专利名称：具有植酸酶活性的多肽和编码多肽的核苷酸序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码具有植酸酶活性多肽的重组DNA分子以及这样编码的多肽。具体地，本发明涉及编码具有植酸酶活性多肽的重组DNA分子，其中所述DNA序列通过成熟的大肠杆菌野生型植酸酶的变异获得，与野生型序列相比，其中指定的氨基酸位置发生修饰。而且，本发明涉及重组植酸酶的表达及其在食品和饲料技术中的用途。
背景技术：
植酸或肌醇-1，2，3，4，5，6-六磷酸二氢酯(缩写为肌醇六磷酸)是植物种子中肌醇的主要来源，并且是磷酸的主要储存形式。在豆类种子中约70％的磷酸含量是以植酸的混合钾盐、镁盐和钙盐形式存在。谷类和豆类植物的种子是食品和饲料制品，特别是动物饲料制品的重要组分。而且谷类和豆类在人类营养方面也越来越重要。
植酸的磷酸单元能结合络和的二价和三价阳离子如金属离子，即营养生理上重要的离子，如钙、铁、锌和镁，以及微量元素，如锰、铜、和钼。除此之外，植酸也通过一定程度的静电作用结合蛋白质。
植酸及其盐肌醇六磷酸盐通常不能被新陈代谢，因为它们不能从胃肠道中吸收，即无论是含在其中的磷、螯合的金属离子还是结合的蛋白质都不是营养生理上可利用的。
由于磷是所有生物体生长的必须元素，因此食品和饲料中必须补加无机磷。营养生理上的必须离子，如铁和钙，也经常需要补充。而且，由于蛋白质被植酸结合，使任何食物的生理营养值减少。因此，植酸经常用来指营养价值的反面指示因子(“Anti-Nhrwertfaktor”)。
而且，由于没有新陈代谢，肌醇六磷酸中的磷通过动物的胃肠道而排泄，这导致不受欢迎的环境磷污染，如可以导致水体富营养化以及藻类的过度生长。
植酸或肌醇六磷酸(除非另有说明，在下面的叙述中这两个术语的意思相同)可以被植酸酶降解。含植酸的植物种子中含有内源性的植酸酶。一经吸收，食物和饲料中的肌醇六磷酸理论上是可以被内源植物植酸酶、肠菌群植酸酶和肠粘膜植酸酶水解。但是，实际上，内源性植物植酸酶和肠中存在的植酸酶的水解潜能，如果有的话，远远不足以显著地确保肌醇六磷酸中结合的磷的生物利用度。因此经常在食品和饲料中补加外源植酸酶。
不仅微生物而且植物都可以产生植酸酶。在微生物中，不仅产植酸酶的真菌和酵母而且产植酸酶的细菌都已公知。
但是，天然存在的植酸酶生产者存在不足植酸酶仅以固定量产生，而且具有有限的特性。但是，正如前面所阐述的那样，对植酸酶的需求，特别是在食品和饲料工业中的需求，越来越多。
发明概述因此，本发明的目的是提供能够经济生产的具有植酸酶活性的多肽。特别是，将有可能有成本效益地生产植酸酶。植酸酶将继续维持天然大肠杆菌野生型植酸酶的基本特性，但将与之有别，分别是培养上清中活性的升高和分泌能力的改善。特别是，在天然野生型植酸酶的基本特性方面，有价值的除了作为烘焙助剂的适宜性，还有改进体内和体外的磷利用度的能力。
本发明的另一个目的是提供植酸酶活性多肽的基因，该基因在宿主细胞中表达时，分别导致在培养上清中所编码蛋白质的活性增加和多肽的分泌提高。生产该多肽将有可能是经济的、有成本效益的。特别是，与野生型植酸酶的表达相比，该多肽在真核微生物中的表达将导致产率提高。而且，还将提供编码多肽的DNA的序列、相应的DNA构建体、载体以及适用于食品和饲料商业应用以及工业加工的重组酶的来源和含有根据本发明酶的组合物。
现在惊奇地发现，在大肠杆菌野生型植酸酶189到211位氨基酸(包括这两个氨基酸)的区域和/或137到152位氨基酸(包括这两个氨基酸)的区域内突变导致提高整个培养上清中植酸酶蛋白的活性，而不影响大肠杆菌野生型植酸酶的有益作用和基本特性。
大肠杆菌中的几种植酸酶已经有文献披露，如Dassa等人1990，J.Bacteriol.1725497-5500(登录号为M58708)。也有文献披露了大肠杆菌植酸酶的遗传修饰突变体导致提高热稳定性和/或更高比活(Rodriguez等人，2000，Arch.Biochem.Biophys.，382105-112，Lanahan等人，2003，美国专利申请2003 0157646 A1，WO 01/90333)。在专利WO 01/36607中还披露定点诱变的大肠杆菌植酸酶具有改善的酶学特性。但是，WO 01/36607所披露的200位Val-Tyr突变体与本发明的200位突变并不对应，因为在专利WO 01/36607中用的是另一种序列计算方法，即前导序列也计算在内。因此所述出版物(WO 01/36607)中序列的第222位对应着本发明计数序列的第200位。更多的具有植酸酶活性的蛋白质在专利WO 99/08539、WO 01/90333、WO 02/095003、WO 03/038035、WO 03/038111、WO04/015084和WO 00/71728中有披露。
此外，Garrett等人的出版物Applied Environ.Microbiol.，2004，70(5)，3041-3046中也披露大肠杆菌植酸酶突变体具有增强的热稳定性和胃肠稳定性。
但是，现有技术没有包含关于突变大肠杆菌植酸酶导致原核来源的酶在真核微生物中表达时能提高产量的描述。而且，现有技术也没有关于通过变异特别是突变大肠杆菌植酸酶以实现在培养上清中具有提高活性的酶的暗示。特别是，现有技术没有关于大肠杆菌野生型植酸酶序列198-211位和/或137-152位氨基酸功能意义的暗示。更特别的是，现有技术中不含关于大肠杆菌野生型植酸酶序列中第200位氨基酸功能意义的暗示。
这个目标的解决在于重组DNA分子，当其在原核或真核宿主细胞中表达时，编码具有植酸酶活性的多肽。其中，重组DNA分子含有的DNA序列选自a)通过成熟的野生型大肠杆菌植酸酶序列的变异得到的DNA序列，对比野生型序列，其中在位置189-211区域和/或在位置137-152区域的至少一个氨基酸发生突变，b)与a)中序列有70％-100％同源性的DNA序列，c)由于遗传密码的简并性而与a)和b)中序列相关的DNA序列，其中所述的重组DNA分子在合适的宿主细胞中表达时，伴随着培养上清中所编码蛋白质活性的增加，这个目标的解决还在于由所述重组DNA分子之一所编码的具有植酸酶活性的多肽。
本发明还涉及根据重组技术生产具有植酸酶活性多肽的方法，包括在利于酶表达的条件下培养重组原核和/或真核宿主细胞(这些细胞含有本发明的核酸序列)，以及随后回收酶。而且，本发明涉及所述具有植酸酶活性的多肽在传统方法中的用途，例如从体外(如在饲料处理中)植物原料的肌醇六磷酸复合物中释放矿物质，或其在烘烤中的用途，或在体内的用途，即向动物施用具有植酸酶活性的多肽。而且，本发明涉及本发明的多核苷酸序列在制备探针以发现在其他生命体中编码相应酶的相似序列中的用途，以及这些多核苷酸序列用于转化宿主细胞的用途。
而且本发明涉及来源于黑曲霉(Aspergillus niger)植酸酶基因的信号序列。
所述附图更详细地阐明本发明图1对转化了质粒pKDa2和pKDa4的菌株的培养上清进行的SDS-PAGE分析。第1和第6泳道是标记蛋白质。具体的说明见实施例6和表3。
图2pKDa2(Tyr200突变体)的质粒图谱。
图3pKDa4(野生型)的质粒图谱。
图4Da2pUC3的质粒图谱。
图5编码大肠杆菌野生型植酸酶成熟蛋白质的DNA序列(使用大肠杆菌的密码子)。Dassa等人，1990，J.Bacteriol.1725497-5500，登录号M58704)。
根据布达佩斯条约规定，质粒Da2pUC3于2004年5月7日保存在德意志微生物保藏中心(Deutschen Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，保藏号为DSM 16396。
发明详述令人惊讶的发现是，在大肠杆菌野生型植酸酶序列位置198到211区域的氨基酸突变(包括界限值)和/或位置137到152区域的氨基酸突变(包括界限值)，伴随着在宿主细胞中表达时培养上清中显著增强的活性。对比野生型序列，优选对位置197到209区域内(包括界限值)和/或位置137到152区域内的至少一个氨基酸(包括界限值)进行突变。更优选对198、200、205和207位和/或144、145和152位的至少一个氨基酸进行突变。在189到211区域间优选的突变是Val 200→Leu，Val 200→Ile，Val 200→Pro，Val 200→Tyr，Leu 198→Ile，Val 205→Leu，Val 205→Ile，Leu 207→Tyr，Leu 207→Phe，而在137到152区间优选的突变是Ile 144→Tyr，Leu 145→Ile，Ile 152→Phe。更优选的突变是Val 200→Leu，Val 200→Pro，Val 200→Tyr和Ile 144→Tyr。特别优选突变的位置是Val 200。此氨基酸优选用芳香族氨基酸如酪氨酸、疏水性氨基酸如亮氨酸或异亮氨酸或者用脯氨酸取代。第200位的突变优选为酪氨酸。而且，也可以产生双突变体，但前提条件是Ile 144→Tyr不能和Val 200的突变一起进行，还有另一个前提条件是Ile 152→Phe不能和Leu 207的任何突变组合进行。优选的双突变体是Leu 198→Ile与Leu 145→Ile组合。不受下面理论解释的限制，根据本发明的修饰预期能改变植酸酶中两个空间上相邻的结构区域(即β-折叠和α-螺旋)，这些区域通过疏水作用而发生改变，从而产生更佳的堆积密度。这种堆积密度进而分别导致所修饰酶在培养上清中增加的活性和分泌。在前述前提条件范围内，所述区域可以进行任何突变和突变组合，只要转化相应DNA序列的微生物能分别自细胞中分泌增加量的所编码的植酸酶，并具有导致培养上清中活性(总活性)提高的特性，其中，野生型大肠杆菌植酸酶的酶活和其他生理特性得以保持。与野生型大肠杆菌植酸酶相比，在相同的检测条件下，突变体在培养上清中的活性和分泌效率方面优选分别提高至少10％，更优选提高至少20％。对植酸酶酶活的测定以及植酸酶其他生理特性的检测可以根据本身已知的方法实施。
与野生型植酸酶的分泌效率相比，植酸酶在培养上清中的活性和分泌效率分别提高至少10％的成绩是令人吃惊的，而且并非是显而易见的。特别令人吃惊的是，与野生型相比，Val 200→Tyr突变体与分泌效率提高100％相关(参考实施例4)。
在现有技术中有关于尝试改善植酸酶特性的报道。因此，在出版物Archives Biochem.Biophys.，2000，382(1)，105-122第109页图3中，描述了由巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌的在培养上清中的植酸酶的活性。野生型大肠杆菌植酸酶(与本发明的pKDa4的序列并不精确地序列一致)在96小时后分泌量为117单位/ml。应该注意，根据所述出版物中的活性测定方法与本发明实施例4中活性测定方法不同。根据上面提到的出版物中的现有技术，底物是在pH 2.5的条件下与酶共孵育的。根据本发明，共孵育是在pH 5.0条件下进行的。根据所述出版物第109页图3的曲线可知，在pH 2.5时的117单位/ml只相当于在pH 5.0时的大约60单位/ml(52％的残留活性)。因此，在所述出版物中由大肠杆菌野生型密码子编码的分泌的大肠杆菌野生型植酸酶的酶活显著地小于从转化pKDa4的瑞氏木霉(T.reesei)菌株中得到的酶活(158-188单位/ml)。
可以使用任何密码子实现对应根据本发明突变植酸酶序列的DNA序列，只要分泌水平不受使用密码子的不利影响。因此，例如，不但可以使用用于表达的微生物的密码子，而且可以分别用大肠杆菌密码子以及其变形。而且，根据本发明突变的大肠杆菌植酸酶序列可以包含更多的序列变异。因此，只要在培养上清中获得较高活性以及分泌效率的特性分别不受不利影响，只要大肠杆菌野生型植酸酶的酶活以及其他基本特性得到保持，就可以进行除前述突变之外的任何变异。
相应的变异对重组DNA领域的技术人员而言是众所周知的，包括前面的变异以及下面列出的例示性变异。
根据本发明，可以使用本发明修饰的多肽的插入和/或缺失分子。因此，本发明修饰的具有植酸酶活性多肽可以通过在N端和/或C端插入更多的序列而延长。因而，可以产生杂合分子，其具有更多的有利特性。例如，分别将融合蛋白质和天然高分泌量的蛋白质插入，从而使分泌效率进一步提高。而且，可以将其他酶的活性序列片断插入以获得具有多重特异性的酶。而且，将极性和非极性序列插入以分别特异地影响所获得酶的溶解性和跨膜的能力(“Membrangngigkeit”)。优选地将曲霉菌植酸酶或酸性磷酸酶连接在N末端。可以用同样的方法延长突变大肠杆菌植酸酶序列的C末端。因而获得改变四级结构的植酸酶。
根据本发明，只要培养上清中植酸酶的高分泌性以及活性不受影响(其中植酸酶的活性得到维持)，也可以将具有植酸酶活性的多肽的序列片断进行缺失。
突变、延长和截短可以用现有技术中本身已众所周知的方法进行。
前面考虑的具有植酸酶活性多肽的修饰分别对应于相应的DNA分子各自的突变和修饰。根据本发明，也考虑这样的序列，其在宽松或严谨条件下与本发明的序列杂交。而且，本发明还涉及这样的序列，其与所要求保护的序列及其部分分别表现出至少70％的同源性，更优选至少90％，特别至少95％，只要各自的序列能分别导致由其编码的具有植酸酶活性的多肽在培养上清中的活性和分泌效率增高即可。同源性优选为70％-100％。因此，优选确定序列的同一性程度，以便确定参与比较的序列中较短的、并与另一序列中有“对应的”配对残基的序列的残基数目。因此，为了本发明的这个目的，通常优选使用惯用的算法确定序列的同源性。根据本发明，只考虑对各个成熟蛋白质的cDNA进行比较。同样地，根据本发明，优选使用已知的计算程序将同一性序列对应物确定为同源序列。这样的程序的例子是Clone Manager Suite程序，包含part Align Plus程序，由科学教育软件公司(Scientific & Educational Software，Durham，NC，USA)发行。因此，根据FastScan-MaxScore方法或根据Needleman-Wunsch方法采用选择局部比对并保留默认值，进行上文定义的两个DNA序列的比较。特别的是，根据本发明，为了计算同源性，使用“Clone Manager 7 Align Plus5”版本的程序，该版本具有“比较两个序列/局部快速扫描矩阵计分/比较DNA序列”的功能。因此，使用来自下列来源的算法Hirschberg，D.S.1975.A linear space algorithm for computing longest common subsequences.Commun Assoc Comput Mach 18341-343；Myers，E.W.和W.Miller.1988.Optimal alignments in linear space.CABIOS 41，11-17；Chao，K-M，W.R.Pearson 和 W.Miller.1992.Aligning two sequences within a specifieddiagonal band.CABIOS 85，481-487。而且，本发明也涉及到由于遗传密码的简并性而与之相关的DNA序列及其等位基因变体。因此，遗传密码的简并性可以是由于天然的简并性或由于特异地选择使用的密码子所致。天然出现的等位基因变体可以使用熟知的分子生物学技术，如聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术来鉴定。
根据本发明，编码多肽的DNA序列可以用来转化任何宿主细胞，如真菌、酵母、细菌、植物或哺乳动物。因此，转化后的细胞因提高植酸酶的分泌而现出特色。所产生的植酸酶也导致磷从肌醇磷酸盐中高效地释放出来。
蛋白质、肽和多肽，这些术语是可以互换使用的。具有植酸酶活性的多肽或酶或植酸酶应指能够使无机磷从多种肌醇磷酸盐中释放出来的任何酶。这样的肌醇磷酸盐(植酸酶底物)的例子是植酸和其任何形式的盐，如植酸钠或植酸钾或混合盐。肌醇二、三、四或五磷酸盐的任何位置异构体都可以作为植酸酶的底物。使用所述底物之一的任何检测方法都可以用来测定植酸酶的活性。根据本发明的植酸酶变体包括从特定的植酸酶衍生而来的多肽变体，这些变体是在天然蛋白质的N端和/或C端缺失或添加一个或多个氨基酸，或在天然蛋白质中一个或多个位置上缺失或添加一个或多个氨基酸，或在植酸酶的一个或多个位置上取代一个或多个氨基酸。这样变异体的产生在本领域是众所周知的。例如。多肽的氨基酸序列变体可以通过DNA中的突变而制备。诱变和核苷酸序列的改造的方法在本领域是众所周知的(见如Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488(1985)，Kunkel等人，Methods in Enzymol.，154367(1987)，美国专利号4,873,192，Walker和Gaastra编辑，Techniques in Molecular Biology，Mac MillanPublishing Company，New York(1983))。关于适当地取代氨基酸而又不影响目的蛋白质生物活性的描述在Dayhoff等人的模型中有报道(Dayhoff等人，Atlas of Protein Sequence and Structure，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.(1987))。优选使用保守取代，如将一个氨基酸转变为具有相似特性的氨基酸。
本发明也涉及分离的或基本纯化的核酸或蛋白质组合物。在这里，分离的或纯化的多核苷酸/多肽及其片断分别指以从其天然环境中分离出来的形式存在的多核苷酸和多肽及其片断。分离的多核苷酸片断或多肽可以以纯化的形式存在，或存在于非天然的环境中，例如，在转基因宿主细胞中。例如，分离的或纯化的多核苷酸片断或蛋白质或其生物活性部分根据重组技术生产时基本上没有其他细胞物质或培养基，或基本上没有化学前体或其他化合物。分离的多核苷酸优选没有用于产生核酸的生物体基因组DNA中天然侧接该核酸的序列(优选是编码蛋白质的序列)(例如，位于核酸的5’和3’端的序列)。例如，根据不同的实施方案，分离的核酸分子可以含有小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，这些核苷酸序列是天然地连接在用于产生核酸的细胞基因组DNA中所述核酸分子侧翼的核苷酸序列。基本上没有细胞物质的蛋白质包含具有小于约70％、50％、30％、20％、10％、5％(基于干重)污染蛋白质的蛋白质或多肽组合物。根据本发明，当蛋白质或其生物活性片断用重组方法生产时，培养基中优选含有小于约70％、50％、30％、20％、10％或5％(基于干重)的化学前体或非蛋白质化学物质。根据本发明，核苷酸序列的片断和变体或由其编码的蛋白质或蛋白质片断也在本发明的范围之内。片断指核苷酸序列的一部分或氨基酸序列的一部分，从而也指由其编码的多肽或蛋白质的一部分。
本发明还涉及表达盒，根据本发明，它可以用来将编码植酸酶的开放阅读框转移(“Einschleusung”)到宿主细胞中。这些表达盒优选含有连接在开放阅读框上的转录起始区。这样的表达盒可以含有大量的限制性酶切位点，以便插入开放阅读框和/或其他DNA，如转录调控区和/或选择性标记基因。转录盒按转录的5’到3’方向含有转录和翻译起始区、目的DNA序列以及在微生物细胞中起作用的转录和翻译终止区。终止区可以相对于转录起始区是天然的，可以相对于目的DNA序列是天然的，或者可以来自任何其他来源。
术语“开放阅读框”是指由从翻译起始密码子到终止密码子间的编码序列编码的氨基酸序列。术语“起始密码子”和“终止密码子”指在编码序列中三个紧邻的核苷酸单位(密码子)，其规定了蛋白质合成中链的起始和终止(mRNA的翻译)。
“有效连接”是指就核酸而言作为同一核酸分子的一部分的连接，其相对于启动子转录起始位点处于适当的位置和方向。有效连接于启动子的DNA处于启动子转录起始调控的控制之下。编码序列可以有效地以有义或反义的方向连接在调节序列上。关于多肽，有效连接意味着作为同一多肽的一部分的连接，即通过肽键连接。
根据本发明，可以使用任何启动子。启动子指相对于编码序列通常在上游(5’)的核苷酸序列，它通过为RNA聚合酶和其他因子提供识别而控制编码序列的表达，所述因子是正确转录所必须的。根据本发明使用的启动子可以包含最小的启动子，即含有TATA盒的短DNA序列和其他序列，它们附着在控制表达的调节元件上，指定转录的起始位点。
根据本发明，启动子也包括由最小的启动子和调节元件组成的核苷酸序列，它能控制编码序列或功能性RNA的表达。这种类型的启动子序列由远端和近端的上游元件组成，其中远端的元件通常称作增强子。因而，增强子是能促进启动子活性的DNA序列，它可以是启动子的内在元件或是用于提高启动子表达水平或组织特异性的插入的异源元件。它可以在两个方向上都发挥作用，甚至可以在启动子的上游或下游的位置发挥作用。增强子以及其他上游启动子元件结合序列特异性的DNA结合蛋白质，从而介导它们的作用。启动子可以来自完整的天然基因；或由不同的元件组成，这些元件可以来源于不同的天然存在的启动子；甚至可以由合成的DNA片断组成。启动子也含有参与结合蛋白质因子的DNA序列，这些蛋白质因子对生理条件或归属于发育的条件做出反应，来控制转录起始的效率。
在缺乏上游激活时，启动子元件，特别是TATA元件，是失活的或启动子的活性强烈地减少，这样的启动子称作最小启动子或核心启动子。在分别存在一种或多种适当的转录因子时，最小启动子的功能是允许转录。因此，最小或核心启动子仅由转录起始所必需的基本元件组成，即TATA盒和/或起始子。
本发明还涉及含有根据本发明DNA的载体。所述载体包括任何质粒、粘粒、噬菌体以及其他的双链或单链、线性或环状形式的载体，它们可以任选地自我转移或移动，可以转化到原核或真核宿主细胞中，要么整合到细胞基因组上，要么游离在染色体外(如具有复制起点的自主复制型质粒)。
用于转化细胞的载体、质粒、粘粒、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)和DNA片断通常包括待转移或引入至细胞中的根据本发明编码植酸酶的DNA以及其他DNA，如cDNA，一种或多种基因。所述DNA构建体包括其他结构，如必要的启动子、增强子、多聚接头或调节基因。挑选的用于引入细胞的DNA片断或基因之一能便利地编码在所获得的转化(重组)细胞中表达的蛋白质，并使转化细胞具有可筛选的或可选择的特征和/或赋予改良的表型。
注意到前面的说明，根据本发明可使用载体的构建对本领域技术人员是公知的(参考例如Sambrook等人，《分子克隆实验手册》(第二版，冷泉港实验室出版，Plainview，N.Y.(1989)。根据本发明，表达盒含有一个或多个限制性位点，以便插入在调节序列调控下的编码植酸酶的核苷酸。表达盒也可以含有有效连接在多核苷酸上的终止信号以及调节序列，它们对多核苷酸的正确翻译是必须的。含有根据本发明多核苷酸的表达盒可以是嵌合体，即对至少一个其他组分而言，至少其组分之一是异源的。表达盒中多核苷酸的表达可以是在组成型启动子、诱导型启动子、可调节的启动子、病毒性启动子或合成的启动子的控制之下。
载体上可以已经含有调节元件，如启动子，或根据本发明的DNA序列经操作而含有这样的元件。合适的可以使用的启动子元件在本领域是公知的，如瑞氏木霉的cbh1或cbh2启动子；米曲霉(Aspergillus oryzae)的amy启动子；黑曲霉的xyl、glaA、alcA、aphA、tpiA、gpdA、sucl和pkiA启动子。用于在酵母中表达的合适的启动子在本领域是公知的，例如，用于在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母中表达的pho5启动子或gap启动子，用于多形汉逊酵母(H.polymorpha)的axoI启动子或fmd启动子或mox启动子。
除了本发明的DNA外，适合引入细胞中的DNA包括从任何来源衍生而来或分离到的DNA。衍生而来的DNA的例子是，在给定生物体中鉴定为有用片断的DNA序列，并且已经以充分纯的形式用化学方法合成。这样的DNA的例子是例如用限制性内切酶处理获得的合适的DNA序列，这样，可以根据本发明对其进一步操作，如可以扩增之。这样的DNA通常称作重组DNA。因此，合适的DNA包括完全合成的DNA、半合成的DNA、从生物来源中分离的DNA以及从引入的RNA衍生而来的DNA。通常，引入的DNA不是受体DNA基因型的原始组分，但是根据本发明，也可以从给定的基因型中分离得到某个基因，并任选地进行修饰，随后，将这个基因的多个拷贝引入相同的基因型中，如为了提高给定基因产物的产量。
引入的DNA包括但不限于基因DNA，如来自细菌、酵母、真菌或病毒基因的DNA。引入的DNA可以包括修饰或合成的基因、基因的一部分、或包含相同或不同基因型的嵌合基因。
根据本发明用于转化的基因可以是环形的、线性的、双链的或单链的。通常，DNA是以嵌合DNA的形式出现，如质粒DNA，也含有编码区域，侧翼是调节序列，以帮助出现在转化细胞中的重组DNA的表达。例如，DNA本身可以含有启动子或由启动子组成，这种启动子在细胞中是有活性的，其来源不同于所述细胞，或者可以使用已经存在于所述细胞即用于转化的靶细胞之中的启动子。
为了尽可能地减少因DNA大小增加而造成的有关物理、化学或酶促降解的敏感性，通常，引入的DNA相对较小，小于约30kb。
合适表达载体的选择取决于宿主细胞。用于酵母或真菌的表达载体包括复制起点、合适的启动子和增强子，也包括任何必需的核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点、剪接供体和剪接受体位点、转录终止序列和非转录5’侧翼序列。
合适的宿主细胞的例子有曲霉菌属(Aspergillus)、根霉菌属(Rhizopus)、木霉菌属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)、毛霉菌属(Mucor)、青霉菌属(Pencillium)等属的真菌细胞，象克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)和毕赤酵母属(Pichia)等属的酵母细胞。例如，合适的宿主系统是，真菌如曲霉菌属，如黑曲霉(ATCC 9142)或者无花果曲霉(Aspergillus ficuum)(NRLL 3135)，或者木霉菌属(如瑞氏木霉QM6a)；以及酵母如酵母属如酿酒酵母，或毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母，或汉逊酵母属如多形汉逊酵母(DSMZ 70277)。这样的微生物可以在认可的保藏单位得到，如美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)(ATCC)，真菌菌种保藏中心(Centraalbureau voorSchimmelcultures)(CBS)或德意志微生物保藏中心(Deutschen Sammlungfür Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)或其他保藏单位。
根据本发明，在5’-3’方向，表达盒可以含有多核苷酸的转录和翻译起始区以及转录和翻译的终止区，表达盒在体内或体外都是有功能的。终止区对于转录起始区而言可以是天然的，或对多核苷酸而言可以是天然的，或是其他起源的。调节序列可以定位在内含子的上游(5’端非编码序列)或编码序列的下游(3’端非编码序列)，并影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性和/或翻译。调节序列可以不受限制地包括增强子、启动子、阻遏物结合位点、翻译前导序列、内含子或多聚腺苷酸化信号序列。他们可以是天然的序列、合成的序列以及由合成和天然序列组合而成序列。
根据本发明，使用的载体也包括用于增强表达的合适序列。
根据本发明，可以使用的启动子的实例是公知的在真核细胞中控制表达的启动子。在丝状真菌中具有控制表达能力的任何启动子都可以使用。实例是受淀粉或纤维素强诱导的启动子，如来自曲霉菌属的葡萄糖淀粉酶或α-淀粉酶的启动子，或来自木霉菌属的纤维素酶(纤维二糖水解酶)的启动子；糖酵解途径中酶的启动子，如磷酸甘油酸激酶(PGK)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)等。优选纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、木聚糖酶或烯醇化酶的启动子。
控制表达的两种主要方法是众所周知的，即表达过量和表达不足。表达过量可以通过插入所选基因的一个或多个附加拷贝而实现。表达不足有两种主要方法，在本领域通常称之为“反义表达不足”和“有义表达不足”。通常这些方法称为“基因沉默”。这两种方法均导致抑制靶基因的表达。
除了使用特异的启动子，其他类型的元件能影响转基因的表达。特别已知的是内含子具有增强转基因表达的潜能。表达盒甚至可以包含其他元件，如由内源或外源元件(如锌指蛋白，包括天然存在的锌指蛋白或嵌合锌指蛋白)调节的元件。
根据本发明，使用的表达盒可进一步含有增强子元件或上游启动子元件。
可以构建根据本发明使用的载体以获得增强子元件。因此，根据本发明，构建体包含目的基因以及作为转录终止信号和允许所得到的mRNA进行多聚腺苷酸化信号的3’端序列。可以使用允许蛋白质从所选宿主生物体中分泌的任何信号序列。优选的信号序列是来源于黑曲霉的植酸酶信号序列或由其衍生的用于丝状真菌分泌的信号序列。
也可以使用特异的前导序列，作为在转录起始位点和编码序列起点之间的DNA序列，即非翻译的前导序列能影响基因的表达。优选的前导序列含有控制所连基因最佳表达的序列，即它们含有优选的共有前导序列以增加或维持mRNA的稳定性，并阻止不适当的翻译起始。这类序列的选择对本领域的技术人员而言是公知的。
将可选择的或可筛选的标记基因引入表达盒中以提高鉴定转化子的可能性。这样的标记基因对本领域技术人员而言是公知的。
将表达盒或含有表达盒的载体构建体引入宿主细胞中。关于将构建体引入宿主细胞中有很多技术可以使用，而且这些技术对本领域技术人员而言是公知的。微生物细胞的转化可以使用聚乙二醇、氯化钙、病毒感染、DEAE-葡聚糖、噬菌体感染、电穿孔以及其他本领域公知的方法进行。真菌的转化可以根据Penttil等人，Gene 61155-164，1987实施。将重组载体引入酵母可以根据本身已知的方法实施，这样的方法包括电穿孔法、使用原生质体法、醋酸锂等。
根据本发明，只要分别得到表达盒和DNA序列，就可以用本身已知的方法将其插入到载体上以便在合适的宿主系统中过量表达所编码的多肽。但是，DNA序列也可以用同样的方法转化到本发明合适的宿主系统中以实现所编码多肽的过量表达。
根据本发明，只要DNA序列在合适的培养基中在合适的宿主细胞中表达，所编码的植酸酶就可以根据本身已知的方法进行浓缩和/或分离在植酸酶分泌到培养基中的情况下，从培养基中分离植酸酶；在植酸酶存在于细胞内(如在周质空间中)的情况下，从宿主生物体中分离。应用从培养基中分离不溶性组分和生物量的已知方法以及随后用于浓缩植酸酶的方法，可以生产浓缩的植酸酶溶液或制备干燥的植酸酶。例如，使用过滤方法或离心方法分离不溶性组分，随后用超滤方法浓缩，或使用交叉流过滤方法。干燥的方法有冻干法或喷雾干燥法、造粒法、挤压法或其他方法。根据本发明，使用已知的蛋白质纯化方法分离植酸酶。例如，单独或组合使用不同的层析法或凝胶层析法。根据本发明，植酸酶可以进行修饰或不进行共价糖基化，这依赖在重组生产方法中使用的宿主细胞。在真核细胞中分泌蛋白质的糖基化是用来调节蛋白质的折叠、构象的稳定性、热稳定性以及对蛋白酶水解的抗性。考虑到植酸酶的特殊应用，优选使用酶的糖基化变体而不是非糖基化的变体。例如，在动物饲料中使用糖基化的植酸酶可以保护酶在饲料制粒过程中抵抗热变性，或保护酶在通过动物胃过程中的蛋白水解失活，从而促进活性酶在肠道中的分布，以到达其作用部位。当应用于食品加工中时，只需要在加工过程中保持酶的活性而不是在终产品中保持酶活，因此优选使用热不稳定的(即非糖基化的)和对蛋白水解降解敏感的植酸酶。
本发明还涉及含有根据本发明多肽的植酸酶组合物。通常，植酸酶组合物是液态或固态的。液体组合物优选包括以纯化或富集形式存在的植酸酶。不过，可以加入辅剂，例如，稳定剂甘油、山梨醇或单丙二醇；添加剂，如盐、糖；防腐剂；调节pH值的手段；蛋白质以及肌醇六磷酸或肌醇磷酸盐(植酸酶的底物)。通常液体组合物分别是水性或油性混悬液或浆液。液体组合物可以在可能的制粒或加工步骤之前或之后加入到食品或饲料中。固态组合物可以是冻干的、喷雾干燥的或挤压的组合物，这样其中只含植酸酶。固态组合物可以制成颗粒，这样很容易与食品或饲料组分混合，或更优选形成预混合料组分。植酸酶颗粒的大小优选与混合物中其他组分相容。这样便于保存以及在如食品、预混合物或动物饲料加工过程中方便地掺入酶。
根据本发明，植酸酶的稳定制剂可以例如通过将液体酶溶液混合物喷洒在如碾磨大豆粉这样的膨胀剂上，然后将混合物干燥而进行生产。减少湿度以及植酸酶与膨胀剂之间的结合作用能防止环境对植酸酶的影响，如在饲料生产过程中出现的温度极值。当降低潜在蛋白水解酶活性时，固态及液态制剂就可以更加稳定，这样的蛋白水解酶可以在用来生产根据本发明酶的液体发酵混合物中作为副产品出现。这样获得的固态酶混合物可以在家禽和猪饲养过程作为饲料增补剂使用。例如，根据本发明，将250个酶单位的酶加入到1公斤标准小麦食品中产生的效果与500个酶单位的曲霉菌植酸酶的效果类似。而且，减少磷酸的补加导致磷酸污染的降低，这将依次减少集约化动物饲养所带来的环境压力。
只要得到固态酶制品，就可以生产团聚的颗粒。因此，使用高速剪切的搅拌机可以使膨胀剂和酶共同成团并形成颗粒。根据本发明，用酶包裹支持材料核心而形成吸收颗粒。典型的膨胀材料是盐，如硫酸二钠。其他的膨胀材料包括高岭土、滑石、硅酸铝镁和纤维素纤维。粘合剂，如糊精，也可以任选地掺入到团聚颗粒中。
典型的支持材料包括淀粉，如木薯、马铃薯、谷物淀粉，特别是玉米、大米和小麦淀粉，或含有如豆蛋白这类的蛋白质。也可以使用盐。颗粒可以任选地用包衣混合物包裹。这样的颗粒包含包衣剂，优选使用疏水性包衣剂，脱氢棕榈油、滑石以及任选地其他添加剂，如碳酸钙和高岭土，从而提高在目的作用位点的生物利用率。
另外，含有植酸酶的混合物含有其他物质，如着色剂、调味料、稳定剂、维生素、矿物质以及其他食品和饲料酶等等。这些特别地涉及所谓的预混合物。
食品或饲料添加剂是基本上很纯的化合物或几种化合物的组合物，这些化合物旨在或适合添加到食品或饲料中。特别是，添加剂物质根据其目的用途成为食品或饲料中的组分，或能影响食品或饲料产品的特性。因此，植酸酶添加剂应当指这样的植酸酶，其并非主要应用于食品和饲料中物质的天然组分，或并非以天然浓度存在于其中。例如，将植酸酶独立于其他饲料物质单独地或与其他饲料添加剂混合地添加到饲料中。典型的预混合物通常包含一种或多种化合物，如维生素、矿物质或饲料强化酶以及合适的载体和/或赋形剂。
即用型植酸酶添加剂不是在饲料或加工食品原地生产的。即用型植酸酶添加剂可以直接施用于人类或动物，或优选在与饲料或食品的其他化合物混合后直接施用。例如，根据本发明的这个方面，饲料添加剂与其他饲料原料或饲料添加剂混合，以获得预混合物或增补饲料。这样的其他饲料组分包含一种或多种其他酶增补物(优选使用热稳定的酶)、其他的饲料添加剂、矿物饲料和氨基酸。由此得到的(混合)饲料添加剂可以包含不同类型的化合物，因此它们可以以适当的量与如谷物和蛋白载体这样的饲料混合，以获得混合的动物饲料。将这些组分加工成动物饲料可在加工装置内混合后进行，这样的加工装置本身是公知的，如双制粒机器、蒸汽制粒机、膨胀机或挤压机。
同样地，根据本发明的实施方案，食品添加剂可以与其他食品组分组合，从而生产出加工后的食品。这样的其他食品组分包括一种或几种酶增补物、维生素、矿物质和微量元素。由此得到的混合食品增补物可以以适当的量与其他的如谷物和植物蛋白这样的食品组分混合，产生出加工后的食品。用本身公知的加工装置将这些化合物加工成加工后的食品。
根据本发明，在优选的实施方案中，植酸酶组合物额外地包括有效量的一种或几种食品或饲料使用的酶，优选选自α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，漆酶，其他植酸酶，磷酸酶，内切葡聚糖酶，特别是内切-β-1，4-葡聚糖酶，内切-β-1，3(4)-葡聚糖酶，内切-1，2-β-葡聚糖酶和内切-1，3-α-葡聚糖酶，纤维素酶，木糖苷酶，半乳糖酶，特别是阿拉伯半乳糖-内切-1，4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳糖-内切-1，3-β-半乳糖苷酶，果胶降解酶，特别是果胶酶，果胶酯酶，果胶裂解酶(pectinlyase)，多聚半乳糖醛酸酶，阿拉伯聚糖酶，鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶(rhamnogalacturonase)，鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶(rhamnogalacturonanacetylesterase)，鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-α-鼠李糖苷酶(rhamnogalacturonan-alpha-rhamnosidases)，果胶裂解酶(pectate lyase)和α-半乳糖醛酸酶(alph-galacturonidase)，甘露聚糖酶，特别是β-甘露糖苷酶，甘露糖乙酰酯酶，木聚糖乙酰酯酶，蛋白酶，木聚糖酶，阿拉伯木聚糖酶和脂解酶，如脂肪酶、磷脂酶和角质酶。
根据本发明，动物饲料添加剂可以在施用饲料之前或与之同时施用于动物。根据本发明，动物饲料添加剂优选与饲料同时施用于动物。
饲料或食品中植酸酶的有效量是大约10-20,000ppu/kg，优选大约10-15,000ppu/kg，更优选大约10-10,000ppu/kg，特别是大约50-5,000ppu/kg，更特别是50-2,000ppu/kg。
本发明还涉及植酸酶在食品和饲料加工和生产中的用途。用于食品的谷物和面粉可以用植酸酶进行酶促处理，以减少植酸含量或原材料。减少植酸含量能增加如铁、钙、锌这样的基本矿物质的生物利用率，从而提高食品的质量。除了提高食品的质量外，在加工过程中使用植酸酶能提高食品生产的总效率。例如，在大豆蛋白分离物生产过程中，向白色大豆薄片中加入植酸酶能显著提高产量和可提取蛋白的质量。因此，植酸酶只在生产和加工过程中有活性，在终产品中则是失活的。这一点特别是对于生面团生产、烘焙以及在以其他谷物为基础的即食食品生产非常重要。同样地，在实际生产过程前，用植酸酶预处理动物食品组分，如烘烤大豆粉或芸苔(canola)粉。在生产之前将动物饲料化合物中的抗营养因子除去可以导致生理上更高的质量以及更有价值的动物饲料成分。在这些加工方法中，在加工过程中植酸酶是有活性的，通常，处理过的饲料经摄取后，植酸酶在动物的消化道中就不再有活性。
除了在饲料加工过程中使用植酸酶作为辅助性手段，本发明还涉及使用植酸酶作为消化助剂(“Verdauungshilfe”)。片剂的植酸酶可以与食品一起摄取，以使有活性的植酸酶分布在胃肠道中。
根据本发明，使用植酸酶对单胃动物以及多胃动物，特别是小牛，都有好处。鱼和甲壳类动物(“Schalentiere”)的饲料中也可以添加植酸酶，以改善食品的开发和减少在集约动物饲养中排泄的磷含量。根据本发明，饲料也可以施用于家禽类动物，如阉母鸡(poularde)、火鸡、鹅、鸭子以及猪、马、牛、绵羊、山羊、狗和猫，以及鱼和甲壳类动物。不过，根据本发明，特别优选将这种饲料施用于猪和家禽。
根据本发明，植酸酶制剂也可以与其他成分组合，从而产生新的、特别有益的饲料组合物。正如前面解释的那样，由于结合植酸，在大豆粉和谷物中植物磷酸的利用率很低。因此，在饲料中加无机磷，以便确保动物有足够的磷供应。但是，这些饲料中总磷的含量太高，从而导致磷对环境的污染。根据本发明，为了提供添加的无机磷量实质上减少的饲料，动物饲料特别包含本发明的植酸酶与动物饲料成分的混合物。根据本发明，在优选实施方案中，饲料包含典型的饲料成分、微量营养素、微量元素、维生素等，以及有效量的植酸酶和无机磷，其中，每公斤饲料中植酸酶的量在50-20,000单位植酸酶，无机磷的含量小于0.45％，优选含量在100-10,000单位植酸酶/公斤饲料且小于0.15％的无机磷，特别是含量在200-20,000单位植酸酶/公斤饲料且不添加无机磷。
本发明也涉及改善动物营养方面的增重和饲料转化比(FCR)，以及本发明植酸酶在这些方法之一中的用途。根据本发明，植酸酶可以改善增重和提高饲料转化比，特别是在含有小量无机磷的饲料的情况下。根据本发明的方法，饲料中无机磷的含量可以减少到0.45％以下的含量，优选在0.225％以下。优选地不添加无机磷。根据本发明，由于添加的植酸酶提高了磷的利用率，动物骨骼矿化显著改善，这对快速生长的动物特别重要。
根据其他的实施方案，本发明涉及本发明植酸酶在烘焙中的用途，从而改善生面团的形成、弹性和/或复原性，和/或体积、团粒结构和/或烘焙货品(“Backgut”)变味(“Altbackenwerden”)的抗性。根据本发明，尽管植酸酶制品可以用来生产任何类型面粉的生面团或烘焙产品，如以裸麦、大麦、燕麦或玉米为基础的面粉产品，但是，已证明本发明中的植酸酶制品在生产小麦或小麦占大量比例的生面团或烘焙产品时特别有用。根据本发明，可以用酶制品生产的烘焙产品包括面包、面包卷、法国面包等等。根据本发明，在烘焙时，植酸酶制品可以与其他的活性酶结合使用，除了植酸酶外，这样的酶有木聚糖酶、脂肪酶、淀粉酶、氧化酶或漆酶；或与有如脂肪酶、淀粉酶和氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、过氧化物酶)的其他酶的混合物一起使用。
实施例下面的实施例更详细地说明本发明。
实施例1植酸酶活性的测定用由0.5％植酸(约5mM)，200mM柠檬酸钠，pH 5.0组成的检测混合物检测植酸酶的活性。在37℃共孵育15分钟后，加入相同体积的15％的三氯乙酸终止反应。用100微升的检测混合物与900微升的水以及1毫升的0.6M硫酸，2％抗坏血酸和0.5％钼酸铵混合，在50℃反应20分钟后，在820nm处定量测定释放出来的磷离子。用磷酸钾的标准液作参照。
实施例2构建pKDa2和pKDa4质粒大肠杆菌编码植酸酶的序列(Dassa等人1990，J.Bacteriol.1725497-5500，登录号M58704)利用瑞氏木霉的密码子(http://www.kazusa.or.jp/codon)产生和合成。对所有合成的片断进行测序，并将有突变和无突变的片断连在一起，从而产生新的植酸酶变体。在最终得到的变体之一中，植酸酶基因的氨基酸Val200(GTG)变成Tyr200(TAC)。这个变体称作Da2。没有突变的原始多核苷酸(“Stammpolynucleotid”)称作Da4。用PCR扩增成熟的大肠杆菌植酸酶基因克隆。在位置1处含有CAG(Gln)密码子的DNA序列含有1,230bp的开放阅读框，能编码有410个氨基酸的植酸酶(SEQ ID NO1/2)。
使用黑曲霉植酸酶(SEQ ID NO3/4)的信号肽以使大肠杆菌的植酸酶从瑞氏木霉中分泌出来。合成的基因含有修饰的黑曲霉植酸酶信号序列和成熟的大肠杆菌植酸酶序列，其含有突变V200Y，并将合成的基因克隆到pUC18质粒上。因此形成的载体称作Da2pUC3，并根据前面的情形以DSM16396保藏。保藏的质粒含有使用真菌密码子的DNA，并根据需要的限制酶的切割位点作轻微的修饰，这从下表1中可以看出表1
在质粒pKDa2(Tyr200突变体)中，合成基因的起始密码子的上游16个碱基对处侧接SacII限制性位点，而终止密码子的下游紧接着是BamHI限制性位点。起始密码子上游的16个碱基对是属于瑞氏木霉的cbhI启动子(Shoemaker等人，1983，Bio/Technology 1，691-696)。合成的基因用SacII和BamHI切割并插入到质粒pALK487(WO 94/28117)中SacII和BamHI切割位点处，这些位点在瑞氏木霉纤维二糖水解酶I的启动子之后。这个质粒构建体称作pKda1。质粒pALK424(WO 93/24621)的EcoRI/SpeI酶切片断钝端化后长4.78kb，含有amdS标记，将此片断及其3’侧翼cbhI序列克隆到pKDa1的StuI切割位点上，从而得到植酸酶表达载体pKDa2。所述的载体用限制性内切酶作图，合成片断的全部序列通过测序确认。
用类似的方法实施表达载体pKDa4(野生型)的构建。
分别从质粒pKDa2和pKDa4中分离的表达盒含有下列遗传物质CbhI(纤维二糖水解酶I)启动子含有cbhI启动子的2.2kb长的EcoRI/SacII酶切片断来自瑞氏木霉QM6a。启动子区域也作为同源DNA(与cbhI 3’片断一起，见下文)起作用，以便控制转化的DNA整合到cbhI基因座上。
信号序列黑曲霉植酸酶(SEQ ID NO3/4)的信号肽用来使大肠杆菌植酸酶从瑞氏木霉中分泌出来。
大肠杆菌植酸酶基因为了使大肠杆菌植酸酶基因在瑞氏木霉中表达，将合成的大肠杆菌植酸酶基因(SEQ ID NO1)，包括修饰的黑曲霉植酸酶信号序列，融合在cbhI启动子和cbhI终止子之间。
cbhI终止子为了确保转录的终止，将含有cbhI终止子的长0.75kb的BamHI/StuI酶切片断随后加到大肠杆菌植酸酶的序列上。
amdS基因从构巢曲霉(Aspergillus nidulans)VH1-TRSX6中分离包括其启动子和终止子并编码乙酰胺酶的基因(Hynes等人1983，Mol.Cell.Biol.31430-1439；Kelly和Hynes，1985，EMBO J.4475-47)。乙酰胺酶允许菌株在以乙酰胺作为唯一氮源的条件下生长。这个特性已经用来筛选转化子。3.1kb长的片断(SpeI/BamHI钝端化)包含1.007kb的启动子区域，1.897kb的编码区(包括内含子)以及183bp的amdS基因终止子区域。
cbhI3’片断从瑞氏木霉ALKO2466中分离得到长1.7kb的片断，是BamHI/EcoRI酶切片断，从基因终止密码子后的1.4kb起始的。菌株ALKO2466衍生自菌株ALKO233(Harkki等人，1991，Enzyme Microb.Technol.13227-233)。3’片断与启动子区一起使用，通过同源重组将植酸酶表达盒靶向整合到cbhI基因座上。
为了研究单拷贝基因突变的效果，选择构建体以靶向寻找并置换出现在瑞氏木霉RH3780d中的单一拷贝的cbhI基因。
实施例3用pKDa2和pKDa4转化瑞氏木霉以获得单拷贝转化子用从质粒pKDa2和pKDa4中分离的线性化表达盒分别转化瑞氏木霉RH 3780d。转化和维持瑞氏木霉的技术参照Penttil等人发表的技术(1987，Gene 61155-164)。用单孢子分离法筛选并纯化得到转化子两次。那些具有最高分泌效率的转化子是从所有转化子中筛选出来的。这些含有来自质粒pKDa2 DNA的转化子称作RH 31068和RH 31069，含有来自质粒pKDa4 DNA的转化子称作RH 31071-31075，并用作进一步的特征表述。
实施例4植酸酶在摇瓶中的分泌分别带有pKDa2和pKDa4表达盒的转化子在含有纤维素酶诱导培养基的摇瓶中生长。培养基的组成2％牛奶蛋白浓缩养分，1％乳糖，1.5％DSG，5％磷酸二氢钾，0.5％硫酸铵，0.5％玉米浸提粉，平衡自来水，在灭菌之前调pH值为5.3。生长6天后得到的培养基滤出液用SDS-PAGE分析并检测植酸酶的活性。结果显示，最高活性的植酸酶是在含有pKDa2表达盒的转化子的培养基中观测到的。在下表2中阐明的活性是最大酶活，它是由最好的转化子经过为期6天的发酵得到的。
表2含有pKda2或pKDa4表达盒的转化子产生的大肠杆菌植酸酶
上面结果显示，用含有Tyr200突变体的pKDa2表达盒转化的菌株表现为分泌植酸酶，分泌量是转化野生型大肠杆菌植酸酶pKDa4的菌株分泌量的大约2倍高。
实施例5Southern印迹为了评估表达盒整合到基因组上的结果，从宿主菌RH 3780d和两个构建体的转化子中分离基因组DNA，并用Southern印迹分析。在用EcoRI酶切割基因组DNA并用9.0kb的EcoRI酶切片断筛选后，所有的转化子在9.0kb处都出现杂交带。带的大小对应着表达盒9.0kb的片断，这说明，表达盒完整地整合到基因组上。
用XbaI切割宿主菌株DNA表现出两条杂交带，分别在1.7kb和9.0kb，但是，所有的转化子出现三条杂交带，分别是1.7kb、4.0kb和7.0kb。正如期望的发生双交换事件一样，单拷贝的表达盒整合到cbhI基因座上导致出现1.7kb、4.0kb和7.0kb三条带，而没有9.0kb的野生型带。4.0kb和7.0kb的带替换了宿主cbhI基因座的9.0kb的带，1.7kb的带没有改变。
在转化子和那些构建体之间杂交信号的强度没有差异，Southern印迹分析、SDS-PAGE和植酸酶活性测定的结果在前面的表2中。Southern印迹分析显示，所有筛选的转化子在cbhI靶基因座上分别只有一个拷贝的大肠杆菌植酸酶基因和突变的基因。
实施例6植酸酶变体的生化表征用Nupage BisTris10％SDS-PAGE凝胶分离重组菌株的上清，并用考马斯亮兰染色(图1)。由于在宿主菌中的糖基化，植酸酶在44.2KD和53.2KD之间出现三条带。所有样品具有相同的植酸酶活性。凝胶晾干并在Agfa平板扫描仪上用Phoretix ID高级软件扫描。整合三条带的面积，数据概括在下表3中。对四种测试菌株而言，三条植酸酶带的面积总和均等地落在检测准确度范围内。这表明，Da2上的突变并没有改变酶的比活，因此，证明了突变是增加植酸酶蛋白分泌的原因。
表3用Phoretix ID高级程序整合SDS-PAGE上植酸酶带的面积
实施例7本发明植酸酶(Tyr200突变体)提高磷在猪中的利用率用猪作消化实验，每种情形先进行为期9天的实验条件期，随后是2个为期5天的采集期。依据玉米粉和萃取的大豆粉，用可消化磷定额减少的量作负对照，并以每公斤饲料中补加125、250、500、750 ppu本发明的植酸酶(大肠杆菌植酸酶突变体Tyr200)。植酸酶通过预混合物加到完全的饲料中。用总共40头阉割的公猪分成5个处理组。所有的处理组含有8头猪(在随后的两个采集期各4头)。所作的处理如下负对照1(NC)NC+植酸酶(125PPU/kg-1)NC+植酸酶(250PPU/kg-1)NC+植酸酶(500PPU/kg-1)NC+植酸酶(750PPU/kg-1)1饲料71.5％玉米粉，28.8％萃取的大豆粉；4.4gkg-1总磷；1.9gkg-1非肌醇六磷酸的磷；5.5gkg-1钙；天然植酸酶90PPU/kg-1。
检测的参数包括磷和钙的可消化性以及磷和钙的保留。
磷的保留和排泄结果显示，磷的可消化性在负对照中是42.5％，在所有添加量植酸酶(每公斤饲料补加125、250、500、750 PPU)的处理中，磷的可消化性分别显著提高到59.3％、65.3％、65.0％和66.3％(p＜0.05)。这导致与排泄粪便中磷的量(203mg/kg/0.75天)相比，在富含植酸酶饲料的处理组中排泄粪便中磷的量显著减少到142、120、121和116mg/kg/0.75天(p＜0.05)。磷的保留从负对照中检测到的152mg/kg/0.75天显著提高到在富含植酸酶饲料的处理组中的221、232、231和236mg/kg/0.75天(p＜0.05)。植酸酶处理之间的差异在最低剂量(125 PPU/kg饲料)与所有其他处理之间显著。
钙的保留和排泄根据本发明，相比对照组，添加植酸酶能显著提高钙的利用率，分别达12.1％、14.3％、15.2％和14.6％(p＜0.05)。在负对照中，通过尿排泄的钙相对较高(114mg/kg/0.75天)，这可能得归于饲料中磷的含量低。在植酸酶的处理组中，通过尿排泄的钙减少到108、118、95和88mg/kg/0.75天，与负对照相比，最高的处理剂量(750PPU/kg，p＜0.05)是非常显著的。钙的保留从负对照中检测的181mg/kg/0.75天显著地增加到所有植酸酶处理的240、245、266和270mg/kg/0.75天(p＜0.05)。植酸酶不同添加量之间的差异在较高剂量(500和750PPU/kg饲料)和较低剂量(125和250PPU/kg饲料)间显著。
结果表明，本发明植酸酶对猪消化道内的肌醇六磷酸的降解有很好的效果。根据本发明，低量植酸酶已经能与较高添加量以相似的效果促进钙和磷的可消化性和保留。
实施例8本发明植酸酶(Tyr200突变体)在阉母鸡中促进磷的利用率在两个收集期内用阉母鸡(“Masthühner”)作消化实验。在4天笼养的条件期后实施一个为期4天的收集期。收集期是在开始期结束和生长期结束后实施。以玉米粉和萃取的大豆粉为基础，用可消化磷的定额减少量作为负对照，并根据本发明以每公斤饲料补加125和250PPU的植酸酶量。另外，用不添加植酸酶的推荐剂量的磷实施其他的处理。总共24只雄性阉母鸡(male poularde)分成4个处理组。处理组在每个收集期有6只阉母鸡。所做处理如下负对照1(NC)NC+植酸酶(125PPUkg-1)NC+植酸酶(250PPUkg-1)正对照21饲料53.6-56.5％玉米粉；37.9-34.5％萃取的大豆粉；4.4-4.7gkg-1总磷；2.0gkg-1非肌醇六磷酸的磷；6.4-5.9gkg-1钙2饲料50.4-54.3％玉米粉；35.9-35.0％萃取的大豆粉；7.3-6.4gkg-1总磷；4.5-3.5gkg-1非肌醇六磷酸的磷；9.8-7.8gkg-1钙检测参数包括磷的排泄和保留。结果表明，植酸酶的两种添加量(125和250PPU/kg饲料)都能增加磷的保留并减少磷的排泄。在开始期结束时检测显示，磷的保留从负对照的58.7％显著增加到用植酸酶处理的64.2％和63.9％(p＜0.05)。这导致接受植酸酶的阉母鸡中磷的排泄减少，与负对照相比，减少11.4％和12.7％(趋向)。在生长期结束后检测也显示，磷的保留从负对照的54.7％增加到用植酸酶处理的58.2和58.9％(趋向)。这导致接受植酸酶的阉母鸡中磷的排泄减少，与负对照相比，显著减少11％和12.7％(p＜0.05)。
实施例9烘焙实验维也纳面包用1,000克小麦粉(Pflzer Mühlenwerke，Mannheim，Type 550)、30克压缩酵母(Fala GmbH，Germany)、20克盐、50克抗坏血酸、580克水混合得到320克生面团块，然后烘焙成维也纳面包。所有成分在低速混合2分钟并高速(Diosna SP12 Mixer)混合6分钟后，生面团的温度是27℃，然后用布遮盖并在室温(22℃)的条件下放置10分钟。在第一次生面团醒面期后，将生面团分割成每块320克(允许±1克)并做成圆形。其后，进行第二次生面团醒面20分钟。在第二次生面团醒面期后，在机械装置中加工生面团并将其放在发酵盘中，用布遮盖。然后，生面包团在32℃在85％的相对湿度下发酵(最终熟化(maturation))，在70分钟的熟化期后烘焙。生面团/面包在有多个插入平面(“in einem mehrschienigen Ofen”)的烤箱(Winkler&Wachtel，Germany)中在235℃用5秒蒸汽喷射烘焙35分钟。
根据本发明，在烘烤实验中植酸酶(大肠杆菌植酸酶突变体Tyr200)不同效果与平行的不添加植酸酶的对照生面团进行了比较。对照面包的体积设为100％。
面包块的体积用油菜籽置换法(“Rapssamenverdrngungsverfahren”)测定。生面团的流变能力和面包的特性由有资格的应用专家/测试面包师凭感觉评估，并测量每次测试中三块面包的平均体积。
烘焙试验的结果概括在下表4中表4
评估标准
评估标准的解释力度生面团的硬度，由经验丰富的面包师评估。
体积最终校准后视觉评估生面团块(“Teigling”)的体积。
复原性最终校准后，对生面团增压以测试其保留气体的能力，并评估出现体积减少的量。
以上结果显示，根据本发明的植酸酶对生面团有稳定效果。
依据实施例7-9的实验显示，根据本发明的大肠杆菌植酸酶突变体Tyr200在作用效果上与野生型植酸酶没有差异。但是，根据本发明大肠杆菌植酸酶突变体Tyr200的特征在于，与野生型相比，分别在整个培养上清中具有更高活性以及有更高分泌效率的优点。
实施例10质粒pKDa41的构建质粒pKDa41包括在瑞氏木霉启动子和cbhI终止子控制下的大肠杆菌植酸酶基因(野生型)。其构建与质粒pKDa4的构建相当，除了植酸酶起始密码子上游的16个碱基对由CCGCGGACTGCGCATCATG变成了CCGCGGACTAGGCATCATG以及限制性酶切位点PacI紧随终止密码子的下游。
为了构建质粒pKD41，用PCR从质粒pKDa4上扩增大肠杆菌植酸酶基因(野生型)。PCR产物用AvrII和PacI酶切，并插入到质粒pAB489的SpeI和PacI切割位点，紧随在瑞氏木霉cbhI启动子之后。得到的质粒称作pKDa41并用限制性内切酶作图，植酸酶的序列经测序确证。从质粒pKDa41中分离的表达盒(NotI片断)与pKDa4中的表达盒含有同样的遗传物质。用质粒pKDa41作起始材料以减少多样化的植酸酶变异体，并作为在瑞氏木霉RH3780d中检测植酸酶表达的参照。
质粒pAB489来自质粒pALK487(WO 94/28117)，在pALK487的cbhI启动子和cbhI终止子之间的SacII位点插入了其他的限制性酶切位点(SpeI和PacI)以及出现在实施例2中的质粒pALK424(WO 93/24621)上的长4.78kb的EcoRI/SpeI酶切片断，并含有amdS标记和cbhI的3’侧翼序列。元件的位置与pKDa4中的一样，并允许将基因变体直接克隆到瑞氏木霉的cbhI启动子之后的多克隆位点的SpeI和PacI酶切位点上。
实施例11植酸酶变体质粒的构建构建下面的植酸酶变体质粒pPhy-V200L，pPhy-V200P，pPhy-L207F。
为了产生植酸酶的变体，用与已报道的原理(Nucleic Acids Research1989，17(2)，723-733和Nucleic Acids Research 1990，18(6)，1656)类似的PCR方法实施植酸酶的突变。构建以及植酸酶变体质粒的克隆与实施例10中报道的质粒pKD41的制备一样。植酸酶变体的序列通过测序确证。
实施例12分别用pKDa41和变体转化瑞氏木霉RH3780从实施例10的质粒pKDa41和实施例11的植酸酶变体质粒中分离表达盒，并转化瑞氏木霉RH3780d，其方法与从质粒pKDa2和pKDa4(实施例3)分离的表达盒转化方法类似。分离的表达盒是来自质粒pKDa2、pKDa4、pKDa41和植酸酶变体质粒的NotI片断。
实施例13pKDa41和植酸酶变体表达盒在摇瓶中生产大肠杆菌植酸酶转化子如实施例4中描述的那样培养，培养滤出液中的植酸酶用来作进一步的检测。
表5用含有pKDa41或植酸酶变体表达盒的转化子生产大肠杆菌植酸酶
序列表<110>AB酶有限公司<120>具有植酸酶活性的多肽和编码多肽的核苷酸序列<130>14052WO<140>
<141>
<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1230<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明成熟大肠杆菌野生型植酸酶的Tyr200突变体<220>
<221>CDS<222>(1)..(1230)<400>1cag agc gag ccc gag ctg aag ctg gag tcg gtc gtg atc gtc agc cgc48Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg1 5 10 15cac ggc gtg cgt gct cct acc aag gcc acg cag ctg atg cag gac gtc96His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val20 25 30acc cct gac gcc tgg ccc acc tgg ccc gtc aag ctt ggc tgg ctg act 144Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr35 40 45cct cgc ggc ggt gag ctc atc gcc tac ctc gga cac tac caa cgc cag 192Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln50 55 60cgt ctg gtt gcc gac gga ctc ctg gct aag aag gga tgc ccg cag tct 240Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Ser65 70 75 80ggc cag gtc gcg att atc gcc gat gtc gac gag cgt acc cgt aag acc 288Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr85 90 95
ggc gaa gcc ttc gct gcc ggc ctc gct cct gac tgt gcc atc acg gtc 336Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val100 105 110cac acc cag gca gac acg tcc agc ccc gat ccg ctg ttt aac cct ctc 384His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu115 120 125aag act ggc gtc tgc caa ctg gat aac gcc aac gtg acc gac gcc atc 432Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile130 135 140ctc agc agg gct gga ggt tcc atc gcc gac ttc acc ggc cat cgg cag 480Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg Gln145 150 155 160acg gcg ttc cgc gag ctg gag cgg gtc ctt aat ttt ccc cag tcg aac 528Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn165 170 175ctg tgc ctc aag cgt gag aag cag gac gag agc tgt tcc ctg acc cag 576Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln180 185 190gca ctc ccg tcg gaa ctc aag tac agc gcc gac aac gtc tcc ctt acc 624Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Tyr Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr195 200 205ggt gcc gtt agc ctc gct tcc atg ctg acg gag atc ttc ctc ctg cag 672Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln210 215 220caa gcg cag gga atg ccc gag cct ggg tgg ggc cgc att acc gat tct 720Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser225 230 235 240cac cag tgg aac acc ctg ctc tcg ctt cac aac gcc cag ttc tat ctg 768His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr Leu245 250 255ctc caa cgc acg ccc gag gtt gcc cgc agc cgc gcc acc ccg ctg ctc 816Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu260 265 270gac ctc atc aag act gcg ctg acg ccc cac cct ccg cag aag cag gct 864Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala275 280 285
tac ggt gtc acc ctc ccc act tcc gtc ctg ttt atc gcc ggt cac gac 912Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp290 295 300acc aac ctg gcc aat ctc ggc ggc gct ctg gag ctc aac tgg acg ctt 960Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu305 310 315 320ccc gga cag ccg gat aac act ccc cct ggc ggt gag ctg gtg ttc gaa 1008Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu325 330 335cgc tgg cgt cgg ctc agc gac aac tcc cag tgg att cag gtt tcg ctg 1056Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu340 345 350gtc ttc cag acc ctg cag cag atg cgc gac aaa acg ccc ctg tcc ctc 1104Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu355 360 365aat acc cct ccc ggc gag gtc aag ctg acc ctg gca ggc tgt gaa gag 1152Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu370 375 380cgc aac gcc cag ggc atg tgc tct ctc gct ggc ttt acg caa atc gtg 1200Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val385 390 395 400aac gag gcc cgc atc ccc gct tgc tct ctg 1230Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu405 410<210>2<211>410<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列的说明成熟大肠杆菌野生型植酸酶的Tyr 200突变体<400> 2Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg1 5 10 15His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val20 25 30Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr35 40 45Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Ser65 70 75 80Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr85 90 95Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val100 105 110His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu115 120 125Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile130 135 140Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg Gln145 150 155 160Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn165 170 175Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln180 185 190Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Tyr Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr195 200205Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln210 215 220Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser225 230 235 240His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr Leu245 250 255Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu260 265 270Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala275 280 285Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp290 295 300Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu305 310 315 320Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu340 345 350Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu355 360 365Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu370 375 380Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val385 390 395 400Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu405 410<210>3<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明修饰的黑曲霉植酸酶信号序列(无内含子)<220>
<221>CDS<222>(1)..(54)<400>3atg ggc gtc tct gct gtt cta ctt cct ttg tat ctc ctg tct gga gtc48Met Gly Val Ser Ala Val Leu Leu Pro Leu Tyr Leu Leu Ser Gly Val1 5 10 15acc tcc54Thr Ser<210>4<211>18<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列的说明修饰的黑曲霉植酸酶信号序列(无内含子)<400>4Met Gly Val Ser Ala Val Leu Leu Pro Leu Tyr Leu Leu Ser Gly Val1 5 10 15Thr Ser
权利要求
1.重组DNA分子，在原核或真核宿主细胞中表达时，其编码具有植酸酶活性的多肽，其中，所述重组DNA分子包含的DNA序列选自a)由成熟的野生型大肠杆菌植酸酶序列变异得到的DNA序列，与野生型序列比较，其在位置189-211区域内和/或在位置137-152区域内的至少一个氨基酸发生突变，b)与a)中序列具有70％-100％同源性的DNA序列，c)由于遗传密码的简并性而与a)和b)中序列相关的DNA序列，其中所述重组DNA分子在合适的宿主细胞中表达时，伴随着培养上清中所编码蛋白质活性的增加。
2.根据权利要求1的重组DNA，其特征在于，与野生型大肠杆菌植酸酶序列相比，其在位置197-209区域内和/或在137-152区域内的至少一个氨基酸发生突变。
3.根据权利要求2的重组DNA分子，其特征在于，在位置198、200、205、207和/或在位置144、145和152处的至少一个氨基酸发生突变。
4.根据权利要求1的DNA序列，其特征在于，至少一个突变选自Val 200→Leu、Val 200→Ile、Val 200→Pro、Val 200→Tyr、Leu 198→Ile、Val 205→Leu、Val 205→Ile、Leu 207→Tyr、Leu 207→Phe和/或Ile 144→Tyr、Leu 145→Ile和Ile 152→Phe。
5.根据权利要求1-4中任一项的重组DNA分子，特征在于其具有SEQ ID NO1的序列。
6.具有植酸酶活性的多肽，由根据权利要求1-5中任一项的重组DNA分子编码，或通过由之转化的宿主细胞表达获得。
7.根据权利要求6的多肽，特征在于其具有SEQ ID NO2的序列。
8.DNA构建体，在引入到合适的宿主细胞中时，能够控制突变的植酸酶基因在宿主中表达，特征在于，其含有任选的启动子、任选的信号序列和标记序列、根据权利要求1-5中任一项的DNA序列、终止子和任选的5’和3’侧翼序列。
9.根据权利要求8的DNA构建体，其特征在于，启动子是纤维素二糖水解酶I、纤维素二糖水解酶II、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、木聚糖酶或烯醇化酶的启动子。
10.根据权利要求8的DNA构建体，其特征在于，信号序列是任选修饰的来自黑曲霉的植酸酶信号序列。
11.具有转化宿主细胞能力的载体，特征在于，所述载体含有根据权利要求8的构建体。
12.根据权利要求11的载体，特征在于，它是质粒Da2pUC3，保藏号为DSM 16396。
13.转化的宿主细胞，选自真菌、酵母、细菌和哺育动物细胞，含有根据权利要求1-5中任一项的重组DNA分子，并具有表达具有植酸酶活性多肽的能力。
14.根据权利要求13的转化的宿主细胞，特征在于，它属于曲霉菌属、根霉菌属、木霉菌属、脉孢菌属、毛霉菌属或青霉菌属。
15.生产植酸酶的方法，特征在于，在有利于形成植酸酶的条件下培养根据权利要求13或14的转化的宿主细胞，并分离所产生的植酸酶。
16.组合物，包含根据权利要求6或7的多肽，任选地还包含其他辅剂和/或活性剂。
17.根据权利要求16的组合物，特征在于它是食品或饲料组合物。
18.根据权利要求16或17的组合物，特征在于组合物是烘焙助剂。
19.根据权利要求6或7的多肽在制备改善动物和人类营养中磷利用的制品中的用途。
20.根据权利要求6或7的多肽在改善生面团的流变学特性以生产烘焙产品中的用途。
21.信号序列，具有SEQ ID NO3的序列且来自黑曲霉植酸酶基因。
全文摘要
本发明涉及重组DNA分子，在原核或真核宿主细胞中表达时，其编码具有植酸酶活性的多肽。其中所述重组DNA分子包含的DNA序列选自a)由成熟的野生型大肠杆菌植酸酶序列变异得到的DNA序列，与野生型序列相比，其在位置189－211区域内和/或在位置137－152区域内的至少一个氨基酸发生突变；b)与a)中序列有70％－100％同源性的DNA序列；c)由于遗传密码的简并性而与a)和b)中序列相关的DNA序列。其中当所述重组DNA分子在合适的宿主细胞中表达时，伴随着培养上清中所编码蛋白质活性的增加。本发明还涉及由所述DNA分子编码的蛋白质。
文档编号C12N15/55GK101080491SQ200580042928
公开日2007年11月28日 申请日期2005年10月14日 优先权日2004年10月15日
发明者K·Q·源, B·温特尔 申请人:Ab酶有限公司