不使载体的金与盖玻片的金发生电短路，在其间插入高度为0.2mm的间隔物。用纸带将盖玻片的周围密封，使杂交溶液不会干燥。
然后，使用金线及市售的银糊料进行连接，使载体的Ni-Cr膜与电源的阳极电导通，将盖玻片的金(金线)连接在电源的阴极上。将其放入65℃的烘箱中培养15分钟。然后，由电源施加1V的电压5分钟后，从烘箱中取出，将盖玻片剥离后进行洗涤、干燥。
其结果为得到与实施例6相同的结果。由此可知，即使缩短杂交时间，也可以通过在凸部的侧面设置电极、施加电场来缩短杂交的时间。
比较例4将以聚丙烯腈为主成分的厚度为1mm的板(三井化学(株)制ZEXLON)裁切成75mm×25mm的大小。将其浸渍在10N NaOH中，在70℃下放置12小时。将其洗涤后，与实施例1同样地进行探针DNA的固定化(探针DNA的碱基长度为60碱基)、与检体DNA的杂交。与实施例1同样地进行测定，结果为自身荧光较强、无法检测检体与探针是否发生杂交。这是由于板本身带有黄色，因此自身荧光非常强。另外，使用Axon Instruments社的GenePix 4000B，在激发波长532nm、光电倍增管的设定增益为700、激光功率为33％的条件下测定碱处理前的平板时，该板的自身荧光强度为30000，非常大。
比较例5使甲基丙烯酸甲酯(MMA)99重量份与甲基丙烯酸1重量份共聚。将其纯化后，溶于溶剂中，采用浸渍法在由PMMA构成的板上制造由上述聚合物构成的膜。省略在碱中浸渍的工序，除此之外，与实施例1同样地在上述膜上固定探针DNA(60碱基长)、与检体DNA杂交，与实施例1同样地进行测定。其结果为信号6000、噪声300。
实施例11使甲基丙烯酸甲酯(MMA)99重量份与甲基丙烯酸1重量份共聚。将其纯化后，溶解在溶剂中，采用浸渍法在PMMA板上制作由上述共聚物构成的膜。在50℃下将其在碱中浸渍10小时，除此之外，与实施例1同样地在上述膜上固定探针DNA(60碱基长)、与检体DNA杂交，与实施例1同样地进行测定。其结果为信号15000、噪声150。推测本实施例优于比较例5的理由为通过进行碱处理，使载体表面的羧基量增加。另外，采用铸塑法制作由甲基丙烯酸甲酯(MMA)99重量份和甲基丙烯酸1重量份共聚而成的聚合物构成的厚度为1mm的板，使用Axon Instruments社的GenePix 4000B，在激发波长532nm、光电倍增管的设定增益为700、激光功率为33％的条件下测定未实施碱处理的平板时，上述板的自身荧光强度为850。
比较例6省略实施例1的碱处理(浸渍在氢氧化钠中的处理)，除此之外，进行同样的实验。此时，未观察到表示杂交的荧光。这是因为如果不用碱处理品或酸进行表面处理，则未充分生成羧基，结果固定化的探针DNA非常少。
产业实用性根据本发明，能够提供一种非特异性检体的吸附少、且杂交效率良好、S/N比良好的固定了选择结合物质的载体。
序列表<110>东丽株式会社<120>选择结合性物质固定化载体<130>TD-04021-PCT<160>8<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>70<212>DNA<213>质粒pKF3<400>1atcgtaaaga acattttgag gcatttcagt cagttgctca atgtacctat aaccagaccg 60ttcatctgga70<210>2<211>60<212>DNA<213>质粒pKF3<400>2acattttgag gcatttcagt cagttgctca atgtacctat aaccagaccg ttcatctgga 60<210>3<211>40<212>DNA<213>质粒pKF3<400>3cagttgctca atgtacctat aaccagaccg ttcatctgga 40<210>4<211>20<212>DNA<213>质粒pKF3
<400>4aaccagaccg ttcatctgga 20<210>5<211>20<212>DNA<213>质粒pKF3<400>5gggcgaagaa gttgtccata 20<210>6<211>20<212>DNA<213>质粒pKF3<400>6gcagagcgag gtatgtaggc 20<210>7<211>2246<212>DNA<213>质粒pKF3<400>7atggcaacag tcaatcagct ggttcgaaag ccgcgagctc gtaaagtggc caaatctaac 60gttccggctc tcgaggcatg cccgtagaag cgtggcatat gcacacgcgt atacactact 120actccgaaga aaccgaattc agcgctgcgc aagctttgcc gcgtacgcct gaccaacggt 180ttcgaggtca cctcatatat aggtggtgaa ggacacaacc tgcaggaaca ctctgttatc 240ctgatcagag gcggccgcgt taaagatctg cccgggatcc ggtaccacac cgtccgcggc 300gctctagact gctccggagt aaaggaccgt cgacaggatc gatcgaaata cggtgtaaaa 360cgtccgaagg cctaatagaa gctagcttgg cactgggcca agctgaattt ctgccattca 420tccgcttatt atcacttatt caggcgtagc accaggcgtt taagggcacc aataactgcc 480ttaaaaaaat tacgccccgc cctgccactc atcgcagtac tgttgtaatt cattaagcat 540tctgccgaca tggaagccat cacagacggc atgatgaacc tgaatcgcca gcggcatcag 600
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<211>968<212>DNA<213>质粒pKF3<400>8gggcgaagaa gttgtccata ttagccacgt ttaaatcaaa actggtgaaa ctcacccagg 60gattggctga gacgaaaaac atattctcaa taaacccttt agggaaatag gccaggtttt 120caccgtaaca cgccacatct tgcgaatata tgtgtagaaa ctgccggaaa tcgtcgtggt 180attcactcca gagcgatgaa aacgtttcag tttgctcatg gaaaacggtg taacaagggt 240gaacactatc ccatatcacc agctcaccgt ctttcattgc catacgaaat tccgtatgag 300cattcatcag gcgggcaaga atgtgaataa aggccggata aaacttgtgc ttatttttct 360ttacggtctt taaaaaggcc gtaatatcca gatgaacggt ctggttatag gtacattgag 420caactgactg aaatgcctca aaatgttctt tacgatgcca ttgggatata tcaacggtgg 480tatatccagt gatttttttc tccattttag cttccttagc tcctgaaaat ctcgataact 540caaaaaatac gcccggtagt gatcttattt cattatggtg aaagttggaa cctcttacgt 600gccgatcaac gtctcatttt cgccaaaagt tggcccaggg cttcccggta tcaacaggga 660caccaggatt tatttattct gcgaagtgat cttccgttcg acggagttcc actgagcgtc 720agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 780ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 840accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct 900tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 960cgctctgc 968
权利要求
1.一种选择结合性物质固定化载体，是固定了选择结合性物质的载体，其特征为，该载体的表面由低自身荧光树脂构成，用碱或酸对所述聚合物的表面进行处理，生成羧基，然后固定选择结合性物质。
2.一种选择结合性物质固定化载体，是在载体表面固定了选择结合性物质的选择结合性物质固定化载体，其特征为，载体表面具有含有用下述通式(1)表示的结构单元的聚合物，在用碱或酸对所述聚合物的表面进行处理后，固定选择结合性物质， 通式(1)的R1、R2、R3表示烷基、芳基或氢原子。
3.如权利要求1或2所述的选择结合性物质固定化载体，其特征为，用碱或酸处理载体表面的聚合物，使通式(1)构成的结构单元的侧链为羧基，使所述羧基和选择结合性物质的官能团结合，由此固定选择结合性物质。
4.如权利要求1或2所述的选择结合性物质固定化载体，其特征为，载体表面的聚合物中通式(1)的结构单元含量占全部单体单元的10％或10％以上。
5.如权利要求1或2所述的选择结合性物质固定化载体，其特征为，利用选择结合性物质的氨基或羟基与载体表面的羧基形成的共价键，将选择结合性物质固定在载体上。
6.如权利要求1或2所述的选择结合性物质固定化载体，其特征为，选择结合性物质为核酸。
7.如权利要求1或2所述的选择结合性物质固定化载体，其特征为，具有通式(1)的结构单元的聚合物为聚甲基丙烯酸甲酯。
8.如权利要求1或2所述的选择结合性物质固定化载体，其特征为，载体表面为黑色。
9.如权利要求8所述的选择结合性物质固定化载体，其特征为，具有通式(1)表示的结构单元的聚合物含有炭黑。
10.如权利要求1或2所述的选择结合性物质固定化载体，其特征为，载体至少具有支持体层和选择结合性物质固定化层，选择结合性物质固定化层表面具有包含所述通式(1)表示的结构单元的聚合物，且选择结合性物质与选择结合性物质固定化层的表面结合。
11.如权利要求10所述的选择结合性物质固定化载体，其特征为，支持体层为玻璃或金属。
12.如权利要求1或2所述的选择结合性物质固定化载体，其特征为，所述载体是固定择结合性物质的载体，在该载体上设置凹凸部，选择结合性物质被固定在凹凸部的多个凸部的上表面。
13.如权利要求12所述的选择结合性物质固定化载体，其特征为，该凹凸部的凸部上表面实质上平坦，固定了选择结合性物质的凸部上表面的高度大致相同。
14.如权利要求12所述的选择结合性物质固定化载体，其特征为，该载体上设置平坦部。
15.如权利要求12所述的选择结合性物质固定化载体，其特征为，固定选择性结合物质的多个凸部内，最高的凸部的高度和最低的凸部的高度差为50μm或50μm以下。
16.如权利要求14所述的选择结合性物质固定化载体，其特征为，凹凸部的凸部上表面的高度与平坦部分的高度差为50μm或50μm以下。
17.如权利要求12所述的选择结合性物质固定化载体，其特征为，载体表面为黑色。
18.如权利要求17所述的选择结合性物质固定化载体，其特征为，具有通式(1)表示的结构单元的聚合物含有炭黑。
19.如权利要求12所述的选择结合性物质固定化载体，其特征为，在凸部的侧面设置导电性材料。
全文摘要
一种选择结合性物质固定化载体，是在载体表面固定了选择结合性物质的选择结合性物质固定化载体，其特征为，载体表面具有聚合物，该聚合物含有占总单体单元的 10％或10％以上的用所述通式(1)表示的结构单元，利用与在载体表面生成的羧基形成的共价键固定选择结合性物质。通式(1)中的R
文档编号B01J19/00GK1839317SQ200480005600
公开日2006年9月27日 申请日期2004年5月18日 优先权日2003年5月19日
发明者剃野邦久, 中村史夫, 信正均 申请人:东丽株式会社