专利名称：一种人白细胞介素21的核苷酸序列及生产成熟的人白细胞介素21的方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及一种在原核细胞中表达成熟的人白细胞介素21的核苷酸序列，本发明还涉及利用该核苷酸序列生产成熟的人白细胞介素21的方法和该序列在制药中的应用。
背景技术：
白细胞介素21(Interleukin 21，IL-21)是近年来新发现的细胞因子，与白细胞介素2、白细胞介素15及白细胞介素4高度同源，具有广泛的生物学活性，主要体现在协同刺激T淋巴细胞和B淋巴细胞、活化自然杀伤细胞(NK)，增强机体的特异性和非特异性免疫功能，从而发挥抗肿瘤和免疫调节的作用，是一种有较好开发前景的新型生物药物。
白细胞介素21只有活化的T淋巴细胞才能分泌。国外的相关研究都是以抗CD3抗体等价格昂贵的活化剂才能得到白细胞介素21的转录和表达。
白细胞介素21的开放读码框编码产物为162个氨基酸的前体，在其第31位Gly处被酶切后表达131个氨基酸的成熟白细胞介素21蛋白质，其中有2对半胱氨酸残基参与其空间构象的折叠。由于原核细胞内缺乏这种蛋白质成熟的切除机制，故在原核表达体系中要想表达具有生物学活性的白细胞介素21，必须去除其N端31个氨基酸的编码基因序列。同时经过相关分析发现，白细胞介素21成熟蛋白质编码基因序列中有三分之一(44/132)的大肠杆菌罕见密码子，故其很难在大肠杆菌表达体系中表达或表达量很低(低于10％)。国外相关机构表达人白细胞介素21都是用真核表达系统进行，2003年日本学者用原核表达体系表达人白细胞介素21时，并没有采用原始的人白细胞介素21基因序列，而是采用了人工合成序列，估计也是基于这种考虑。并且，大肠杆菌表达系统表达产物多存在于细胞质中，有些甚至形成包涵体，丧失其生物学活性。
通过定点突变的方法可以置换DNA序列中的单个或多个碱基，并且在密码子简并性的原则下不改变其编码产物的氨基酸的序列，得到高效的原核表达体系。目前没有采用这种方法制备人白细胞介素21原核表达体系，制备成熟的具有生物活性的人白细胞介素21。
发明内容
本发明的目的是提供一种在原核细胞中表达成熟的人白细胞介素21的核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供一种生产成熟的人白细胞介素21的方法。
本发明通过定点突变的方法置换人白细胞介素21编码基因序列中原核细胞罕见密码子，使其变换为原核细胞偏好密码子，从而得到可以在原核细胞中高效表达的人白细胞介素21突变编码基因序列，并制备该序列的高效原核表达系统，从而可以直接获得成熟的具有生物学活性的人白细胞介素21。
本发明的目的是通过下列技术措施实现的一种人白细胞介素21的核苷酸序列，该序列为SEQ ID No.1。
所述核苷酸序列编码的人白细胞介素21成熟蛋白质的氨基酸序列，该序列为SEQID No.2。
利用核苷酸序列SEQ ID No.1生产成熟的人白细胞介素21的方法，该方法通过制备人白细胞介素21突变编码基因序列SEQ ID No.1，将该序列导入表达载体，形成重组载体，将重组载体转化原核细胞，培养增殖，诱导，提取，纯化，即可得到序列为SEQID No.2的成熟人白细胞介素21。
所述的方法，其中制备人白细胞介素21突变编码基因序列SEQ ID No.1的方法是通过定点突变的方法置换人白细胞介素21编码基因序列中原核细胞罕见密码子，使其变换为原核细胞偏好密码子，从而得到人白细胞介素21突变编码基因序列SEQ ID No.1所述的方法，其中重组载体为重组质粒rMuhIL-21/pET22b。该重组质粒可以在大肠杆菌表达体系中高效表达表达，且表达产物定位于质周腔，易于纯化，并具有生物学活性，可以作为生物工程药物。
所述的方法，其中原核细胞为大肠杆菌。
所述的核苷酸序列(SEQ ID No.1)或所述的氨基酸序列(SEQ ID No.2)在制备基因工程药物中的应用。所述的基因工程药物为免疫调节剂或抗肿瘤药物。
本发明的有益效果本发明首次用定点突变的方法获得原核细胞(如大肠杆菌)偏好的人白细胞介素21成熟蛋白质编码的突变核苷酸序列。
本发明采用pET22b表达体系表达人白细胞介素21，其表达产物位于质周腔内，保持了天然构象，从而可以直接获得成熟的具有生物学活性的人白细胞介素21。
本发明构建了rMuhIL-21/pET22b，其在大肠杆菌中可以高效表达，产物易于分离纯化，产物具有生物学活性，可以发挥免疫调节、抗肿瘤等作用，是新的基因工程药物。
本发明提供的核苷酸序列可以在原核细胞中直接高效表达出成熟的具有生物学活性的人白细胞介素21，该方法适于工业化大规模生产人白细胞介素21，该核苷酸序列及其表达的氨基酸序列可用于制备基因工程药物。
图1是本发明获得的人白细胞介素21成熟蛋白质编码核苷酸(gbc)和GenBank原始人白细胞介素21蛋白质编码核苷酸(ori)比对图。下划线者为核苷酸突变。
图2是本发明获得的人白细胞介素21成熟蛋白质氨基酸组成(gbc)和GenBank原始人白细胞介素21蛋白质氨基酸组成(ori)比对图。下划线者为氨基酸突变。
图3是本发明获得的人白细胞介素21成熟蛋白质促进人T淋巴细胞增殖和协同增殖的实验结果图。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1人白细胞介素21成熟蛋白质编码基因及其高效原核表达系统的建立具体操作包括以下步骤1、人T淋巴细胞的活化及总RNA的提取取正常志愿者外周静脉血2份，以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)，混合重悬于含10％小牛血清的RLM-1640完全培养基，加入PHA 5μg/106细胞，培养48小时。收集活化的细胞。将细胞离心后加Tritrol 1ml，裂解2min后加200μl氯仿，剧烈混匀，12000rpm离心，吸取水相后以异丙醇沉淀，最后以不含有RNA酶的水溶解，95℃变性后-20℃保存。
2、RT-PCR扩增人白细胞介素21成熟蛋白基因编码区按常规方法AMV酶，随机引物进行逆转录反应(42℃，1hour)。逆转录产物进行PCR反应。反应参数为94℃预变性2min；94℃，1min；54℃，30sec；72℃，30sec，共35个循环；最后1个循环，72℃延伸7min。然后置于4℃终止反应并储存。根据质粒载体和GenBank登录的IL-21基因序列自行进行引物设计，上游引物GBup为5’-tgtcgctagctcctggagac tca-3’(SEQ ID No.5)；下游引物GBlow为5’-ccgggatatcctaggagaga tg-3’(SEQ IDNo.6)。上下游引物序列中下划线部分分别是Nhe I和Hind III酶切位点，扩增出IL-21分子成熟段基因编码序列。
3、PCR产物的定向克隆PCR产物和质粒载体(pET22b)分别用Nhe I和Hind III双酶切，用PCR产物纯化试剂盒纯化。紫外分光光度计定量。连接及连接产物的转化扩增按3∶1(IL-21质粒)的摩尔比混合待连接片段和切开的载体，于4℃反应12h。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，卡那霉素琼脂平板筛选。取阳性单克隆扩增，PCR初步筛选阳性克隆，并抽提出重组hIL-21/pET22b质粒。
重组质粒的鉴定酶切电泳鉴定重组质粒用Nhe I和Hind III双酶切，电泳鉴定。
测序鉴定测序引物为T7启动子(5’-taa tac gac tca cta tag gga ga-3’)。送Invitrogene公司进行自动测序，测得序列为SEQ ID No.3。
根据以上序列(SEQ ID No.3)，使用生物软件，得出人白细胞介素21成熟蛋白质的化学一级结构(氨基酸序列)为SEQ ID No.4。
4、hIL-21/pET22b质粒的诱导表达将鉴定过的质粒转化入表达大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后，涂于LA平板。挑选单个克隆于2ml液体培养基中。培养过夜后转接于1L液体培养基继续培养至OD600约0.6时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续于37℃振荡培养。收集诱导培养产物，12％SDS-PAGE电泳鉴定表达情况。结果显示目的蛋白质无表达。
5、突变基因的获得自行设计突变引物，以hIL-21基因为模板，PCR扩增出相应突变的片段。最后以GB1(SEQ ID No.7)和GBlow(SEQ ID No.6)为上下游引物(GB15’-tgtcgctagc ccatggatcg tc-3’)，以稀释的上述产物为模板，扩增出完整的定点突变hIL-21基因(MuhIL-21)。
6、MuhIL-21/pET22b质粒的构建以Nhe I和Xho I分别酶切MuhIL-21 PCR产物和pET22b质粒，纯化后以T4 DNA连接酶连接。连接产物转化DH5α后，PCR筛选阳性克隆后，酶切和测序鉴定其序列，序列结果为SEQ ID No.1。
根据以上序列，使用生物软件，得出突变人白细胞介素21成熟蛋白质的化学一级结构(氨基酸序列)为SEQ ID No.2。
本发明中编码人白细胞介素21的突变基因序列和GenBank原始报道序列有95个核苷酸突变，具体位置和突变情况如图1及表1所示。
本发明中突变人白细胞介素21成熟蛋白质氨基酸序列和GenBank原始蛋白质氨基酸序列只有1个突变，具体位置及突变情况如图2及表2所示。
表1编码人白细胞介素21的突变基因序列和GenBank原始序列核苷酸突变情况
表2突变人白细胞介素21成熟蛋白走和GenBank原始蛋白质氨基酸突变情况
7、MuhIL-21/pET22b质粒的表达将鉴定过的质粒转化入表达大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后，涂于LA平板。挑选单个克隆于2ml液体培养基中。培养过夜后转接于1L液体培养基继续培养至OD600约0.6时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续于37℃振荡培养。收集诱导培养产物，12％SDS-PAGE电泳鉴定表达情况。结果显示目的蛋白质的表达约占菌体蛋白质总量的40％。
8、表达产物的Western Blot鉴定IPTG诱导产物经12％SDS-PAGE电泳后，电转移到PVDF膜上。PVDF膜以PBST洗涤后，以含5％脱脂奶粉的PBST封闭1h。封闭后的PVDF膜洗涤后分别以hIL-21单抗(羊抗人，1∶200，37℃，2h)和HRP标记的二抗(兔抗羊，1∶2000，37℃，1h)孵育。抗体孵育后洗涤，加DAB和H2O2，避光放置5-10min显色。结果显示表达产物为人白细胞介素21。
9、rhIL-21蛋白质的分离纯化挑取MuhIL-21/pET22b单克隆，2ml LA液体培养基培养过夜，转接到1L培养基培养至OD600约0.6时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续培养8h，收集菌体。将上述收集的菌体以PBS重悬后离心去上清。沉淀以高渗缓冲液重悬，0℃渗透30min后，离心收集上清。分别以CM-52纤维素离子交换层析和Sephedax 50凝胶层析柱纯化。反相层析检测结果显示纯度达到95％。
10、rhIL-21蛋白质生物学活性检测Ficoll分离正常志愿者抗凝静脉血中单个核淋巴细胞(PBMC)，以抗CD3抗体及磁珠包被二抗分离T细胞，调整细胞浓度为1×106/mL。以上述分离的T细胞作为效应细胞，以不同浓度的rhIL-21(100ng-10μg)为刺激因子，分单独刺激组和协同刺激组。以抗CD3抗体作为增殖实验的阳性对照和协同刺激因子，每组设3复孔，每孔加入以上所得T细胞悬液，培养48h后检测细胞总数。结果显示rhIL-21可以协同增强T细胞增殖活性(见图3)，说明重组人白细胞介素21具有良好的免疫调节活性。
11、rhIL-21蛋白质抗肿瘤活性检测Ficoll分离正常志愿者抗凝静脉血中单个核淋巴细胞(PBMC)，加入rhIL-21蛋白质，使其浓度达到1ug/106细胞。分别以刺激活化和没有刺激活化的淋巴细胞作为效应细胞，人肝癌细胞SMMC-7721为靶细胞，效靶比50比1，每组设4复孔，培养48小时，培养过程中再分别设置组别加入或不加rhIL-21蛋白质，终浓度为0.1ug/ml。培养结束以Promega公司的CellTiter-Blue Cell ViabilityAssay试剂盒检测，结果以抑瘤活性表示，计算公式如下抑瘤活性＝{(效应细胞组+靶细胞组)-效靶细胞组}/靶细胞组结果如下表
结果显示rhIL-21活化的淋巴细胞有良好的抗肿瘤细胞活性。
<110>中国药科大学<120>一种人白细胞介素21的核苷酸序列及生产成熟的人白细胞介素21的方法和应用<160>7<210>1<211>396<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>定点突变的人白细胞介素21的核苷酸序列<400>
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<211>131<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>由定点突变的人白细胞介素21的核苷酸序列表达的氨基酸序列<400>
Met Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp1 5 10 15Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala20 25 30Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe35 40 45Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile50 55 60Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn65 70 75 80Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser85 90 95Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu100 105 110Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser115 120 125Glu Asp Ser130<210>3<211>396<212>DNA<213>人白细胞介素21的核苷酸序列<400>
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Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp1 5 10 15Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala20 25 30Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe35 40 45Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile50 55 60Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn65 70 75 80Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser85 90 95Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu100 105 110Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser115 120 125Glu Asp Ser130<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工设计的引物<400>
tgtcgctagc tcctggagac tca 23<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工设计的引物<400>
ccgggatatc ctaggagaga tg 22<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工设计的引物<400>
tgtcgctagc ccatggatcg tc 2权利要求
1.一种人白细胞介素21的核苷酸序列，该序列为SEQ ID No.1。
2.权利要求1所述核苷酸序列编码的人白细胞介素21成熟蛋白质的氨基酸序列，该序列为SEQ ID No.2。
3.利用权利要求1所述核苷酸序列生产成熟的人白细胞介素21的方法，其特征在于制备人白细胞介素21突变编码基因序列SEQ ID No.1，将该序列导入表达载体，形成重组载体，将重组载体转化原核细胞，培养增殖，诱导，提取，纯化，即可得到序列为SEQ ID No.2的成熟人白细胞介素21。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于制备人白细胞介素21突变编码基因序列SEQ ID No.1的方法是通过定点突变的方法置换人白细胞介素21编码基因序列中原核细胞罕见密码子，使其变换为原核细胞偏好密码子，从而得到人白细胞介素21突变编码基因序列SEQ ID No.1
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于重组载体为重组质粒rMuhIL-21/pET22b。
6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述的原核细胞为大肠杆菌。
7.权利要求1所述的核苷酸序列或权利要求2所述的氨基酸序列在制备基因工程药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的基因工程药物为免疫调节剂。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的基因工程药物为抗肿瘤药物。
全文摘要
本发明公开了一种人白细胞介素21的核苷酸序列及生产成熟的人白细胞介素21的方法和应用。该核苷酸序列为SEQ ID No.1；该方法通过制备人白细胞介素21突变编码基因序列SEQ ID No.1，将该序列导入表达载体，形成重组载体，将重组载体转化原核细胞，培养增殖，诱导，提取，纯化，即可得到序列为SEQ ID No.2的成熟人白细胞介素21。本发明提供的核苷酸序列可以在原核细胞中直接高效表达出成熟的具有生物学活性的人白细胞介素21，该方法适于工业化大规模生产人白细胞介素21，该核苷酸序列及其表达的氨基酸序列可用于制备基因工程药物。
文档编号C07K14/54GK1869230SQ20061004076
公开日2006年11月29日 申请日期2006年5月31日 优先权日2006年5月31日
发明者陈国兵, 汤卫国, 吴梧桐 申请人:中国药科大学