一种利用表面固定化技术反复批次发酵生产d-乳酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用表面固定化技术反复批次发酵生产D-乳酸的方法，其步骤包括：固定化反应体系的构建、固定化过程和反复批次发酵过程。表面固定化技术利用纤维材料作为固定化载体，具有高空隙率和比表面积的特点，改进了纤维材料的固定方式，提高细胞密度、提高发酵速率的同时还可以避免普通固定化技术的传质问题。反复批次发酵技术可以种子培育的时间，极大地节省了种子培养的时间和劳动力。表面固定化技术与反复批次发酵技术的结合使每一批次结束后不需要保留发酵液作为下一批次的种子液，而是可以直接利用纤维材料固定的菌体直接进行发酵，进一步简化了工艺操作，保证了长期发酵的稳定性。
【专利说明】ー种利用表面固定化技术反复批次发酵生产D-乳酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物化工【技术领域】，具体涉及ー种利用表面固定化技术反复批次发酵生产D-乳酸的方法。
【背景技术】
[0002]D-乳酸是合成多种手性物质的前体，在高分子材料、农药和化工等方面的应用十分广泛。D-乳酸最主要的功能是可以用于合成聚乳酸的前体，聚乳酸具有与聚苯乙烯相似的光泽度和加工性能。由聚乳酸制成的产品具有很好的生物相容性，可以用于制作骨内固定物、手术缝合线和药物控释载体等医用材料；还可以替代聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯等材料生产新型环保包装材料。
[0003]目前发酵法是生产乳酸的主要方法，但高纯度D-乳酸的生产规模相对较小，传统的游离细胞发酵方式有ー些不足。一方面，发酵过程大都为钙盐法中和乳酸，即采用定期添加碳酸钙作为中和剂控制PH，而且是采用发酵开始预加过量的方式，会给后续分离提取中的活性炭和纳滤膜带来很大压力。因为乳酸钙溶液中含有少量的残糖和氨基酸，在分离的沉降絮凝时会发生美拉德反应，生成水溶性黑精，使乳酸钙溶液呈黄褐色，极难去除。另ー方面，传统游离细胞的分批发酵的细胞浓度低、周期长、底物转化率低、产酸率不高。同吋，初始底物浓度过高，培养基灭菌后抑制菌体生长，从而使生产成本升高。
[0004]近年来越来越多的人将固定化技术应用于乳酸发酵。传统的固定化方法主要存在传质问题，到发酵后期会造成死细胞大量累积影响发酵速率。美国俄亥俄州立大学的杨尚天教授等人于1992年发明了ー种新型的细胞固定化反应器——纤维床生物反应器用于固定化发酵，主要是使菌体吸附于载体表面形成高密度培养，但固定化载体单一，主要以棉织物为主，现阶段应用范围小而且仅限于实验室规模的操作，目前还没有将该固定化技术应用于D-乳酸的文献报道。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供ー种表面固定化技术，将之与反复批次发酵技术相结合应用于D-乳酸的发酵生产上。表面固定化技术以纤维材料作为固定化载体将菌体吸附于表面，通过高密度的培养提高发酵速率，并通过反复批次发酵的方式得到高浓度的D-乳酸。这是ー种发酵效率高、底物转化率高、长期发酵稳定性好的D-乳酸发酵方法。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:
[0007]—种利用表面固定化技术反复批次发酵生产D-乳酸的方法，它包括以下步骤:
[0008](1)固定化反应体系的构建:将纤维材料固定在不锈钢支架上放入带夹套的不锈钢柱中构建固定化反应器，固定化反应器通过循环管路与发酵罐相连通发酵罐的调控系统和循环管路保证固定化反应器的液体混匀以及调控反应器的PH，并且在固定化反应器的夹套内通过蠕动泵循环通入由恒温水浴锅控温的水以控制反应器的温度；[0009](2)固定化过程:将培养至对数期的芽孢乳杆菌种子液接入发酵罐中，接种量5~15 (v/v) %，发酵罐通入0.1~lL/mL的氮气，培养温度30~50°C，搅拌速度20~150rpm，并流加液体碱性物质将发酵罐内PH值控制在5.5~7.0，培养12~60h至菌悬液OD66tl达到6.0后，再通过蠕动泵将发酵罐中的培养基打入固定化反应器中，将循环流速设置为30~100mL/min,在固定化反应器内开始菌体的固定化过程，固定化过程维持在24~96h ；
[0010](3)反复批次发酵过程:固定化过程结束以后将发酵罐和固定化反应器中的培养基泵出，之后泵入新鲜的发酵培养基开始反复批次发酵过程，进行3~8个批次的发酵。
[0011]其中，所述的纤维材料是用于固定菌体的固定化介质，具体可以为经过农业秸杆、甘蔗渣、玉米芯、棉纤维、麻纤维、竹纤维、无纺布、静电纺丝、活性炭纤维、聚乙烯醇纤維和聚砜纤维中的任意ー种。当纤维材料使用农业秸杆中的玉米秸杆时，需要对玉米秸杆进行改性处理，主要通过蒸汽爆破处理改变其结构，使其表面出现褶皱，结构变的蓬松，比表面积増大。
[0012]其中，对于无纺布、棉纤维、竹炭纤维这样的长纤维材料，可以将其缠绕不锈钢支架外围ー圈进行固定；对于甘蔗渣、玉米芯、秸杆这样的短纤维材料，可以将其填充在不锈钢支架网内。
[0013]其中，所述的不锈钢支架是在ー根不锈钢管上360度错落焊接带有小孔的不锈钢鉄片(如图1所示)，或者是将三个不锈钢丝网槽焊接在四根细不锈钢管上并附有可拆卸的不锈钢丝网盖子(如图2所示)。
[0014]其中，在批次发酵的过程中，每ー批次可以采用单批补料发酵、补料分批发酵、和同步糖化发酵方式中的任意ー种。
[0015]其中，所述液体碱性物质选自NaOH水溶液、NH4OH水溶液、Na2CO3水溶液、NaHCO3水溶液和KOH水溶液中的任意ー种或几种。
[0016]其中，芽孢乳杆菌种子液接入发酵罐之前一般需要经过平板培养和种子培养的过程。
[0017]平板培养:将冻存保藏的菌株接种到平板培养基上，厌氧箱中30~50°C静置培养24~72h活化。
[0018]种子培养:从活化的平板挑取菌体接入50~100ml种子培养基中，30~50°C下静置培养12~60h形成一级种子液。再将ー级种子液转接于装有500ml种子培养基中，接种量5%~15%，30~50°C下静置培养12~60h形成二级种子液。
[0019]优选地，所述初始平板培养基、种子培养基和发酵培养基中含有碳源、氮源和无机盐等其他成分。
[0020]优选地，所述碳源选自淀粉、洋姜、木薯、葡萄糖、果糖、蔗糖、菊糖、麦芽糖和甘露糖中的ー种或几种；更优选地，所述碳源的初始浓度为0.01~250g/L，优选为30~200g/
し
[0021]优选地，所述氮源选自酵母粉、酵母膏、玉米浆、蛋白胨、尿素、硫酸铵中的ー种或几种；更优选地，所述氮源的初始浓度为0.01~100g/L，优选为I~20g/L。
[0022]优选地，所述无机盐选自磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐中的ー种或几种；更优选地，所述无机盐的初始浓度为0.001~100g/L，优选为0.01~10g/L。
[0023]优选地，所述初始种子培养基中含有こ酸盐，其中こ酸盐选自こ酸钠、こ酸铵和こ酸钾的ー种或几种；更优选地，所述こ酸盐的初始浓度为0.01~100g/L，优选为I~IOg/
し
[0024]优选地，所述金属离子选自钾离子、纳离子、亚铁离子、锰离子、镁离子、钙离子、锌离子中的ー种或几种；更优选地，所述无机盐的初始浓度为0.001~100g/L，优选为0.01 ~10g/L。
[0025]其中，所述方法中反复批次发酵方式是当第一批发酵达到末期时，移除发酵液并且补入新鮮的培养基，固定化反应器中的纤维材料固定的菌体即作为第二批的发酵的种子，而当第二批发酵进行到末期，再移除发酵液补入新鮮培养基进行第三批的发酵，如此反复批次发酵得到高浓度D-乳酸的发酵液。
[0026]有益效果:本发明具有如下优势:
[0027]I)不利用碳酸钙作为中和剂，而是通过中间流加氨水等液体碱性物质，中和不断产生的乳酸，維持发酵所需要的适宜酸度，避免了在发酵结束时会形成高浓度的乳酸钙固体，从而给后续分离提取中的活性炭和纳滤膜带来很大压力，造成下罐困难，清洗、取样不便。同时利用氨水作为中和剂在后期分离中产生的NH4SO4有较高的经济利用价值，可以提高D-乳酸生产链的经济效益。
[0028]2)固定化反应器中细胞吸附于纤维材料表面，很大程度上提高了细胞密度，而纤维材料作为固定化载体具有高空隙率和比表面积的特点，使其传质效率明显高于传统固定化方式，可以有效避免固定化后期堵塞的问题。
[0029]3)改进优化了纤维材料的固定方式，避开传统的铁丝网+纤维+铁丝网三明治形式的固定方式，将纤维材料直接缝接在特定的支架上或者是填充在分三层设计的钢丝网槽中，增加了发酵液中的菌体与纤维材料的接触面积，利于发酵液中的菌体更好地吸附在纤维材料上。`
[0030]4)在反复批次过程中，通过分批补料和同步糖化发酵控制较低浓度的碳源，可以减小底物抑制，提高底物利用率和发酵效率。
[0031]5)在反复批次发酵的过程中，上一批次发酵过程中纤维床反应器固定菌体可以直接作为下ー批次发酵的种子，略去了种子培育的时间，极大地节省了种子培养的时间和劳动力。
[0032]6)利用表面固定化技术进行反复批次发酵的特点在于每ー批次结束后不需要保留发酵液作为下ー批次的种子液，而是直接利用纤维材料固定的菌体直接进行发酵。
[0033]7)本发明的单批发酵与传统的单批游离细胞发酵相比，发酵速率提高了 0.58~0.96g/L/h，发酵时间由144~168h缩短至72~96h，产物得率(乳酸产量/葡萄糖消耗)提高了 1.74% ~10.32%(w/w)。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1是将纤维材料固定于不锈钢支架构成细胞固定化载体的ー种方式的示意图。
[0035]图2是将纤维材料固定于不锈钢支架构成细胞固定化载体的另ー种方式的示意图。
[0036]图1是在ー根不锈钢管上360度错落焊接带有小孔的不锈钢鉄片，将纤维材料如无纺布、棉纤维、竹炭纤维等是通过小孔绕ー圈缝接在不锈钢支架上；图2是将三个不锈钢丝网槽焊接在四根细不锈钢管上并附有不锈钢丝网盖子，将纤维材料如玉米芯、秸杆颗粒、甘蔗渣等填充在分三层的不锈钢网槽内。
[0037]图3为固定化反应器系统发酵生产D-乳酸的示意图。
[0038]图1、图2和图3中，I表示不锈钢支架；2表示不锈钢铁片上的小孔；3表示纤维材料；4表示焊有网槽的不锈钢支架；5表示可拆卸的不锈钢丝网盖子；6表示恒温水浴锅；7表不固定化反应器(内有固定化载体)；8表不发酵罐；9表不发酵罐控制箱；10表不磁力搅拌桨表示pH电极；12表示温度电极；13表示碱液瓶；14表示补料瓶；15表示氮气入ロ ；16表示尾气出ロ ；17表示蠕动泵；18表示蠕动泵。
【具体实施方式】
[0039]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0040]以下各实施例中的分析方法如下:
[0041](I)生物量的测定:
[0042]将发酵液样品稀释，用752分光光度计于660nm处测量其吸光度，其吸光度OD66。与每升的细胞干重(DW/L)的转化值为:IOD66tl=0.392g DW/L。
[0043](2)乳酸和葡萄糖含量的测定:
[0044]将各发酵液样品进行离心，测定菌体干重，取上清稀释后，采用AgilentllOO高效液相色谱仪测定D-乳酸含量(HPLC)。色谱柱为Bio-Rad公司的Aminex HPX-87H ionexclusion column (300 X 7.8mm)，柱温25°C，检测器为示差检测器，流动相为5mM的H2SO4水溶液；流速0.6mL/min ;进样量:20uLo
[0045](3) D-乳酸光学纯度测定:
[0046]手性分离柱Sumichiral 0A-5000C150X4.6mm 1.D., Sumika chemical AnalysisService, Osaka, /Japan), 2mmol/L硫酸铜作为流动相,流速:lml/min,紫外检测器,检测波长:254nm,操作温度:50°C, D-乳酸标品购Sigma-Aldrich公司。
[0047]实施例1:
[0048]本实施例以玉米淀粉为原料，采用同步糖化发酵的补料形式进行固定化反复批次发酵，方法步骤如下:
[0049]平板培养基(g/L):葡萄糖80g/L，酵母膏8g/L，无水こ酸钠2g/L，无水硫酸镁
0.8g/L，KH2P042g/L，硫酸亚铁0.lg/L，硫酸锰0.1 g/L ;种子培养基(g/L):葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，无水硫酸镁0.4g/L，硫酸亚铁0.lg/L，硫酸锰0.lg/L, CaC0320g/L ；
[0050]发酵培养基(g/L):玉米淀粉150g/L,酵母膏6.5g/L,无水硫酸镁0.8g/L,无水こ酸钠4g/L,硫酸亚铁0.lg/L,硫酸猛0.lg/L。
[0051]I)平板培养:将冻存保藏的菌株接种到平板培养基上，厌氧箱中35°C静置培养60h活化。
[0052]2)种子培养:从活化的平 板挑取菌体接入60ml种子培养基中，35°C下静置培养48h形成一级种子液。再将ー级种子液转接于装有500ml种子培养基中，接种量8%，35°C下静置培养48h形成二级种子液。[0053]3)固定化反复批次发酵:
[0054]①固定化反应体系的构建:将麻纤维3固定在不锈钢支架I外围(如图1所示)放入带夹套的不锈钢柱中构建固定化反应器7，固定化反应器通过循环管路与发酵罐8相连(如图3所示)，发酵罐的调控系统9和循环管路保证固定化反应器的液体混匀以及调控反应器的PH，并且在固定化反应器的夹套内通过蠕动泵18循环通入由恒温水浴锅控温6的水以控制反应器的温度。
[0055]②发酵培养基的预处理:将玉米淀粉用液化酶90°C液化SOmin后加入糖化酶以及灭过菌的其他发酵培养基成分，打入发酵罐。
[0056]③固定化过程:将培养至对数期(培养时间36h)的种子液接入装有发酵培养基的发酵罐，接种量10%，发酵罐内的工作体积为4L，通入0.3L/mL的氮气保持反应器中的厌氧环境，培养温度35°C，搅拌速度lOOrpm，并流加NaOH将pH控制在6.0，培养28h至菌悬液吸光度(OD66tl)达到6.0左右，通过蠕动泵17将发酵罐中的培养基打入固定化反应器，将循环流速设置为30mL/min，在FBB反应器内开始菌体的固定化过程，这个过程进行60h。
[0057]④反复批次发酵过程:固定化过程结束之后将发酵罐和固定化反应器中的培养基泵出，通过蠕动泵将含有新鲜发酵培养基打入发酵罐，然后开启循环管路的蠕动泵，将循环流速设置为80mL/min,利用固定化反应器内麻纤维固定的菌体发酵生产D-乳酸，当残糖浓度低于10g/L时，放出发酵罐和固定化反应器内的料液(保留麻纤维)，然后将新鮮的发酵培养基通过蠕动泵打入发酵罐并且通过循环管路与固定化反应器接通，开始反复批次发酵的第二批发酵，共进行了 3个批次的发酵。HPLC检测结果见表1。
[0058]表1
[0059]
【权利要求】
1.ー种利用表面固定化技术反复批次发酵生产D-乳酸的方法，其特征在于，它包括以下步骤: (1)固定化反应体系的构建:将纤维材料固定在不锈钢支架上放入带夹套的不锈钢柱中构建固定化反应器，固定化反应器通过循环管路与发酵罐相连通； (2)固定化过程:将培养至对数期的芽孢乳杆菌种子液接入发酵罐中，接种量5~15 (v/v) %，发酵罐通入0.1~lL/mL的氮气，培养温度30~50°C，搅拌速度20~150rpm，并流加液体碱性物质将发酵罐内PH值控制在5.5~7.0，培养12~60h至菌悬液OD66tl达到6.0后，再通过蠕动泵将发酵罐中的培养基打入固定化反应器中，将循环流速设置为30~100mL/min,在固定化反应器内开始菌体的固定化过程，固定化过程维持在24~96h ； (3)反复批次发酵过程:固定化过程结束以后将发酵罐和固定化反应器中的培养基泵出，之后泵入新鲜的发酵培养基开始反复批次发酵过程，进行3~8个批次的发酵。
2.根据权利要求1所述的利用表面固定化技术反复批次发酵生产D-乳酸的方法，其特征在于，所述的纤维材料为农业秸杆、甘蔗渣、玉米芯、棉纤维、麻纤维、竹纤维、无纺布、静电纺丝、活性炭纤维、聚乙烯醇纤维和聚砜纤维中的任意ー种。
3.根据权利要求1所述的利用表面固定化技术反复批次发酵生产D-乳酸的方法，其特征在于，对于无纺布、棉纤维、竹炭纤维这样的长纤维材料，可以将其缠绕不锈钢支架外围一圈进行固定；对于甘蔗渣、玉米芯、秸杆这样的短纤维材料，可以将其填充在不锈钢支架网内。
4.根据权利要求1或3所述的利用表面固定化技术反复批次发酵生产D-乳酸的方法，其特征在干，所述的不锈钢支架是在ー根不锈钢管上360度错落焊接带有小孔的不锈钢铁片，或者是将三个不锈钢丝网槽焊接在四根细不锈钢管上并附有可拆卸的不锈钢丝网盖子。`
5.根据权利要求1所述的利用表面固定化技术反复批次发酵生产D-乳酸的方法，其特征在于，在批次发酵的过程中，每ー批次可以采用单批补料发酵、补料分批发酵、和同步糖化发酵方式中的任意ー种。
6.根据权利要求1所述的利用表面固定化技术反复批次发酵生产D-乳酸的方法，其特征在于，所述液体碱性物质选自NaOH水溶液、NH4OH水溶液、Na2CO3水溶液、NaHCO3水溶液和KOH水溶液中的任意ー种或几种。
【文档编号】C12P7/56GK103555776SQ201310530636
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月31日 优先权日:2013年10月31日
【发明者】应汉杰, 陈勇, 赵婷, 柳东, 任恒飞, 施欣驰, 赵南, 陈小春, 吴菁岚, 庄伟
申请人:南京工业大学