用于二恶英类物质生物检测的重组载体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种重组载体，具体涉及一种用于二恶英类物质生物检测的重组载体以及包含该重组载体的细胞。本发明还涉及所述重组载体和细胞在二恶英类物质生物检测方面的用途。
【专利说明】用于二恶英类物质生物检测的重组载体
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种重组载体，具体涉及一种用于二恶英类物质生物检测的重组载体以及包含该重组载体的细胞。本发明还涉及所述重组载体和细胞在二恶英类物质生物检测方面的用途。
【背景技术】
[0002]二恶英(Dioxin)是持久性有机污染物(POPs)的一种，以其强烈的毒性及对生物体巨大的危害而被称为“世纪之毒”。
[0003]就目前二恶英的检测方法而言，一般来说有两大类方法，即仪器分析法和生物分析法。上世纪90年代美国环境保护局公布的检测二恶英的标准方法US EPA Methodl613和1618界定了用高分辨气相色谱-高分辨质谱(HRGC-HRMS)联机检测二恶英，该方法也被公认为是鉴定和定量二恶英的“黄金标准”方法。这种方法虽然准确，但是成本高，检测周期长，而且需要一定的专业技术人员，因此限制了这种方法的的应用性。
[0004]而生物检测方法普遍具有价格低廉、高通量和便于推广应用等特点，近年来在全球范围内得到了飞速的发展和应用。如果从所使用的检测体系来分类，生物检测方法大致可以分为体内法和体外法两大类。体内法是利用活体动物，比如说小鼠、斑马鱼等等，通过检测其生物学标记物表达的变化或其生理指标的变化来检测二恶英类化合物。虽然任何化合物毒性的最后确定都需要体内法，但这种方法费时费力费钱，并不适合大规模筛查。第二大类，就是体外法。简单的讲就是脱离动物活体，以细胞或者抗体等简单的手段检测二恶英的含量，狭义地讲二恶英的生物分析方法就是指的体外法。在体外法中，又可以根据其基本原理分为两大类:一类是基于二恶英毒性信号通路的，主要包括基于CYPlAl酶活的EROD法、和基于报告基因的CALUX法；另外一类是基于`二恶英抗体酶联免疫反应的，包括酶联免疫测定法(ELISA)、荧光免疫测定法(DELFIA)等。而CALUX是这些生物检测方法中最灵敏的，也是其中具有代表性的检测方法之一。
[0005]CALUX法灵敏度高、通量高、便于操作，已在很多国家和地区得到了实际应用。目前发达国家包括美国、欧盟、日本相继建立和完善了各国自己的基于该方法的标准，例如USEPA Method4435 ；EU Commission Regulation N01883/2006 等等。目前 CALUX 技术的最低检测阈值(MDL)已经可以达到ΙρΜ，而半数效应浓度(EC50)则已经达到20pM，已经达到了仪器分析的灵敏度，显示了其良好的应用价值。
[0006]CALUX法的基本原理是:二恶英进入细胞后与细胞质内的芳香烃受体(AhR)结合并活化该受体，活化的AhR进核并与芳香烃受体核转位蛋白(ARNT)结合，而后AhR = ARNT异源二聚体可以直接充当转录因子结合于一些基因启动子区中的二恶英反应元件(DRE)上从而调控这些基因的表达水平。在这些基因中，CYPlAl是目前公认的二恶英反应标记物。所以将CYPlAl启动子中的富含DRE的区段克隆下来，并插入到小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子的调控区域，最后把这个重组启动子构建于报告基因上游，那么二恶英就可以诱导报告基因的表达了，这就是CALUX法的基本原理。[0007]CALUX使用MMTV作为重组启动子的骨架既有优点又有缺点，优点是MMTV本身是强启动子所以在一定程度上可以放大二恶英反应的信号，缺点是MMTV启动子区域很长，可能还会受到未知其他转录因子的调控，增加了该生物检测系统的不确定性。而且在实际应用中，人们的确发现了利用该系统检测一些环境样品时其报告基因反应值高于饱和浓度二恶英标准品2，3，7,8-四氯二苯并二恶英(IODD)的反应值，这表明一些环境样品中的确存在一些未知的化合物通过活化MMTV区段或其他区段而诱导了报告基因的表达。
[0008]根据二恶英类物质生物检测的现状并结合我国检测设备和水平较落后的具体情况，仍需开发成本低廉、灵敏度高以及克服现有系统缺陷的生物报告检测方法。
【发明内容】
[0009]本发明的发明人经过大量实验，提供了改进的二恶英类化合物生物报告检测载体和细胞，由此完成了本发明。
[0010]本发明第一方面涉及重组载体，所述载体沿着其基因转录的方向可操作地连接有来源于CYPlAl启动子的CYPlAl启动子基本区段和两个或多个二恶英反应元件(DRE)富集区段，以及报告基因；
[0011]所述CYPlAl启动子基本区段和两个或多个二恶英反应元件富集区段调节该报告基因的转录。
[0012]根据本发明第一方面任一项的重组载体，其中所述的CYPlAl启动子为哺乳动物CYPlAl启动子，例如为小鼠、豚鼠或人的CYPlAl启动子。在本发明的实施方案中，所述的CYPlAl启动子为小鼠启动子。
[0013]在本发明的实施方案中，所述启动子基本区段包括启动子核心启动序列和近端启动序列。
[0014]在本发明的实施方案中，所述的二恶英反应元件(DRE)富集区段包含四个二恶英反应元件。
[0015]在本发明中，所述两个或多个二恶英反应元件富集区段是指两个或两个以上，例如 2 — 8 个(例如 2、3、4、5、6、7、8 个)。
[0016]根据本发明第一方面任一项的重组载体，其中所述CYPlAl启动子的基本区段的序列为SEQ ID NO:8所示的序列；和/或所述二恶英反应元件的富集区段的序列为SEQ IDNO:9所示的序列；和/或所述两个或多个二恶英反应元件富集区段的序列为SEQ ID NO:15所示的序列。
[0017]在本发明中，所述CYPlAl启动子的基本区段和所述二恶英反应元件的富集区段之间或者两个或多个二恶英反应元件富集区段之间的连接方式为本领域所公知，例如可以通过linker或酶切位点连接。在本发明的实施方案中,所述二恶英反应元件的富集区段位于CYPlAl启动子的基本区段的上游方向。
[0018]根据本发 明第一方面任一项的重组载体，其中所述CYPlAl启动子的基本区段和两个或多个二恶英反应元件(DRE)的富集区段的序列为SEQ ID N0:16所示的序列。
[0019]根据本发明第一方面任一项的重组载体，其中所述的报告基因为萤火虫荧光素酶基因。
[0020]根据本发明第一方面任一项的重组载体，所述载体含有萤火虫荧光素酶基因。[0021]根据本发明第一方面任一项的重组载体，其是在pGL系列载体的萤火虫荧光素酶基因的上游可操作地连接有所述CYPlAl启动子的基本区段和两个或多个二恶英反应元件(DRE)的富集区段。
[0022]在本发明的实施方案中，其是在多克隆位点连接有所述CYPlAl启动子的基本区段和两个或多个二恶英反应元件(DRE)的富集区段。
[0023]根据本发明第一方面任一项的重组载体，其中所述的pGL系列载体为pGL2、pGL3、pGL4 或 pGL6。
[0024]在本发明的实施方案中，所述pGL系列载体为pGL3系列载体。在本发明的实施方案中，所述pGL系列载体为pGL3 — basic载体。
[0025]在本发明的实施方案中，所述重组载体为pCL-CR2。
[0026]本发明第二方面涉及重组细胞，其含有本发明第一方面任一项的重组载体。
[0027]根据本发明第二方面任一项的重组细胞，所述细胞为哺乳动物细胞。
[0028]根据本发明第二方面任一项的重组细胞，其为重组肝源细胞，例如为重组肝癌细胞(例如!fepal、HePG2、SMMC-7721、BEL-7402, QGY-7701)，例如为重组!fepal 细胞。
[0029]在本发明中，所述肝源细胞是指来源于肝实质的细胞。
[0030]本发明第三方面涉及本发明第一方面任一项的重组载体或第二方面任一项的重组细胞用于二恶英类化合物生物检测的用途。
[0031]本发明第四方面涉及一种二恶英类化合物生物检测方法，所述方法使用本发明第一方面任一项的重组载体或第二方面任一项的重组细胞的步骤。
[0032]根据本发明第三方面任一项的用途或者第四方面任一项的方法，其中所述的二恶英类化合物选自多氯二苯并二恶英(P⑶Ds)(例如2，3，7,8-四氯二苯并二恶英)、多氯二苯并呋喃(P⑶Fs)、多氯联苯(PCBs)、卤代芳香烃(HAHs)、多环芳香烃(PAHs)、氯代二苯醚和氯代萘，以及除以上氯代化合物外的溴代(PBDD/Fs和PBBs)及其它混合卤代化合物。
[0033]发明的有益效果
[0034]本发明采用CYPlAl的基础启动子与多个DRE富集区段连接作为荧光素酶报告基因的启动子，构建了二恶英类物质生物检测的重组载体，大大提高了二恶英类物质的检测灵敏度，达到了 0.ΙρΜ；
[0035]由于该启动子未添加任何外源基因，更有利于二恶英类物质与二恶英反应元件的特异性结合，以尽可能模拟二恶英类物质暴露的真实情况；
[0036]同时，该组合启动子的长度较短，并且具有很高的灵敏度，因此在保证检测灵敏度的同时可以降低非特异性序列与二恶英类物质的结合，从另一方面也提高了检测特异性；
[0037]并且，在相同处理及仪器检测条件下，荧光检测强度(RLU)较目前常用的生物检测载体提高了一个数量级，这样可以降低对酶标仪检测参数的要求，进而降低检测成本，为实现检测方法的大范围推广提供了更加有利的条件。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]图1为pCL-CR2构建示意图；
[0039]图2为pCL-CRl、pCL-FL和pGL6.1对T⑶D的反应，其中左侧纵坐标为荧光强度，其单位为RLU，即相对发光值，右侧纵坐标为荧光素酶水平相对于溶剂对照的倍数；[0040]图3 为 pCL-CR2 与 pGL6.l、pCL_FL、pCL_CRl 瞬转 H印al 后对 TCDD 的反应，纵坐标为荧光强度，其单位为RLU，即相对发光值；
[0041]图4 为 pGL6.UpCL-FL, pCL-CRl 与 pCL_CR2 对 InM TCDD 刺激 4 小时的反应；
[0042]图5为pCL-CR2对梯度浓度T⑶D的反应。
[0043]图6为pCL-CRl对梯度浓度T⑶D的反应。
[0044]图7为pCL-FL对梯度浓度T⑶D的反应。
【具体实施方式】
[0045]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0046]本发明中使用的缩写，具有以下含义:AhR，芳基烃受体;ARNT，芳基烃受体核转蛋白；TCDD，2，3，7,8-四氯二苯并_p_ 二恶英；TCDF，2，3，7，8-四氯二苯并呋喃；PeCDF，2，3，4，7，8-五氯二苯并呋喃；DRE，二恶英反应元件；POTDS，多氯代二苯并-对-二恶英；P⑶Fs,，多氯代二苯并呋喃；PCBs，多氯联苯；DLCs，二恶英类化合物。
[0047]其中Hepal 细胞也叫 Hepalclc7 细胞，Michael S.Denison 赠，参见 Garrison, P.M., Tullis, K., Aarts, J.Μ.M.J.G., Brouwer, A., Giesy, J.P., andDenison, M.S.(1996).Species-specific recombinant cell lines as bioassay systems for thedetection of2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-like chemicals.Fund.App1.Toxicol.30, 194 - 203.[0048]pGL6.1,也叫 pGudLuc6.1,Michael S.Deni son 赠，参见 Han, D._H.，Nagy, S.R.，andDenison, M.S.(2004).Comparison of recombinant cell bioassays for the detectionof Ah receptor agonists.Biofactors20, 11 - 22.[0049]pGL3_basic 购自 Promega。
[0050]实施例1
[0051 ] 小鼠基因组DNA来自于肝癌细胞Ifepal细胞，按照试剂盒标准方法抽提。
[0052]1.pCL-FL质粒的构建
[0053]小鼠基因组DNA来自于Ifepal细胞，按照试剂盒标准方法抽提。并通过标准的分子克隆手段分别构建获得PCL-FL。
[0054]本实验的目的是构建获得包括小鼠CYPlAl启动子(-1400~+3)原始序列的二恶英报告基因检测质粒，该序列包含6个DRE序列。以小鼠基因组DNA为模板，用以下引物进行PCR反应。
[0055]5’ 引物为:5’ -CACGCTCGAGAACAGGTTGAGTTAGAC-3，(SEQ ID NO:1)
[0056]3，引物为:5，-CACGAAGCTTCAGGGTTAGGGTGAAG-3，(SEQ ID NO:2)
[0057]获得PCR片段后，以Xho I和Hind III双酶切，并对载体质粒pGL3_basic进行同样的双酶切，最后将该片段构建入pGL3-basic中。最后经酶切测序鉴定后，获得pCL-FL质粒。
[0058]其中启动子的序列为:
[0059]AACAGGTTGAGTTAGACACGCCAAGTTCAGATGTTCTTCTTACACTAATCTCACTCTGGGAGCACCCTT
【权利要求】
1.重组载体，所述载体沿着其基因转录的方向可操作地连接有来源于CYPlAl启动子的CYPlAl启动子基本区段和两个或多个二恶英反应元件(DRE)富集区段，以及报告基因； 所述CYPlAl启动子基本区段和两个或多个二恶英反应元件富集区段调节该报告基因的转录。
2.权利要求1的重组载体，其中所述的CYPlAl启动子为哺乳动物CYPlAl启动子，例如为小鼠CYPlAl启动子。
3.权利要求1的重组载体，其中所述CYPlAl启动子的基本区段的序列为SEQID NO:8所示的序列；和/或所述二恶英反应元件的富集区段的序列为SEQ ID NO:9所示的序列；和/或所述两个或多个二恶英反应元件富集区段的序列为SEQ ID N0:15所示的序列。
4.权利要求1的重组载体，其中所述CYPlAl启动子的基本区段和两个或多个二恶英反应元件(DRE)的富集区段的序列为SEQ ID N0:16所示的序列。
5.权利要求1的重组载体，其中所述的报告基因为萤火虫荧光素酶基因。
6.权利要求1-5任一项的重组载体,其是在pGL系列载体的萤火虫突光素酶基因的上游可操作地连接有所述CYPlAl启动子的基本区段和两个或多个二恶英反应元件(DRE)的富集区段。
7.权利要求6的重组载体，其中所述的pGL系列载体为pGL2、pGL3、pGL4或pGL6，优选地，所述重组载体为PCL-CR2。
8.重组细胞，其含有权利要求1-7任一项的重组载体。
9.权利要求8的重组细胞,其为为重组肝源细胞,例如为重组肝癌细胞,例如为重组Hepal细胞。
10.权利要求1-7任一项的重组载体或权利要求8或9的重组细胞用于二恶英类化合物生物检测的用途。
11.一种二恶英类化合物生物检测方法，所述方法使用权利要求1-7任一项的重组载体或权利要求8或9的重组细胞的步骤。
12.权利要求10的用途或者权利要求11的方法，其中所述的二恶英类化合物选自多氯二苯并二恶英(P⑶Ds)(例如2，3，7，8-四氯二苯并二恶英)、多氯二苯并呋喃(P⑶Fs)、多氯联苯(PCBs)、卤代芳香烃(HAHs)、多环芳香烃(PAHs)、氯代二苯醚和氯代萘，以及除以上氯代化合物外的溴代(PBDD/Fs和PBBs)及其它混合卤代化合物。
【文档编号】C12N5/10GK103820495SQ201410099507
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月18日 优先权日:2014年3月18日
【发明者】赵斌, 裴新辉, 谢群慧 申请人:中国科学院生态环境研究中心