微小rna的制作方法

专利名称：微小rna的制作方法
技术领域：
本发明领域一般地涉及植物分子生物学和植物生物工程领域。更特别地，本发明涉及抑制靶基因表达或减量调节靶基因的构建体和方法。
背景技术：
RNA干扰是指在动物中由小干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire et al.(1998)Nature 391806-811)。植物中的相应过程通常是指转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，在真菌中也称作压制(quelling)。转录后基因沉默过程被认为是进化保守的细胞防御机制，用于阻止外源基因的表达，一般为各种不同的生物区系和门(flora and phyla)所共有(Fire(1999)Trends Genet.15358-363)。这种防止外源基因表达的机制可能在通过特异性破坏病毒基因组RNA的同源单链RNA的细胞应答机制而应答衍生自病毒感染或转座子元件随机整合进宿主基因组的双链RNA(dsRNA)的产生中得以进化。细胞中dsRNA的存在通过还未被完全鉴定的机制触发RNAi应答。
一类新的小RNA分子在从动物至植物的众多真核生物中参与调节基因表达。这些小RNA或称微小RNA(microRNA)(miRNA；miR)是长度为20-22个核苷酸的分子，与靶信使RNA特异性碱基配对以抑制其翻译或诱导其降解。进来的报道已经从脊椎动物、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、果蝇和拟南芥(Arabidopsisthaliana)中鉴别了许多miRNA(Bartel(2004)Cell 116281-297；Heand Hannon(2004)Nature Reviews Genetics 5522-531)。
病毒如芜菁花叶病毒(TuMV)和芜菁黄化花叶病毒(TYMV)在世界范围内导致明显的农作物减产，并且对农业具有严重的经济影响(Morch et al.(1998)Nucleic Acids Res 166157-6173；Skotnicki et al.(1992)Arch Virol 12725-35；Tomlinson(1987)Ann Appl Biol 110661-681)。大多数(即使不是全部)植物病毒编码一或多种能抑制宿主转录后基因沉默(PTGS)机制的蛋白质，以保证其在宿主细胞中成功复制。PTGS是植物宿主通过触发对作为病毒基因组复制的中间体而产生的双链RNA的破坏而用于防御病毒的机制(Bernstein et al.(2001)Nature 409363-366；Hamilton and Baulcombe(1999)Science 286950-952；Zamore et al.(2000)Cell 3125-33)。
特异基因包括病毒基因的活性降低(也称作基因沉默或基因抑制)是植物遗传工程的一些方面所需要的。目前仍需要诱导针对广泛选择的靶基因的基因抑制并且以高效率产生靶基因的有效沉默的方法和构建体。
发明概述根据本发明的一个方面，提供了一种在细胞中对靶序列进行减量调节的方法及这种方法中使用的核酸构建体，以及这种核酸构建体中使用的多核苷酸。所述方法包括向细胞中导入能产生miRNA的核酸构建体并足够长时间地表达所述核酸构建体以产生miRNA，其中所述miRNA抑制靶序列的表达。所述核酸构建体包含编码能形成双链RNA或发夹结构的修饰的miRNA前体的多核苷酸，其中所述修饰的miRNA前体包含修饰的miRNA和与所述修饰的miRNA互补的序列，其中所述修饰的miRNA是被修饰为(i)与靶序列完全互补，或者(ii)除了GU碱基配对之外与靶序列完全互补的miRNA。正如本领域所熟知的，pre-miRNA形成发夹，在一些情况中其双链区可以非常短，例如长度不超过21-25bp。所述核酸构建体可进一步包含与所述多核苷酸可操纵地连接的启动子。细胞可以是植物细胞，即单子叶植物或双子叶植物细胞，包括但不限于玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、高粱、粟(millet)、向日葵、红花、棉花、大豆、canola、苜蓿、Arabidopsis及烟草。所述启动子可以是病原体诱导型启动子或者其它诱导型启动子。修饰的miRNA与靶RNA的结合导致靶RNA裂解。靶RNA的靶序列可以是编码序列、内含子或者剪接位点。
根据另一方面，本发明提供了一种编码修饰的植物miRNA前体的分离的多核苷酸，所述修饰的前体能形成双链RNA或者发夹结构，并包含修饰的miRNA及与所述修饰的miRNA互补的序列，其中所述修饰的miRNA是被修饰为(i)与靶序列完全互补，或者(ii)除了GU碱基配对之外与靶序列完全互补的miRNA。所述多核苷酸的表达产生miRNA前体，其在宿主细胞中被加工以提供抑制靶序列表达的成熟miRNA。所述多核苷酸可以是核酸构建体或者可以是修饰的植物miRNA前体。所述核酸构建体可进一步包含与所述多核苷酸可操纵地连接的启动子。所述启动子可以是病原体诱导型启动子或者其它诱导型启动子。所述修饰的miRNA与靶RNA的结合导致靶RNA裂解。靶RNA的靶序列可以是编码序列、非编码序列或者剪接位点。
根据本发明的另一方面，提供了一种抑制多个靶序列的核酸构建体。所述核酸构建体包含至少两个及直至45个或更多个多核苷酸，每个多核苷酸编码能形成双链RNA或发夹结构的miRNA前体。每个miRNA与本文所述的靶基本上互补或者被修饰为与所述靶互补。在一些实施方案中，构建体中的每个编码前体miRNA的多核苷酸均单独地置于一个启动子的控制下。在一些实施方案中，编码前体miRNA的多个多核苷酸可操纵地连接在一起，由此它们可置于一个启动子的控制下。启动子可以可操纵地与多个miRNA的构建体连接或者多个miRNA的构建体可以被插入宿主基因组中，由此其与一个单启动子可操纵地连接。启动子可以是病原体诱导型启动子或者其它诱导型启动子。在一些实施方案中，所述多个多核苷酸彼此连接，从而当表达时形成一个单转录物。所述核酸构建体中多核苷酸的表达产生多个miRNA前体，它们在宿主细胞中被加工提供多个成熟miRNA，每个成熟miRNA抑制一个靶序列的表达。在一个实施方案中，每个成熟miRNA与每个靶RNA的结合导致每个靶RNA的裂解。靶RNA的靶序列可以是编码序列、非编码序列或剪接位点。
根据本发明的另一方面，提供了一种在细胞中减量调节多个靶序列的方法。所述方法包括向细胞中导入能产生多个miRNA的核酸构建体，并表达所述核酸构建体足够长时间以产生多个miRNA，其中每个miRNA抑制靶序列的表达。所述核酸构建体包含至少两个及直至45个或更多个多核苷酸，每个多核苷酸编码能形成双链RNA或发夹结构的miRNA前体。每个miRNA与本文所述的靶基本上互补或者被修饰为与本文所述的靶互补。在一些实施方案中，构建体中的每个编码前体miRNA的多核苷酸均单独地置于一个启动子的控制下。在一些实施方案中，编码前体miRNA的多个多核苷酸连接在一起，由此它们可置于一个单启动子的控制下。在一些实施方案中，所述多个多核苷酸彼此连接，当表达时形成一个单转录物。在一些实施方案中，所述构建体可以是杂聚的pre-miRNA或者同聚的pre-miRNA。核酸构建体中的多核苷酸的表达产生多个miRNA前体，它们在宿主细胞中被加工提供多个成熟miRNA，每个成熟miRNA抑制一个靶序列的表达。在一个实施方案中，每个成熟miRNA与每个靶RNA的结合导致每个靶RNA的裂解。靶RNA的靶序列可以是编码序列、非编码序列或者剪接位点。
根据本发明的另一方面，提供了包含本发明的分离的多核苷酸或核酸构建体的细胞。在一些实施方案中，本发明的分离的多核苷酸或核酸构建体可以插入细胞的基因或转基因的内含子中。所述细胞可以单子叶植物或双子叶植物细胞，包括但非限于玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、高粱、粟、向日葵、红花、棉花、大豆、canola、苜蓿、Arabidopsis及烟草。
根据本发明的另一方面，提供了一种包含所述分离的多核苷酸或核酸构建体的转基因植物。在一些实施方案中，本发明的分离的多核苷酸或核酸构建体可以插入转基因植物的基因或转基因的内含子中。所述转基因植物可以是单子叶植物或双子叶植物，包括但非限于玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、高粱、粟、向日葵、红花、棉花、大豆、canola、苜蓿、Arabidopsis及烟草。
根据本发明另一方面，提供了一种抑制细胞中靶序列表达的方法，所述方法包括(a)向细胞中导入包含修饰的植物miRNA前体的核酸构建体，所述修饰的植物miRNA前体包含第一个和第二个寡核苷酸，其中所述第一个或第二个寡核苷酸中的至少一个与所述前体是异源的，其中所述第一个寡核苷酸编码与靶序列基本相同的RNA序列，第二个寡核苷酸编码与靶序列基本互补的miRNA，从而所述前体编码miRNA；和(b)将所述核酸构建体表达足够长的时间以产生miRNA，其中所述miRNA抑制靶序列的表达。
根据本发明的另一方面，提供了一种包含修饰的植物miRNA前体的分离的多核苷酸，所述修饰的前体包含第一个和第二个寡核苷酸，其中所述第一个或第二个寡核苷酸中的至少一个与所述前体是异源的；其中第一个寡核苷酸编码与靶序列基本相同的RNA序列，第二个寡核苷酸包含与靶序列基本互补的miRNA，其中所述多核苷酸的表达产生抑制靶序列表达的miRNA。本发明还涉及包含这种分离的多核苷酸的细胞。所述细胞可以是植物细胞，单子叶植物或双子叶植物细胞，包括但非限于玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、高粱、粟、向日葵、红花、棉花、大豆、canola、苜蓿、Arabidopsis及烟草。
根据本发明另一方面，提供了一种抑制细胞中靶序列表达的方法，所述方法如本文所述的任何方法，进一步包括产生转化的植物，其中所述植物包含编码所述miRNA的核酸构建体。本发明还涉及通过这些方法产生的植物。所述植物可以是单子叶植物或双子叶植物，包括但非限于玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、高粱、粟、向日葵、红花、棉花、大豆、canola、苜蓿、Arabidopsis及烟草。
附图简述

图1示出由miR172a-2周围的序列形成的预测的发夹结构。成熟微小RNA(microRNA)由灰色方框标示。
图2示出miR172a-2过表达表型。a野生型(Columbia生态型)植物，3.5周龄。bEAT-D植物，3.5周龄。c野生型花。dEAT-D花。注意没有第二轮生器官(花瓣)。箭头表示萼片，有沿着边缘的胚珠和顶端柱头乳突(stigmatic papillae)。e35S-EAT植物的茎叶缘。箭头指示从边缘伸出的柱头乳突束。f从35S-EAT植物茎叶叶腋形成的孤立雌蕊群(箭头所示)。
图3示出EAT基因含有与APETALA2(AP2)互补的miRNA。a染色体5上的EAT基因的位置。图中示出了T-DNA插入和35S增强子的方向。在EAT基因下面示出了相应于miR172a-2的21nt的序列(SEQ ID NO86)。b在AP2的基因结构下面示出了推定的21ntmiR172a-2/AP2RNA双链体。双链体中的GU摆动以下划线标示。cAP2 21nt区域(黑色线条所示)及周围序列与三个其它ArabidopsisAP2家族成员和两个玉米AP2基因(IDS1和GL15)的排列对比。dmiR172a-2miRNA(黑色线条所示)及周围序列与Arabidopsis、番茄、大豆、马铃薯和水稻的miR172-样序列的排列对比。
图4示出miR172a-2miRNA表达。a对野生型(第3和7列)和EAT-D(第4和8列)的总RNA进行的Northern印迹分析。将印迹用miR172a-2miRNA的有义(第1-4列)或反义(第5-8列)寡核苷酸探查。加样100pg的有义寡核苷酸(第2和6列)和反义寡核苷酸(第1和5列)作为杂交对照。核苷酸大小标记在左侧标示。b对miR172a-2miRNA的S1核酸酶作图。未消化的5’-末端标记的探针(第1列)，或者在与野生型(第2列)、EAT-D(第3列)或者tRNA(第4列)的总RNA杂交后消化的5’-末端标记的探针。
图5示出miR172家族成员的发育表达模式。a来自在萌发后第2、5、12和21天收获的野生型幼苗(分别为第1-4列)或者来自成熟叶(第5列)及花芽(第6列)的总RNA的RT-PCR。PCR引物标示在左侧。b相对于野生型(Col)，在指示的突变体中的mirR172表达的Northern分析。将印迹用针对miR172a-2的寡核苷酸探查，然而所有miR172成员均应交叉杂交。
图6示出推定的EAT靶基因的表达分析。a分离自野生型(Col)或EAT-D花芽的polyA+RNA的Northern印迹分析。杂交探针在右侧示出。b来自野生型或EAT-D花芽的蛋白质的Western印迹，用AP2抗体探查。RbcL，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的大亚基作为加样对照。
图7示出LAT-D的鉴别。aT-DNA插入体在LAT-D中的位置，位于At2g28550与At2g28560之间。4×35S增强子与At2g28550相隔大约5kb。b在野生型及LAT-D植物中At2g28550表达的RT-PCR分析。
图8示出EAT-D上位于(epistatic)LAT-D。EAT-D与LAT-D植物之间的遗传杂交，示出获得的F1植物及其开花时间(以莲座叶数目测定)。
图9示出At2g28550(2-28550)和At5g60120(6-60120)突变体的功能丧失。标示了每一品系中的T-DNA位置及内含子/外显子结构。
图10示出miR172miRNA家族的潜在功能。amiR172a-2及其亲缘(relatives)的时序表达可引起对AP2靶(例如At2g28550和At5g60120)的时序减量调节，一旦靶蛋白质低于临界阈值(星点线标示)则其可以触发开花。b在各种位置的Dicer裂解可以从miR172家族产生至少4种不同的miRNA(标示为具有miRNA共有序列的单一发夹结构)。图中标示了每种miRNA的5’和3’末端的序列，以椭圆形标示出不变的中间15个核苷酸。由各个miRNA识别的推定的靶在下方以括号标示。
图11A-11C示出设计为裂解Nicotiana benthamiana的八氢番茄红素去饱和酶(PDS)的人工microRNA(miRNA)。图11A示出在CaMV 35S启动子(35S)和NOS终止子(Tnos)控制下的pre-miR159a序列构建体的结构。成熟miRNA的方向和位置以箭头标示。图11B示出miR159a(SEQ ID NO141)中的点突变(以箭头标示)，使其变为miR-PDS159a(SEQ ID NO142)以与N.benthamiana PDS mRNA中的一个区域完全互补。图11C示出对农杆菌渗入(infiltrated)的N.benthamiana叶进行的Northern印迹分析显示在用空白载体(载体)或人工miRNA(miR-PDS159a)渗入1、2、3天后(d.p.i)的样品中miR-PDS159a、miR-PDS159a*及miR159的表达。
图12A-12B示出miR-PDS159a(SEQ ID NO142)导致PDSmRNA(SEQ ID NO143)裂解。图12A示出对用空白载体或miR-PDS159a渗入1或2天后(d.p.i.)的样品的PDS mRNA进行的Northern印迹分析(上组)。下组示出相同样品的EtBr-染色的琼脂糖凝胶。图12B示出miRNA的裂解位点。对用miR-PDS159a构建体渗入的样品进行5’RACE分析，6个克隆中的5个克隆的5’-末端序列标示出miRNA的裂解位点，以箭头标示。
图13A-13E示出miR-PDS169g的表达导致PDS mRNA裂解。图13A示出miR169g中的点突变(下划线处核苷酸)，由此使其转变为miR-PDSa169g(SEQ ID NO145)或者miR-PDSb169g(SEQ ID NO146)，以便与N.benthamiana PDS mRNA中两个不同区域完全互补。图13B示出两个不同的miR169g表达构建体的Northern印迹分析。总RNA提取自未被渗入的叶(C)或用含有在0.3kb(0.3kb)或2.0kb(2.0kb)片段中的前体miR169g序列的农杆菌渗入的叶或者对照Arabidopsis叶(+)中。箭头表示miR169信号的位置。图13C示出Northern印迹分析，示出在含有0.3kb构建体的被渗入的叶中miR-PDSa169g(a)和miR-PDSb169g(b)的表达，在用空白质粒(载体)渗入的对照组中无表达。图13D示出miRNA的裂解位点。对用miR-PDS169ga(SEQ ID NO145)和b(SEQ ID NO146)构建体渗入的叶进行5’RACE分析，从独立的克隆中鉴别的5’末端序列用箭头标示，并示出分析的克隆数。PDSmRNA是SEQ ID NO147和SEQ ID NO148。图13E示出Northern印迹分析以检测用携带空白载体(C)或表达miR-PDSa169g(a)或miR-PDSb169g(b)的构建体的农杆菌菌株渗入的植物中的PDS mRNA水平。
图14A-14C示出Nicotiana benthamiana rbcS mRNA的microRNA介导的裂解。图14A示出miR159a(SEQ ID NO141)中的点突变(以箭头标示)，使其变成miR-rbcS159a-A(SEQ ID NO149)，以与所有N.benthamiana rbcS mRNA的共有区(示作rbcS mRNA；SEQID NO150)互补。miRNAmRNA碱基对以垂直线标示，GU摆动碱基对以冒号标示。图14B示出对农杆菌渗入的N.benthamiana叶进行的Northern印迹分析，示出在用空白载体(C)或人工miRNA(A)渗入2天后(d.p.i)的样品中的miR-rbcS159a-A的表达。图14C示出用于检测B图中的相同样品中所有6个基因的rbcS mRNA丰度的RT-PCR分析。EF1αmRNA的扩增用作加样对照。
图15A-15B示出图11-14所示操作中使用的基因及相关序列的示意图。图15A示出用作参考序列的Lycopersicum esculetum的PDS基因，因为未知N.benthamiana的完整PDS基因(以虚线示出缺失节段)。大的灰色箭头表示由文中所述的miR-PDS构建体靶向的位置。小箭号表示用于5’RACE分析的引物。已知的N.benthamianaPDS片段连同序列起源一起标示。图15B示出用于装配rbcS基因序列的不同的报导序列。灰色箭头表示由miR-rbcS159a-A靶向的序列位置，箭号表示图14A-14C所示RT-PCR实验中使用的引物位置。
图16A-16B示出在Arabidopsis miR159a和miR169g中导入的改变的总结。图16A示出与miR159a(SEQ ID NO141)对比的miR-PDS159a(SEQ ID NO142)和miR-rbcS159a-A(SEQ ID NO149)序列。在每种情况中碱基改变以下划线标示，而未修饰的位置以星号标示。图16B示出与miR169g(SEQ ID NO144)对比的miR-PDSa169g(SEQID NO145)和miR-PDSb169g(SEQ ID NO146)序列。在每种情况中碱基改变以下划线标示，未修饰的位置以星号标示。
图17示出在野生型、突变体和转基因植物中Arabidopsis根毛的发育。A组野生型根示出许多根毛结构。B组在cpc突变体中极少有根毛。C组35S::CPC植物示出较多根毛。D组在gl2突变体中较多根毛。该图取自Wada et al.((2002)Development 1295409-5419)。
图18示出转基因植物中的Arabidopsis根毛发育。a组无诱导物(雌二醇)的XVE::pre-miRCPC159a。b组具有诱导物(雌二醇)的XVE::pre-miRCPC159a。c组无诱导物(雌二醇)的XVE::pre-miR159a。d组具有诱导物(雌二醇)的XVE::pre-miR159a。
图19示出转基因植物中的Arabidopsis根毛发育。a组35S::pre-miR159。b组35S::pre-miRCPC1159a。c组35S::pre-miRP69159a。
图20示出转基因植物中的Arabidopsis根毛发育。a组35S::pre-miR159。b组35S::pre-miRCPC159a。
图21A-21E表示设计一种聚合的pre-miRNA的方法的流程图。图21A三种不同的pre-miRNA(pre-miR A、pre-miR B和pre-miR C)的扩增产物，其中通过扩增加入AvrII、SpeI和XhoI位点。图21Bpre-miR A用SpeI和XhoI消化，pre-miR B用AvrII和XhoI消化。图21C将消化的pre-miR A和pre-miR B连接形成二聚体pre-miRNA。图21Dpre-miR A-B用SpeI和XhoI消化，pre-miR C用AvrII和XhoI消化。图21E将消化的pre-miR A-B和pre-miR C连接形成三聚体pre-miRNA。
图22是含有pre-miRPDS169g和pre-miRCPC3159a的二聚体构建体的图示。
图23A和23B示出成熟miRPDS169g(图23A)和miRCPC3159a(图23B)从二聚体构建体中成功产生。第1道是35S::pre-miRPDS169g，第2道是35S::CPC3159a，第3道是35S::pre-miRPDS1169g-CPC3159a。
图24示出miR159a前体的结构(SEQ ID NO161)。
图25示出用三种不同处理对miR-HC-Pro159a进行的Northern印迹分析(1)具有35S::pre-miR-HC-Pro159a的农杆菌细胞，(2)具有35S::HC-Pro的农杆菌细胞，及(3)具有35S::pre-miR-HC-Pro159a和35S::HC-Pro的农杆菌细胞。
图26示出对miR-P69进行的Northern印迹分析，进行4种不同处理(1)携带35S::pre-miR-P69159a的农杆菌细胞，(2)携带XVE::pre-miR-P69159a的农杆菌细胞，(3)携带35S::P69的农杆菌细胞，及(4)携带35S::pre-miR-P69159a和35S::P-69的农杆菌细胞。
图27示出对随机挑选的T235S::pre-miRHC-Pro159a转基因品系(植物)的成熟人工miRNA水平进行的Northern印迹分析。已知T2植物是转基因的，因为首先将其在含有卡那霉素的培养基上选择以除去野生型。T2植物是杂合(一个拷贝)或纯合的(两个拷贝)，比率应大约为2∶1。
图28示出对随机挑选的T235S::pre-miR-P69159a转基因品系(植物)的成熟人工miRNA水平进行的Northern印迹分析。
图29示出表达miR-HC-Pro159a人工miRNA的T2转基因植物对TuMV感染有抗性。在接种2周后(感染14天后)拍照。表达miR-HC-Pro159a的T2转基因植物(品系#11；图33B)产生正常的influorescences，而野生型植物和表达miR-P69159a的T2转基因植物(品系#1；图33B)示出病毒感染症状。标尺(bar)表示3cm。
图30示出由TuMV感染所致influorescences症状。(上组)在TuMV感染14天后，T2转基因的miR-P69159a植物(品系#1)和col-0植物示出在较短的花间节间的influorescences，而T2miR-HC-Pro159a转基因植物(品系#11)展示正常的influorescences发育。标尺表示1cm。(下组)TuMV感染的Arabidopsis植物的influorescences的特写观察。T2转基因miR-P69159a植物(品系#1)和col-0植物示出过熟利用期(senescence)和传粉缺陷，而T2转基因的miR-HC-Pro159a植物(品系#11)示出正常的花和长角果发育。对于模拟感染，仅用缓冲液接种植物。标尺表示0.2cm。
图31示出由TuMV感染所致长角果的症状。在TuMV-感染的T2转基因miR-P69159a植物(品系#1)和野生型(col-0)植物中，长角果较小并且发育不良。T2转基因miR-HC-Pro159a植物(品系#11)对TuMV感染有抗性，示出正常的长角果发育。接种缓冲液的植物(模拟接种的植物)用作对照。标尺代表0.5cm。
图32示出在不同的转基因和野生型植物的叶中对TuMV衣壳蛋白(CP)水平进行的Western印迹分析。
图33示出(A)对35S::miR-HC-Pro159a、35S::miR-P69159a和野生型(Col-o)的代表性植物进行的Western印迹分析，(B)对转基因植物产生的miRNA进行的Northern印迹分析。
图34示出对在不同的转基因和非转基因Arabidopsis中的TuMV进行的ELISA检测。
图35示出对pre-miR-P69159a、pre-miR-HC-Pro159a和pre-miR-P69159a-HC-Pro159a进行的Northern印迹分析，表明同源二聚体miRNA前体pre-miR-P69159a-HC-Pro159a可以产生成熟miR-P69159a和miR-HC-Pro159a。
图36示出其中miR-HC-Pro159a被置于CPC基因的内含子1或内含子2中的构建体。
图37示出对图36的构建体进行的Northern印迹分析，表明CPC转录物的内含子1和内含子2可用于产生人工miRNA。
图38示出其中pre-miR-HC-Pro159a被置于CPC内含子1或内含子2中同时pre-miR-P69159a被置于CPC基因的内含子2或内含子1中的构建体。
图39示出对图38的构建体进行的Northern印迹分析，表明可以使用CPC内含子在一个转录物中同时产生两种不同的人工miRNA。
发明详述近来发现小RNA在控制基因表达中起重要作用。许多发育过程包括开花的调节是由小RNA控制的。目前可以使用在植物中产生小RNA的转基因构建体在植物基因的基因表达中产生改变。
本发明提供了可用于抑制被靶向的序列的方法和组合物。所述组合物可用于任何类型的植物细胞，及用于包含适当加工成分(例如RNA干扰成分)的其它细胞，包括无脊椎动物和脊椎动物细胞。所述组合物和方法基于在Arabidopsis中发现的一种内源性miRNA沉默过程，可以使用一种类似的策略扩充所用方法中组合物和生物体的数目。所述方法可以加以调整以适合任何真核细胞系统。另外，本发明所述组合物和方法可在个体细胞、培养的细胞或组织或者在生物体体内或者在生物体的器官或其它部分中应用。
组合物通过编码与靶序列的一个区域基本互补的miRNA而选择性抑制靶序列。所述miRNA以核酸构建体形式提供，当所述核酸构建体被转录成RNA时预期形成发夹结构，该发夹结构由细胞加工产生miRNA，由此抑制靶序列的表达。
本发明提供了一种编码针对任何特定靶序列的miRNA的核酸构建体。任何miRNA均可插入该构建体中，由此所编码的miRNA选择性靶向和抑制靶序列。
本发明提供了一种抑制靶序列的方法。所述方法应用上述构建体，其中miRNA被设计为针对靶序列的一个区域并被插入该构建体中。在导入细胞中时，产生的miRNA抑制被靶向序列的表达。靶序列可以是内源性植物序列，或者是植物中的异源转基因。靶基因也可以是来自植物病原体如致病病毒、线虫、昆虫、或者霉菌或真菌的基因。
本发明提供了包含所述构建体和/或miRNA的植物、细胞和种子。典型地，所述细胞是植物细胞，但是也可以是其它真核细胞，包括但非限于酵母、昆虫、线虫或者动物细胞。植物细胞包括单子叶植物细胞和双子叶植物细胞。本发明还提供了包含所述构建体和/或miRNA的植物和种子。本发明还提供了包含所述构建体的病毒和原核细胞。
单位、前缀和符号以SI接受形式标明。除非特别指出，则核酸是以5’至3’方向从左至右书写；氨基酸序列是以从氨基至羧基方向从左至右书写。本说明书中列举的数字范围包括限定范围的数字本身并且包括限定范围内的每一整数。在本文中氨基酸可以IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的公知的三字母符号或者单字母符号表示。同样，核苷酸可以其通常公认的单字母代码表示。除非特别提供，本文所用软件、电学及电子学术语均如The New IEEE StandardDictionary of Electrical and Electronics Terms(5thedition，1993)所解释。如下对本说明书中提及的术语更充分地定义。
如本文所用，“核酸构建体”或“构建体”是指导入宿主细胞中的分离的多核苷酸。这种构建体可包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或修饰的核苷酸的任何组合。所述构建体可以被转录形成RNA，其中所述RNA能形成双链RNA和/或发夹结构。这种构建体可以在细胞中表达，或者是分离的或经合成产生。所述构建体可进一步包含启动子，或者便于所述构建体操纵或表达的其它序列。
如本文所用，“抑制(suppression)”或者“沉默”或者“抑制(inhibition)”可互换使用，表示与在野生型生物体中其正常表达水平相比靶序列产物的表达的减量调节。抑制包括与野生型表达水平相比降低大约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或者100％。
如本文所用，“编码”是指DNA序列被加工产生RNA和/或多肽。
如本文所用，“表达”是指从导入的构建体、内源DNA序列或者稳定掺入的异源DNA序列中产生RNA转录物。该术语还可以指从产生自任何上述DNA前体的mRNA中产生多肽。
如本文所用，对于核酸而言“异源”是指源自外来物种或者是合成设计的，或者如果来自相同物种核酸则与其天然形式相比在成分和/或基因组基因座方面通过有意人工干预而加以修饰的核酸。异源蛋白质可源自外来物种，或者如果来自相同物种则通过有意人工干预对其原始形式加以充分修饰。
“宿主细胞”是指含有导入的核酸构建体并支持所述构建体复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或者是真核细胞如真菌、酵母、昆虫、两栖动物、线虫或哺乳动物细胞。或者，宿主细胞是单子叶植物或双子叶植物细胞。单子叶植物宿主细胞的一个例子是玉米宿主细胞。
术语“导入”是指为将核酸或蛋白质提供进细胞中。导入包括将核酸掺入真核或原核细胞中，在这种情况中核酸可以掺入细胞的基因组中，该术语还包括为细胞暂时提供核酸或蛋白质。导入包括稳定或瞬时转化方法，以及有性杂交。
术语“分离的”是指材料如核酸或蛋白质是(1)大部分或基本上不含与在其天然发生的环境中发现的材料天然伴随或者相互作用的成分，或者(2)如果所述材料处于其天然环境中，则所述材料已经通过有意人工干预而被改变成分和/或被置于细胞中该材料天然位置之外的位置。
如本文所用，“miRNA”是指寡核糖核酸，其抑制包含靶序列转录物的多核苷酸的表达或者减量调节靶RNA。“miRNA前体”是指被加工产生成熟miRNA的较大的多核苷酸，并包括编码RNA前体的DNA，及包含miRNA的RNA转录物。“成熟miRNA”是指从miRNA前体的加工中产生的miRNA。“miRNA模板”是在核酸构建体中的编码miRNA的一个或多个寡核苷酸区。miRNA的“backside”区是多核苷酸构建体的一部分，其与miRNA模板基本上互补，并且预计与miRNA模板碱基配对。miRNA模板和backside可形成双链多核苷酸，包括发夹结构。如就天然miRNA所已知，成熟miRNA及其互补序列可含有错配及形成凸出(bulge)，并因此不需要完全互补。
如本文所用，短语“靶序列”及“感兴趣的序列”可互换使用。靶序列是指被选择抑制表达的核酸序列，并且不限于编码多肽的多核苷酸。靶序列包含与miRNA充分或完全互补的序列。靶序列可以是RNA或者DNA，也可以是包含靶序列的多核苷酸。
如本文所用，“核酸”是指多核苷酸，并包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。核酸也可以包括片段和修饰的核苷酸。
“核酸文库”是指分离的DNA或RNA分子的集合，其包含或者基本上代表指定生物体或该生物体组织的基因组的全部被转录部分。核酸文库如基因组或cDNA文库的构建如标准分子生物学参考文献所教导，如Berger and Kimmel，Guide to Molecular CloningTechniques，Methods in Enzymology，Vol.152，Academic Press，Inc.，SanDiego，CA(Berger)；Sambrook et al.，Molecular Cloning-A LaboratoryManual，2nd ed.，Vol.1-3(1989)；及Current Protocols in MolecularBiology，F.M.Ausubel et al.，Eds.，Current Protocols，a joint venturebetween Greene Publishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.(1994)。
如本文所用，“可操纵地连接”包括至少两个序列的功能连接。可操纵地连接包括启动子与另一个序列之间的连接，其中所述启动子序列起始并介导相应于该另一个序列的DNA序列的转录。
如本文所用，“植物‘包括植物或植物部分，包括但非限于植物细胞、植物组织如叶、茎、根、花和种子。
如本文所用，“多肽“是指蛋白质、蛋白质片段、修饰的蛋白质、氨基酸序列及合成的氨基酸序列。多肽可以是糖基化或非糖基化的。
如本文所用，“启动子”包括参与RNA聚合酶及其它蛋白质的识别与结合以起始转录的DNA区域。
术语“选择性杂交”包括在严格杂交条件下核酸序列与指定核酸靶序列的杂交，杂交程度高于(例如高出背景至少2倍)其与非靶核酸序列的杂交，并且基本排除非靶核酸。选择性杂交序列典型地彼此具有大约至少80％序列相同性，或者90％序列相同性，直至并包括100％序列相同性(即完全互补)。
术语“严格条件”或者“严格杂交条件”包括探针与其靶序列选择性杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同的情况中而有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴别与探针100％互补的靶序列(同源探查)。或者，可以调节严格条件以允许序列中有一些错配，以便检测到更低程度的相似性(异源探查)。通常地，探针的长度小于大约1000个核苷酸，任选小于500个核苷酸。
典型地，严格条件是其中盐浓度低于约1.5M Na+，典型为约0.01-1.0M Na+浓度(或者其它盐)，pH 7.0-8.3，对于短探针(例如10-50个核苷酸)温度为至少大约30℃，对于长探针(例如50个核苷酸以上)温度为至少大约60℃。严格条件也可以通过加入去稳定剂如甲酰胺而实现。举例性的低严格条件包括在37℃用30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)缓冲溶液杂交及在50-55℃于1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。举例性的中等严格条件包括在37℃在40-45％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中杂交，及在55-60℃在0.5×至1×SSC中洗涤。举例性的高严格条件包括在37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，及在60-65℃在0.1×SSC中洗涤。
特异性典型地是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可从Meinkoth andWahl((1984)Anal Biochem 138267-284)所述等式推出Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是一价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，L是杂交体碱基对长度。Tm是50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在指定离子强度和pH下)。每错配1％则Tm降低大约1℃，因此可以调节Tm、杂交和/或洗涤条件以与具有希望相同性的序列杂交。例如，如果需要序列相同性≥90％，则Tm可以降低10℃。通常，选择的严格条件是在指定离子强度和pH下较特定序列及其互补体的热解链温度低大约5℃。然而，非常严格的条件可利用较热解链温度(Tm)低1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤条件；中等严格条件可利用较热解链温度(Tm)低6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤条件；低严格条件可利用较热解链温度(Tm)低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤条件。使用所述等式、杂交和洗涤条件及希望的Tm，本领域技术人员理解杂交和/或洗涤条件的严格性可以变化。如果希望的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选提高SSC浓度以便可以使用较高的温度。关于核酸杂交的详尽指导见Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2″Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays″，Elsevier，New York(1993)；及Current Protocols in Molecular Biology，Chapter 2，Ausubel et al.，Eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)所描述。杂交和/或洗涤条件可应用至少10、30、60、90、120或者240分钟。
如本文所用，“转基因的”包括包含异源多核苷酸的植物或细胞。通常地，所述异源多核苷酸被稳定整合进基因组中，由此所述多核苷酸在连续的世代中传代。本文所用术语转基因的包括其基因型通过存在异源核酸而已被改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，所述异源核酸包括如此改变的最初那些转基因以及从最初的转基因中通过有性杂交或无性繁殖产生的那些转基因。本文所用术语“转基因的”不包括通过常规植物培育方法或者通过天然发生的事件如随机杂交授精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或者自发突变所致的基因组(染色体或染色体外)的改变。
如本文所用，“载体”包括用于将本发明的多核苷酸导入宿主细胞中的核酸。表达载体可以使得插入其中的核酸转录。
多核苷酸序列与靶基因的选择区域可具有实质相同性、同源性或者互补性。如本文所用，“实质相同性(substantial identity)”和“实质同源性”表示序列彼此具有序列相同性或同源性。通常地，实质相同或实质同源的序列具有大约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性，其中序列相同性百分比是在全部序列基础上，使用默认参数(GCG，GAP version 10，Accelrys，San Diego，CA)通过GAP排列对比而确定。GAP使用Needleman and Wunsch((1970)J Mol Biol48443-453)的算式，以发现匹配数最大化及序列缺口数最小化的两个完整序列的排列对比。具有100％相同性的序列是相同的。“实质互补性”是指序列彼此互补及碱基能彼此配对。在描述互补序列中，如果第一个序列的所有核苷酸与第二个序列均碱基配对，则这两个序列是完全互补的。
通过正向遗传学方法，鉴别了Arabidopsis中赋予发育表型的microRNA。这种miRNA即miR172a-2(Park et al.(2002)Curr Biol121484-1495)当过表达时导致早开花及花器官缺陷。miR172a-2的推定的靶是APETALA2样转录因子的小亚家族(Okamuro et al.(1997)Proc Natl Acad Sci USA 947076-7081)。miR172a-2的过表达减量调节这个家族的至少一个成员。另外，AP2样靶基因之一At2g28550的过表达，导致晚开花。这个结果结合At2g28550及另一种靶基因At5g60120的功能丧失分析结果，表明至少一些被miR172a-2靶向的AP2-样基因通常发挥开花阻抑物功能。过表达miR172-a2的EAT-D品系对光周期具有野生型应答。也鉴别了编码miRNA的基因组区域(SEQ ID NO1)，用于产生其中可插入其它针对靶序列的miRNA的盒(SEQ ID NO3)，及产生可用于克隆所述盒及表达所述miRNA的表达载体(SEQ ID NO44)。所述表达载体包含编码miRNA的1.4kb区域。这个区域在细胞中的表达被加工，产生抑制靶基因表达的miRNA。或者，所述miRNA可以合成产生并直接导入细胞中。
在一个实施方案中，提供了一种抑制靶序列的方法，包括向细胞中导入编码与靶实质互补的miRNA的核酸构建体。在一些实施方案中，所述miRNA包含大约10-200个核苷酸，大约10-15、15-20、19、20、21、22、23、24、25、26、27、25-30、30-50、50-100、100-150或者大约150-200个核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸构建体编码miRNA。在一些实施方案中，所述核酸构建体编码可以形成双链RNA或者包含所述miRNA的发夹结构的多核苷酸前体。在一些实施方案中，SEQ ID NO3的第39-59和107-127位核苷酸分别由miRNA模板的backside及miRNA模板置换。在一些实施方案中，这个新序列置换SEQ ID NO1的等价区域。在另外的实施方案中，这个新序列置换SEQ ID NO44的等价区域。
在一些实施方案中，所述核酸构建体包含一个修饰的内源性植物miRNA前体，其中所述前体已经被修饰为用设计为产生针对靶序列的miRNA的序列置换内源性miRNA编码区。在一些实施方案中，所述miRNA前体模板是miR172a miRNA前体。在一些实施方案中，所述miR172a前体来自双子叶植物或单子叶植物。在一些实施方案中，所述miR172a前体来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、番茄、大豆、水稻或者玉米。在一些实施方案中，所述miRNA前体是SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或者SEQ ID NO44。
在另一个实施方案中，所述方法包括一种抑制靶序列在细胞中表达的方法，包括(a)向细胞中导入包含与一种多核苷酸可操纵地连接的启动子的核酸构建体，其中所述多核苷酸以如下顺序包含(i)SEQ ID NO3的第1-38位核苷酸区域中的至少大约20个及直至38个连续核苷酸，(ii)由10至大约50个连续核苷酸组成的第一个寡核苷酸，其中所述第一个寡核苷酸与第二个寡核苷酸充分互补，(iii)SEQ ID NO3的第60-106位核苷酸区域中的至少大约20个及直至47个连续核苷酸，(iv)由10至大约50个连续核苷酸组成的第二个寡核苷酸，其中所述第二个寡核苷酸编码miRNA，所述第二个寡核苷酸与靶序列充分互补，和(v)SEQ ID NO3的第128-159位核苷酸区域中的至少大约20个及直至32个连续核苷酸；其中所述多核苷酸编码能形成发夹结构的RNA前体，和(b)将所述核酸构建体表达足够长的时间，以产生miRNA，其中所述miRNA抑制靶序列的表达。
在另一个实施方案中，所述方法包括选择基因的靶序列，及设计包含编码与靶序列充分互补的miRNA的多核苷酸的核酸构建体。在一些实施方案中，所述靶序列选自基因的任何区域。在一些实施方案中，所述靶序列选自非翻译区。在一些实施方案中，所述靶序列选自基因的编码区。在一些实施方案中，所述靶序列选自起始密码子上游的大约50至大约200个核苷酸的区域，包括起始密码子上游大约50-75、75-100、100-125、125-150或者150-200个核苷酸的区域。在另外的实施方案中，所述靶序列和/或miRNA基于拟南芥中Apetela2样基因的EAT抑制的多核苷酸及过程。在一些实施方案中，SEQ ID NO3的第39-59和107-127位核苷酸分别由miRNA模板的backside(第一个寡核苷酸)和miRNA模板(第二个寡核苷酸)置换。在一些实施方案中，这个新序列置换SEQ ID NO1的等价区域。在另外的实施方案中，这个新序列置换SEQ ID NO44的等价区域。
在一些实施方案中，miRNA模板(即编码miRNA的多核苷酸)及miRNA可包含相对于靶序列的一些错配。在一些实施方案中，所述miRNA模板与靶序列相比具有≥1个核苷酸错配，例如所述miRNA模板与靶序列相比可具有1、2、3、4、5或更多个错配。这种错配程度也可以通过确定miRNA模板与靶序列的互补序列的相同性百分比而加以描述。例如，所述miRNA模板与靶序列的互补序列具有大约至少70％、75％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的相同性百分比。
在一些实施方案中，miRNA模板(即编码miRNA的多核苷酸)及miRNA可包含相对于miRNA backside的一些错配。在一些实施方案中，所述miRNA模板与miRNA backside相比具有≥1个核苷酸错配，例如所述miRNA模板与miRNA backside相比可具有1、2、3、4、5或更多个错配。这种错配程度也可以通过确定miRNA模板与miRNA backside的互补序列的相同性百分比而加以描述。例如，所述miRNA模板与miRNA backside的互补序列可具有大约至少70％、75％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％相同性百分比。
在一些实施方案中，靶序列选自植物病原体。预期包含针对病原体的靶序列的miRNA的植物或细胞对所述病原体的敏感性降低和/或抗性增加。在一些实施方案中，miRNA由进一步包含一个可操纵地连接的启动子的核酸构建体编码。在一些实施方案中，所述启动子是病原体诱导型启动子。
在另一个实施方案中，所述方法包括用编码与靶基因的靶区域充分互补的miRNA的序列置换SEQ ID NO3的多核苷酸中的miRNA编码序列。
在另一个实施方案中，提供了一种抑制靶序列在细胞中表达的方法，所述方法包括
(a)向细胞中导入包含与一种多核苷酸可操纵地连接的启动子的核酸构建体，所述多核苷酸编码包含第一个和第二个寡核苷酸的修饰的植物miRNA前体，其中所述第一个或第二个寡核苷酸中的至少一个与所述前体是异源的，其中第一个寡核苷酸与第二个寡核苷酸充分互补，第二个寡核苷酸编码与靶序列充分互补的miRNA，其中所述前体能形成发夹结构；(b)使所述核酸构建体表达足够长的时间以产生miRNA，其中所述miRNA抑制靶序列的表达。
在另一个实施方案中，提供了一种抑制靶序列在细胞中表达的方法，所述方法包括(a)向细胞中导入包含与一种多核苷酸可操纵地连接的启动子的核酸构建体，所述多核苷酸编码包含第一个和第二个寡核苷酸的修饰的植物miR172 miRNA前体，其中所述第一个或第二个寡核苷酸中的至少一个与所述前体是异源的，其中第一个寡核苷酸与第二个寡核苷酸充分互补，第二个寡核苷酸编码与靶序列充分互补的miRNA，其中所述前体能形成发夹结构；(b)使所述核酸构建体表达足够长的时间以产生miRNA，其中所述miRNA抑制靶序列的表达。
在一些实施方案中，所述修饰的植物miR172 miRNA前体是修饰的Arabidopsis miR172 miRNA前体，或者修饰的玉米miR172miRNA前体等。
在另一个实施方案中，提供了抑制靶序列的核酸构建体。所述核酸构建体编码与靶充分互补的miRNA。在一些实施方案中，所述核酸构建体进一步包含与编码miRNA的多核苷酸可操纵地连接的启动子。在一些实施方案中，设计缺乏启动子的核酸构建体并导入细胞中，使其在整合进宿主基因组中时与启动子可操纵地连接。在一些实施方案中，所述核酸构建体使用重组整合，包括位点同源性重组。见例如并入本文作参考的PCT国际出版物No.WO 99/25821所述。在一些实施方案中，所述核酸构建体是RNA。在一些实施方案中，所述核酸构建体包含至少一个重组位点，包括位点特异性重组位点。在一些实施方案中，所述核酸构建体包含至少一个重组位点以便于所述构建体的整合、修饰或者克隆。在一些实施方案中，所述核酸构建体包含位于miRNA前体侧翼的两个位点特异性重组位点。在一些实施方案中，所述位点特异性重组位点包括FRT位点、lox位点、或者att位点，包括attB、attL、attP或attR位点。见例如并入本文作参考的PCT国际出版物No.WO 99/2582及美国专利5,888,732、6,143,557、6,171,861、6,270,969和6,277,608所述。
在一些实施方案中，所述核酸构建体包含一个修饰的内源性植物miRNA前体，其中所述前体已经被修饰为用设计用于产生针对靶序列的miRNA的序列置换miRNA编码区。在一些实施方案中，所述miRNA前体模板是miR172a miRNA前体。在一些实施方案中，所述miR172a前体来自双子叶植物或单子叶植物。在一些实施方案中，所述miR172a前体来自拟南芥、番茄、大豆、水稻或者玉米。在一些实施方案中，所述miRNA前体是SEQ ID NO1、SEQ IDNO3或者SEQ ID NO44。
在另一个实施方案中，所述核酸构建体包含分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码修饰的植物miRNA前体的多核苷酸，所述修饰的前体包含第一个和第二个寡核苷酸，其中所述第一个和第二个寡核苷酸中的至少一个与所述前体是异源的，其中第一个寡核苷酸与第二个寡核苷酸充分互补，第二个寡核苷酸包含与靶序列充分互补的miRNA，其中所述前体能形成发夹结构。
在另一个实施方案中，所述核酸构建体包含分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码修饰的植物miR172 miRNA前体的多核苷酸，所述修饰的前体包含第一个和第二个寡核苷酸，其中所述第一个和第二个寡核苷酸中的至少一个与所述前体是异源的，其中第一个寡核苷酸与第二个寡核苷酸充分互补，第二个寡核苷酸包含与靶序列充分互补的miRNA，其中所述前体能形成发夹结构。在一些实施方案中，所述修饰的植物miR172 miRNA前体是修饰的Arabidopsis miR172 miRNA前体，或者修饰的玉米miR172 miRNA前体等。
在一些实施方案中，所述miRNA包含大约10-200个核苷酸，大约10-15、15-20、19、20、21、22、23、24、25、26、27、25-30、30-50、50-100、100-150或者大约150-200个核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸构建体编码miRNA。在一些实施方案中，所述核酸构建体编码可形成双链RNA或包含miRNA的发夹结构的多核苷酸前体。在一些实施方案中，SEQ ID NO3的第39-59和/或107-127位核苷酸分别由miRNA模板的backside和miRNA模板置换。在一些实施方案中，这个新序列置换SEQ ID NO1的等价区域。在另外的实施方案中，这个新序列置换SEQ ID NO44的等价区域。在一些实施方案中，靶区域选自靶序列的任何区域。在一些实施方案中，靶区域选自非翻译区。在一些实施方案中，靶区域选自靶序列的编码区。在一些实施方案中，靶区域选自终止密码子上游的大约50至大约200个核苷酸的区域，包括终止密码子上游的大约50-75、75-100、100-125、125-150或者150-200个核苷酸区域。在另外一些实施方案中，靶区域和/或miRNA基于拟南芥中的Apetela2样序列的EAT抑制的多核苷酸和过程。
在另一个实施方案中，所述核酸构建体包含一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸以如下顺序包含SEQ ID NO3的第1-38位核苷酸区域中的至少20个及直至38个连续核苷酸，由大约10至大约50个连续核苷酸组成的第一个寡核苷酸，其中所述第一个寡核苷酸与第二个寡核苷酸充分互补，SEQ ID NO3的第60-106位核苷酸区域中的至少大约20个及直至47个连续核苷酸，由大约10至大约50个连续核苷酸组成的第二个寡核苷酸，其中所述第二个寡核苷酸编码miRNA，且第二个寡核苷酸与靶序列充分互补，SEQ ID NO3的第128-159位核苷酸区域中的至少大约20个及直至32个连续核苷酸，其中所述多核苷酸编码能形成发夹结构的RNA前体。
在一些实施方案中，提供了包含导入的多核苷酸和/或通过本发明方法产生的细胞、植物和种子。所述细胞包括原核细胞和真核细胞，包括但非限于酵母、真菌、病毒、无脊椎动物、脊椎动物和植物的细胞。本发明的植物、植物细胞和种子包括gynosperms、单子叶植物和双子叶植物，包括但非限于例如水稻、小麦、燕麦、大麦、粟、高粱、大豆、向日葵、红花、canola、苜蓿、棉花、Arabidopsis及烟草。
在一些实施方案中，所述细胞、植物和/或种子包含具有修饰的植物miRNA前体的核酸构建体，其中所述前体被修饰为用设计用于产生针对靶序列的miRNA的序列置换内源性miRNA编码区。在一些实施方案中，所述miRNA前体模板是miR172a miRNA前体。在一些实施方案中，所述miR172a前体来自双子叶植物或单子叶植物。在一些实施方案中，所述miR172a前体来自拟南芥、番茄、大豆、水稻或者玉米。在一些实施方案中，所述miRNA前体是SEQID NO1、SEQ ID NO3或者SEQ ID NO44。在一些实施方案中，所述miRNA前体由SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或者SEQ ID NO44编码。在一些实施方案中，所述核酸构建体包含至少一个重组位点，包括位点特异性重组位点。在一些实施方案中，所述核酸构建体包含至少一个重组位点，以便于构建体的修饰或克隆。在一些实施方案中，所述核酸构建体包含位于miRNA前体侧翼的两个位点特异性重组位点。在一些实施方案中，所述位点特异性重组位点包括FRT位点、lox位点，或者att位点，包括attB、attL、attP或attR位点。见例如并入本文作参考的PCT国际出版物No.WO 99/25821及美国专利5,888,732、6,143,557、6,171,861、6,270,969和6,277,608所描述。
在另一个实施方案中，提供了一种减量调节靶RNA的方法，所述方法包括向细胞中导入编码与靶RNA的一个区域互补的miRNA的核酸构建体。在一些实施方案中，所述miRNA与靶RNA的区域完全互补。在一些实施方案中，所述miRNA是互补的并包括G-U碱基配对即GU摆动的使用以便完全互补。在一些实施方案中，所述miRNA的头10个核苷酸(从miRNA的5’末端计数)与靶RNA的一个区域完全互补，剩余的核苷酸可包括与靶RNA的错配和/或凸出。在一些实施方案中，所述miRNA包含大约10-200个核苷酸，大约10-15、15-20、19、20、21、22、23、24、25、26、27、25-30、30-50、50-100、100-150或者大约150-200个核苷酸。所述miRNA与靶RNA中互补序列的结合导致靶RNA裂解。在一些实施方案中，所述miRNA是已经被修饰的miRNA，由此所述miRNA与靶RNA的靶序列完全互补。在一些实施方案中，所述miRNA是已经被修饰的内源性植物miRNA，由此所述miRNA与靶RNA的靶序列完全互补。在一些实施方案中，编码所述miRNA的多核苷酸与一个启动子可操纵地连接。在一些实施方案中，所述核酸构建体包含与所述miRNA可操纵地连接的启动子。
在一些实施方案中，所述核酸构建体编码miRNA。在一些实施方案中，所述核酸构建体包含与miRNA可操纵地连接的启动子。在一些实施方案中，所述核酸构建体编码可形成双链RNA或包含miRNA的发夹结构的多核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸构建体包含与可形成双链RNA或包含miRNA的发夹结构的多核苷酸可操纵地连接的启动子。在一些实施方案中，所述核酸构建体包含已经被修饰的内源性植物miRNA前体，由此所述miRNA与靶RNA的靶序列完全互补。在一些实施方案中，所述核酸构建体包含与miRNA前体可操纵地连接的启动子。在一些实施方案中，所述核酸构建体包含大约50至大约3000个核苷酸，大约50-100，100-150，150-200，200-250，250-300，300-350，350-400，400-450，450-500，500-600，600-700，700-800，800-900，900-1000，1000-1100，1100-1200，1200-1300，1300-1400，1400-1500，1500-1600，1600-1700，1700-1800，1800-1900，1900-2000，2000-2100，2100-2200，2200-2300，2300-2400，2400-2500，2500-2600，2600-2700，2700-2800，2800-2900或者大约2900-3000个核苷酸。
在一些实施方案中，设计并导入缺乏启动子的核酸构建体使其在整合进宿主基因组中时与启动子可操纵地连接。在一些实施方案中，使用重组、包括位点特异性重组整合核酸构建体。在一些实施方案中，核酸构建体是RNA。在一些实施方案中，核酸构建体包含至少一个重组位点，包括位点特异性重组位点。在一些实施方案中，核酸构建体包含至少一个重组位点，以便于所述构建体的整合、修饰或克隆。在一些实施方案中，所述核酸构建体包含在miRNA前体侧翼的两个位点特异性重组位点。
在另一个实施方案中，所述方法包括一种减量调节细胞中靶RNA的方法，所述方法包括向细胞中导入编码与靶RNA的一个区域互补的miRNA的核酸构建体，使所述核酸构建体表达足够时间以产生miRNA，其中所述miRNA减量调节所述靶RNA。在一些实施方案中，所述miRNA与靶RNA的区域完全互补。在一些实施方案中，所述miRNA是互补的并包括G-U碱基配对即GU摆动的使用以便完全互补。
在另一个实施方案中，所述方法包括选择靶RNA，选择miRNA，将靶RNA(或其DNA)的序列与miRNA的序列进行对比，鉴别靶RNA(或其DNA)中核苷酸序列与miRNA的核苷酸序列相似的区域，修饰miRNA的核苷酸序列以使其与鉴别的靶RNA区域的核苷酸序列互补，以及制备包含所述修饰的miRNA的核酸构建体。在一些实施方案中，所述miRNA与鉴别的靶RNA区域完全互补。在一些实施方案中，所述miRNA是互补的并包括G-U碱基配对即GU摆动的使用以便完全互补。在一些实施方案中，核酸构建体编码可形成双链RNA或者包含miRNA的发夹结构的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸构建体包含已根据这个实施方案修饰的miRNA的前体，即pre-miRNA。
在另一个实施方案中，所述方法包括选择靶RNA，选择靶RNA内的核苷酸序列，选择miRNA，修饰所述miRNA序列以使其与鉴别的靶RNA区域的核苷酸序列互补，以及制备包含所述修饰的miRNA的核酸构建体。在一些实施方案中，所述miRNA与鉴别的靶RNA区域完全互补。在一些实施方案中，所述miRNA是互补的并包括G-U碱基配对即GU摆动的使用以便完全互补。在一些实施方案中，核酸构建体编码可形成双链RNA或包含miRNA的发夹结构的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸构建体包含已根据这个实施方案修饰的miRNA前体，即pre-miRNA。
在一些实施方案中，miRNA是在microRNA registry、现也称作miRBase序列数据库中揭示的miRNA(Griffiths-Jones(2004)NuclAcids Res 32，Database issueD109-D111；http://microrna.sanger.ac.uk/)。在一些实施方案中，miRNA是ath-MIR156a，ath-MIR156b，ath-MIR156c，ath-MIR156d，ath-MIR156e，ath-MIR156f，ath-MIR156g，ath-MIR156h，ath-MIR157a，ath-MIR157b，ath-MIR157c，ath-MIR157d，ath-MIR158a，ath-MIR158b，ath-MIR159a，ath-MIR159b，ath-MIR159c，ath-MIR160a，ath-MIR160b，ath-MIR160c，ath-MIR161，ath-MIR162a，ath-MIR162b，ath-MIR163，ath-MIR164a，ath-MIR164b，ath-MIR164c，ath-MIR165a，ath-MIR165b，ath-MIR166a，ath-MIR166b，ath-MIR166c，ath-MIR166d，ath-MIR166e，ath-MIR166f，ath-MIR166g，ath-MIR167a，ath-MIR167b，ath-MIR167c，ath-MIR167d，ath-MIR168a，ath-MIR168b，ath-MIR169a，ath-MIR169b，ath-MIR169c，ath-MIR169d，ath-MIR169e，ath-MIR169f，ath-MIR169g，ath-MIR169h，ath-MIR169i，ath-MIR169j，ath-MIR169k，ath-MIR169l，ath-MIR169m，ath-MIR169n，ath-MIR170，ath-MIR171a，ath-MIR171b，ath-MIR171c，ath-MIR172a，ath-MIR172b，ath-MIR172c，ath-MIR172d，ath-MIR172e，ath-MIR173，ath-MIR319a，ath-MIR319b，ath-MIR319c，ath-MIR390a，ath-MIR390b，ath-MIR393a，ath-MIR393b，ath-MIR394a，ath-MIR394b，ath-MIR395a，ath-MIR395b，ath-MIR395c，ath-MIR395d，ath-MIR395e，ath-MIR395f，ath-MIR396a，ath-MIR396b，ath-MIR397a，ath-MIR397b，ath-MIR398a，ath-MIR398b，ath-MIR398c，ath-MIR399a，ath-MIR399b，ath-MIR399c，ath-MIR399d，ath-MIR399e，ath-MIR399f，ath-MIR400，ath-MIR401，ath-MIR402，ath-MIR403，ath-MIR404，ath-MIR405a，ath-MIR405b，ath-MIR405d，ath-MIR406，ath-MIR407，ath-MIR408，ath-MIR413，ath-MIR414，ath-MIR415，ath-MIR416，ath-MIR417，ath-MIR418，ath-MIR419，ath-MIR420，ath-MIR426，ath-MIR447a，ath-MIR447b，ath-MIR447c，osa-MIR156a，osa-MIR156b，osa-MIR156c，osa-MIR156d，osa-MIR156e，osa-MIR156f，osa-MIR156g，osa-MIR156h，osa-MIR156i，osa-MIR156j，osa-MIR156k，osa-MIR156l，osa-MIR159a，osa-MIR159b，osa-MIR159c，osa-MIR159d，osa-MIR159e，osa-MIR159f，osa-MIR160a，osa-MIR160b，osa-MIR160c，osa-MIR160d，osa-MIR160e，osa-MIR160f，osa-MIR162a，osa-MIR162b，osa-MIR164a，osa-MIR164b，osa-MIR164c，osa-MIR164d，osa-MIR164e，osa-MIR166a，osa-MIR166b，osa-MIR166c，osa-MIR166d，osa-MIR166e，osa-MIR166f，osa-MIR166j，osa-MIR166k，osa-MIR166l，osa-MIR166g，osa-MIR166h，osa-MIR166i，osa-MIR166m，osa-MIR166n，osa-MIR167a，osa-MIR167b，osa-MIR167c，osa-MIR167d，osa-MIR167e，osa-MIR167f，osa-MIR167g，osa-MIR167h，osa-MIR167i，osa-MIR167j，osa-MIR168a，osa-MIR168b，osa-MIR169a，osa-MIR169b，osa-MIR169c，osa-MIR169d，osa-MIR169e，osa-MIR169f，osa-MIR169g，osa-MIR169h，osa-MIR169i，osa-MIR169j，osa-MIR169k，osa-MIR169l，osa-MIR169m，osa-MIR169n，osa-MIR169o，osa-MIR169p，osa-MIR169q，osa-IR171a，osa-MIR171b，osa-MIR171c，osa-MIR171d，osa-MIR171e，osa-MIR171f，osa-MIR171g，osa-MIR171h，osa-MIR171i，osa-MIR172a，osa-MIR172b，osa-MIR172c，osa-MIR173d，osa-MIR390，osa-MIR319a，osa-MIR319b，osa-MIR393，osa-MIR393b，osa-MIR394，osa-MIR395b，osa-MIR395c，osa-MIR395d，osa-MIR395e，osa-MIR395g，osa-MIR395h，osa-MIR395i，osa-MIR395j，osa-MIR395k，osa-MIR395l，osa-MIR395m，osa-MIR395n，osa-MIR395o，osa-MIR395r，osa-MIR395q，osa-MIR395c，osa-MIR395a，osa-MIR395f，osa-MIR395p，osa-MIR396a，osa-MIR396b，osa-MIR396c，osa-MIR397a，osa-MIR397b，osa-MIR398a，osa-MIR398b，osa-MIR399a，osa-MIR399b，osa-MIR399c，osa-MIR399d，osa-MIR399e，osa-MIR399f，osa-MIR399g，osa-MIR399h，osa-MIR399i，osa-MIR399j，osa-MIR399k，osa-MIR408，osa-MIR413，osa-MIR414，osa-MIR415，osa-MIR416，osa-MIR417，osa-MIR418，osa-MIR419，osa-MIR426，osa-MIR437，osa-MIR439，osa-MIR439c，osa-MIR439d，osa-MIR438e，osa-MIR439f，osa-MIR439g，osa-MIR439h，osa-MIR440，osa-MIR441a，osa-MIR441c，osa-MIR442，osa-MIR443，osa-MIR445d，osa-MIR446，zma-MIR156a，zma-MIR156b，zma-MIR156c，zma-MIR156d，zma-MIR156e，zma-MIR156f，zma-MIR156g，zma-MIR156h，zma-MIR156i，zma-MIR156j，zma-MIR156k，zma-MIR159a，zma-MIR159b，zma-MIR159c，zma-MIR159d，zma-MIR160a，zma-MIR160b，zma-MIR160c，zma-MIR160d，zma-MIR160e，zma-MIR160f，zma-MIR161l，zma-MIR162，zma-MIR164a，zma-MIR164b，zma-MIR164c，zma-MIR164d，zma-MIR166a，zma-MIR166b，zma-MIR166c，zma-MIR166d，zma-MIR166e，zma-MIR166e，zma-MIR166f，zma-MIR166g，zma-MIR166h，zma-MIR166i，zma-MIR166j，zma-MIR166k，zma-MIR166m，zma-MIR167a，zma-MIR167b，zma-MIR167c，zma-MIR167d，zma-MIR167e，zma-MIR167f，zma-MIR167g，zma-MIR167h，zma-MIR168a，zma-MIR168b，zma-MIR169a，zma-MIR169b，zma-MIR169c，zma-MIR169d，zma-MIR169e，zma-MIR169f，zma-MIR169g，zma-MIR169i，zma-MIR169j，zma-MIR169k，zma-MIR171a，zma-MIR171b，zma-MIR171c，zma-MIR171d，zma-MIR171e，zma-MIR171f，zma-MIR171g，zma-MIR171h，zma-MIR171i，zma-MIR171j，zma-MIR171k，zma-MIR172a，zma-MIR172b，zma-MIR172c or zma-MIR172d，zma-MIR172e，zma-MIR319a，zma-MIR319b，zma-MIR319d，zma-MIR393，zma-MIR394a，zma-MIR394b，zma-MIR395a，zma-MIR395b，zma-MIR395c，zma-MIR395d，zma-MIR396a，zma-MIR396b，zma-MIR399a，zma-MIR399b，zma-MIR399c，zma-MIR399d，zma-MIR399e，zma-MIR399f，zma-MIR408。
在一些实施方案中，miRNA是Genbank(美国)、EMBL(欧洲)或者DDBJ(日本)中揭示的miRNA。在一些实施方案中，miRNA选自如下Genbank登记号之一AJ505003，AJ505002，AJ505001，AJ496805，AJ496804，AJ496803，AJ496802，AJ496801，AJ505004，AJ493656，AJ493655，AJ493654，AJ493653，AJ493652，AJ493651，AJ493650，AJ493649，AJ493648，AJ493647，AJ493646，AJ493645，AJ493644，AJ493643，AJ493642，AJ493641，AJ493640，AJ493639，AJ493638，AJ493637，AJ493636，AJ493635，AJ493634，AJ493633，AJ493632，AJ493631，AJ493630，AJ493629，AJ493628，AJ493627，AJ493626，AJ493625，AJ493624，AJ493623，AJ493622，AJ493621，AJ493620，AY615374，AY615373，AY730704，AY730703，AY730702，AY730701，AY730700，AY730699，AY730698，AY599420，AY551259，AY551258，AY551257，AY551256，AY551255，AY551254，AY551253，AY551252，AY551251，AY551250，AY551249，AY551248，AY551247，AY551246，AY551245，AY551244，AY551243，AY551242，AY551241，AY551240，AY551239，AY551238，AY551237，AY551236，AY551235，AY551234，AY551233，AY551232，AY551231，AY551230，AY551229，AY551228，AY551227，AY551226，AY551225，AY551224，AY551223，AY551222，AY551221，AY551220，AY551219，AY551218，AY551217，AY551216，AY551215，AY551214，AY551213，AY551212，AY551211，AY551210，AY551209，AY551208，AY551207，AY551206，AY551205，AY551204，AY551203，AY551202，AY551201，AY551200，AY551199，AY551198，AY551197，AY551196，AY551195，AY551194，AY551193，AY551192，AY551191，AY551190，AY551189，AY551188，AY501434，AY501433，AY501432，AY501431，AY498859，AY376459，AY376458AY884233，AY884232，AY884231，AY884230，AY884229，AY884228，AY884227，AY884226，AY884225，AY884224，AY884223，AY884222，AY884221，AY884220，AY884219，AY884218，AY884217，AY884216，AY728475，AY728474，AY728473，AY728472，AY728471，AY728470，AY728469，AY728468，AY728467，AY728466，AY728465，AY728464，AY728463，AY728462，AY728461，AY728460，AY728459，AY728458，AY728457，AY728456，AY728455，AY728454，AY728453，AY728452，AY728451，AY728450，AY728449，AY728448，AY728447，AY728446，AY728445，AY728444，AY728443，AY728442，AY728441，AY728440，AY728439，AY728438，AY728437，AY728436，AY728435 AY728434，AY728433，AY728432，AY728431，AY728430，AY728429，AY728428，AY728427，AY728426，AY728425，AY728424，AY728423，AY728422，AY728421，AY728420，AY728419，AY728418，AY728417，AY728416，AY728415，AY728414，AY728413，AY728412，AY728411，AY728410，AY728409，AY728408，AY728407，AY728406，AY728405，AY728404，AY728403，AY728402，AY728401，AY728400，AY728399，AY728398，AY728397，AY728396，AY728395，AY728394，AY728393，AY728392，AY728391，AY728390，AY728389，AY728388，AY851149，AY851148，AY851147，AY851146，AY851145，AY851144或者AY599420。
在一些实施方案中，miRNA选自并入本文作参考的美国公开的专利申请No.2005/0144669A1揭示的序列之一。
在一些实施方案中，上述以及本文揭示的那些miRNA已经被修饰而针对特异性靶。
在一些实施方案中，靶RNA是植物病原体RNA，如植物病毒或植物类病毒。在一些实施方案中，针对植物病原体RNA的miRNA与病原体诱导型启动子可操纵地连接。在一些实施方案中，靶RNA是mRNA。mRNA中的靶序列可以是非编码序列(如内含子序列，5’非翻译区和3’非翻译区)，编码序列或参与mRNA剪接的序列。将miRNA靶向内含子序列损害mRNA的成熟。将miRNA靶向参与mRNA剪接的序列影响提供不同的蛋白质同种型的可变剪接形式的成熟。
在一些实施方案中，提供了包含本发明的多核苷酸和/或通过本发明的方法产生的细胞、植物和种子。在一些实施方案中，所述细胞、植物和/或种子包含具有修饰的植物miRNA前体的核酸构建体。在一些实施方案中，核酸构建体中修饰的植物miRNA前体与启动子可操纵地连接。所述启动子可以是任何熟知的启动子，包括组成型启动子、诱导型启动子、可去抑制的启动子等等，如下文描述。所述细胞包括原核细胞和真核细胞，包括但非限于细菌、酵母、真菌、病毒、无脊椎动物、脊椎动物和植物细胞。本发明的植物、植物细胞和种子包括gynosperms、单子叶植物和双子叶植物，包括但非限于水稻、小麦、燕麦、大麦、粟、高粱、大豆、向日葵、红花、canola、苜蓿、棉花、Arabidopsis及烟草。
在另一个实施方案中，提供了一种减量节多个靶RNA的方法，所述方法包括向细胞中导入一种编码多个miRNA的核酸构建体。多个miRNA中的一个miRNA与一个靶RNA的一个区域互补。在一些实施方案中，miRNA与靶RNA的该区域完全互补。在一些实施方案中，miRNA是互补的并包括G-U碱基配对即GU摆动的使用以完全互补。在一些实施方案中，miRNA的头10个核苷酸(从miRNA的5’末端计数)与靶RNA的一个区域完全互补，剩余的核苷酸可包括与靶RNA的错配和/或凸出。在一些实施方案中，miRNA包含大约10-200个核苷酸，大约10-15、15-20、19、20、21、22、23、24、25、26、27、25-30、30-50、50-100、100-150或者大约150-200个核苷酸。miRNA与靶RNA中其互补序列的结合导致靶RNA裂解。在一些实施方案中，miRNA是已经修饰的miRNA，由此所述miRNA与靶RNA的靶序列完全互补。在一些实施方案中，miRNA是已经修饰的内源性植物miRNA，由此所述miRNA与靶RNA的靶序列完全互补。在一些实施方案中，所述miRNA与启动子可操纵地连接。在一些实施方案中，多个miRNA彼此连接，当表达时形成一个单转录物。在一些实施方案中，所述核酸构建体包含与miRNA可操纵地连接的启动子。
在一些实施方案中，所述核酸构建体编码抑制多个靶序列的多个miRNA。所述核酸构建体编码至少两个miRNA。在一些实施方案中，每个miRNA与靶均充分互补，或者其被修饰而与本文所述的靶互补。在一些实施方案中，所述核酸构建体编码2-30个或更多个miRNA，例如3-40个或更多个miRNA，例如3-45个或更多个miRNA，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49个或更多个miRNA的多聚体。在一些实施方案中，多个miRNA彼此连接，当表达时形成一个单转录物。
在一些实施方案中，提供了聚合的pre-miRNA，其是由一个以上miRNA前体单位组成的人工miRNA。所述聚合的pre-miRNA可以是不同的miRNA前体杂聚的，或者是含有一些相同miRNA前体单位的同聚的。实施例表明杂聚的pre-miRNA能产生不同的成熟人工miRNA。例如由pre-miR-CPC3159a和pre-miR-PDS1169g组成的二聚体pre-miR-PDS1169g-CPC3159a当在植物细胞中表达时可以产生成熟的miR-PDS1169g和miR-CPC3159a。实施例还表明同聚的miRNA前体能产生不同的成熟人工miRNA。例如由pre-miR-P69159a和pre-miR-HC-Pro159a组成的二聚体pre-miR-P69159a-HC-Pro159a可产生成熟的miR-P69159a和miR-HC-Pro159a。以相似方式，产生含有任何数目单体单位的杂聚或同聚的pre-miRNA，如本文所述。一种制备包含在一个单启动子控制下的多个pre-miRNA的核酸构建体的方法实例在实施例21和27中示出。每个成熟miRNA均从所述核酸构建体中正确加工，如实施例22和27所示。
在一些实施方案中，所述核酸构建体包含多个多核苷酸，每个多核苷酸均编码一个单独的miRNA前体，即单独的pre-miRNA。所述多核苷酸彼此可操纵地连接，由此它们被置于一个单启动子的控制下。在一些实施方案中，所述多个多核苷酸彼此连接，当表达时形成含有多个pre-miRNA的一个单转录物。所述单转录物在宿主细胞中被加工，产生多个成熟miRNA，每个miRNA均能减量调节其靶基因。如希望多的编码pre-miRNA的多核苷酸可以连接在一起，唯一的限制是转录物的最终大小。技术人员熟知8-10kb的转录物可以在植物中产生。因此，可以形成核酸构建体，其包含编码2-30个或更多个pre-miRNA例如3-45个或更多个pre-miRNA的多聚多核苷酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或更多个pre-miRNA的多聚体。
在一些实施方案中，核酸构建体进一步包含与编码多个miRNA的多核苷酸可操纵地连接的启动子。在一些实施方案中，设计并导入缺乏启动子的核酸构建体，由此其在整合进宿主基因组时与启动子可操纵地连接。在一些实施方案中，使用重组、包括位点特异性重组整合核酸构建体。见例如并入本文作参考的PCT国际出版物No.WO 99/25821所述。在一些实施方案中，核酸构建体是RNA。在一些实施方案中，核酸构建体包含至少一个重组位点，包括位点特异性重组位点。在一些实施方案中，核酸构建体包含至少一个重组位点，以便于所述构建体的整合、修饰或克隆。在一些实施方案中，核酸构建体包含在miRNA前体侧翼的两个位点特异性重组位点。在一些实施方案中，所述位点特异性重组位点包括FRT位点、lox位点，或者att位点，包括attB、attL、attP或attR位点。见例如并入本文作参考的PCT国际出版物No.WO 99/25821及美国专利5,888,732、6,143,557、6,171,861、6,270,969和6,277,608所述。
在一些实施方案中，pre-miRNA被插入细胞或植物的基因或转基因的内含子中。如果基因具有多个内含子，则相同或不同的pre-miRNA可插入每个内含子中。在一些实施方案中，插入内含子中的pre-miRNA是聚合的pre-miRNA，如本文所述。在RNA剪接期间，内含子从原始RNA转录物中释放，并因此如本文所例证可作为miRNA的前体。大多数内含子含有在5’末端的一个剪接供体，在3’末端的剪接受体及在内含子中的分支位点。分支位点对于内含子成熟非常重要，没有分支位点则内含子不能从原始RNA转录物中切离和释放。分支位点通常位于剪接受体位点上游20-50个核苷酸，而剪接供体位点与分支位点之间的距离在不同内含子之中变化很大。因此，在一些实施方案中，pre-miRNA被插入在内含子中的剪接供体和分支位点之间。
在一些实施方案中，靶RNA是植物病原体的RNA，如植物病毒或植物类病毒。在一些实施方案中，针对植物病原体RNA的miRNA与病原体诱导型启动子可操纵地连接。在一些实施方案中，靶RNA是mRNA。mRNA中的靶序列可以是内含子序列、编码序列或者参与mRNA剪接的序列。miRNA靶向于内含子序列损害mRNA的成熟。miRNA靶向于参与mRNA剪接的序列影响提供不同的蛋白质同种型的可变剪接形式的成熟。在一些实施方案中，所述靶包括影响农学性状、昆虫抗性、疾病抗性、除草剂抗性、不育性、谷物特性和商业产品的基因。
在一些实施方案中，提供了包含本发明的编码多个miRNA的核酸构建体的和/或通过本发明方法产生的细胞、植物和种子。在一些实施方案中，所述细胞、植物和/或种子包含具有多个多核苷酸的核酸构建体，每个多核苷酸均编码一个植物miRNA前体。在一些实施方案中，所述多个多核苷酸与启动子可操纵地连接。所述启动子可以是任何熟知的启动子，包括组成型启动子、诱导型启动子、可去抑制启动子等，如下文描述。编码miRNA前体的多核苷酸连接在一起。在一些实施方案中，多个多核苷酸彼此连接，当在细胞、植物或种子中表达时形成含有多个pre-miRNA的一个单转录物。所述细胞包括原核细胞和真核细胞，包括但非限于细菌、酵母、真菌、病毒、无脊椎动物、脊椎动物和植物细胞。本发明的植物、植物细胞和种子包括gynosperms、单子叶植物和双子叶植物，包括但非限于水稻、小麦、燕麦、大麦、粟、高粱、大豆、向日葵、红花、canola、苜蓿、棉花、Arabidopsis及烟草。
本发明涉及可用于抑制靶序列和/或确认功能的方法和组合物。本发明还涉及使用microRNA(miRNA)介导的RNA干扰(RNAi)沉默或抑制靶序列以评估功能或者确认靶序列的表型作用和/或性状发育的方法。特别地，本发明涉及包含能诱导沉默的小核酸分子miRNA的构建体，及使用这些miRNA选择性沉默靶序列的方法。
RNA干扰是指在动物中由小干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire et al.(1998)Nature 391806-811)。植物中的相应过程通常是指转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，在真菌中也称作压制(quelling)。转录后基因沉默过程被认为是进化保守的细胞防御机制，用于阻止外源基因的表达，一般为各种不同的生物区系和门所共有(Fire(1999)Trends Genet.15358-363)。这种防止外源基因表达的机制可能在通过特异性破坏病毒基因组RNA的同源单链RNA的细胞应答机制而应答衍生自病毒感染或转座子元件随机整合进宿主基因组的双链RNA(dsRNA)的产生中得以进化。细胞中dsRNA的存在通过还未被完全鉴定的机制触发RNAi应答。
细胞中长dsRNA的存在刺激被称作dicer的核糖核酸酶III的活性。Dicer参与dsRNA加工成称作小干扰RNA(siRNA)的dsRNA短片段(Bernstein et al.(2001)Nature 409363-366)。衍生自dicer活性的小干扰RNA的长度典型为大约21至23个核苷酸，包含大约19个碱基对双链体(Elbashir et al.(2001)Genes Dev 15188-200)。Dicer还参与21和22个核苷酸的小temporal RNA(stRNA)从保守结构的前体RNA中的切离，预期它们参与翻译控制(Hutvagner et al.(2001)Science 293834-838)。RNAi应答的特征还在于一种核酸内切酶复合物，通常称作RNA诱导的沉默复合物(RISC)，其介导具有与siRNA双链体的反义链的序列互补性的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解发生在与siRNA双链体的反义链互补的区域中部(Elbashir et al.(2001)Genes Dev 15188-200)。另外，RNA干扰也可包括小RNA(例如microRNA或miRNA)介导的基因沉默，推测通过调节染色质结构并从而防止靶基因序列转录的细胞机制进行(见例如Allshire，Science 2971818-18192002；Volpe et al.(2002)Science 2971833-1837；Jenuwein(2002)Science 2972215-2218；Hall et al.(2002)Science 2972232-2237)。因此，本发明的miRNA分子可用于通过与RNA转录物相互作用或者通过与特定基因序列相互作用而介导基因沉默，其中这种相互作用导致在转录或转录后水平的基因沉默。
RNAi已经在多种系统中加以研究。Fire et al.((1998)Nature391806-811)首先在C.elegans中观测到RNAi。Wianny and Goetz((1999)Nature Cell Biol 270)描述了在小鼠胚胎中dsRNA介导的RNAi。Hammond et al.((2000)Nature 404293-296)描述了在用dsRNA转染的果蝇细胞中的RNAi。Elbashir et al.((2001)Nature411494-498)描述了通过在培养的哺乳动物细胞包括人胚肾细胞和HeLa细胞中导入合成的21个核苷酸的RNA双链体而诱导的RNAi。
小RNA在控制基因表达中起重要作用。许多发育过程包括开花的调节是由小RNA控制的。现在可以通过使用在植物中产生小RNA的转基因构建体对植物基因的表达进行遗传工程改变。
小RNA看起来通过与互补RNA或DNA靶序列进行碱基配对而发挥功能。当与RNA结合时，小RNA触发靶序列的RNA裂解或翻译抑制。当结合DNA靶序列时，据信小RNA可以介导靶序列的DNA甲基化。无论具体机制如何，这些事件的结果是基因表达被抑制。
据信小RNA与其RNA靶之间的序列互补性有助于确定哪种机制(RNA裂解或翻译抑制)被采用。据信与其靶完全互补的siRNA通过RNA裂解起作用。一些miRNA与其靶具有完全或接近完全的互补性，对于至少几个这些miRNA已经证实了RNA裂解。其它miRNA与其靶具有一些错配，看起来在翻译水平抑制其靶。同样，不受特定的作用机制理论的限制，产生一种一般原则，即完全或接近完全的互补有利于RNA裂解，特别是在头10个核苷酸中(从miRNA的5’末端开始计数)，而当miRNA/靶双链体含有多个错配时有利的是翻译抑制。看起来例外的是植物中的microRNA 172(miR172)。miR172的一个靶是APETALA2(AP2)，尽管miR172呈现与AP2接近完全互补，但看起来其引起AP2翻译抑制而非RNA裂解。
MicroRNA(miRNA)是长度为大约19个至大约24个核苷酸(nt)的非编码RNA，其在动物和植物中均已经鉴别(Lagos-Quintana et al.(2001)Science 294853-858，Lagos-Quintana et al.(2002)Curr Biol12735-739；Lau et al.(2002)Science 294858-862；Lee and Ambros(2001)Science 294862-864；Llave et al.(2002)Plant Cell 141605-1619；Mourelatos et al.(2002)Genes Dev 16720-728；Park et al.(2002)Curr Biol 121484-1495；Reinhart et al.(2002)Genes Dev 161616-1626)。它们从大小为大约70-200个核苷酸的较长的前体转录物加工而来，这些前体转录物具有形成稳定的发夹结构的能力。在动物中，参与加工miRNA前体的酶被称作Dicer，这是一种RNAe III样蛋白质(Grishok et al.(2001)Cell 10623-34；Hutvagner et al.(2001)Science 293834-838；Ketting et al.(2001)Genes Dev 152654-2659)。植物也具有Dicer样酶，即DCL1(先前称作CARPELFACTORY/SHORT INTEGUMENTS1/SUSPENSOR1)，近来有证据表明其与Dicer一样，参与加工发夹前体产生成熟miRNA (Park et al.(2002)Curr Biol 121484-1495；Reinhart et al.(2002)Genes Dev161616-1626)。另外，从近来的研究中显然明了，至少一些miRNA发夹前体作为更长的聚腺苷酸化转录物而产生，一些不同的miRNA和相关的发夹结构可存在于一个单转录物中(Lagos-Quintanaet al.(2001)Science 294853-858；Lee et al.(2002)EMBO J 214663-4670)。近来的研究还分析了来自通过DICER对发夹结构的加工而产生的dsRNA产物的miRNA链的选择(Schwartz et al.(2003)Cell115199-208)。看起来经加工的dsRNA的两个末端的稳定性(即GC对AU含量，和/或错配)影响链选择，较低稳定性的末端易于通过解旋酶活性的作用而解链。低稳定性末端的5’末端链被掺入RISC复合物中，而另一链被降解。
在动物中，有直接的证据表明特异性miRNA在发育中的作用。已经发现在C.elegans的lin-4和let-7 miRNA控制时序发育，这基于当产生lin-4和let-7 miRNA的基因被突变时产生的表型而得出的结论(Lee et al.(1993)Cell 75843-854；Reinhart et al.(2000)Nature 403-901-906)。另外，这两个miRNA均呈现与其在控制发育时间中的作用一致的时序表达模式。其它动物miRNA展示发育调节的时间和组织特异性表达模式(Lagos-Quintana et al.(2001)Science 294853-853，Lagos-Quintana et al.(2002)Curr Biol 12735-739；Lau et al.(2001)Science 294858-862；Lee and Ambros(2001)Science 294862-864)，导致产生这样的假说，即在许多情况中miRNA可能参与重要的发育过程的调节。同样，在植物中，许多miRNA的差异表达模式提示在发育中的作用(Llave et al.(2002)Plant Cell 141605-1619；Park et al.(2002)Curr Biol 121484-1495；Reinhart et al.(2002)GenesDev 161616-1626)，这在目前已经示出(例如Guo et al.(2005)PlantCell 171376-1386)。
MicroRNA看起来通过与位于靶基因产生的转录物中的互补序列结合而调节这些靶基因。在lin-4和let-7情况中，靶位点位于靶mRNA的3’UTR中(Lee et al.(1993)Cell 75843-854；Wightman etal.(1993)Cell 75855-862；Reinhart et al.(2000)Nature 403901-906；Slack et al.(2000)Mol Cell 5659-669)，并且在lin-4和let-7miRNA与其靶位点之间有一些错配。lin-4或let-7 miRNA的结合看起来导致对由靶mRNA编码的蛋白质的稳态水平的减量调节，但不影响转录物自身(Olsen and Ambros(1999)Dev Biol 216671-680)。另一方面，近来的证据表明miRNA在一些情况中可以导致靶位点中靶转录物的特异性RNA裂解，这种裂解步骤看起来需要miRNA与靶转录物之间特别是头10个核苷酸内(从miRNA的5’末端计数)的100％互补(Hutvagner and Zamore(2002)Science 2972056-2060；Llave et al.(2002)Plant Cell 141605-1619)。看起来很可能miRNA可以进入靶基因调节的至少两个途径。当靶互补性＜100％时导致蛋白质减量调节，当靶互补性为100％时产生RNA裂解。进入RNA裂解途径的microRNA与动物中的RNA干扰(RNAi)期间及植物中的转录后基因沉默(PTGS)期间产生的21-25个核苷酸的小干扰RNA(siRNA)相似(Hamilton and Baulcombe(1999)Science 286950-952；Hammond et al.，(2000)Nature 404293-296；Zamore et al.，(2000)Cell 3125-33；Elbashir et al.，(2001)Nature 411494-498)，很可能掺入与RNAi所见相似或相同的RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。
用生物信息学鉴别miRNA的靶在动物中还未成功，这可能是由于动物miRNA与其靶的互补程度较低所致。另一方面，生物信息学已经成功用于预测植物miRNA的靶(Llave et al.(2002)Plant Cell141605-1619；Park et al.(2002)Curr Biol 121484-1495；Rhoadeset al.(2002)Cell 110513-520)，因此看起来植物miRNA与其推定的靶较动物miRNA具有更高的整体互补性。植物miRNA的大多数这些推定的靶转录物编码参与植物发育模式或细胞分化的转录因子家族的成员。但是，对于任何植物miRNA均未直接证实其生物学功能。尽管Llave et al.((2002)Science 2972053-2056)已经示出SCARECROW样转录因子的转录物是Arabidopsis miRNA mir171的靶，但是这些研究是在异源物种中进行的，而且未报导与mir171相关的植物表型。
本发明提供的方法可以在有可利用的转化方法以及有至少一些针对靶序列或感兴趣的靶序列侧翼的区域的序列信息的任何生物体中实施。也应理解可以通过依次转化、与一个以上的靶向载体共转化或者构建包含一个以上miRNA序列的DNA构建体而靶向两或多个序列。本发明的方法也可以通过组合核酸文库构建实施，以产生针对随机靶序列的miRNA文库。所述miRNA文库可用于基因功能确认的高通量筛选。
感兴趣的序列的一般种类包括例如参与调节或信息的那些基因，如锌指基因、转录因子、同源异形基因，或者细胞周期和细胞死亡调节物，参与通讯的那些如激酶，及参与管家的那些如热激蛋白。
靶序列进一步包括编码区和非编码区，如启动子、增强子、终止子、内含子等，它们可以被修饰以改变感兴趣的基因的表达。例如，内含子序列可以加入在5’区域，以增加积累的成熟信使的量(见例如Buchman and Berg(1988)Mol Cell Biol 84395-4405)；及Calliset al.(1987)Genes Dev 11183-1200所述)。
靶序列可以是内源性序列，或者可以是导入的异源序列，或者是转基因。例如，所述方法可用于改变转基因的调节和表达，或者用于除去转基因或者其它导入的序列如导入的位点特异性重组位点。靶序列也可以是来自病原体的序列，例如靶序列可以是来自植物病原体如病毒、霉菌或真菌、昆虫或线虫的序列。miRNA可以在植物中表达，在感染或侵染时其可以靶向病原体并赋予植物一定程度的抗性。本文实施例证实了设计人工miRNA以赋予植物病毒抗性/耐受性的技术。在一些实施方案中，可以使用针对不同病毒序列的两或多个人工miRNA序列，以防止靶病毒突变及因此逃避抗性机制。在一些实施方案中，可以选择人工miRNA的序列以便其靶向病毒RNA的关键区域(例如沉默基因阻抑物的活性位点)。在这种情况中，这个选择的区域中病毒的突变可导致编码的蛋白质失活，因此阻止病毒突变以逃避抗性机制。在一些实施方案中，针对病毒科的保守序列的人工miRNA将赋予对整个科的成员的抗性。在一些实施方案中，针对成员中保守序列的人工miRNA将赋予对不同病毒科的成员的抗性(例如见表1所示)。
表1用于人工miRNA设计的TuMV的保守的病毒基因组序列
a基因组序列的区域是根据TuMV CY5毒株(AF530055)。
b来自21个不同TuMV毒株的高度保守的TuMV序列通过Vector NTIAdvance 10.0.1软件(Invitrogen Corp)排列对比。
21个不同TuMV毒株的全长序列从GenBank数据库如下登记号获得AB093596、AB093598、AB093599、AB093600、AB093615、AB093616、AB093617、AB093618、AB093619、AB093611、AB093612、AY227024、AB093609、AF394601、AF169561、AF530055、AF394602、AB093623、AB093624、AY090660、D83184。
在植物中，其它种类的靶序列包括影响农学性状、昆虫抗性、疾病抗性、除草剂抗性、不育性、谷粒特性及商业产品的基因。感兴趣的基因还包括参与油、淀粉、碳水化合物或者营养代谢的那些基因，以及影响例如谷粒大小、蔗糖含量等的那些基因。谷粒质量反映在如下性状中如油的水平和类型、饱和和不饱和的、必需氨基酸的性质和数量及纤维素水平等。例如，可以抑制植酸生物合成途径的基因可以被抑制以产生高利用度的磷表型。见例如WO02/059324揭示的植酸生物合成酶，包括肌醇多磷酸激酶-2多核苷酸，WO 03/027243揭示的肌醇-1，3，4-三磷酸5/6-激酶多核苷酸，及WO 99/05298揭示的肌醇-1-磷酸合酶及其它植酸生物合成多核苷酸，所有这些文献均并入本文作参考。木质化途径中的基因可以被抑制以增强可消化性或能量可利用性。影响细胞周期或细胞死亡的基因可以被抑制以影响生长或应激应答。影响DNA修复和/或重组的基因可以被抑制以增加遗传可变性。影响开花时间的基因以及影响不育性的基因可以被以抑制。任何靶序列均可以被抑制，以评估或证实其在特定性状或表型中的作用，或者分析分子学、调节性、生物化学或蛋白质组学途径或网络。
有许多启动子可以使用，这些启动子可以基于希望的结果而加以选择。技术人员意识到通过使用植物表达盒中不同的启动子以调节miRNA表达的时间、位置和/或水平可以增强不同的应用。如果需要，这些植物表达盒也可以含有启动子调节区(例如赋予诱导型、组成型、环境或发育调节的、或细胞或组织特异性/选择性的表达的启动子调节区)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点，和/或聚腺苷酸化信号。
可以应用组成型、组织优选型或诱导型启动子。组成型启动子例如包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区，衍生自根癌农杆菌的T-DNA的1′-或2′-启动子，遍在蛋白1启动子，Smas启动子，肉桂基醇脱氢酶启动子(美国专利No.5,683,439)，Nos启动子，pEmu启动子，rubisco启动子，GRP1-8启动子及本领域技术人员已知的各种植物基因的其它转录起始区。如果希望低水平表达，则可以使用弱启动子。弱组成型启动子包括例如，Rsyn7启动子的核心启动子(WO 99/43838及美国专利No.6,072,050)，核心35S CaMV启动子等。其它组成型启动子包括例如美国专利No.5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463及5,608,142所述。也见于并入本文作参考的美国专利No.6,177,611所述。
诱导型启动子的例子是Adh1启动子，其是可由缺氧或寒冷刺激诱导的启动子；Hsp70启动子，其是可由热刺激诱导的启动子；PPDK启动子和PEP(磷酸烯醇丙酮酸酯)羧化酶启动子，这两种启动子均可以由光诱导。也可以使用可由化学物质诱导的启动子，如可由安全剂诱导的In2-2启动子(美国专利No.5,364,780)，由雌激素诱导的ERE启动子，及由植物生长素诱导的绒毡层特异性但在愈伤组织中也有活性的Axig1启动子(PCT国际出版物No.WO 02/04699)。其它诱导型启动子例如包括GVG和XVE启动子，其分别可由糖皮质激素和雌激素诱导(美国专利No.6,452,068)。
在发育控制下的启动子的例子包括优先在某些组织中如在叶、根、果实、种子或花中起始转录的启动子。举例性的启动子是花药特异性启动子5126(美国专利No.5,689,049和5,689,051)。种子优选的启动子例如包括但非限于27kDγ玉米蛋白启动子和蜡样(waxy)启动子(Boronat et al.(1986)Plant Sci 4795-102；Reina et al.(1990)Nucl Acids Res 18(21)6426；Kloesgen et al.(1986)Mol.Gen.Genet.203237-244)。在胚、果皮和胚乳中表达的启动子在美国专利No.6,225,529和PCT国际出版物No.WO 00/12733中揭示。所述文献均以全文并入本文作参考。
在一些实施方案中，从诱导型启动子、特别是从病原体诱导型启动子中表达基因是有益的。这种启动子包括来自病原体感染后诱导的致病性相关蛋白(PR蛋白)例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、壳多糖酶等的那些启动子。见例如Redolfi et al.(1983)Neth.J.Plant Pathol.89245-254；Uknes et al.(1992)Plant Cell 4645-656；及Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.4111-116所述。也见于PCT国际出版物No.WO 99/43819所述，所述文献均并入本文作参考。
感兴趣的是在病原体感染部位或附近局部表达的启动子。见例如Marineau et al.(1987)Plant Mol Biol 9335-342；Matton et al.(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions 2325-331；Somsisch etal.(1986)Proc Natl Acad Sci USA 832427-2430；Somsisch et al.(1988)Mol Gen Genet 293-98；和Yang(1996)Proc Natl Acad SciUSA 9314972-14977所述。也见于Chen et al.(1996)Plant J 10955-966；Zhang et al.(1994)Proc Natl Acad Sci USA 912507-2511；Warner et al.(1993)Plant J 3191-201；Siebertz et al.(1989)Plant Cell1961-968；美国专利No.5,750,386(线虫可诱导的)，及其中引用的文献所述。特别感兴趣的是玉米PRms基因的诱导型启动子，其表达是由病原体Fusarium moniliforme诱导(见例如Cordero et al.(1992)Physiol Mol Plant Path 41189-200)。
另外，因为病原体通过创伤或虫害而进入植物中，因此创伤诱导型启动子可用于多核苷酸的构建中。这种创伤诱导型启动子包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因(Ryan(1990)Ann Rev Phytopath28425-449；Duan et al.(1996)Nature Biotech 14494-498)；wun1和wun2(美国专利No.5,428,148)；win1和win2(Stanford et al.(1989)Mol Gen Genet 215200-208)；systemin(McGurl et al.(1992)Science2251570-1573)；WIP1(Rohmeier et al.(1993)Plant Mol Biol 22783-792；Eckelkamp et al.(1993)FEBS Lett 32373-76)；MPI基因(Corderok et al.(1994)Plant J 6(2)141-150)等，所述文献并入本文作参考。
化学物质调节的启动子可通过应用外源化学调节剂而用于调节基因在植物中的表达。根据应用目的，当化学品的应用诱导基因表达时，启动子可以是化学诱导型启动子，或者当化学品的应用抑制基因表达时，启动子可以是化学阻抑型启动子。化学诱导型启动子为本领域所已知，包括但非限于由苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉米In2-2启动子，由用作萌发前除草剂的疏水性亲电子化合物激活的玉米GST启动子，及由水扬酸激活的烟草PR-1a启动子。其它感兴趣的化学调节的启动子包括类固醇应答启动子(见例如糖皮质激素诱导型启动子(Schena et al.(1991)Proc Natl Acad Sci USA 8810421-10425及McNellis et al.(1998)Plant J 14(2)247-257))及四环素诱导型和四环素阻抑型启动子(见例如Gatz et al.(1991)Mol Gen Genet227229-237及美国专利No.5,814,618和5,789,156)，所述文献并入本文作参考。
组织优选的启动子可用于靶向感兴趣的序列在特定植物组织中的增强表达。组织优选的启动子包括Yamamoto et al.(1997)Plant J12(2)255-265；Kawamata et al.(1997)Plant Cell Physiol 38(7)792-803；Hansen et al.(1997)Mol Gen Genet 254(3)337-343；Russell etal.(1997)Transgenic Res 6(2)157-168；Rinehart et al.(1996)PlantPhysiol 112(3)1331-1341；Van Camp et al.(1996)Plant Physiol112(2)525-535；Canevascini et al.(1996)Plant Physiol 112(2)513-524；Yamamoto et al.(1994)Plant Cell Physiol 35(5)773-778；Lam(1994)Results Probl Cell Differ 20181-196；Orozco et al.(1993)PlantMol Biol 23(6)1129-1138；Matsuoka et al.(1993)Proc Natl Acad SciUSA 90(20)9586-9590；及Guevara-Garcia et al.(1993)Plant J4(3)495-505所述启动子。如果需要，这种启动子可以修饰为弱表达。
叶优选的启动子为本领域所已知。见例如Yamamoto et al.(1997)Plant J 12(2)255-265；Kwon et al.(1994)Plant Physiol 105357-67；Yamamoto et al.(1994)Plant Cell Physiol 35(5)773-778；Gotoret al.(1993)Plant J 3509-18；Orozco et al.(1993)Plant Mol Biol23(6)1129-1138；及Matsuoka et al.(1993)Proc Natl Acad Sci USA90(20)9586-9590所述。另外，也可以使用cab和RUBISCO启动子。见例如Simpson et al.(1958)EMBO J 42723-2729和Timko et al.(1988)Nature 31857-58所述。
根优选的启动子为本领域所已知，可从许多可获得的文献中选择或者从各种相容物种中分离。见例如Hire et al.(1992)Plant MolBiol 20(2)207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller andBaumgartner(1991)Plant Cell 3(10)1051-1061(法国菜豆的GRP 1.8基因中的根特异性控制元件)；Sanger et al.(1990)Plant Mol Biol14(3)433-443(根癌农杆菌的mannopine合酶(MAS)基因的根特异性启动子)；及Miao et al.(1991)Plant Cell 3(1)11-22(编码胞质溶胶谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根结中表达)。也见于Bogusz et al.(1990)Plant Cell 2(7)633-641所述，其中描述了从固氮非豆类Parasponia andersonii及相关的非固氮非豆类Trema tomentosa的血红蛋白基因分离的两种根特异性启动子。将这些基因的启动子与β-葡糖醛酸糖苷酶报道基因连接，并导入非豆类Nicotiana tabacum和豆类Lotus corniculatus中，在这两种情况中根特异性启动子活性均被保留。Leach and Aoyagi((1991)Plant Science(Limerick)79(1)69-76)描述了对Agrobacterium rhizogenes的高度表达的rolC和rolD根诱导基因的启动子进行的分析。他们推断增强子和组织优选的DNA决定簇在这些启动子中是解离的。Teeri et al.((1989)EMBO J 8(2)343-350)使用与lacZ的基因融合体示出编码octopine合酶的农杆菌T-DNA基因在根尖的表皮特别有活性，TR2′基因在完整植物中具有根部特异性并且由叶组织中的创伤刺激，这是与杀虫剂或杀幼虫剂基因一起使用的非常希望的特征组合。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1′基因示出相似特性。其它的根优选的启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster et al.(1995)Plant Mol Biol 29(4)759-772)；和rolB启动子(Capana et al.(1994)Plant Mol Biol 25(4)681-691。也见于美国专利No.5,837,876、5,750,386、5,633,363、5,459,252、5,401,836、5,110,732和5,023,179所述。菜豆蛋白基因(Murai et al.(1983)Science 23476-482及Sengopta-Gopalen et al.(1988)Proc Natl Acad Sci USA 823320-3324)。
转化方案以及向植物中导入核苷酸序列的方案可依赖于被靶向转化的植物或植物细胞的类型即单子叶植物或双子叶植物而改变。导入DNA构建体的合适方法包括显微注射(Crossway et al.(1986)Biotechniques 4320-334；及美国专利No.6,300,543)、有性杂交、电穿孔(Riggs et al.(1986)Proc Natl Acad Sci USA 835602-5606)、农杆菌介导的转化(Townsend et al.，美国专利No.5,563,055；及美国专利No.5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski et al.(1984)EMBO J32717-2722)、及ballistic粒子加速(见例如美国专利No.4,945,050；美国专利No.5,879,918；美国专利No.5,886,244；美国专利No.5,932,782；Tomes et al.(1995)“Direct DNA Transfer into IntactPlant Cells via Microprojectile Bombardment，”in Plant Cell，Tissue，andOrgan CultureFundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；及McCabe et al.(1988)Biotechnology6923-926)所述。也见于Weissinger et al.(1988)Ann Rev Genet22421-477；Sanford et al.(1987)Particulate Science and Technology527-37(洋葱)；Christou et al.(1988)Plant Physiol 87671-674(大豆)；Finer and McMullen(1991)In Vitro Cell Dev Biol 27P175-182(大豆)；Singh et al.(1998)Theor Appl Genet 96319-324(大豆)；Datta et al.(1990)Biotechnology 8736-740(水稻)；Klein et al.(1988)Proc Natl Acad Sci USA 854305-4309(玉米)；Klein et al.(1988)Biotechnology 6559-563(玉米)；美国专利No.5,240,855；美国专利No.5,322,783；美国专利No.5,324,646；Klein et al.(1988)PlantPhysiol 91440-444(玉米)；Fromm et al.(1990)Biotechnology 8833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren et al.(1984)Nature 311763-764；美国专利No.5,736,369(谷类)；Bytebier et al.(1987)Proc NatlAcad Sci USA 845345-5349(Liliaceae)；De Wet et al.(1985)in TheExperimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman et al.(Longman，New York)，pp.197-209(花粉)；Kaeppler et al.(1990)Plant Cell Reports 9415-418 and Kaeppler et al.(1992)Theor ApplGenet 84560-566(whisker介导的转化)；D′Halluin et al.(1992)PlantCell 41495-1505(电穿孔)；Li et al.(1993)Plant Cell Reports 12250-255及Christou and Ford(1995)Annals of Botany 75407-413(水稻)；Osjoda et al.(1996)Nature Biotechnology 14745-750(经根癌农杆菌的玉米)；及美国专利No.5,736,369(分生组织转化)所描述，所有文献均并入本文作参考。
核苷酸构建体可以通过将植物与病毒或病毒核酸接触而导入植物中。通常地，这种方法包括将本发明的核苷酸构建体掺入病毒DNA或RNA分子中。另外，技术人员意识到可用的启动子包含用于通过病毒RNA聚合酶进行转录的启动子。涉及病毒DNA或RNA分子的将核苷酸构建体导入植物中并在其中表达编码的蛋白质的方法为本领域所已知。见例如美国专利No.5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931所述；所述文献并入本文作参考。
在一些实施方案中，希望进行瞬时表达。在这些情况中，可以使用标准瞬时转化技术。这种方法包括但非限于病毒转化方法、DNA或RNA显微注射以及本领域熟知的其它方法。
可以根据常规方式使已经稳定掺入核苷酸序列的植物细胞生长成植物。见例如McCormick et al.(1986)Plant Cell Reports 581-84所述。然后使这些植物生长，用相同转化的株系或不同株系授粉，所得杂交体具有由靶位点或转移盒中所含的感兴趣的核苷酸和/或遗传标记赋予的希望表型特征的组成型表达。可以生长两或多代以保证希望的表型特征表达稳定保持并遗传，然后收获种子以保证达到希望的表型特征的表达。
包含DNA构建体的细胞和/或植物的最初鉴别和选择可以通过使用标记基因而促进。如果有鉴别重组体的敏感方法则可以不用选择而进行基因靶向，例如如果靶向的基因修饰可易于通过PCR分析检测，或者如果其产生某种表型。然而在大多数情况中，基因靶向事件的鉴别通过使用标记而促进。可用的标记包括阳性和阴性可选择标记以及便于筛选的标记，如可见标记。可选择标记包括携带如下抗生素抗性的基因，如壮观霉素(例如aada基因，Svab et al.(1990)Plant Mol Biol 14197-205)、链霉素(例如aada或SPT，Svab et al.(1990)Plant Mol Biol 14197-205；Jones et al.(1987)Mol Gen Genet21086)、卡那霉素(例如nptII，Fraley et al.(1983)Proc Natl Acad SciUSA 804803-4807)、潮霉素(例如HPT，Vanden Elzen et al.(1985)Plant Mol Biol 5299)、庆大霉素(Hayford et al.(1988)Plant Physiol861216)、腐草霉素、zeocin，或者博来霉素(Hille et al.(1986)PlantMol Biol 7171)，或者对除草剂如膦丝菌素(bar基因)或者磺酰脲(乙酰乳酸合酶(ALS))的抗性(Charest et al.(1990)Plant Cell Rep 8643)，满足在不完全培养基上生长需要的基因，如在酵母中的HIS3、LEU2、URA3、LYS2和TRP1基因，及本领域已知的其它这种基因。阴性可选择标记包括胞嘧啶脱氨酶(codA)(Stougaard(1993)PlantJ.3755-761)、tms2(DePicker et al.(1988)Plant Cell Rep 763-66)、硝酸盐还原酶(Nussame et al.(1991)Plant J 1267-274)、SU1(O’Keefe et al.(1994)Plant Physiol.105473-482)、来自农杆菌的Ti质粒的aux-2，及胸苷激酶。可筛选的标记包括荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)(Chalfie et al.(1994)Science 263802；US 6,146,826；US5,491,084；和WO 97/41228)，报道酶如β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)(Jefferson(1987)Plant Mol Biol Rep 5387；美国专利No.5,599,670；美国专利No.5,432,081)，β-半乳糖苷酶(lacZ)，碱性磷酸酶(AP)，谷胱甘肽S-转移酶(GST)和萤光素酶(美国专利No.5,674,713；Ow et al.(1986)Science 234856-859)，可见标记如花色素苷如CRC(Ludwiget al.(1990)Science 247449-450)，R基因家族(例如Lc，P，S)，A，C，R-nj，果蝇中的身体和/或眼睛颜色基因，哺乳动物系统中毛色基因，及本领域已知的其它标记。
可以使用一或多个标记以选择和筛选基因靶向事件。一种常用的基因破坏策略包括使用靶修饰多核苷酸，其中所述靶由无启动子的可选择标记破坏。由于所述可选择标记没有启动子，因此随机整合事件不太可能导致基因的转录。基因靶向事件将使所述可选择标记置于靶基因的启动子控制下。基因靶向事是通过选择可选择标记的表达而鉴别的。另一种常用的策略是利用阳性一阴性选择方案。这种方案利用两种可选择标记，一种赋予抗性(R+)偶联一种赋予敏感性(S+)，这两种标记均具有启动子。当这种多核苷酸随机插入时，所得表型是R+/S+。当产生基因靶向事件时，这两种标记未偶联，所得表型是R+/S-。使用阳性-阴性选择方案的实例见并入本文作参考的Thykjaer et al.(1997)Plant Mol Biol 35523-530及PCT国际出版物No.WO 01/66717所述。
除非特别说明，则本发明应用本领域技术人员熟知的常规化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学技术。见例如Maniatis et al.(1982)Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York)；Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning，2nd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning，3rd Ed.(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Ausubel et al.(1992)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons，including periodic updates)；Glover(1985)DNA Cloning(IRL Press，Oxford)；Anand(1992)Techniques for the Analysis of ComplexGenomes(Academic Press).；Guthrie and Fink(1991)Guide to YeastGenetics and Molecular Biology(Academic Press).；Harlow and Lane(1988)Antibodies，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York)；Jakoby and Pastan，eds.(1979)“Cell Culture”Methods in Enzymology Vol.58(Academic Press，Inc.，Harcourt BraceJovanovich(NY)).；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene TransferVectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，Vols.154and 155(Wu et al.eds.)，Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；Riott，Essential Immunology，6thEdition，Blackwell Scientific Publications，Oxford，1988；Hogan et al.，Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)；Westerfield，M.，The zebrafish book.Aguide for the laboratory use of zebrafish(Danio rerio)，(4th Ed.，Univ.ofOregon Press，Eugene，2000)；Methods in Arabidopsis Research(C.Koncz et al.，eds，World Scientific Press，Co.，Inc.，River Edge，Minnesota1992)；ArabidopsisA Laboratory Manual(D.Weigel and J.Glazebrook，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York，2002)所描述。
实施例1本实施例描述了microRNA的鉴别。
下列实验在Arabidopsis thaliana Col-0生态型上进行。植物在冷白光下于22℃在长日照(16小时光照、8小时黑暗)下生长。
Arabidopsis植物用修改的浸花法(floral dip method)转化，其中农杆菌细胞悬液通过从上面直接浇水而施加于植物。使用的T-DNA载体pHSbarENDs含有4个拷贝的相邻于右边界的CAMV 35S增强子，这一排列类似于Weigel et al.(Plant Physiol.1221003-1013，2000)所述。转化的植物用glufosinate(BASTA)选择并筛选其开花时间，由此鉴别了早花(early-flowering)EAT-D突变体。在EAT-D中鉴别与早花共分离的一个单一T-DNA，并进行TAIL-PCR以扩增相邻于该T-DNA左边界和右边界的序列。为了鉴别在EAT-D突变体中被上调的转录物，探查含有从野生型(Col-0)和EAT-D植物中提取的RNA的Northern印迹。针对基因At5g04270和At5g04280(GenBank NC_003076)的探针未检测到野生型和EAT-D之间有任何差异，而来自基因间区域的探针鉴别了一个～1.4kb的转录物，其在EAT-D中以显著高于在野生型中的水平表达。
为了分离全长EAT cDNA，用选择5’加帽mRNA的GeneRacer试剂盒(Invitrogen)进行5’-和3’-RACE-PCR。用寡dT引物进行逆转录，PCR使用与5’试剂盒引物配对的基因特异性引物(SEQ ID NO455’-CTGTGCTCACGATCTTGTTGTTCTTGATC-3’)或与3’试剂盒引物配对的第二个基因特异性引物(SEQ ID NO465’-GTCGGCGGATCCATGGAAGAAAGCTCATC-5’)。
在激活标记的群体中鉴别Arabidopsis EAT-D(Early ActivationTagged-Dominant)突变体(Weigel et al.(2000)Plant Physiol1221003-1013)。如通过肉眼观察和测量莲座叶数目所表明的(表2)，EAT-D突变体开花非常早。另外，EAT-D展示与在强apetala2(ap2)突变体等位基因中观察到的基本上相同的花缺陷(Bowman et al.(1991)Development 1121-20)，包括完全缺乏花瓣并且萼片转变成心皮。这一ap2样表型仅在EAT-D纯合子中观察到，而EAT-D杂合子和纯合子均早花，表明开花时间表型比ap2样花表型更加对EAT-D剂量敏感。
表2Arabidopsis品系的莲座叶数目
EAT-D中的激活标记的T-DNA插入序列被定位于5号染色体，位于注释基因At5g04270和At5g04280之间。然后使用位于这一区域内的引物经5’-和3’-RACE PCR鉴别一1.4kb转录物(SEQ IDNO1)，其被称为EAT，其在EAT-D中被上调。当该1.4kb EATcDNA与组成型CAMV 35S启动子融合并且所得的35S::EAT构建体通过农杆菌介导的转化(Clough and Bent(1998)Plant J 16735-743)被导入野生型(Col-0)植物中时，该35S::EAT转化子展示与在EAT-D中所见相同的早花和ap2样表型(表1)。许多35S::EAT转化子有时候展示额外的缺陷，包括在茎生叶缘上的柱头乳突以及在茎生叶叶腋中形成完全或部分花而不是二级花序。EAT基因在35S::EAT植物中的异位表达因此影响了开花时间和花器官的规格(specification offloral organ identity)。
基于RACE-PCR方法学，EAT基因产生1417个核苷酸的非编码RNA，其预测为5’-加帽的并且是聚腺苷酸化的。用EAT cDNA对几个数据库进行BLASTN和BLASTX检索未揭示EAT和任何其他基因有广泛的核苷酸或预测的氨基酸序列相同性。但是，在EAT转录物的中部鉴别了一段21个核苷酸(nt)(SEQ ID NO4)长的序列段，其与最近鉴别的一种miRNA即miR172a-2(Park et al.(2002)Curr Biol121484-1495)相同。为了证实EAT cDNA内的这一miR172a-2序列的功能重要性，产生EAT的一种突变形式，其中缺失miR172a-2序列，并且使由这一突变体EAT cDNA组成的构建体eatdel由35S启动子驱动。携带这一35S::eatdel构建体的转基因植物以与野生型相同的叶子数目开花并且具有正常的花(表1)，提示miR172a-2序列是赋予在EAT过表达品系中所见的开花时间和花器官性质表型所需的。
如由Park et al.(2002)Curr Biol 121484-1495)所注意到的，该21-nt miR172a-2miRNA具有与AP2的编码区的3’末端附近的序列形成RNA双链体的潜力(表3)。
表3推断的21-ntmiR172a-2/AP2RNA双链体
双链体中的GU摆动(wobble)以下划线示出。
AP2基因的这一特定区域在AP2家族中在核苷酸水平的保守性差，但是互补于miR172a-2的AP2序列(SEQ ID NO49)在三个其它Arabidopsis AP2家族成员At5g60120(SEQ ID NO50)、At2g28550(SEQ ID NO51)、At5g67180(SEQ ID NO52)中的类似的位置被发现。另外，该序列可以在玉米AP2基因indeterminate spikeletl(Chuck et al.(1998)Genes Dev 121145-1154)(IDS1(SEQ ID NO53))和glossy15(Moose and Sisco(1996)Genes Dev 103018-3027)(GL15(SEQ ID NO54))以及在来自许多其它植物物种包括大豆、水稻、小麦、番茄和豌豆的AP2家族成员(未示出)中的相应位置被发现。三种Arabidopsis和两种玉米AP2家族成员的序列对比见下表4。
表4AP221-nt区域(黑条杆示出)和周围序列(SEQ ID NO)的对比AP2ACCAAGTGTTGACAAATGCTGCAGCATCATCAGGATTCTCTCCTCATCATCACAATCAG(49)At5g60120 CACCGCCACTGTTTTCAAATGCAGCATCATCAGGATTCTCACTCTCAGCTACACGCCCT(50)At2g28550 CACCATTGTTCTCAGTTGCAGCAGCATCATCAGGATTCTCACATTTCCGGCCACAACCT(51)At5g67180 GAAATCGAGTGGTGGGAATGGCAGCATCATCAGGATTCTCTCCTCAACCTTCCCCTTAC(52)IDS1 ACGTGCCGTTGCACCACTCTGCAGCATCATCAGGATTCTCTACCGCCGCCGGGGCCAAC(53)GL15 ACGCCAGCAGCGCCGCCGCTGCAGCATCATCAGGATTCCCACTGTGGCAGCTGGGTGCG(54)在染色体2上有一额外拷贝的Arabidopsis基因组中的miR172a-2miRNA(miR172a-1，图2d)，并且miR172a-2与三个其它Arabidopsis基因座高度相似。与miR172a-2miRNA一样，该序列的所有四个重复均在基因间区域，即在目前在GenBank中有注释的Arabidopsis基因之间。另外，该序列在来自番茄、马铃薯和大豆的EST中发现，并且在水稻的基因组序列中发现了4个拷贝。
实施例2本实施例描述了表达载体的构建。
为了过表达EAT基因，设计含有XhoI位点的引物(SEQ IDNO55 5’-GACTACTCGAGCACCTCTCACTCCCTTTCTCTAAC-3’和SEQ ID NO56 5’-GACTACTCGAGGTTCTCAAGTTGAGCACTTGAAAAC-3’)以从Col-0 DNA中扩增完整的EAT基因。PCR产物用XhoI消化并插入到不具有BamHI和HindIII位点的修饰的pBluescriptSK+载体(Stratagene，La Jolla，CA)中，以产生EATX4(SEQ ID NO44)。为了产生35S::EAT转化子，将XhoI切割的EAT基因插入到二元载体pBE851中，使之位于CAMV 35S启动子和b-菜豆蛋白终止子之间，通过浸花法转化Col-0。为了产生eatdel构建体，合成两个寡核苷酸(SEQ ID NO57 5’-GATCCATGGAAGAAAGCTCATCTGTCGTTGTTTGTAGGCGCAGCACCATTAAGATTCACATGGAAATTGATAAATAC-3’和SEQ IDNO58 5’-CCTAAATTAGGGTTTTGATATGTATATTCAACAATCGACGGCTACAAATACCTAA-3’)，它们完整重建了EAT cDNA的BamHI/HindIII片段，只是该片段内缺失21nt miR172a-2序列。这两个寡核苷酸与其合成的互补链(SEQ ID NO59 5’-TAGGGTATTTATCAATTTCCATGTGAATCTTAATGGTGCTGCGCCTACAAACAACGACAGATGAGCTTTCTTCCATG-3’和SEQ ID NO605’-AGCTTTAGGTATTTGTAGCCGTCGATTGTTGAATATACATATCAAAACCCTAATT-3’)退火并在三分子连接反应中与已用BamHI和HindIII消化的EATX4连接。这样产生了159bp野生型EAT序列用138bp突变序列置换。然后将eatdel cDNA亚克隆进pBE851并如上所述进行转化。使用BASTA选择植物中的EAT和eatdel过表达构建体。
为了测试miR172家族另一成员miR172a-1是否会赋予与miR172a-2类似的表型，产生含有与miR172a-1周围的基因组区域融合的35S启动子的构建体。含有所述35S::miR172a-1构建体的植物早花并且展示ap2表型(表1)，提示miR172a-1当被过表达时以与miR172a-2相同的方式起作用。
所有miR172miRNA家族成员均位于使RNA发夹形成的前后序列中(图1)。推测起来这一发夹结构是随后被植物Dicer同系物裂解的底物，由此产生成熟的miRNA。MiRNA在发夹内的位置，即在茎的3’侧上，在miR172家族的所有成员中是保守的，这可能反映了加工这一特定miRNA家族的结构要求。因此，预测21-nt miR172a-2miRNA是miRNA家族的一个成员，该家族具有通过与AP2基因中的21nt关连序列形成RNA双链体而调节AP2基因亚集合的能力。
实施例3本实施例描述microRNA表达和AP2表达的分析。
用TRIZOL试剂(Sigma)从已经开花的野生型和EAT-D完整植物中分离总RNA。将50mg每种RNA在15％TBE-Urea Criterion凝胶(BioRad)上电泳，用TransBlot-SD装置(BioRad)电印迹至Hybond-N+滤纸(Amersham)上。滤纸然后在UltraHyb-Oligo缓冲液(Ambion)中与32P-标记的寡聚物在37℃杂交过夜。所述寡聚物是30聚体，其相应于miR172a-2 miRNA的有义链或反义链，在每侧各有4-5个核苷酸的侧翼序列。滤纸在含有2X SSC和0.5％SDS的缓冲液中于37℃洗两次。为了S1分析，通过用T4多核苷酸激酶和32P末端标记一种寡聚物(SEQ ID NO61)(5’-ATGCAGCATCATCAAGATTCTCATATACAT-3’)而制备探针。用标准方案进行杂交和S1反应的加工。为进行miR172a-2和miR172a-1的发育分析，使用Rneasy试剂盒(Qiagen)从实施例4指示的处于各种阶段的植物和组织中分离总RNA。用标准方案进行RT-PCR，使用的是特异于miR172a-2邻近序列的寡聚物(SEQ ID NO62)(5’-GTCGGCGGATCCATGGAAGAAAGCTCATC-3’和(SEQ ID NO63)5’-CAAAGATCGATCCAGACTTCAATCAA TATC-3’)或特异于miR172a-1邻近序列的寡聚物(SEQ ID NO64)(5’-TAATTTCCGGAGCCACGGTCGTTGTTG-3’和(SEQ ID NO65)5’-AATAGTCGTTGATTGCCGATGCAGCATC-3’)。用于扩增ACT11(肌动蛋白)转录物的寡聚物是(SEQ ID NO66)5’-ATGGCAGATGGTGAAGACATTCAG-3’，和(SEQ ID NO67)5’-GAAGCACTTCCTGTGGACTATTGATG-3’。AP2的RT-PCR分析在来自花芽的RNA上进行，使用如下寡聚物(SEQ ID NO68)5’-TTTCCGGGCAGCAGCAACATTGGTAG-3’，和(SEQ ID NO69)5’-GTTCGCCTAAGTTAACAAGAGGATTTAGG-3’。用于扩增ANT转录物的寡聚物是(SEQ ID NO70)5’-GATCAACTTCAATGACTAACTCTGGTTTTC-3’，和(SEQ ID NO71)5’-GTTATAGAGAGATTCATTCTGTTTCACATG-3’。
AP2的免疫印迹分析在从花芽中提取的蛋白质上进行。在10％SDS-PAGE凝胶上电泳之后，将蛋白质转移至Hybond-P膜(Amersham)上并与特异于AP2蛋白的抗体(aA-20，Santa CruzBiotechnology)保温。用ECL-plus kit(Amersham)处理印迹。
使用针对miR172a-2miRNA为有义和反义的探针的Northern分析鉴别了一种21-25个核苷酸的小的单链RNA，其在EAT-D突变体植物中积累至相对于野生型高得多的水平。在野生型中见到的少量转录物据推测代表不仅miR172a-2miRNA而且还有与其足够相似而能与探针交叉杂交的其家族成员的内源性性水平。预测的miR172a-2发夹长度为117个核苷酸(图1)，少量～100nt转录物在EAT-D中被检测到有积累，这可能代表部分加工的miR172a-2发夹前体。miR172a-2miRNA的S1核酸酶作图提供了对由Park et al.((2002)Curr Biol 121484-1495)所报道的miR172a-2的5’末端的独立的确证。
实施例4本实施例描述EAT miRNA表达的发育模式为了独立于其它Arabidopsis家族成员而获得miR172a-2的野生型表达谱，使用RT-PCR以特异性检测含有miR172a-2的一种1.4kbEAT全长前体转录物的片段。EAT前体转录物表达被时序调节(temporally regulated)，在萌发后2天很少或未检测到转录物，随着植物接近开花可见逐渐增多的稳态转录物积累。miR172a-1的前体转录物显示类似的时序表达谱。miR172a-2和miR172a-1前体转录物在开花发生后均持续被表达并在叶和花芽中积累。其它miR172家族成员的前体表达未检测到，也许是由于它们仅在未包括在本分析中的组织类型中表达所致，或者是由于它们的转录物太瞬时而未能检测到。针对miR172a-2和miR172a-1所见的时序表达谱使人联想到针对let-7和lin-4所观察到的结果，它们是在C.elegans中控制发育时间的两种miRNA(Feinbaum and Ambros(1999)Dev Biol 21087-95；Reinhart et al.(2000)Nature 403901-906)。
实施例5评价miR172在各种开花时间突变体中的水平，以尝试将miR172定位于已知的开花时间途径中。miR172水平在所测试的任何突变体中均未改变，并且在生长在长日照和生长在短日照的植物中EAT转录物的水平是相同的。
实施例6本实施例描述蛋白质表达的评价。
免疫印迹分析表明在EAT-D突变体中AP2蛋白相对于野生型下降3.5倍，而AP2转录物未受影响。这一数据提示miR172a-2miRNA通过翻译抑制而负调节AP2。据推测，miR172a-2miRNA和AP2靶位点之间的被推测为近乎完全的互补性引发由RNA干扰(RNAi)途径(Llave et al.(2002)Plant Cell 141605-1619；Hutvagnerand Zamore(2002)Science 2972056-2060)导致的AP2mRNA裂解。确实，其他人已经推测许多植物miRNAs仅由于它们与推断的靶的近乎完全的互补性而进入RNAi途径(Rhoades et al.(2002)Cell110513-520)。尽管没有有关在推测的miR172a-2/AP2RNA双链体中GU摆动碱基对的证据，但是其在所有推测的miR172家族成员与其AP2靶之间的双链体中是保守的。无论机制如何，从AP2表达数据和EAT-D的观察表型可以明白AP2是由miR172a-2负调节的靶，至少当miR172a-2被过表达时是这样。
实施例7在鉴别早花EAT-D突变体的同一遗传筛选中，鉴别了一种激活标记的迟开花突变体，称为LAT-D。除了迟开花之外，该LAT-D突变体未展示另外的表型(表1)，并且所述迟开花表型与单T-DNA插入共分离。对LAT-D中的T-DNA插入的序列分析表明4X 35S增强子位于At2g28550上游大约5kb，At2g28550是潜在地被miR172调节的AP2样靶基因中的一种。使用特异于At2g28550的引物进行的RT-PCR分析表明相应于这一基因的转录物在LAT-D中确实以高于野生型的水平表达。为了证实At2g28550的过表达导致迟开花，将含有完整At2g28550编码区(从起始密码子至终止密码子)的基因组区域与35S启动子融合，产生含有这一构建体的转基因植物。转基因35S::At2g28550植物迟于野生型植物开花，并且比LAT-D突变体略迟(表1)。这一迟开花表型在多个独立的转化子中观察到。
At2g28550的过表达导致迟开花这一事实提示miR172部分通过减量调节At2g28550而促进开花。但是，因为miR172看起来影响其靶基因的蛋白质而不是转录物的积累，并且因为不存在At2g28550基因产物的抗体，因此这一调节作用通过遗传杂交而间接测试。将LAT-D杂合的植物与EAT-D纯合植物杂交，由此F1子代含有一个拷贝的EAT-D，并且50％的F1子代也会具有一个拷贝的LAT-D。通过PCR评价F1子代是否存在LAT-D等位基因，并记录开花时间。所有的F1植物均早花，而无论它们是否含有一个拷贝的LAT-D等位基因，由此提示EAT-D相对于LAT-D是上位性的。这一结果与如下观点一致，即在EAT-D中过表达的miR172a-2直接减量调节在LAT-D中过表达的At2g28550。
实施例8为了评价降低At2g28550功能的效应，鉴别含有At2g28550基因中的T-DNA插入的植物。另外鉴别At2g60120的T-DNA突变体，At2g60120是一种紧密相关的AP2样基因，其也含有miR172靶序列。At2g28550插入序列或At5g60120插入序列纯合的植物相对于野生型略早开花(表1)。将这两种突变体杂交，通过PCR基因分型分离双突变体。At2g28550/At5g60120双突变体比任一单个突变体均早开花(表1)，提示这两个基因具有重叠功能。At2g28550/At5g60120双突变体的早花表型与如下观点一致，即miR172过表达品系的早花表型是由于几种AP2样基因如At2g28550和At5g60120的减量调节所致。令人感兴趣地，At2g28550/At5g60120双突变体不象miR172过表达品系一样早花(参见EAT-OX，表1)，这提示miR172的其它AP2样靶例如AP2本身或At5g67180也对开花时间控制有贡献。因为ap2突变体不是早花，所以AP2对开花的任何潜在负调节在正常情况下必须被遗传冗余性所掩盖。
实施例9本实施例描述靶选择方法和设计DNA构建体的方法以使用SEQID NO3和44的构建体产生miRNA。任何感兴趣的序列均可以被选择以用于通过如下方法产生的miRNA的沉默1.从感兴趣的基因的编码链选择一个区域作为靶序列。典型地，选择在与AP2样基因中被EAT靶向的区域(其为终止密码子上游约100nt的区域)类似的位置中发现的约10-50个核苷酸的区域。然而靶的精确位置看起来不是关键。推荐选择具有～50％GC并且是高序列复杂性即没有重复或长多核苷酸序列段的区域。还推荐的是所选择的区域的末端为T或A，从而互补miRNA将以A或U起始。这有助于保证在其双链Dicer产物形式中的miRNA的5’末端的低稳定性(Schwartz，et al.(2003)Cell 115199-208)。例如，在miR172a-2前体中，miRNA序列以A起始，许多其它miRNA以U起始。
2.为使用SEQ ID NO3的构建体，产生与所述21nt靶序列互补的21个核苷酸的序列(miRNA)。任选地，将miRNA中的一个C变为T，其将在靶序列中产生一个GU摆动，模拟EAT中所见的GU摆动。
3.产生发夹结构的21个核苷酸的“backside”序列。其与步骤2的miRNA基本上互补。注意，这一backside序列也与靶序列基本上相同。典型地，导入几个错配以在发夹结构的茎中产生一些凸出(bulge)，它们类似于原始EAT发夹中的凸出。任选地，在backside的3’末端导入一个A，以产生miRNA的5’末端的错配。这一最后步骤可有助于保证在其双链Dicer产物形式中miRNA的5’末端的低稳定性(Schwartz et al.(2003)Cell 115199-208)。
4.用步骤2和3的新miRNA和“backside”序列置换EATBamHI/HindIII DNA构建体(SEQ ID NO3)中的21个核苷酸的miRNA序列和21个核苷酸的“backside”序列。
5.使用MFOLD(GCG，Accelrys，San Diego，CA)或等价程序比较步骤4的新发夹结构与原始的发夹结构。通常，所述序列基本上复制原始发夹结构(图1)。推测导入的凸出无需在长度、序列或位置上与原始的精确相同。检查发夹结构中的miRNA序列，确定推测的Dicer的dsRNA产物的5’和3’末端的相对稳定性。
6.产生4个长度为76-77个核苷酸的合成寡核苷酸，以生成两个双链片段，这些片段包含BamHI和HindIII限制位点和4个核苷酸的突出端以促进定向连接，定向连接会重建BamHI/HindIII片段。突出端的设计可以由本领域技术人员进行，本实施例中使用SEQ IDNO3的位置79-82的4核苷酸区域(CCTA)。因此，例如Oligo 1在5’末端具有未配对的BamHI位点，并且以SEQ IDNO3的第78位核苷酸结束。
Oligo 2具有在5’末端未配对的位置79-82的核苷酸(CCTA)，并且就在HindIII位点(或SEQ ID NO3的位置151-154)之前终止。
Oligo 3基本上与Oligo 1互补，(SEQ ID NO3的核苷酸5-78)，并且以与Oligo 2的核苷酸1-4(CCTA)互补的4个核苷酸终止。
Oligo 4基本上与Oligo 2互补，起始于位置5的核苷酸，并在3’末端以HindIII位点终止。
将这些寡核苷酸退火，产生两个片段以用于后续的与质粒序列的连接反应中。
任选地，可以合成包含attB序列的两个合成寡核苷酸，并退火以产生侧翼为attB的miRNA前体，所述miRNA前体随后用重组克隆(GATEWAY，InVitrogen Corp.，Carlsbad，CA)整合进载体中。
7.在一三分子连接反应中将来自步骤6的两个DNA片段与一种用BamHI/HindIII切割的质粒连接。本实施例中使用SEQ ID NO44的修饰的pBluescript SK+质粒，其包含SEQ ID NO1的1.4kb EAT序列，其用BamHI/HindIII消化并用标准分子生物学技术与小片段凝胶纯化分离。所述新设计的针对感兴趣的基因的miRNA以置换了先前的miRNA。
如果使用来自步骤6的侧翼为attB的序列，可以使用BP和LR重组反应(GATEWAY，InVitrogen Corp.，Carlsbad，CA)以将修饰的发夹结构插入包含全长miR172a-2前体的目的载体中。
8.来自步骤7的质粒可根据需要进行任何其它制备或修饰，其用于经合适于靶的技术转化靶生物。
9.靶基因的沉默可用本领域熟知的技术如Northern印迹分析、免疫印迹分析(如果感兴趣的靶基因编码多肽)和任何与靶基因相关的表型筛选例如开花时间或花形态学而进行。
实施例10本实施例描述的是可用于将多核苷酸或多肽导入植物细胞的丰富。
A.玉米颗粒介导的DNA输送一种DNA构建体可被导入能在合适的玉米培养基上生长的玉米细胞中。这种相容细胞可以来自玉米悬浮培养物、固体培养基上的愈伤组织培养物、新鲜分离的未成熟胚或分生组织细胞。Hi-II基因型的未成熟胚可以被用作靶细胞。在传粉后约10天采集穗(ears)，从谷粒中分离1.2-1.5mm的未成熟胚，并使盾片(scutellum)侧向下放置于玉米培养基上。
在从穗上采集后轰击未成熟胚18-72小时。在轰击前6和18小时之间，将未成熟胚放置在具有额外的渗压剂的培养基上(MS基础培养基，Musashige and Skoog(1962)Physiol Plant 15473-497，具有0.25M山梨糖醇)。在高渗透压培养基上的胚用作轰击靶，并在轰击后继续留在这一培养基上18小时。
为进行颗粒轰击，用标准CaCl2-亚精胺化学将质粒DNA(如上所述)沉淀在1.8mm钨颗粒上(参见例如Klein et al.(1987)Nature32770-73)。用DuPont Helium Gun在600 PSI轰击每一平板1次(Lowe et al.(1995)Bio/Technol 13677-682)。用于玉米为成熟胚分离、愈伤组织起始、愈伤组织增殖和植物再生的典型培养基配方参见Armstrong(1994)In The Maize Handbook，M.Freeling and V.Walbot，eds.Springer Verlag，NY，pp 663-671。
颗粒轰击后1-7天内，将胚移到含有3mg/l选择剂bialaphos的基于N6的培养基上。每2周将胚和晚期愈伤组织转移到新鲜选择平板上。筛选从未成熟胚发育的愈伤组织的希望的表型。6-8周后，回收转化的愈伤组织。
B.大豆转化大豆胚发生悬浮培养物保持在250ml Erlenmeyer瓶中的35ml液体培养基SB196或SB172中，Erlenmeyer瓶置于摇床上，150rpm，26℃，冷白荧光，光周期为16∶8小时白天/黑夜，光密度为30-35uE/m2s。培养物每2周通过将约35mg的组织接种进35ml新鲜液体培养基中而传代培养。或者，培养物在6孔Costar板中起始和维持。
SB 172培养基如下制备(每升)，1瓶Murashige and SkoogMedium(Duchefa#M 0240)，1ml B5维生素1000X原液，1ml 2，4-D原液(Gibco 11215-019)，60g蔗糖，2g MES，0.667g无水L-天冬酰胺(GibcoBRL 11013-026)，pH 5.7。SB 196培养基如下制备(每升)10ml MS FeEDTA，10ml MS硫酸盐，10ml FN-Lite Halides，10ml FN-Lite P，B，Mo，1ml B5维生素1000X原液，1ml 2，4-D，(Gibco 11215-019)，2.83g KNO3，0.463g(NH4)2SO4，2g MES，1g无水天冬酰胺粉末(Gibco 11013-026)，10g蔗糖，pH 5.8。2，4-D原液浓度10mg/ml如下制备将2，4-D溶解在0.1N NaOH中，过滤灭菌并储存在-20℃。B5维生素1000X原液如下制备(每100ml)-储存等份于-20℃，10g肌醇，100mg烟酸，100mg吡哆醇HCl，1g硫胺素。
通过颗粒枪轰击方法(Klein et al.(1987)Nature 32770)将大豆胚发生悬浮培养物用各种质粒转化。为制备用于轰击的组织，将约两瓶已经自其最近的传代培养中恢复了大约1-2周的悬浮培养组织置于在底部含有1片无菌滤纸以帮助吸收水分的无菌的60×20mm皮氏皿中。组织(即大小约3-5mm的悬浮簇)在每一皮氏皿中均匀扩散开。在轰击前，残留液体用移液枪从组织除去，或者蒸发除去过量水分。每个实验轰击4-6个平板。每一平板从2瓶中制备。
为制备用于轰击的金颗粒，将30mg金在乙醇中洗涤，离心并重悬于0.5ml无菌水中。为了将每一质粒组合(处理)用于轰击，制备一单独的微离心管，用50微升如上所述制备的金颗粒起始。在每一管中，还加入如下物质5μl of质粒DNA(1μg/μl)，50μl CaCl2，和20μl 0.1M亚精胺。将这一混合物在涡旋振荡器上振荡3分钟，然后用微离心机在14,000RPM离心10秒。倾倒出上清，附着有沉淀的DNA的金颗粒用400μl乙醇洗2次(每次洗涤之间如上所述短暂离心)。每管最终的100％乙醇体积调整至40μl将这种颗粒/DNA悬液保持在冰上直至被用于轰击。
在即将施加颗粒/DNA之前，将管短暂浸入超声浴中以分散颗粒，然后将5μL DNA prep吸到每个飞盘(flying disk)上使之干燥。然后将飞盘置于DuPont Biolistics PDS1000/HE中。使用DuPontBiolistic PDS 1000/HE仪器，用于颗粒介导的DNA输送进大豆悬浮簇中，使用如下设置。膜破裂压力为1100psi。腔室抽真空至27-28英寸汞真空。将组织置于距保留/终止筛(从底部起第3个架)约3.5英寸。每一平板轰击2次，在轰击之间用无菌刮刀重新排列。
轰击后，将组织重悬于液体培养基中，每个平板被分到2个具有新鲜SB196或SB172培养基的培养瓶中并如上所述培养。轰击后4-7天，将培养基用含有选择剂的新鲜培养基置换。所述选择培养基每周更新，共4周，并在6周再次更新。如果细胞密度和培养基浊度高则4周后的每周更新仍可能是需要的。
轰击后4-8周，可观察到新生的转化组织从未转化的坏死的胚发生簇中生长出。取出分离的新生组织接种于具有液体培养基的6孔微滴定板中以产生克隆繁殖的转化的胚发生悬浮培养物。
将每一胚发生簇置于Costar 6孔板的每一孔中，孔中含有5ml具有选择剂的新鲜SB196培养基。培养物维持2-6周，每2周更换新鲜培养基。当有足够的组织时，将存活的转化克隆的一部分传代至第2个6孔板中以作为抗污染备份为促进体外成熟，将转化的胚发生簇从液体SB196中取出，置于固体琼脂培养基SB166上2周。2-4mm大小的组织块以每个平板10-15簇的组织密度置于板上。在漫射低光(＜10μE)中于26+/-1℃保温平板。2周后，将所述的组织簇传代至SB103培养基，培养3-4周。
SB166如下制备(每升)，1pkg.MS盐(Gibco/BRL-Cat#11117-017)，1ml B5维生素1000X原液，60g麦芽糖，750mg六水MgCl2，5g活性炭，pH 5.7，2g gelrite。SB 103培养基如下制备(每升)，1pkg.MS盐(Gibco/BRL-Cat# 11117-017)，1ml B5维生素1000X原液，60g麦芽糖，750mg六水MgCl2，pH 5.7，2g gelrite。5-6周成熟后，干燥各个胚，方法是将胚置于100X 15皮氏皿中，该皮氏皿中具有1cm2部分的SB103培养基以产生具有足够湿度以促进部分干燥而不是死亡的腔。
每个平板干燥约25个胚。用几层parafilm密封平板，再次置于低光条件。干燥步骤时长通过经验确定，并取决于每个平板放置的胚的大小和数量。例如，小胚或几个胚/平板需要较短的干燥时间，而大胚或多个胚/平板需要较长的干燥时间。最好在约3天后检查胚，但是合适的干燥最可能需要5-7天。在这一过程中胚将缩小尺寸。
将干燥的胚接种到SB71-1或MSO培养基中，使之在与悬浮培养相同的条件下萌发。当小植株具有两片完全伸展的三叶(trifoliateleaves)时，将萌发的生根的胚转移到无菌土壤中并用MS肥料浇灌。生长植物至成熟以收集种子并进行分析。健康的可育转基因植物在温室中生长。
SB 71-1如下制备1瓶含蔗糖的Gamborg’s B5盐(Gibco/BRL-Cat#21153-036)，10g蔗糖，750mg六水MgCl2，pH 5.7，2g gelrite。MSO培养基如下制备1pkg Murashige and Skoog盐(Gibco 11117-066)，1ml B5维生素1000X原液，30g蔗糖，pH 5.8，2g Gelrite。
实施例11本实施例描述用实施例9的方法设计和合成miRNA靶和针对在玉米、大豆和/或Arabidopsis中发现的各种基因靶的发夹结构。
A.靶向Arabidopsis AGAMOUS，At4g18960选择和设计SEQ ID NO4的miRNA序列。这一序列通过退火SEQ ID NO12-15的合成寡核苷酸并将它们与SEQ ID NO44的BamHI/HindIII骨架片段连接而被置于BamHI/HindIII发夹结构盒中。
如实施例1所述转化和培养拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col-0。用包含SEQ ID NO4的miRNA的载体转化后，88％的转化体展示突变的AGAMOUS(ag)花表型，其特征在于在轮生体(whorl)3中雄蕊转化为花瓣，在轮生体4中心皮变为另一朵ag花(Bowman，etal.(1991)The Plant Cell 3749-758)。突变表型在各转化体之间有变化，其中约1/3显示强ag表型，1/3显示中等ag表型，1/3显示若ag表型。对分离自转化体的小RNA的凝胶电泳和Northern印迹分析证实突变ag表型程度与antiAG miRNA水平直接相关，最强的表型具有最高的加工miRNA(～21nt)的积累。
B.靶向Arabidopsis Apetela3(AP3)，At3g54340选择来自AP3的两个miRNA靶并设计寡核苷酸。
选择并设计SEQ ID NO5的miRNA序列。这一序列通过退火SEQ ID NO16-19的合成寡核苷酸并将它们与SEQ ID NO44的BamHI/HindIII骨架片段连接而被置于BamHI/HindIII发夹结构盒中。
选择并设计SEQ ID NO6的miRNA序列。这一序列通过退火SEQ ID NO20-23的合成寡核苷酸并将它们与SEQ ID NO44的BamHI/HindIII骨架片段连接而被置于BamHI/HindIII发夹结构盒中。
如实施例1所述转化和培养拟南芥Col-0。用包含SEQ ID NO5的miRNA的载体转化后，转化体具有新的叶和花表型，但不显示任何突变的AP3表型。对分离自转化子的2周龄莲座叶组织的RNA进行的凝胶电泳和Northern印迹分析证实加工miRNA(～21nt)的最高积累相应于前体的“backside”链，其明显沉默不同的靶序列而产生新的叶和花表型。
选择一种新的靶，其具有正确的不对称性以使miRNA靶链在掺入RISC过程中被选择(Schwartz et al.(2003)Cell 115199-208)。选择并设计SEQ ID NO6的miRNA序列。这一序列通过退火SEQ ID NO20-23的合成寡核苷酸并将它们与SEQ ID NO44的BamHI/HindIII骨架片段连接而被置于BamHI/HindIII发夹结构盒中。由花表型和电泳分析确定，超过90％的转化体显示AP3基因沉默。在转基因植物中检测到高水平的约21nt miRNA(antiAP3b)，在野生型对照植物中未检测到。RT-PCR分析证实与野生型对照植物相比，转化体中AP3转录物的量下降C.靶向玉米八氢番茄红素去饱和酶选择来自八氢番茄红素去饱和酶(PDS)的两个miRNA靶并设计寡核苷酸。
选择并设计SEQ ID NO7的miRNA序列。这一序列通过退火SEQ ID NO24-27的合成寡核苷酸并将它们与SEQ ID NO44的BamHI/HindIII骨架片段连接而被置于BamHI/HindIII发夹结构盒中选择并设计SEQ ID NO8的miRNA序列。这一序列通过退火SEQ ID NO28-31的合成寡核苷酸并将它们与SEQ ID NO44的BamHI/HindIII骨架片段连接而被置于BamHI/HindIII发夹结构盒中D.靶向玉米植酸生物合成酶选择3个玉米植酸生物合成酶基因靶并设计miRNA和寡核苷酸。肌醇多磷酸激酶-2多核苷酸在引入本文作参考的PCT国际公开WO 02/059324中揭示。肌醇1，3，4-三磷酸5/6激酶多核苷酸在引入本文作参考的PCT国际公开中揭示。肌醇1-磷酸合酶多核苷酸在引入本文作参考的PCT国际公开WO 99/05298中揭示。
肌醇多磷酸激酶-2(IPPK2)选择并设计SEQ ID NO9的miRNA序列。这一序列通过退火SEQ ID NO32-35的合成寡核苷酸并将它们与SEQ ID NO44的BamHI/HindIII骨架片段连接而被置于BamHI/HindIII发夹结构盒中。
肌醇1，3，4-三磷酸5/6-激酶-5(ITPK5)选择并设计SEQ ID NO10的miRNA序列。这一序列通过退火SEQ ID NO36-39的合成寡核苷酸并将它们与SEQ ID NO44的BamHI/HindIII骨架片段连接而被置于BamHI/HindIII发夹结构盒中。
肌醇1-磷酸合酶(milps)选择并设计SEQ ID NO11的miRNA序列。这一序列通过退火SEQ ID NO40-43的合成寡核苷酸并将它们与SEQ ID NO44的BamHI/HindIII骨架片段连接而被置于BamHI/HindIII发夹结构盒中。
E.靶向大豆Apetela2-样序列(AP2)相同的用于Arabidopsis转化的包含SEQ ID NO1的EAT(miR172a-2)构建体被用于转化大豆。这一构建体具有编码SEQ IDNO48的miRNA的miRNA模板序列。这一构建体如实施例2所述用PCR扩增Arabidopsis的miR172a-2前体序列、限制消化和连接而产生。
基本上如实施例10所述转化大豆组织并培养。转化后，42％的转化体显示特征在于萼片转化为叶的突变表型。展示最强表型的植物是不育的，不结种。器官的同源异型转化以及对可育性的影响均与在Arabidopsis的ap2突变等位基因中所见的类似。用miR172反义的寡核苷酸探针探查小RNA凝胶电泳和Northern分析显示miR172在转基因品系中积累。在大豆对照品系中也检测到少量内源性性大豆miR172。突变表型程度与miRNA水平直接相关，最强的表型具有最高的加工miRNA(～21nt)的积累。
F.靶向Arabidopsis AP2-样基因选择并设计SEQ ID NO72的miRNA序列。该序列通过退火SEQ ID NO73-74的合成寡核苷酸并进行BP重组反应(GATEWAY)而被置于attB发夹结构盒中以产生attL中间体。这一中间体被用于LR反应中以与目的载体重组，所述目的载体在实施例12中概述，其包含含attR位点的EAT全长前体和代替发夹结构的阴性选择标记。这一反应的产物包含侧翼为attR位点的miR172a-2前体发夹结构盒(即发夹结构置换标记盒)。
G.靶向Arabidopsis脂肪酸去饱和酶(FAD2)基于NM_112047的序列(At3g12120)选择和设计SEQ ID NO75的miRNA序列。该序列通过退火SEQ ID NO76-77的合成寡核苷酸并进行BP重组反应(GATEWAY)而被置于attB发夹结构盒中以产生attL中间体。这一中间体被用于LR反应中以与目的载体重组，所述目的载体在实施例12中概述，其包含含attR位点的EAT全长前体和代替发夹结构的阴性选择标记。这一反应的产物包含侧翼为attR位点的FAD2 miRNA前体发夹结构盒(即发夹结构置换标记盒)。anti-FAD2 miRNA的作用可以通过确定脂肪酸谱变化的脂肪酸分析而确定，例如参见引入本文作参考的Wu et al.(1997)Plant Physiol.113347-356。
H.靶向Arabidopsis八氢番茄红素去饱和酶(PDS)基于NM_202816的序列(At4g14210)选择和设计SEQ ID NO78的miRNA序列。该序列通过退火SEQ ID NO79-80的和合成寡核苷酸并进行BP重组反应(GATEWAY)而被置于attB发夹结构盒中以产生attL中间体。这一中间体被用于LR反应中以与目的载体重组，所述目的载体在实施例12中概述，其包含含attR位点的EAT全长前体和代替发夹结构的阴性选择标记。这一反应的产物包含侧翼为attR位点的PDS miRNA前体发夹结构盒(即发夹结构置换标记盒)。含有antiPDS构建体的转基因植物在萌发时在超过约90％的品系中被光漂白，提示PDS的沉默。
实施例12本实施例描述使用重组克隆技术构建表达载体。
实施例2中所述的载体(SEQ ID NO44)被修饰以掺入att重组位点以便于使用GATEWAY技术(InVitrogen，Carlsbad，CA)的重组克隆。将BamHI/HindIII片段以一种序列置换，所述序列以如下顺序包含attR1-CAM-ccdB-attR2。当与含有位于miRNA发夹结构前体构建体侧翼的attB位点的寡聚物重组(BP+LR)时，选择标记由miRNA发夹结构前体置换。
实施例13本实施例、特别是表5总结了针对实施例所述的miRNA沉默构建体的靶序列和寡聚物。
表5
实施例14本实施例描述基因组玉米miR172前体的鉴别和分离。
用21nt miR172a-2序列检索National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)的Genome Survey Sequence(GSS)数据库以鉴别含有miR172前体序列的基因组玉米序列。鉴别了几种玉米miR172前体，被称为miR172a-miR172e(SEQ ID NO81-85)，如表6所示。将每一序列输入到Vector NTI(InVitrogen，Carlsbad，CA)中，进行重叠群分析。分析鉴别了4个基因座，每一个具有一独特的共有序列。用RNA Structure软件(Mathews et al.(2004)Proc Natl Acad SciUSA 1017287-7292，引入本文作参考)检查了来自每一基因座的围绕在miRNA序列周围的约200个核苷酸的区域，以期发现二级结构折叠。这一分析的结果鉴别了玉米序列miR172a-e中的每一个序列的发夹结构前体。
表6玉米miR172前体和发夹结构位置以及miRNA双链体成分
设计寡核苷酸以才B73基因组玉米文库扩增miR172a或miR172b，这些引物还添加限制酶识别位点以促进克隆(BamHI或EcoRV)。或者，可以使用设计产生用于重组克隆的att位点的PCR引物。在PCR扩增后，分离、纯化产物并用序列分析证实。证实后，将这些序列插入到包含玉米遍在蛋白(UBI)启动子的构建体中。这一构建体可以被用于转化载体的构建，例如通过添加att位点可以使用GATEWAY系统。
下列PCR引物用于扩增包含玉米miR172a的发夹结构前体的序列正向引物(SEQ ID NO87)5’GGATCCTCTGCACTAGTGGGGTTATT 3’反向引物(SEQ ID NO88)5’GATATCTGCAACAGTTTACAGGCGTT 3’下列PCR引物用于扩增包含玉米miR172b的发夹结构前体的序列正向引物(SEQ ID NO89)5’GGATCCCATGATATAGATGATGCTTG 3’反向引物(SEQ ID NO90)5’GATATCAAGAGCTGAGGACAAGTTTT 3’实施例15本实施例描述miRNA靶和针对在玉米中发现的各种基因靶的发夹结构的设计和合成，以与玉米miR172b miRNA前体一起应用。
A.玉米中的miR172b靶与Arabidopsis EAT实施例类似，玉米miR172b发夹前体通过在玉米中过表达而测试。包含miRNA模板的前体序列示于SEQ IDNO91。miRNA示于SEQ ID NO92，miRNA双链体的backside示于SEQ ID NO93。通过退火SEQ ID NOS97和98的寡核苷酸产生一双链DNA分子，其包含miRNA前体和针对BamHI和KpnI的限制酶突出端。
B.八氢番茄红素去饱和酶(PDS)包含miRNA模板的寡核苷酸示于SEQ ID NO94。针对PDS的miRNA示于SEQ ID NO92，并且miRNA双链体的backside示于SEQ ID NO93。通过退火SEQ ID NOS99和100的寡核苷酸产生一双链DNA分子，其包含miRNA前体和针对BamHI和KpnI的限制酶突出端。
本实施例的寡核苷酸可以使用标准克隆技术如限制消化和连接和/或重组克隆如GATEWAY而被插入用于转化的载体中。
实施例16本实施例描述用于实施例17-19的材料和方法。
质粒构建体用引物CACC-miR159a-prec5’CACCACAGTTTGCTTATGTCGGATCC 3’(SEQ ID NO101)和miR159a-Xma5’TGACCCGGGATGTAGAGCTCCCTTCAATCC 3’(SEQ ID NO102)经PCR扩增克隆含有Arabidopsis miR159a的完整序列(见下述)的276bp片段。miR159a-Xma含有成熟miR159a的21个核苷酸中的18个(粗体)以及一个引入的XmaI位点(斜体)。根据厂商指导将所述PCR片段克隆进pENTR/SD/D-TOPO载体(Invitrogen)以获得pENTR-miR 159a-prec。
使用Gateway重组系统将pre-miR159a序列转移到含有2个拷贝的35S启动子和NOS终止子的植物双向载体pK2GW7中以产生pK2-pre-miR159a。
用下述寡核苷酸经PCR进行pre-miR159a的诱变。
5’-miR-PDS159a5’ATAGATCTTGATCTGACGATGGAAGAAGAGATCCTAAC TTTTCAAA 3’(SEQ ID NO103；这一寡核苷酸含有天然BglII位点(斜体)和miR-PDS159a*序列(粗体))。
3’-miR-PDS159a5’TGACCCGGGATGAAGAGATCCCATATTTCCAAA 3’SEQ IDNO104；这一寡核苷酸含有在miR159a序列中的点突变(粗体)以增加其与PDS mRNA序列的互补性，这是基于可获得的N.benthamiana PDS mRNA部分序列(Genbank AJ571700，见下述))。
使用上述引物和作为模板的pENTR-miR159a-prec DNA对PCRmiR159a前体进行的PCR扩增产生一种DNA片段，将该DNA片段用BglII和XmaI消化以重新插入到pENTR-pre-miR159a中，产生pENTR-pre-miR-PDS159a。再次使用Gateway系统程序以将miR-PDS159a前体转移进pK2GW7并产生pK2-pre-miR-PDS159a。
miR-PDS169g如下克隆。用引物miR169g-For 5’CACCAATGATGATTACGATGATGAGAGTC 3’(SEQ ID NO105)，和miR169g-Rev 5’CAAAGTTTGATCACGATTCATGA 3’(SEQ IDNO106)扩增含有miR169g序列(见下述)的222bp Arabidopsis基因组片段。将所得PCR片段导入pENTR/D-TOPO中(Invitrogen)以获得pENTR-pre-miR169g。然后用Gateway系统将pre-miR169g序列转移进双向载体pBADC和pB2GW7中，产生pBA-pre-miR169g和pB2-pre-miR169g。
使用pENTR-pre-miR169g作为模板和Stratagene的Quick-changeMutagenesis试剂盒产生两个miR-PDS169g前体。pENTR-pre-miR-PDSa169g用下述寡核苷酸制备miR169PDSa5’GAGAATGAGGTTGAGTTTAGTCTGACTTGGCCAGTTTTTTTACCAATG 3’SEQ ID NO107)，和miR169PDSa*5’CTGATTCTGGTGTTGGCCAAGTCAGACTAAACTCTGTTTCCTTCTC 3’(SEQ ID NO108)。
pENTR-pre-miR-PDSb169g用下述寡核苷酸产生miR169PDSb5’GAGAATGAGGTTGATCTCTTTCCAGTCTTCAGGGTTTTTTTACCAATG 3’(SEQ ID NO109)，和miR169PDSb*5’GATTCTGGTGTCCTGAAGACTGGAAAGAGATCTGTTTCCTTCTCTTC 3’(SEQ ID NO110)。
然后将上述两个诱变的miR-PDS169g前体转移进植物双向载体pBADC和pB2GW7中以产生pBA-pre-miR-PDSa169g，pB2-pre-miR-PDSa169g；pBA-pre-miR-PDSb169g，和pB2-pre-miR-PDSb169g。
用类似于pENTR-miR-PDS159a所述的方法使用下列引物产生靶向N.benthamiana rbcS转录物的人工miRNA的前体(pENTR-pre-miR-rbcS159a-A)并克隆进pK2GW7，所述引物为MrbcSA-S5’TCTGACGATGGAAGTTCCTCGCCCGACATTCGAAAATGAGTTGA 3’(SEQID N0111)，和MrbcSA-R5’AAACCCGGGATGTTCCTCGCCCGGAATTCGAAAGAGAGTAAAAG 3’(SEQ ID NO112)。
所有克隆的序列均经DNA测序证实。
使用的前体序列miR159a前体模板序列(276bp)ACAGTTTGCTTATGTCGGATCCATAATATATTTGACAAGATACTTTGTTTTT TGAGTTGAGCAGGGTAAAGAAAAGCTGCTAAGCTATGGATCCCATAAGCCCTAATCCTTGTAAAGTAAAAAAGGATTTGGTTATATGGATTGCATATCTCA (克隆的pre-miR159a的序列。miR159a*和miR159a(斜体)的序列以粗体示出。在miR-PDS159a中改变的核苷酸以下划线示出)miR-159a成熟模板5’TTTGGATTGAAGGGAGCTCTA 3’(SEQ ID NO114)miR-PDS159a成熟模板5’TTTGGAaatAtGGGAtCTCTt 3’(SEQ ID NO115)miR169g前体模板序列0.3kb(222bp)AATGATGATTACGATGATGAGAGTCTCTAGTTGTATCAGAGGGTCTTGCAT
CTGTTTCCTTCTCTTCTTTTGGATGTCAGACTCCAAGATATCTATCATCATGAATCGTGATCAAACTTTG(SEQ ID NO116)(克隆的pre-miR169g片段(0.3kb)的序列。miR169g(斜体)和miR169g*序列以粗体示出。在miR-PDS169g中改变的核苷酸以下划线示出)miR169g成熟模板5’GAGCCAAGGATGACTTGCCGG 3’(SEQ ID NO117)miR-PDSa169g成熟模板5’GAGtttAGtcTGACTTGgCca3’(SEQ ID NO118)miR169g成熟模板5’GAGCCAAGGATGACTTGCCGG 3’(SEQ ID NO119)miR-PDSb169g成熟模板5’GAtCtctttccagtcTtCaGG 3’(SEQ ID NO120)miR169g前体模板序列2.0kb(2474bp)AAGCTTTGATCTTTAGCTCTTTGCCAAAGCTTCTTTTGATTTTTCTATTTCTCTAATCTATCCATTGACCATTTGGGGTGATGATATTCTTCAATTTATGTTGTTGTTTATTGCCCATCCACAGACCCACGTTTGATTTGTTTAATCAAAATATATAAACTGACAGTTGTGCCACTAGTCACTTGCCAATTAAGCATTCCAAAGCTCCTTCCTTTACATTAGTATCAAGTGAGACTAGCACAAGCTTTTAAGTCCAGATAAAAAGCCCCATGGAAGGGAAGCTTTCAAGAACGAGATTTAACCGTAAAACCCAATTTCGATTTCCGCTAATAATTTGGATCCAAAAATCTAGACAAAATCTGATAAAATTAGACAAAGAAATGGATAAAACCCCAAAACCCATAATCGTCGTTGTTCTTGTTTGCTTCAATATCACTCTTTCCCCTCCAACGAGTTAGTTAGAGTGACGTGGCAGCTGAACTAGATTTGGAGTAACGGGATAGATTACCCATAAAGCCCAATAATGATCATTACGTGAGACATAACTTGCTTAGATAACCTCATTTTATGGGCTTAGATGGGGTCTCTAGTGTTAGTCATAAGCTCTTAAATACCATTTCTAGTTATATATCAATCTTTAGCTTGGAATTGGATCGTTGTCCTATAGTAAAAAAACTTTTACTATTTTATGTTAGCAATCCCACTTAACATTCAATATGTTTAAAATGAAAGAGTTTACCAAAAGGAAAGAAAAAAAGGTTGGTAATGAATTTATCTAATCGGATACGATATTTCATAATCTAATGATGGGATCTATCAAT
AAATAGAATCAAAGTTAACTTTAACGCTTTTGTTACCTGTTTTCTTTCTTTAGCAATTAATATTAAACGAGTTTTAGTAATATAAATATGTTTCCAGTTATATACCAAACTTTATGTAATATTCATAAGCTTGCCAAAATTTACAAGAGTTTTTGGAACGCGCACAAAATTCTCATATATTTCTTACCCAAAAATAAATTTTTTTTTTTTTTTTACTTGTTTATAATCCTATATGAACATTGCTCATCTTCCCCATTTGATGGTAATTTTTCTATTCCTATATGTAATTAAATCCTAACTAATGAAATTGAAAACATAATTTGAAGATAATCAATCCTAATATCTCCCGTCTTAGATCTATTTAAATGGTCTTATTTAATTTCCTATATTTTGGCCTAATTATTTATTTGATATAGTGAATTTATGGAAGCTTCATGTTGATGGAATAAAACCGGCTTATCCCAATTAATCGATCGGGAGCTATAACACAAATCGAAACTCTAGTAGCTATAAAGAGTGTGTAATAGCTTTGGATCACATGTATTACTATTTATTTACTAGCTCGTGCAACAATTGGCTTTGGGAAAAAATTTATTTACTAGTACTCCCCCTTCACAATGTGATGAGTCTCCAAATGATATATTCTCAACCCAAAGGACAATCTGAAATTTTCAATATATATTCCATTTTATCCGCAACATTTGAAATTTGTGGCAATGTTTTTAAAAAGACTATTTATAAAGAATCTTTCTAAATTGTTTCTACGACAATCGATAACACCTTTTGTTGATCAACCCCACACAAGACTATGATTCCAATCCTAAGAAACATACGACACGTGGATTTTTATGTCACACTAGTACGATGCGTCGATGCCTTCAGAGTACGAATATTATTCACATAAAATTCTTATTCGAATTTGATAATATAAGGTCAGCCAATCTTTTAAAGTAATTATATTCTTCAATATACGGTTGTGGTCAAAATTCCATTTTATTTTGTAGCTTGCATGCACTACTAGTTTAAAACCATGCATGGATTTATTGCATATAATAACATTATATGAATTTTCAATTAAATTAATCCACACATTTCCCATTTCAATATGCCTATAAATACCTTCATCACGAGTATGACAAGATCACAAGACAAGAAAAGAAAGGTAGAGAAAACATGATAATGATGATTACGATGATGAGAGTCTCTAGTTGTATCAGAGGGTCTTGCATGGAAGA CCTTCTCTTCTTTTGGATGTCAGACTCCAAGATATCTATCATCATGAATCGTGATCAAACTTTGTAATTTCATTGAAATGTGTTTTTCTTGATGCGAATTTTTTGGCTTACGGTTTTTC GATTTGAATGATCAGATTTTTGTTTTTGCACTCAAACTATAGTTTCACTTAGGTTCTATTTTTTTCAGGTTTATGAATGATAAAACAAGTAAGATTTTATGCTAGTTTTAGTTCATTTTTCGATTCAAATTCAAACATCTTGGTTTTGGTTTAGTTAAGTTTGATTTTTCAAGTCAAATGCTATGTrTTCTTGT(SEQ ID NO121)(克隆的pre-miR169g片段(2.0kb)的序列。miR169g(斜体)和miR169g*的序列以粗体示出)
使用的靶基因序列Nicotiana benthamiana PDS序列5’末端探针序列(相应于Le-PDS位置1-268，参见图15A)ATGCCTCAAATTGGACTTGTTTCTGCTGTTAACTTGAGAGTCCAAGGTAGTTCAGCTTATCTTTGGAGCTCGAGGTCGTCTTCTTTGGGAACTGAAAGTCGAGATGGTTGCTTGCAAAGGAATTCGTTATGTTTTGCTGGTAGCGAATCAATGGGTCATAAGTTAAAGATTCGTACTCCCCATGCCACGACCAGAAGATTGGTTAAGGACTTGGGGCCTTTAAAGGTCGTATGCATTGATTATCCAAGACCAGAGCTGGACAATACAG(SEQ ID NO122)部分+5’RACE片段。从部分Nicotiana benthamiana PDS序列(Genbank(AJ571700)和5’RACE实验组装的序列(相应于Le-PDS位置858-1514，参见图15A)。
GGCACTCAACTTTATAAACCCTGACGAGCTTTCGATGCAGTGCATTTTGATTGCTTTGAACAGATTTCTTCAGGAGAAACATGGTTCAAAAATGGCCTTTTTAGATGGTAACCCTCCTGAGAGACTTTGCATGCCGATTGTGGAACATATTGA CTGAATGAGGATGGAAGTGTCAAATGTTTTATACTGAATAATGGCAGTACAATTAAAGGAGATGCTTTTGTGTTTGCCACTCCAGTGGATATCTTGAAGCTTC TAGTGGGAGTTCCTGTGATAAATGTCCATATATGGTTTGACAGAAAACTGAAGAACACATCTGATAATCTGCTCTTCAGCAGAAGCCCGTTGCTCAGTGTGTACGCTGACATGTCTGTTACATGTAAGGAATATTACAACCCCAATCAGTCTATGTTGGAATTGGTATTTGCACCCGCAGAAGAGTGGATAAATCGTAGTGACTCAGAAATTATTGATGCTACAATGAAGGAACTAGCGAAGCTTTTCCCTGATGAAATTTCGGCAGATCAGAGCAAAGCAAAAATATTGAAGTACCATGT(SEQID NO123)(指示了由miR-PDSa169g(粗体)，miR-PDSb169g(粗斜体)和miR-PDS159a(下划线)靶向的序列)Nicotiana benthamiana rbcS序列(在所有6个rbcS基因序列中的粗体核苷酸相应于由miR-rbcS159a-A靶向的序列)rbcS1(Genbank accessionsCN74890456-633bp，CN748069419-end)GGAGAAAGAGAAACTTTCTGTCTTAAGAGTAATTAGCAATGGCTTCCTCAGTTCTTTCCTCAGCAGCAGTTGCCACCCGCAGCAATGTTGCTCAAGCTAACATGGTTGCACCTTTCACAGGTCTTAAGTCTGCTGCCTCATTCCCTGTTTCAAGAAAGCAAAACCTTGACATCACTTCCATTGCCAGCAACGGCGGAAGAGTGCAATGCATGCAGGTGTGGCCACCAATTAACATGAAGAAGTATGAGACTCTCTCATACCTTCCCGATTTGAGCCAGGAGCAATTGCTCTCCGAAATTGAGTACC ATTTGTCTACCGTGAACACCACAAGTCACCAGGATACTATGATGGCAGATACTGGACCATGTGGAAGCTACCTATGTTCGGATGCACTGATGCCACCCAAGTGTTGGCTGAGGTGGGAGAGGCGAAGAAGGAATACCCACAGGCCTGGGTCCGTATCATTGGATTTGACAACGTGCGTCAAGTGCAGTGCATCAGTTTCATTGCCTCCAAGCCTGACGGCTACTGAGTTTCATATTAGGACAACTTACCCTATTGTCTGTCTTTAGGGGCAGTTTGTTTGAAATGTTACTTAGCTTCTTTTTTTTCCTTCCCATAAAAACTGTTTATGTTCCTTCTTTTTATTCGGTGTATGTTTTGGATTCCTACCAAGTTATGAGACCTAATAATTATGATTTTGTGCTTTGTTTGTAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO124)rbcS2(Genbank accessionsCN7484953-552b，CN748945364-575b)TCTTTCTGTCTTAAGTGTAATTAACAATGGCTTCCTCAGTTCTTTCCTCAGCAGCAGTTGCCACCCGCAGCAATGTTGCTCAAGCTAACATGGTTGCACCTTTCACTGGTCTTAAGTCAGCTGCCTCGTTCCCTGTTTCAAGGAAGCAAAACCTTGACATCACTTCCATTGCCAGCAACGGCGGAAGAGTGCAATGCATGCAGGTGTGGCCACCAATTAACAAGAAGAAGTACGAGACTCTCTCATACCTTCCTGATCTGAGCGTGGAGCAATTGCTTAGCGAAATTGAGTACCTCTTGAAAAATG GAACACCACAAGTCACCGGGATACTATGACGGCAGATACTGGACCATGTGGAAGTTGCCTATGTTCGGATGCACTGATGCCACCCAAGTGTTGGCCGAGGTGGAAGAGGCGAAGAAGGCATACCCACAGGCCTGGATCCGTATTATTGGATTCGACAACGTGCGTCAAGTGCAGTGCATCAGTTTCATTGCCTACAAGCCAGAAGGCTACTAAGTTTCATATTAGGACAACTTACCCTATTGTCCGACTTTAGGGGCAATTTGTTTGAAATGTTACTTGGCTTCTTTTTTTTTTAATTTTCCCACAAAAACTGTTTATGTTTCCTACTTTCTATTCGGTGTATGTTTTTGCATTCCTACCAAGTTATGAGACCTAATAACTATGATTTGGTGCTTTGTTTGTAAAT(SEQID NO125)rbcS3(Genbank accessionsCN74637422-108b，CN748757156-175b，CN748929158-309b，CN748913319-489b，CN748777485-603b，CN748188453-529b)TAGCAATAGCTTTAAGCTTAGAAATTATTTTCAGAAATGGCTTCCTCAGTTATGTCCTCAGCAGCTGCTGTTGCGACCGGCGCCMTGCTGCTCAAGCCAACATGGTTGCACCCTTCACTGGCCTCAAGTCCGCCTCCTCCTTCCCTGTTACCAGGAAACAAAACCTTGACATTACCTCCATTGCTAGCAATGGTGGAAGAGTTCAATGCATGCAGGTGTGGCCACCAATTAACATGAAGAAGTACGAGACACTCTCATACCTTCCTGATTTGAGCCAGGAGCAATTGCTTAGTGAAGTTGAGTAC ATTCGTCTACCGTGAACACCACAACTCACCAGGATACTACGATGGCAGATACTGGACCATGTGGAAGTTGCCCATGTTCGGGTGCACTGATGCCACTCAGGTGTTGGCTGAGGTCGAGGAGGCAAAGAAGGCTTACCCACAAGCCTGGGTTAGAATCATTGGATTCGACAACGTCCGTCAAGTGCAATGCATCAGTTTTATCGCCTCCAAGCCAGAAGGCTACTAAAATCTCCATTTTTAAGGCAACTTATCGTATGTGTTCCCCGGAGAAACTGTTTTGGTTTTCCTGCTTCCTTATATTATTCAATGTATGTTTTTGAATTCCAA(SEO ID NO126)rbcS4(Genbank accessions CN7489069-607b，CN747257629-709b)AATGGCTTCCTCAGTTATGTCCTCAGCTGCCGCTGTTGCCACCGGCGCCAATGCTGCTCAAGCCAGTATGGTTGCACCTTTCACTGGCCTCAAGTCCGCAACCTCCTTCCCTGTTTCCAGAAAACAAAACCTTGACATTACTTCCATTGCTAGCAACGGCGGAAGAGTTCAATGCATGCAGGTGTGGCCACCAATTAACAAGAAGAAGTACGAGACACTCTCATACCTTCCCGATTTGAGCCAGGAGCAATTGCT TATTATGATGGCAGATACTGGACCATGTGGAAGTTGCCCATGTTCGGGTGCACTGATGCCACTCAGGTGTTGGCTGAGGTCGAGGAGGCAAAGAAGGCTTACCCACAAGCCTGGGTTAGAATCATTGGATTCGACAATGTCCGTCAAGTGCAATGCATCAGTTTCATCGCCTACAAGCCAGAAGGCTACTAGAATCTCCATTTTTAAGGCAACTTATCGTATGTGTTCCCCGGAGAAACTGTTTTGGTTTTTCCTGCTTCATTATATTATTCAATGTATGTTTTTGAATTCCAATCAAGGTTATGAGAACTAATAATGACATTTAATTTGTTTCTTTTCTATATA(SEQ ID NO127)rbcS5(Genbank accessionCN74471216-713b)TAAATAATTAATTGCAACAATGGCTTCCTCTGTGATTTCCTCAGCTGCTGCCGTTGCCACCGGCGCTAATGCTGCTCAAGCCAGCATGGTTGCACCCTTCACTGGCCTCAAATCTGCTTCCTCCTTCCCTGTTACCAGAAAACAAAACCTTGACATTACATCCATTGCTAGCAATGGTGGAAGAGTCCAATGCATGCAGGTGTGGCCACCAATTAACATGAAGAAGTACGAGACACTCTCATACCTTCCTGATTTGAGCCAGGAGCAATTGCTTAGTGAAGTTGAGTATCTTTTGAAAAATGGATGG TCACAGCTCACCAGGATACTACGATGGCAGATACTGGACCATGTGGAAGTTGCCCATGTTCGGGTGCACTGATGCCACTCAGGTGTTGGCTGAGGTCGAGGAGGCAAAGAAGGCTTACCCACAAGCCTGGGTTAGAATCATTGGATTCGACAACGTCCGTCAAGTGCAATGCATCAGTTTTATCGCCTCCAAGCCAGAAGGCTACTAAAATCTCCATTTTTAAGGCAACTTATCGTATGTGTTCCCCGGAGAAACTGTTTTGGTTTTCCTGCTTCATTATATTATTCAATGTATGTTTTTGAATTCCAATCAAGGTTATGAGAACTAATAATGACATTTAA(SEQ ID NO128)rbcS6(Genbank accessionsCN74503014-123b，CN7480771-523b)GCACGAGGCTTCCTCAGTTATGTCCTCAGCTGCCGCTGTTTCCACCGGCGCCAATGCTGTTCAAGCCAGCATGGTCGCACCCTTCACTGGCCTCAAGGCCGCCTCCTCCTTCCCGGTTTCCAGGAAACAAAACCTTGACATTACTTCCATTGCTAGAAATGGTGGAAGAGTCCAATGCATGCAGGTGTGGCCGCCAATTAACAAGAAGAAGTACGAGACACTCTCATACCTTCCTGATTTGAGCGTGGAGCAATT GGATACTACGATGGCAGATACTGGACGATGTGGAAGTTGCCCATGTTCGGGTGCACCGATGCCACTCAGGTCTTGGCTGAGGTAGAGGAGGCCAAGAAGGCTTACCCACAAGCCTGGGTCAGAATCATTGGATTCGACAACGTCCGTCAAGTGCAATGCATCAGTTTCATCGCCTACAAGCCCGAAGGCTATTAAAATCTCCATTTTTAGGACAGCTTACCCTATGTATTCAGGGGAAGTTTGTTTGAATTCTCCTGGAGAAACTGTTTTGGTTTTCCTTTGTTTTAATCTTCTTTCTATTATATTTTTGGATTTTACTCAAGTTTATAAGAACTAATAATAATCATTTGTTTCGTTACTAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO129)用根癌农杆菌渗入N.benthamiana如下进行用携带合适质粒的根癌农杆菌的渗入。将细胞在合适的抗生素和40μM乙酰丁香酮的存在下培养至指数期。离心收集细胞并重悬于含有150μM乙酰丁香酮的10mM MgCl2中并室温保温2小时，期间不振荡。用无针注射器施加于叶的远轴侧而进行渗入。1、2或3天后收集组织，在液氮中冷冻和研磨，然后用于RNA提取。
Northern印迹杂交使用来自Nicotiana benthamiana的叶用Trizol试剂(Invitrogen)提取总RNA。将10-20μg总RNA溶解在15％聚丙烯酰胺/1×TBE(8.9mM Tris，8.9mM硼酸，20mM EDTA)/8M脲凝胶中并印迹至Hybond-N+膜(Amersham)。具有与miRNA精确反向互补序列的DNA寡核苷酸用32P-γ-ATP和T4多核苷酸激酶(New England Biolabs)进行末端标记以产生高比活性探针。用ULTRAHyb-Oligo溶液根据厂商指导(Ambion，TX)进行杂交，通过放射自显影检测信号。在每种情况中，探针含有待被检测的预期miRNA的精确反义序列。
Northern印迹杂交检测PDS mRNA丰度根据标准程序进行。5’末端探针相应于以前报道的等价于番茄PDS基因序列第1-268位(Genbank X59948，见上述)的N.benthamiana PDS基因的一个片段(Guo et al.(2003)Plant J 34383-392)3’末端探针相应于通过5’RACE获得的并等价于and equivalent to the番茄PDS基因序列第1192-1514位的一个片段。
5′RACE为了鉴别miRNA介导的裂解的产物，在5′RACE实验中使用First Choice RLM-RACE Kit(Ambion)，只是无需进一步加工RNA样品而将总RNA(2μg)用于与RNA衔接子直接连接。后续的步骤根据厂商指导进行。用于PDS裂解片段的嵌套PCR扩增的寡核苷酸序列为3’Nb-PDS1 5’CCACTCTTCTGCAGGTGCAAAAACC 3’(SEQ ID NO130)3’Nb-PDS2 5’ACATGGTACTTCAATATTTTTGCTTTGC 3’(SEQ ID NO131)
3’Nb-PDS3 5’GATCTTTGTAAAGGCCGACAGGGTTCAC3’(SEQ ID NO132)所有三个引物均基于可获得的番茄PDS基因的序列信息而设计，因为完整N.bethamiana PDS基因序列尚未公布。
将得自5’RACE实验的PCR片段克隆到pCR4载体(Invitrogen)中并通过对各个克隆进行DNA测序而分析。
RT-PCR用寡dT引物(Sigma)和Ready-To-Go You-Prime First-strand珠(Amersham Biosciences)从5μg总RNA合成第一链cDNA。第一链cDNA的量通过使用针对EF1α的引物的PCR(Nishihama et al.(2002)Cell 10987-99)而归化。为扩增rbcS cDNA的DNA片段，使用下列引物。
NBrbcs51/2-F5’TTCCTCAGTTCTTTCCTCAGCAGCAGTTG 3’(SEQ IDNO133)rbcS3-F5’CTCAGTTATGTCCTCAGCAGCTGC 3’(SEQ ID NO134)rbcS4/6-F5’TCCTCAGTTATGTCCTCAGCTGCC 3’(SEQ ID NO135)NBrbcS5-F5’TGTGATTTCCTCAGCTGCTGCC 3’(SEQ ID NO136)NBrbcs1 rev25’AACTCAGTAGCCGTCAGGCTTGG 3’(SEQ ID NO137)NBrbcs2 rev25’AATATGAAACTTAGTAGCCTTCTGGCTTGT 3’(SEQ IDNO138)NBrbcs3/4/5rev15’GTTTCTCCGGGGAACACATACGA 3’(SEQ ID NO139)NBrbcs6rev15’AAACAAACTTCCCCTGAATACATAGGG 3’(SEQ ID NO140)实施例17本实施例描述裂解Nicotiana benthamiana的八氢番茄红素去饱和酶(PDS)mRNA的人工microRNA的设计。
目前被鉴别的Arabidopsis miRNA已显示靶向不同的mRNA，并且有许多编码转录因子(Bartel(2004)Cell 116281-297；Wang et al.(2004)Genome Biol 5R65；Rhoades et al.(2002)Cell 110513-520)。植物miRNA与其靶mRNA的碱基配对几乎是完全的并导致RNA分子的裂解，这已由若干例子显示(Jones-Rhoades and Bartel(2004)MolCell 14787-799)，由此使基因表达沉默。或者，miRNA与靶mRNA的相互作用可以导致翻译的抑制而不是mRNA裂解，这由Arabidopsis的miR172表明(Aukerman and Sakai(2003)Plant Cell152730-2741；Chen(2004)Science 3032022-2025)。
在设计能抑制特定基因的表达的人工miRNA的尝试中，我们尝试修饰已知miRNA的序列以靶向选择的mRNA。
Arabidopsis miR159已经被示出靶向一系列MYB转录因子。miR159与其靶mRNA的碱基配对几乎是完全的并导致RNA分子的裂解(Achard et al.(2004)Development 1313357-3365；Palatnik et al.(2003)Nature 425257-263)。有3个基因组序列(MIR159a，MIR159b，MIR159c)有编码miR159的潜力。miR159的天然启动子和精确前体序列是未知的，也不知道microRNA基因是否由DNA聚合酶II或III转录。我们决定使用一种276bp的含有Arabidopsis miR159a的DNA片段作为前体序列。这一前体序列被称为pre-miR159a，其被置于35S启动子的下游，在3’末端侧翼为胭脂碱合酶基因的polyA添加序列(图11A)。我们决定使用N.benthamiana八氢番茄红素去饱和酶(PDS)基因作为靶以查看我们是否能设计一种裂解其mRNA并由此妨碍(compromise)其表达的人工microRNA。我们比较了At-miR159a和PDS的序列以发现两个序列之间的最佳匹配。对于PDS mRNA的一个特定区域，我们发现仅6个碱基改变就足以将miR159a转变为能与PDS mRNA完全碱基配对的miRNA(图11B)。我们将这一序列称为miR-PDS159a。
为了产生pre-miR-PDS159a，使用PCR技术在处于Arabidopsispre-miR159a前后序列中的miR159a和miR159a*序列(在前体序列内位于与miRNA相对的臂中的RNA序列)中均导入点突变。将所得前体置于强花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子的控制下并通过含有合适的构建体的根癌农杆菌的渗入而在N.benthamiana中表达。
首先分析Arabidopsis pre-miR-PDS159a在N.benthamiana中的表达以证实在其序列中导入的突变不影响其加工和miR-PDS159a的成熟。Northern印迹分析显示渗入后2-3天，miR-PDS159a清楚表达(图11C)，积累至与内源性性miR159相当的水平。已知miRNA的生物发生包括几乎互补的miRNA*的产生，其寿命短并且当与实际miRNA相比时积累水平非常低。一致地，检测到了miR-PDS159a*的存在，但是其丰度显著低于miR-PDS159a的丰度(图11C，中间组)。在这些条件下内源性性miR159的表达未改变，其作为上样和探针特异性的对照(图11B，下面一组)。另外，这一结果表明基于ArabidopsismiRNA前体的人工miRNA的表达不影响内源性性N.benthamianamiR159的表达。最后，这些发现暗示天然microRNA前体的加工的酶学机制不是限速的并且可以以高效率加工人工前体。
我们接下来确定了miR-PDS159a的表达是否导致内源性性PDSmRNA的预期的裂解。表达miR-PDS159a的样品的Northern印迹杂交显示PDS mRNA水平的明显降低(图12A)。为进一步确立PDSmRNA降低的机制我们开始确定(1)PDS mRNA是否由miR-PDS159a裂解以及是否含有诊断性5’磷酸，和(2)裂解点是否相应于基于PDSmRNAmiR-PDS159a碱基配对相互作用预测的位点。为此，进行To5’RACE实验。我们发现6个独立克隆中的5个克隆的5’末端序列定位裂解位点位于从miR-PDS159a的5’末端计数的第10个核苷酸之后。这一裂解位点的位置与用其它miRNA靶发表的工作完全相关(Jones-Rhoades and Bartel(2004)Mol Cell 14787-799)。
这些结果证实PDS mRNA水平下降是由miR-PDS159a介导的精确裂解所致。
实施例18本实施例证实microRNA介导的PDS mRNA的裂解可以从一不同的microRNA前体产生。
为表明人工miRNA的表达不限于使用pre-miR159a，我们基于一种含有Arabidopsis miR169g的推断的前体序列设计了一种不同的miR-PDS以产生两种不同的miR-PDS169g(图13A)。在设计用于miR169g的表达载体的过程中，我们注意到含有仅222bp的茎环前体的构建体比含有完整2.0kb的包括miR169g基因在内的基因间区域的构建体产生更高的成熟miRNA的积累(图13B)。基于这一结果我们决定使用短的前体载体继续我们的miRNA诱变。用miR169g序列检查PDS mRNA揭示mRNA序列中一个对miRNA裂解敏感的区域，与针对miR-PDS159a所发现的不同。7个点突变使miR169g变成能与PDS mRNA完全碱基配对的microRNA(miR-PDSd169g，图13A)。如之前针对基于miR159a的miR-PDS所示出的，miR-PDSa169g在N.benthamiana中的瞬时表达很容易检测(图13C)。另外，为了测试完整miRNA是否能被改变为不依赖于其原始序列，我们产生了miR-PDSb169g(图13A和图13C)，其靶向PDS mRNA中一不同的区域，该区域的选择不考虑其与原始的miR169g的同源性。使用miR-PDSa169g和miR-PDSb169g我们能够检测到由5’RACE分析确定的PDS mRNA的裂解(图13D)以及由Northern印迹分析确定的PDS mRNA水平的降低(图13E)。
这些结果表明可以使用不同的miRNA前体以靶向降解PDSmRNA，并且重要的是原始miRNA的序列可以被广泛改变用于设计人工序列。
实施例19本实施例证实microRNA介导的Nicotiana benthamiana rbcSmRNA的特异性裂解。
为显示这一方法可用于靶向不同于PDS的其它基因，我们在miR159a中引入了点突变以靶向N.benthamiana的Rubisco小亚基(rbcS)基因家族的不同成员。我们检索了公共数据库中存在的rbcSEST转录物，发现有至少6种不同的rbcS转录物在N.benthamiana中表达。这些rbcS转录物的编码区的核苷酸序列彼此相同性超过90％，使得我们设计出miR-rbsS159a-A，其靶向该基因家族的所有成员。此处，在miR159a中引入的序列没有由靶向rbsS的最低变化数来指导，而是反映了靶向在所有rbsS mRNA中共有的一种特异区域的需要，并因此包括若干变化。以此方式，我们产生了一个miRNA，其靶向所有6个rbcS mRNA(miR-rbcS159a-A，图14A)。
如前述实施例一样，我们检测了miR-rbsS159a-A的有效表达(图14B)，但是由于这一家族成员之间的高同源性程度，很难通过Northern印迹分析检测到各自不同的rbsS mRNA。由此，我们使用半定量RT-PCR以确定在用含有miR-rbcS159a-A构建体的农杆菌菌株渗入的植物中的mRNA的水平。与用空双向载体渗入的叶(图14C中的C)相比，在用miR-rbcS159a-A构建体渗入的样品(图14C中的A)中rbcS基因1、2和3的mRNA积累下降而rbcS基因4、5和6未能检测到。这些结果表明人工miRNA靶向希望其靶向的所有rbcSmRNA，尽管在每种情况中效率各有不同。最后，人工miRNA的存在不感染其它植物基因如EF1α的表达(图14C，下面一组)。
本文提供的人工miRNA在PDS mRNA中沿3个不同位置分布(见图15A概括)，并被用于靶向2种不同的基因(PDS和rbcS，图15A和图15B)。这一范围的应用也反映在miRNA序列的灵活性中，因为人工miRNA显示出几乎每一核苷酸位置均可被改变(图16)。miR159a中产生两种人工miRNA的变化仅保留8个位置不变(图16A)。在miR169g情况中，这一数字下降为仅3个位置(图16B)。另外，当一起分析两种miRNA中的突变时，仅有开始的2个核苷酸位置未变化。这提示miRNA序列的每一位置均可以被改变，由此使用人工miRNA进行基因沉默的优势又增加了一点。
实施例20本实施例证实人工miRNACPC159a在Arabidopsis中抑制根毛发育根表皮细胞分为根毛细胞和无毛细胞。仅有根毛表皮细胞能够发育成根毛。在Arabidopsis根中，在总共16-22个细胞队列(cellfiles)中，有8个系统定位的细胞队列是根毛细胞，所有其它的是无毛细胞队列。CAPRICE(CPC)是一种MYB样蛋白，其通过负调节促进根表皮细胞分化成无毛细胞的GLABRA2(GL2)而正调节根毛发育。在cpc突变体中，GL2导致大多数表皮细胞分化成无毛细胞，并因此仅非常少的细胞能够发育根毛。gl2突变体或过表达CPC的野生型转基因植物的根产生比野生型根更多的根毛(图17；Wada et al.(2002)Development 1295409-5419)。
CPC是用来研究人工miRNA沉默或抑制基因功能的用途的一种良好候选者，因为CPC的丧失功能表型在幼苗发育的非常早期就出现，不致死并且容易观察。使用pre-miRNA159作为骨架设计两种人工pre-miRNA即pre-miRCPC159a和pre-miRCPC3159a以靶向CPCmRNA的不同区域。成熟miRCPC1159a和miRCPC3159a分别与位于CPC信使RNA的nt 233-253和nt 310-330的序列互补。这些前体和成熟miRNA的核苷酸序列如下。
miRCPC1159a前体模板5’acagtttgcttatgtcggatccataatatatttgacaagatactttgtttttcgatagatcttgatctgacgatggaagaagaggtgagtaatgttgaaacatgagttgagcagggtaaagaaaagctgctaagctatggatcccataagccctaatccttgtaaagtaaaaaaggatttggttatatggattgcatatctcaggagctttaacttgccctttaatggcttttactcttctttcgatactactcacctcttcatcccgggtca 3’(SEQ ID NO151).
miRCPC1159a成熟模板5’tttcgatactactcacctctt 3’(SEQ ID NO152).miRCPC3159a前体模板5’acagtttgcttatgtcggatccataatatatttgacaagatactttgtttttcgatagatcttgatctgacgatggaagctcgttggcgacaggtgggagcatgagttgagcagggtaaagaaaagctgctaagctatggatcccataagccctaatccttgtaaagtaaaaaaggatttggttatatggattgcatatctcaggagctttaacttgccctttaatggcttttactcttcctcccacctgacgccaacgagcatcccgggtca 3’(SEQ ID NO153).
miRCPC3159a成熟模板5’ctcccacctgacgccaacgag 3’(SEQ ID NO154).
将这两个人工pre-miRNA克隆到含有组成型35S启动子的载体中以表达这些前体。用携带35S::per-miRCPC1159a或35S::pre-miRCPC3159a构建体的农杆菌渗入的Nicotinana benthamiana叶的Northern印迹分析表明成功产生了成熟miRCPC1159a和miRCPC3159a。
拟南芥植物用携带XVE::pre-miRCPC1159a或35S::pre-miRCPC1159a的农杆菌转化并获得了许多转基因品系。XVE::pre-miRCPC1159a植物的T1种子在含有卡那霉素的抗生素选择培养基上萌发，并将抗性转基因幼苗转移到含有或不含有XVE系统诱导物β-雌二醇的MS培养基上。携带XVE::pre-miR159的T1转基因品系用作对照。pre-miR159是用于构建人工pre-miRCPC1159a的骨架。
在含有或不含有诱导物的培养基上生长的XVE::pre-miR159幼苗之间的根毛发育中没有观察到差异(图18，组c和d)。相反，在含有β-雌二醇的培养基上生长的XVE::pre-miRCPC1159a幼苗(图18，组b)比不含诱导物生长的幼苗(图18，组a)清楚发育更少的根毛。
研究了携带35S::pre-miRCPCl159a，35S::pre-miR159和35S::pre-miRP69159a的转基因Arabidopsis幼苗的T1幼苗并获得与XVE可诱导品系类似的结果。转基因品系的T1种子在BASTA选择培养基上萌发，将2周龄幼苗转移到垂直放置于组织培养室中的MS培养基平板上。在这一实验中，使用两个阴性对照携带35S::pre-miR159的转基因品系和携带35S::pre-miRP69159a的转基因品系。后者是用pre-miR159作为骨架而设计用于产生靶向芜菁黄化花叶病毒(TYMV；Bozarth et al.(1992)Virology 187124-130)的P69mRNA的nt 214-234的人工pre-miRP69159a。这些前体和成熟miRNA的核苷酸序列如下。miRP69159a前体模板5’acagtttgcttatgtcggatccataatatatttgacaagatactttgtttttcgatagatcttgatctgacgatggaagccacaagacaatcgagactttcatgagttgagcagggtaaagaaaagctgctaagctatggatcccataagccctaatccttgtaaagtaaaaaaggatttggttatatggattgcatatctcaggagctttaacttgccctttaatggcttttactcttcaaagtctcgattgtcttgtggcatcccgggtca 3’(SEQ ID NO155)miRP69159a成熟模板5’aaagtctcgattgtcttgtgg 3’(SEQ ID NO156).
这两种类型的转基因植物的幼苗都象野生型植物一样发育出丰富的根毛(图19，组a和c)。相反，在30个独立的35S::pre-miRCPC159a品系中，有18个品系清楚显示出比阴性对照植物(图19，组a和c)少的根毛(图19，组b)。
在阴性对照转基因植物(35S::pre-miR159和pre-miRP69159a)中，根尖区表皮中的所有根毛队列细胞均能够发育根毛(图20，组a，见箭头)。但是在携带35S::pre-miRCPC1159a的转基因品系中，根毛队列中的许多细胞不能产生根毛(图20，组b；见箭头)。这些结果表明人工miRCPC1159a能够诱导内源性性CPC mRNA的裂解，从而导致CPC基因功能的丧失并抑制根毛发育。
实施例21本实施例描述了设计多聚pre-miRNA的方法的一个实施方案。
步骤1用PCR扩增不同的pre-miRNA以在5’末端包括一个AvrII位点，在3’末端包括一个SpeI位点和一个XhoI位点。每一pre-miRNA然后被克隆进一个载体如pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)以产生例如pENTR/pre-miRA，pENTR/pre-miRB和pENTR/pre-miRC(图21A)。
步骤2将pENTR/pre-miRA用限制酶SpeI和XhoI消化。用限制酶AvrII和XhoI消化pENTR/pre-miRB载体(图21B)。收集切开的载体pENTR/pre-miRA和pre-miRB的DNA片段并纯化用于进一步的步骤。
步骤3将来自步骤2的切开的载体pENTR/pre-miRA和pre-miRB的DNA片段连接起来产生二聚pre-miRA-B(图21C)。由于Because of compatible cohesive ends of AvrII and SpeI的粘性末端相容，所以pre-miRB片段可以被插入切开的pENTR/pre-miRA中并且在连接后AvrII和SpeI位点消失(图21C)。
步骤4用限制酶SpeI和XhoI消化pENTR/pre-miRA-B，用限制酶AvrII和XhoI消化pENTR/pre-miRC(图21D)。收集切开的载体pENTR/pre-miRA-B和pre-miRC的DNA片段并纯化以用于进一步的步骤。
步骤5将来自步骤4的切开的载体pENTR/pre-miRA-B和pre-miRC的DNA片段连接以产生三联pre-miRNA-B-C(图21E)。
以此方式，或使用功能等价的限制酶可以制备含有更多pre-miRNA单位的多聚pre-miRNA。如所希望的那样多的pre-miRNA可以如此方式被连接起来，唯一的限制是转录物的最终大小。熟知的是在植物中可以产生8-10kb的转录物。因此，可以形成多聚pre-miRNA分子，其含有2-30个或更多个、例如3-40个或更多个、例如3-45个和更多个pre-miRNA，例如含有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或更多个pre-miRNA的多聚体。
实施例22本实施例证实二聚pre-miRNA成功加工成两个成熟的miRNA。
如实施例21所述连接人工pre-miRPDS1169g和pre-miRCPC3159a形成二聚前体pre-miRPDS169g-CPC3159a。这一二聚miRNA前体被克隆到一载体中，其中35S启动子驱动pre-miRPDS1169g-CPC3159a的表达(图22)。前体和成熟miRNA的核苷酸序列如下。
miRPDS1169g前体模板5’aatgatgattacgatgatgagagtctctagttgtatcagagggtcttgcatggaagaatagagaatgaggttgagtttagtctgacttggccagtttttttaccaatgaatctaattaactgattctggtgttggccaagtcagactaaactctgtttccttctcttcttttggatgtcagactccaagatatctatcatcatgaatcgtgatcaaactttg 3’(SEQ ID NO157).
miRPDS1169g成熟模板5’gagtttagtctgacttggcca 3’(SEQ ID NO158).
miRPDS1169g-CPC3159a前体模板5’cacctaggaatgatgattacgatgatgagagtctctagttgtatcagagggtcttgcatggaagaatagagaatgaggttgagtttagtctgacttggccagtttttttaccaatgaatctaattaactgattctggtgttggccaagtcagactaaactctgtttccttctcttcttttggatgtcagactccaagatatctatcatcatgaatcgtgatcaaactttgaagggtgggcgactaggacagtttgcttatgtcggatccataatatatttgacaagatactttgtttttcgatagatcttgatctgacgatggaagctcgttggcgacaggtgggagcatgagttgagcagggtaaagaaaagctgctaagctatggatcccataagccctaatccttgtaaagtaaaaaaggatttggttatatggattgcatatctcaggagctttaacttgccctttaatggcttttactcttcctcccacctgacgccaacgagcatcccgggtcaaagggtgggcgactagtctagactcgagtatt 3’(SEQ ID NO159)。
对用携带不同构建体35S::pre-miRPDS1169g，35S::pre-miRCPC3159a和35S::pre-miRPDS169g-CPC3159a的农杆菌渗入的烟草Nicotiana benthamiana叶的Northern印迹分析表明成熟的miRPDS169g和CPC3159a得以从二聚miRNA前体成功产生(图23A和23B)。在这一实验中，处理1是35S::pre-miRPDS1169g，处理2是35S::miRCPC3159a，处理3是35S::pre-miRPDS169g-CPC3159a。当miRPDS1169g反义DNA寡聚物作为探针时，处理1和3均显示信号，证明二聚前体能产生成熟的miRPDS169g。当探针是miRCPC3159a反义DNA寡聚物时，处理3中的信号证实pre-miRPDS169g-CPC3159a能产生成熟miRCPC3159a。
实施例23抗病毒miRNA的设计由于病毒基因沉默抑制物被用于抵消宿主防御，所以我们推断通过表达特异性miRNA而妨碍这些抑制物的产生会是赋予对植物病毒的抗性或耐受力的有效机制(Roth et al.(2004)Virus Res 10297-108)。用TuMV作为例子证实这一原理。
HC-Pro和P69是分别由TuMV和TYMV编码的植物PTGS抑制物(Anandalakshmi et al.(1998)Proc Natl Acad Sci USA 9513079-13084；Chen et al.(2004)Plant Cell 161302-1313；Kasschau and Carrington(1998)Cell 95461-470)。使用这两个病毒抑制基因作为靶，设计了与它们的编码序列有序列互补性的人工miRNA。
At-miR159a在大多数Arabidopsis器官中强表达并且处于高水平。在其它植物物种如玉米和烟草中也发现了类似的高水平表达。由于这些原因，使用miR159a前体(pre-miR159a)作为骨架以产生人工miRNA。pre-miR159a是一种184nt茎环RNA，其从靠近3’末端的茎的基部产生成熟miR159a(5’-uuuggaungaagggagcucua-3’；SEQ IDNO160)。这一基部茎序列(base stem sequence)是miR159a序列，互补链被称作miR159a*序列(图24；SEQ ID NO161)。为了设计人工miRNA，将miR159a序列用与TuMV基因组序列的2045-2065的编码HC-P的病毒序列互补的序列5’-acuugcucacgcacucgacug-3’(SEQ IDNO162)置换。miR159a*序列也被改变以保持茎结构。为了更有效的miRNA加工和更方便的人工miRNA前体操作，将从pre-miR159上游的基因组序列克隆的78bp序列加到这一人工miRNA前体的5’末端。这个一级miRNA样人工miRNA前体被称作pre-miRHC-P159a。其DNA序列如下。
Pre-miRHC-P159a5’CAGTTTGCTTATGTCGGATCCATAATATATTTGACAAGATACTTTGTTTTTCGATAGATCTTGATCTGACGATGGAAGCAGTCGAGTGCGTGAGCAAGTCATGAGTTGAGCAGGGTAAAGAAAAGCTGCTAAGCTATGGATCCCATAAGCCCTAATCCTTGTAAAGTAAAAAAGGATTTGGTTATATGGATTGCATATCTCAGGAGCTTTAACTTGCCCTTTAATGGCTTTTACTCTTCACTTGCTCACGCACTCGACTGC 3’(SEQ ID NO163)使用相同方法，还构建了pre-miRP69159a。预计pre-miRP69159a产生成熟的人工miRNA P69159a，5’-aaagucucgauugucuugugg-3’(SEQID NO164)，靶向TYMV的P69基因。其DNA序列如下。
Pre-miR P69159a5’CAGTTTGCTTATGTCGGATCCATAATATATTTGACAAGATACTTTGTTTTTCGATAGATCTTGATCTGACGATGGAAGCCACAAGACAATCGAGACTTTCATGAGTTGAGCAGGGTAAAGAAAAGCTGCTAAGCTATGGATCCCATAAGCCCTAATCCTTGTAAAGTAAAAAAGGATTTGGTTATATGGATTGCATATCTCAGGAGCTTTAACTTGCCCTTTAATGGCTTTTACTCTTCAAAGTCTCGATTGTCTTGTGGC 3’(SEQ ID NO165)实施例24pre-miRHC-P159a和pre-miRP69159a在Nicotiana benthamiana中的表达置换pre-miR159中的miR159和miR159*序列可能会实现据信对于miRNA生物合成是重要的RNA折叠结构。使用烟草瞬时表达系统检查这两个人工miRNA前体是否可以产生希望的miRNA。含有携带35S::pre-miR-HC-Pro159a，35::pre-miR-P69159a，35S::HC-Pro，35S::P69和XVE::pre-miR-P69159a的质粒的农杆菌细胞用于渗入N.benthamiana叶(Llave et al.(2000)Proc Natl Acad Sci USA 9713401-13406；Voinnet et al.(2000)Cell 103157-167)。
将1ml的携带不同构建体的根癌农杆菌的稳定期生长培养物在含有100mg/l壮观霉素和50mg/l卡那霉素的50ml LB培养基中培养过夜，在4,000rpm离心10分钟收集细胞。细菌沉淀重悬于具有75μl 100mM乙酰丁香酮的50ml 10mM MgCl2溶液中。在室温不振荡保温3小时后，通过注射器将所述农杆菌悬液渗入N.bethamiana的叶中。2天后，用trizol试剂(Invitogen)从渗入的叶中提取总RNA并经northern印迹杂交分析(Guo et al.(2005)Plant Cell 171376-1386；Wang et al.(2004)Genome Biol 5R65)。在15％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分析20μg总RNA样品并印迹至Hybond-N+膜(Amersham)上。具有准确互补于miR-HC-Pro159a或pre-miR-P69159a的序列的DNA寡核苷酸用[γ-32P]-ATP和T4多核苷酸激酶进行末端标记以产生高比活性探针。杂交用ULTRA-Hyb Oligo溶液根据厂商指导(Ambion)进行并通过放射自显影检测信号。
miR-HC-Pro159a的Northern印迹分析用三种不同处理进行(1)具有35S::pre-miR-HC-Pro159a的农杆菌细胞，(2)具有35S::HC-Pro的农杆菌细胞，和(3)具有35S::pre-miR-HC-Pro159a和35S::HC-Pro的农杆菌细胞。结果如图25所示。
注意到成熟miR-HC-Pro159a信号在具有35S::pre-miR-HC-Pro159a的所有处理中均检测到(图25的列1、2、5、6)。当叶仅用35S::HC-Pro构建体渗入时未检测到信号(图25的列3和4)。这一结果表明人工pre-miR-HC-Pro159a可以在植物细胞中产生成熟的miR-HC-Pro159a。
在miR-P69情况中，进行4种不同的处理(1)携带35S::pre-miR-P69159a的农杆菌细胞，(2)携带XVE::pre-miR-P69159a的农杆菌细胞，(3)携带35S::P69的农杆菌细胞，和(4)携带35S::pre-miR-P69159a和35S::P-69的农杆菌细胞。注意到XVE系统是应答β-雌二醇的转录诱导系统(Zuo et al.(2001)Nature Biotechnol 19(2)157-61)。
Northern印迹结果(图26)显示成熟的miR-P69159a仅在用35S::pre-miR-P69159a和XVE::pre-miR-P69159a加上诱导物渗入的叶中可检测到(图26的列1、2、4、6、8和9)。用不加诱导物的35S::P69和XVE::pre-miRP69159a渗入的叶不能产生miR-P69159a(图26的列3、5和7)。这些结果加在一起表明人工pre-miR-P69159a可以被成功用于产生成熟的miR-P69159a。
实施例25具有高人工miRNA表达水平的稳定的Arabidopsis转基因品系用花芽法(Clough and Bent(1998)Plant J 16735-43)通过农杆菌介导将含有35S::pre-miR-HC-Pro159a或35S::pre-miR-P69159a构建体转化进Arabidopsis Col-0生态型中。
转基因幼苗在选择培养基(MS盐4.3g/l+蔗糖10g/l+Basta 10mg/l+Carbenicilin 200mg/l+琼脂8g/l)上选择。随机挑选12个不同的35S::pre-miR-HC-Pro159a或35S::pre-miR-P69159aT2转基因品系并用于经northern印迹分析成熟人工miRNA水平。在12个转基因35S::pre-miRHC-Pro159a品系中，11个品系显示出高水平的miRHC-Pro159a表达(图27)。在Arabidopsis转基因35S::pre-miR-P69159a植物中，测试的全部T2品系均显示出miR-P69159a信号并且10个品系显示出高表达水平(图28)。
实施例26TuMV病毒攻击野生型和转基因植物用TuMV接种野生型和转基因Arabidopsis品系N.benthamiana叶用芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus，TuMV)接种(Chen et al.(2003)Plant Dis 87901-905)，两周后在0.5M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中以1∶20(wt/vol)稀释度提取组织。这一提取物用作病毒接种物。接种前，35S::miR-HC-Pro159a转基因Arabidopsis品系的T2植株在温室中生长4周(5-6叶时期)。用600目Carborundum在第一至第四片叶上清理植物并轻轻用200μl接种物摩擦。野生型拟南芥(col-0)植物和表达35S::miR-P69159a的转基因植物用作对照。接种的植物保持在温度受控的温室中(23℃至28℃)，每日监控症状发展，共2周。
酶联免疫吸附测定(ELISA)在14dpi(感染后天数)取来自用TuMV感染的每一植物的不同系统叶的叶盘(总共0.01g)，并用抗TuMV衣壳蛋白(CP)的多克隆抗血清(Chen et al.(2003)Plant Dis 87901-905)以及与碱性磷酸酶缀合的山羊抗兔免疫球蛋白通过间接酶联免疫吸附测定(ELISA)进行分析。使用底物对硝基苯基磷酸进行显色。用Tunable MicroplateReader(VersaMax，Molecular Devices Co.，CA)在405nm测定吸收度而记录结果。
Western印迹分析用抗TuMV CP的兔抗血清(Chen et al.(2003)Plant Dis 87901-905)以及与碱性磷酸酶缀合的山羊抗兔免疫球蛋白G进行Western印迹分析。来自Arabidopsis植物的系统叶在20体积(wt/vol)的变性缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 6.8，4％SDS，2％2-巯基乙醇，10％甘油和0.001％溴酚蓝)中均质。提取物在100℃加热5分钟，在8000xg离心3分钟以沉淀植物碎片。每一样品的总蛋白质(15μl)上样在12％聚丙烯酰胺凝胶上，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后使用电转移装置(BioRad)转移至PVDF膜(immobilon-P，Millipore，Bedford，MA)上。膜与作为一抗的抗TuMV CP的多克隆兔抗血清和过氧化物酶缀合的二抗(Amersham Biosciences)保温，之后用ECL试剂盒(Amersham Biosciences)观察免疫反应性蛋白质。凝胶用考马斯蓝R250染色，RUBISCO的大亚基(55kd)的水平用作上样对照。
发现了表达miR-HC-Pro159a人工miRNA的转基因植物对TuMV感染有抗性(图29)。在接种后2周(感染后14天)拍照。表达miR-HC-Pro159a的植物(品系#11；图33B)发生正常influorescences，而WT植物和表达miR-P69159a的转基因植物(品系#1；图33B)显示病毒感染症状。
TuMV感染后14天，miR-P69159a(品系#1)和col-0植物显示在influoresences中的较短的花间节间，而miR-HC-Pro159a转基因植物(品系#11)展示正常的influoresences发育(图30，上面一组)。仔细观察TuMV感染的Arabidopsis植物上的influoresences。miR-P69159a(品系#1)和col-0植物显示衰老(senescence)和传粉缺陷，而miR-HC-Pro159a植物(品系#11)显示正常花和长角(silique)发育(图30，下面一组)。未进行模拟感染，植物用缓冲液接种。
在TuMV感染的miR-P69159a(品系#1)和WT(col-0)植物中，长角小并且发育不全。miR-HC-Pro159a植物(品系#11)对TuMV感染有抗性并且显示正常的长角发育(图31)。缓冲液接种的植物(模拟接种的)用作对照。
进行两个独立的实验以检查各种转基因miR-HC-Pro159a和WT植物对TuMV感染的抗性。实验1使用T2转基因品系(miR-HC-Pro159a品系#11植物和miR-P69159a品系#1植物)的16个个体植株。12个个体植株用病毒接种，而4个个体植株用作为对照(MOCK)的缓冲液接种。2周后，收集系统叶使用抗TuMV CP抗体进行western印迹分析。在miR-HC-Pro159a转基因植物中未检测到TuMVCP，而TuMV CP在miR-P69159a和WT col-0植物中高表达(图32)。RUBISCO的大亚基(55kd)用作上样对照。注意到在泳道6(上面一组)和泳道4(中间一组)未检测到CP，可能是由于病毒接种失败所致。这些植物无症状。感染性测定的结果如表7所示。
表7用TuMV接种物攻击的miR-HC-Pro159a和miR-P69159a转基因Arabidopsis的感染性测定
实验2使用下述转基因品系和野生型(WT)植物(1)35S::miR-HC-Pro159a植物品系#10(12个植株用TuMV接种，4个植株用缓冲液接种)；品系#11(12个植株用TuMV接种，4个植株用缓冲液接种)；品系#12(9个植株用TuMV接种，4个植株用缓冲液接种)；品系#13(10个植株用TuMV接种，4个植株用缓冲液接种).(2)35S::miR-P69159a植物品系#1(8个植株用TuMV接种，4个植株用缓冲液接种)；品系#2(7个植株用TuMV接种，4个植株用缓冲液接种)；品系#3(9个植株用TuMV接种，4个植株用缓冲液接种)；品系7(5个植株用TuMV接种，4个植株用缓冲液接种)。
来自每一转基因品系的代表性植株的Western印迹结果示于图33的A组。RUBISCO的大亚基(55kd)水平用作上样对照。所有表达35S::miR-HC-Pro159a的植物均对病毒有抗性并且未显示出任何可见的症状，也不表达任何TuMV CP。所有WT植物和35S::miR-P69159a植物均显示出TuMV感染症状并且表达高水平的TuMV CP。所有模拟感染的植物均正常并且未表达任何TuMV CP。在miR-HC-Pro159a和miR-P69159a转基因Arabidopsis中人工miRNA的表达如图33的组B所示。感染性测定结果见表8所示。
表8用TuMV接种物攻击的miR-HC-Pro159a和miR-P69159a转基因Arabidopsis的感染性测定
用TuMV感染14天后，收集系统叶样品并且用ELISA测定提取物。结果是来自两个不同实验的9或12个植物的ELISA读数的平均值。结果(图34)显示miR-HC-Pro159a植物对TuMV感染有完全抗性。在底物水解30分钟后取读数。
实施例27使用同聚pre-miRNA从同一转录物产生一个以上的合成miRNA多聚pre-miRNA是由一个以上miRNA前体单位组成的人工miRNA前体。它们可以是与不同的miRNA前体杂聚的，或者是含有若干单位的相同miRNA前体的同聚物。在前面的实施例中，已经证实杂聚pre-miRNA能够产生不同的成熟若干miRNA。例如，pre-miR-PDS1169g-CPC3159a是由pre-miR-CPC3159a和pre-miR-PDS1169g组成的二聚体，当其在植物细胞中表达时可以产生成熟的miR-PDS1169g和miR-CPC3159a。此处描述了使用同聚miRNA前体产生不同的成熟若干miRNA。
Pre-miR-P69159a和pre-miR-HC-Pro159a是从pre-miR159a骨架产生。它们衍生自同一miRNA前体。它们连接在一起形成同二聚体pre-miRNA即pre-miR-P69159a-HC-Pro159a。DNA序列如下。
Pre-miRP69159a-HC-P159a5’cagtttgcttatgtcggatccataatatatttgacaagatactttgtttttcgatagatcttgatctgacgatggaagccacaagacaatcgagactttcatgagttgagcagggtaaagaaaagctgctaagctatggatcccataagccctaatccttgtaaagta atccataatatatttgacaagatactttgtttttcgatagatcttgatctgacgatggaagcagtcgagtgcgtgagcaagtcatgagttgagcagggtaaagaaaagctgctaagctatggatcccataagccctaatccttgtaaagtaaaaaaggatttggttatatggangcatatctcaggagctttaacttgccctttaatggctntactcttcACTTGCTCACGCACTCGACTGc3’(SEQ ID NO166)小写字体序列是At-miR159骨架。粗体序列是miR-P69159a。斜体序列是miR-HC-Pro159a。粗斜体序列是接头序列。
使用烟草瞬时表达系统以检查这一同二聚miRNA前体是否能产生希望的成熟miR-P69159a和miR-HC-Pro159a。在这一实验中，进行3种处理(1)具有35S::pre-miR-P69159a的农杆菌，(2)35S::pre-miR-HC-Pro159a的农杆菌，和(3)具有35::pre-miR-P69159a-HC-Pro159a的农杆菌。Northern分析表明同二聚miRNA前体pre-miR-P69159a-HC-Pro159a能产生成熟miR-P69159a和miR-HC-Pro159a(图35)。
实施例28从插入到内含子序列中的pre-miRNA表达miRNA在RNA剪接过程中，内含子从原始RNA转录物中释放并因此可潜在地用作miRNA的前体。本实施例描述了pre-miRNA插入到这类内含子序列中以产生人工miRNA。
大多数内含子以序列5’-GU-3’起始并以序列5’-AG-3’结束。这些序列分别被称为剪接供体和剪接受体位点。除了这些序列之外，位于内含子内的分支位点对于内含子成熟也是重要的。没有分支位点，内含子不能从原始RNA转录物中切割和释放。分支位点位于剪接受体位点上游20-50nt。剪接供体位点和分支位点之间的距离在不同内含子之间有很大不同。为此，决定将人工pre-miRNA插入到这两个位点之间，即内含子的剪接供体和分支位点之间。
Arabidopsis CARPRICE(CPC)基因含有3个外显子和两个内含子。在分支位点共有序列5’-CU(A/G)A(C/U)-3’(其中A在所有转录物中保守)之后，预测有两个分支位点位于起始密码子下游128至132nt(内含子1)和722至726nt(内含子2)。分别位于内含子1和内含子2中的111-114nt和272-697nt的序列由含有miR159a骨架的人工miRNA置换。DNA序列如下。
CPC基因组序列atgtttcgttcagacaaggcggaaaaaatggataaacgacgacggagacagagcaaagccaaggcttcttgttccgaagG
TTGTATGTTTGTTTCGCAGaggtgagtagtatcgaatgggaagctgtgaagatgtcagaagaagaagaagatctcatttctcggatgtataaactcgttggcgacagGTTAGAGACTCTTTCTCTCTCGATCCATCT aggatcccgggacggacgccggaggagatagagagatattggcttatgaaacacggcgtcgtttttgccaacagacgaagagacttttttaggaaatga(SEQ ID NO167)小写字母的序列是外显子，粗斜体序列是分支位点。粗体序列由人工pre-miRNA置换。内含子序列包括正常字体、粗体和粗斜体字体的序列。
产生构建体35S::CPC-A和35S::CPC-B以检查未剪接的CPC转录物的内含子1或内含子2是否可被用于插入人工pre-miRNA以产生人工miRNA。在CPC-A构建体中，pre-miR-HC-Pro159a被插入到内含子1中，而在内含子2中无变化。在CPC-B中，pre-miR-HC-Pro159a被插入到内含子2中，而在内含子1中无变化(图36)。将携带35S::CPC-A、35S::CPC-B、35S::pre-miR-HC-Pro159a，和35S::pre-miR159a的农杆菌细胞渗入(infiltrate)到N.benthamiana叶中进行瞬时表达。用互补于miR-HC-Pro159a的探针进行的Nonhern印迹杂交显示在4个独立的实验中用CPC-A和CPC-B渗入的叶样品表达miR-HC-Pro159a(图37)。这一结果证实CPC转录物的内含子1和内含子2均可用于产生人工miRNA。
产生构建体35S::CPC-C和35S::CPC-D以确定同时在两个内含子中产生miRNA的可能性。在CPC-C中，pre-miR-HC-Pro159a被插入到内含子1中，pre-miR-P69159a被插入到内含子2中。在CPC-D中，pre-miR-P69159a被插入到内含子1中，pre-miR-HC-Pro159a被插入到内含子2中(图38)。将携带35S::CPC-C、35S::CPC-D、35S::pre-miR-HC-P159a和35S::pre-miR-P69159a的农杆菌细胞渗入到N.benthamiana叶中进行瞬时表达。图39显示了4个独立实验的northern印迹结果。注意到所有4个样品均显示相应于miR-HC-Pro159amiRNA和miR-P69159a的信号，尽管样品1中的信号较弱(图39，35S::CPC-C的1)。这一弱信号可能是由于在这一特定样品中的较低瞬时表达效率所致。在35S::CPC-D实验的样品4中遇到类似情况。这些结果证实使用CPC内含子可以在一个转录物中同时产生两种不同的人工miRNA。
上述这些实施例是提供用于举例示出本发明而不是限制其范围。本发明的其它变体对于本领域技术人员是显而易见的并包含在权利要求书。例如，在上述实施例中，使用pre-miR159a和pre-miR169g产生人工pre-miRNA。但是如本文所述的其它pre-miRNA也可以代替pre-miR159a和pre-miR169g使用。本文引用的所有出版物、专利、专利申请和计算机程序通过引入而并入本文。还应理解的是在本说明书和权利要求书中，单数形式的“一个”以及“所述”包括复数形式，除非上下文明确指示不是这样。还应理解本说明书和权利要求书中，术语“包含”、“包括”是指开放形式，不仅包括所引述的元件或步骤，也进一步包括任何额外的元件或步骤。
序列表<110>洛克菲勒大学<120>微小RNA<130>2312-124<150>US 60/671,089<151>2005-04-14<150>PCT/US2004/033379<151>2004-10-12<160>174<170>FastSEQ for Windows Version 4.0/Patent-In 3.3<210>1<211>1417<212>DNA<213>Arabidopsis thaliana<400>1gcacctctca ctccctttct ctaactagtc ttgtgtgcac ccatttatgt gtacgtacta60ttatctcata aataaatatt tttaaaatta gatgcattta ttgatatgaa aaagttacaa120gattagtttg ttgtgtgtga gactttggat cgacagatcg aaaaattaac taaccggtca180gtattgaata tcaactatta tatgctccat gcattcgctt atagtttcac acaatttgtt240ttcttcacgg tctaaaatca gaagattcca tatattttct tatgacgtaa aaggaccact300tataagttga cacgtcagcc cttggattcg tgaggttttt ctctctactt cacctatcta360cttttcctca tatcccactg cttttctcct tcttgttctt gtttttctcg tttttttctt420cttcttctcc aagaaaatag agatcgaaaa gattagatct attttgtgta gcaagaaatt480atcattttcg tttcttcatt catatattgt tctattatgt tgtacaataa tagatactcg540atctcttgtg cgtgcgtaaa ttttatacaa gttgtcggcg gatccatgga agaaagctca600tctgtcgttg tttgtaggcg cagcaccatt aagattcaca tggaaattga taaataccct660aaattagggt tttgatatgt atatgagaat cttgatgatg ctgcatcaac aatcgacggc720tacaaatacc taaagcttga gaaagaaact tgaagatatt gattgaagtc tggatcgatc780tttggtaaat ctctctcttg attagtttta agaatcactt ttttttttct gtgtttgaac840atgtttacat atatcatcta tgtctcaata tatatatttt cttaatctag ggtcaatgac900ggattagggc gttaattaca atgaatatgg aaaaactatt ttgcctttga tcttgacttg960agtgttgatg aacagatgta taatgttatg tagtatgtac tgtatttttt ctagaatcat1020tctttagtct ccaactctcc attaatcaaa tgaggtcctt ataggtaatg ctatgatcaa1080gaacaacaag atcgtgagca cagatcggcc agttcggtca ctttttaaaa gagagatgtt1140atattgttaa tttgttatta tcaggtataa taaatacaga atagttcgtc cagagaccag1200acattttata gtttcaattt tatgacagtc ttgtaataat atttgtttaa tagtgtgtca1260ccttctattt ctgggttatt acttggtccc gaaattttct tattgttcta attttgtaat1320attagaaatt tggttttctt gccaaatcaa atcaaacatt acggtgtgtt gtacattgta1380ccagaacttt tgttttcaag tgctcaactt gagaacc 1417<210>2<211>95<212>DNA<213>Arabidopsis thaliana<400>2aggcgcagca ccattaagat tcacatggaa attgataaat accctaaatt agggttttga 60tatgtatatg agaatcttga tgatgctgca tcaac95<210>3<211>159<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>miRNA template cassette<400>3ggatccatgg aagaaagctc atctgtcgtt gtttgtaggc gcagcaccat taagattcac60atggaaattg ataaataccc taaattaggg ttttgatatg tatatgagaa tcttgatgat120gctgcatcaa caatcgacgg ctacaaatac ctaaagctt 159<210>4<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence
<220>
<223>miRNA template to target At4g18960<400>4taggttgtaa tgccgcgact t 21<210>5<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<223>miRNA template to target maize phytoene desaturase<400>7tgctggcaga agtccgattg c 21<210>8<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>miRNA template to target mai ze phytoene desaturase<400>8agcttcctgg ataggactgc a 21<210>9<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>miRNA template to target is maize IPPK2<400>9aagttgtggt taatcacccc a 21<210>10<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>miRNA template to target is maize ITPK5<400>10gaggacagtt tcgtatcctg g 21<210>11<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence
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<223>EAT deletion oligonucleotide
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<223>AP2 PCR primer<400>68tttccgggca gcagcaacat tggtag 26<210>69<211>29<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<223>ANT PCR primer<400>70gatcaacttc aatgactaac tctggttttc 30<210>71<211>30<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>ANT PCR primer<400>71gttatagaga gattcattct gtttcacatg 30<210>72<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<223>Synthetic oligonucleotide 2 for EAT with attBsites<400>74ttaaaccact ttgtacaaga aagctgggtg ccgtcgattg ttgatgcagc atcatcaaga60ttctcatata catatcaaaa ccctaattta gggtatttat caatttccat gtgaatctta120atggtgctgc gcctacaaac aacgacagcc tgcttttttg tacaaacttg tttaa 175<210>75<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>miRNA template for FAD2<400>75agataagacc aactgtgtca t 21<210>76<211>175<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<223>miRNA template for PDS<400>78agaaactctt aaccgtgcca t 21<210>79<211>175<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Synthetic oligonucleotide 1 to target PDS<400>79ttaaacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg tcgttgtttg taggcggcac ggtcaagagt 60ttcacatgga aattgataaa taccctaaat tagggttttg atatgtatat gagaaactct 120taaccgtgcc atcaacaatc gacggcaccc agctttcttg tacaaagtgg tttaa 175<210>80<211>175<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Synthetic oligonucleotide 2 to target PDS<400>80ttaaaccact ttgtacaaga aagctgggtg ccgtcgattg ttgatggcac ggttaagagt 60ttctcatata catatcaaaa ccctaattta gggtatttat caatttccat gtgaaactct 120tgaccgtgcc gcctacaaac aacgacagcc tgcttttttg tacaaacttg tttaa 175<210>81<211>907<212>DNA<213>Zea mays<400>81ttaaaaaaat agcgatttgt ttgaagaaag gatcatggcc gagcatcatt caacgtacct 60ctgtagggcg tatgaatcgt tggattagga tcaaagtcgg caacggttaa attcaaggaa 120gaaaacaacg ggcgtggggt cctgtccacg tcatcaggtg accaggcagg caggcatgcg 180cgccatgcgg cattgcttct gtccccgtgc ccgggcagct tttggcagcg gatccggacg 240gaacaccacg cgcgcgcgcg cgcggcaggc acgcaccggc caacttaatc ttgcctccac 300tctgcactag tggggttatt aacaatttga ttaatccgac actgacgtac tgtgtcaacc 360aatggcaccg cctatatatt aatcgaacca ttcagctcgt cttaattgcc acccacccac 420ccaccgccat tgccatggtt cacctcattc attctaagct tagacgatgc agtgatagaa 480attaatactg caaatcagtc agtgtttgcg ggcgtggcat catcaagatt cacaacccat 540caatccgaac cactgatttg gaatgcatgt atgagaatct tgatgatgct gcatccgcca 600acaagcgcct acgaacgttt gtgtgctcat cttcgccatc aatcgagatt ttgtatcttc 660acgtttagct aaggtgaaag atcgtcatcc catccgccta aagctagctt tgcaaatttt 720tattcgaaac aacgaccatt tctatatatt tcctttctct gttatagtct ctaattaacg 780cctgtaaact gttgcaccct gcttctgcat cttcttatta attagttttg tctcttatgg 840atgctaaaca gccatgacgt ttcggacaat gttcagctcg tacttccttc aatcgggagc 900gccaaaa 907<210>82<211>1128<212>DNA<213>Zea mays<400>82tcgtcgatct gatttgcctg ctttatttct tcttcttctt cacaccgagc tagctagcta 60tcttgcttta atttgcctag aacgaataga tccaccgtac tagcttcttg ctcgatctgc 120agcttctcgc ttgtgagcca agagcccggc cagcagtgtc ggccgtgcag tggcactctc 180tccatcaaca atcaaccctc tctccgtcga catgtggaaa ggtaggtaga gatagatggt 240gtgtgtaatc cggttccttg gttcttgtgt ttccgatctc ctctaattaa tcgatctctc 300tacctggcca gctcacttca cccatgcttg catctagctg ttccaatctg atgcatgata 360tagatgatgc ttgcggcctc ttcttcttga ttcataggct catcatctat gcctctgtca 420tgcacacact cgtgtctttc ttcttgatgg atacacgtac ggggggttgg gttgttcaca 480tatatagtag tatagctagt ttattagatg caggtataca gatcatgagg aagcaagaaa 540ttatgcaaaa cagtcggtgc ttgcaggtgc agcaccatca agattcacat ccccagctcg 600atctgtgcat gatgagatga gaatcttgat gatgctgcat cagcaaacac tcacttacat 660cgatctcacc cctggacaag ctggacagtg aaaccggact gagcaatcga gtactactaa 720aaacttgtcc tcagctcttt atgttttact ttcaattacc ttgcttatat taattttctt 780tcacttaatt tagttaatta ctgctctctc tctctctctc tgtctctctc tctctctctc 840tggttttttc atcttgcaaa aaaaatgcag aaattaatat gtatatgtgt acctcatgat 900tattaaggcc gctgcaccat gattttatgg tatattatta tcagcttaaa acaggctttc 960
ccttttgatt atatttcaat aattcgttta gcatcattag tttctgcatt tgccgatgat1020ctcgaggttc tgtttgcaag aagtggctgc actgcagccc tgcagctata tatacacagg1080ttcaagttac taattttgtg cttctacaat aatcctatca gtccgcag 1128<210>83<211>912<212>DNA<213>Zea mays<400>83cactaatagc tttctatctg atcgattcat catcatccgg gcatgcatga gcatcatcgt60ctccagatcg ttgggctctc gcagctacct acattcaaca ttcaagctcg ctctacatat120gcatgcaaat ctgcaacact cgctcttggc agggatacat tcacgccgag agagagagag180agagagagag agagagagag agagagagag atgtgtgtgc tgtagtcatc agccagccgg240tgatttctgg agtggcatca tcaagattca cacactgcat gccaacataa tgcgcgtgtt300catgcatcca tcgccgccgc tgcatcatgc atcatatata atatatatat atgtgtatgt360gtgggaatct tgatgatgct gcattggata tcaagggcta tatatatata tggatcaagc420atatatatat atatatcaga tcaccagtca tatcgagttc ttccttccag gcttgctagg480taatttataa cttaaacctt gttgctgaac taactaattt tacttagcta gctagctact540actatacttc attgttagta gtagctagca agaaggaaag taggcatccc ggccggttcg600taccttcttt ttttttgcac agcaggatct gaccttctgt ataaaatgca tttttgcctt660gagttttttt gtttttccac agtaggaggt agctgattct gatctgctgt ataaaaatgc720atttttttcc ttttcatttc atggcagaag gcaatatata ataagaaaag actgaaagga780aaaggcacca ctgccatgat ggatcgcatc agtgcatctg ttttgttctt ctaaacgatt840caggtcatca ggtgagctag gtgggctaat aagtatatag attaatttct attttgcaca900tgatttatat gg912<210>84<211>1063<212>DNA<213>Zea mays<400>84catgcatgct gccttacacc taagctagct agctgttgaa tttgatgcat gacgcatgct60ttcctcctcc tccgttcgta gtcgttgtcg ttgtctcagt aatccatcct ctctcttttt120ttcttgctaa tacataaaag gggttcagat ggtagctgct agtggttatt cttcttctta180gacgatgcaa gtatatgtat atggaccacc aaattagctt ctcgtcttgc cgccggaccg240ccatcatgca ccttggagaa gcaacagaac gaagctcgct gctatgctat ctatggatta300ttgtattgta tatgaatgaa gcagcaagca aacgtagttc agtacagtcg gtgcttgcag360gtgcagcacc atcaagattc acatcgtcca actcatgcat catgcatata tgcatcttca420atgatgcgtg cctcgcatgt gtgtgtatat atatatgatg agatgagaat cttgatgatg480ctgcatcagc agacactcac tagctcatgc atcacctcca agtaataaga gatgaattga540attaacgacc atgcagctac tagctctrgt acgtaccact tcgttctcct ctaatttctt600tttccattca gtctaccttg tttgctaatc aacttgttct catataatat atggttccca660atgcgataag ggttggcctg caggcttagc tctgcagcag gtagcaccca tgcatggccc720atgatacata acatattgat ggatatatac tagcataaaa acatgatgat gcagagcagc780agcatccatc tcatagctag cataaaaaca tgcatgagct agcagcggca gttgacgatg840actcttcgag aggaaggaag gaagcagcag atcgatggac gcgagacatg agcagtgaca900gatgcataat gtagcagtac atacagcatt attgctatta tttgtgccca agcaaattaa960ggaaggggac caaattgaaa tatactaatg acattgcaga cggcaccagc agagtccaca1020gctcgtgaac ctgtgtaggc tgcctgccga tggtacaatg caa 1063<210>85<211>1738<212>DNA<213>Zea mays<400>85ccatcagcaa ctgctcgtag ctccgtcctc atcacttaaa ccttatcatc atcactctct60cttcctctct cttctggccg gccggtcctt tcacctcact catcttctca gttcattcca120tggagagcgt cgttcctata tatcatgcat catccaccaa ggccctagct aagctgctac180tacctgctag gggttttatt agttgctcaa ccttcgctgg ccggccttat atatacctag240ctatagctgt cttgcttgca tagatcatcg atccatgttg ctagctagct agctccctca300gttcagttca gttcagttca gctcagctag ctagctcact cctctcttga gtcgtggtgt360ccatcacaat cttctctata tcgatacagg tgaggaggta gctagacaga tcaacaccaa420tcctctcaac gacatcccct tgttcttgta gagagagttg gtgtaggtcg aaaggcagat480agatcatata tagagggaga gatgcatata tggtgtaggg ttcttcaatt tgtttctatg540atcgattcat tcgccctgca gccccccctg cgcatctagt tatgtctcca tccctcctcc600cttgttcctg atacatatat atatatgtag gtagtggctc tgtatatacc catgccatct660ctctcaatct catctatatc atatataccc atgctttgca tctagctgtt tcatttcttt720tcactcgtgc tttgaaagat ctggtacagt ccggcctgta ttagtaagaa cgagttagaa780aaatacacac gtacgcgcga gaaccatgca tcatcagcta gctcctctct ttcctctttt840tttttgttaa tgcatacatt catatatata ttcccatgaa tgaatgcttt aagcatgagg900caagcaaaca tcgacagtgg gtgcttgcag gtgcagcacc accaagattc acatccaact960ctcacgcatc ttcagtgatg catgcatgct ctgtgatgtc tcgcagcagc tatatgcata1020tgtgatgaga tgagaatctt gatgatgctg catcagcaga cactcactca tcacaccaac1080
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<223>Forward PCR primer for maize miR172b<400>89ggatcccatg atatagatga tgcttg 26<210>90<211>26<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<223>miRNA template to PDS target<400>95agacaacctg caaggcagga t 21<210>96<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<223>Oligonucleotide 2 for maize miR172b<400>98ccagcttgtc caggggtgag atcgatgtaa gtgagtgttt gctgatgcag catcatcaag60attctcatct catcatgcac agatcgagct ggggatgtga atcttgatgg tgctgcacct120gcaagcaccg actgttttgc ataatttctt gcttcctcat gatctgtata 170<210>99
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<223>miRNA precursor<400>165cagtttgctt atgtcggatc cataatatat ttgacaagat actttgtttt tcgatagatc60ttgatctgac gatggaagcc acaagacaat cgagactttc atgagttgag cagggtaaag120aaaagctgct aagctatgga tcccataagc cctaatcctt gtaaagtaaa aaaggatttg180gttatatgga ttgcatatct caggagcttt aacttgccct ttaatggctt ttactcttca240aagtctcgat tgtcttgtgg c 261<210>166<211>551<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>homo-polymeric pre-miRNA<400>166cagtttgctt atgtcggatc cataatatat ttgacaagat actttgtttt tcgatagatc60ttgatctgac gatggaagcc acaagacaat cgagactttc atgagttgag cagggtaaag120aaaagctgct aagctatgga tcccataagc cctaatcctt gtaaagtaaa aaaggatttg180gttatatgga ttgcatatct caggagcttt aacttgccct ttaatggctt ttactcttca240aagtctcgat tgtcttgtgg catcccgggt caaagggtgg gcgactagga cagtttgctt300atgtcggatc cataatatat ttgacaagat actttgtttt tcgatagatc ttgatctgac360gatggaagca gtcgagtgcg tgagcaagtc atgagttgag cagggtaaag aaaagctgct420aagctatgga tcccataagc cctaatcctt gtaaagtaaa aaaggatttg gttatatgga480
ttgcatatct caggagcttt aacttgccct ttaatggctt ttactcttca cttgctcacg540cactcgactg c 551<210>167<211>23<212>DNA<213>Turnip mosaic virus<400>167cgatttaggc ggcagataca gcg 23<210>168<211>35<212>DNA<213>Turnip mosaic virus<400>168attctcaatg gtttaatggt ctggtgcatt gagaa35<210>169<211>26<212>DNA<213>Turnip mosaic virus<400>169ataaacggaa tgtgggtgat gatgga 26<210>170<211>21<212>DNA<213>Turnip mosaic virus<400>170gatcaggtgg aattcccgat c 21<210>171<211>32<212>DNA<213>Turnip mosaic virus<400>171cacgccaaac ccacatttag gcaaataatg gc 32<210>172<211>68<212>DNA<213>Turnip mosaic virus<400>172gctgaagcgt acattgaaaa gcgtaaccaa gaccgaccat acatgccacg atatggtctt 60cagcgcaa 68<210>173<211>80<212>DNA<213>Turnip mosaic virus<400>173gaaatgactt ctagaactcc aatacgtgcg agagaagcac acatccagat gaaagcagca60gcactgcgtg gcgcaaataa 80<210>174<211>26<212>DNA<213>Turnip mosaic virus<400>174acaacggtag agaacacgga gaggca 2权利要求
1.一种减量调节细胞中靶序列的方法，包括(a)向所述细胞中导入包含一种多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸编码能形成双链RNA或发夹结构的修饰的miRNA前体，其中所述修饰的miRNA前体包含修饰的miRNA及与所述修饰的miRNA互补的序列，其中所述修饰的miRNA被修饰为(i)与靶序列完全互补，(ii)除了GU碱基对之外与靶序列完全互补或者(iii)从miRNA 5’末端开始计数的头10个核苷酸与靶序列完全互补的miRNA；和(b)将所述核酸构建体表达足够的时间以产生修饰的miRNA，其中所述修饰的miRNA减量调节所述靶序列。
2.权利要求1的方法，其中所述核酸构建体进一步包含与所述多核苷酸可操纵地连接的启动子。
3.权利要求1或2的方法，其中所述细胞是植物细胞。
4.权利要求3的方法，其中所述细胞选自玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、高粱、粟、向日葵、红花、棉花、大豆、canola、苜蓿、Arabidopsis和烟草。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述修饰的miRNA结合靶序列并且双链RNA被裂解。
6.权利要求5的方法，其中所述修饰的miRNA是被修饰为与靶序列完全互补的植物miRNA。
7.权利要求6的方法，其中所述植物miRNA来自选自Arabidopsis、番茄、大豆、水稻和玉米的植物。
8.权利要求5的方法，其中所述修饰的miRNA是被修饰为除了使用GU碱基配对之外与靶序列完全互补的植物miRNA。
9.权利要求8的方法，其中所述植物miRNA得自选自Arabidopsis、番茄、大豆、水稻和玉米的植物。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中所述靶序列是植物病原体的RNA。
11.权利要求10的方法，其中所述启动子是病原体诱导型启动子。
12.权利要求10或11的方法，其中包含靶序列的植物病原体是植物病毒或植物类病毒。
13.权利要求12的方法，其中所述靶序列选自由一种病毒关键区域的序列、一个病毒科的保守序列及不同病毒科的成员中的保守序列组成的组。
14.权利要求13的方法，其中所述核酸构建体编码两或多个修饰的miRNA前体序列。
15.权利要求14的方法，其中所述核酸构建体是杂聚的前体miRNA或同聚的前体miRNA。
16.权利要求1-9任一项的方法，其中所述靶序列是在RNA的非编码区中。
17.权利要求1-9任一项的方法，其中所述靶序列是在RNA的编码区中。
18.权利要求1-9任一项的方法，其中所述靶序列含有RNA的剪接位点。
19.权利要求1的方法，其中所述核酸构建体被插入细胞的基因或转基因的内含子中。
20.一种分离的核酸，其包含编码能形成双链RNA或发夹结构的修饰的miRNA前体的多核苷酸，其中所述修饰的miRNA前体包含修饰的miRNA及与所述修饰的miRNA互补的序列，其中所述修饰的miRNA是被修饰为(i)与靶序列完全互补，(ii)除了GU碱基配对之外与靶序列完全互补，或者(iii)从所述miRNA的5’末端开始计数的头10个核苷酸与靶序列完全互补的miRNA。
21.权利要求20的分离的核酸，其进一步包含与所述多核苷酸可操纵地连接的启动子。
22.权利要求20或21的分离的核酸，其中所述修饰的miRNA是被修饰为与靶序列完全互补的植物miRNA。
23.权利要求22的分离的核酸，其中所述植物miRNA得自选自Arabidopsis、番茄、大豆、水稻和玉米的植物。
24.权利要求20的分离的核酸，其中所述修饰的miRNA是被修饰为除了使用GU碱基配对之外与靶序列完全互补的植物miRNA。
25.权利要求24的分离的核酸，其中所述植物miRNA得自选自Arabidopsis、番茄、大豆、水稻和玉米的植物。
26.权利要求20-25任一项的分离的核酸，其中所述靶序列是植物病原体的RNA。
27.权利要求26的分离的核酸，其中所述启动子是病原体诱导型启动子。
28.权利要求26或27的分离的核酸，其中包含靶序列的植物病原体是植物病毒或植物类病毒。
29.权利要求28的分离的核酸，其中所述靶序列选自由一种病毒关键区域的序列、一个病毒科的保守序列及不同病毒科的成员中的保守序列组成的组。
30.权利要求29的分离的核酸，其中所述核酸构建体编码两或多个修饰的miRNA前体序列。
31.权利要求30的分离的核酸，其中所述核酸构建体是杂聚的前体miRNA或者同聚的前体miRNA。
32.权利要求20-25任一项的分离的核酸，其中所述靶序列是RNA的非编码区。
33.权利要求20-25任一项的分离的核酸，其中所述靶序列是RNA的编码区。
34.权利要求20-25任一项的分离的核酸，其中所述靶序列含有RNA剪接位点。
35.包含权利要求20-34任一项的分离的核酸的细胞。
36.权利要求35的细胞，所述细胞是植物细胞。
37.权利要求36的细胞，其中所述植物选自玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、高粱、粟、向日葵、红花、棉花、大豆、canola、苜蓿、Arabidopsis和烟草。
38.权利要求35-38任一项的细胞，其中所述分离的核酸被插入细胞的基因或转基因的内含子中。
39.一种包含权利要求20-34任一项的分离的核酸的转基因植物。
40.权利要求39的转基因植物，其中所述植物选自玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、高粱、粟、向日葵、红花、棉花、大豆、canola、苜蓿、Arabidopsis和烟草。
41.权利要求39或40的转基因植物，其中所述分离的核酸被插入转基因植物的基因或转基因的内含子中。
42.权利要求39-41任一项的转基因植物的种子。
43.一种减量调节细胞中的两或多个靶序列的方法，包括(a)向所述细胞中导入包含可操纵地连接在一起的两或多个多核苷酸的核酸构建体，每个多核苷酸均编码能形成双链RNA或发夹结构的修饰的miRNA前体，其中每个修饰的miRNA前体均包含修饰的miRNA及与所述修饰的miRNA互补的序列，其中每个修饰的miRNA被修饰为(i)与其靶序列完全互补，(ii)除了GU碱基配对之外与靶序列完全互补，或者(iii)从所述miRNA的5’末端计数的头10个核苷酸与靶序列完全互补的miRNA；(b)将所述核酸构建体表达足够长的时间以产生两或多个修饰的miRNA，其中每个修饰的miRNA均减量调节靶序列。
44.权利要求43的方法，其中所述核酸构建体进一步包含与所述可操纵地连接的多核苷酸可操纵地连接的启动子。
45.权利要求43或44的方法，其中所述细胞是植物细胞。
46.权利要求45的方法，其中所述细胞选自玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、高粱、粟、向日葵、红花、棉花、大豆、canola、苜蓿、Arabidopsis和烟草。
47.权利要求43-46任一项的方法，其中每个修饰的miRNA均结合其靶序列，且双链RNA被裂解。
48.权利要求47的方法，其中所述修饰的miRNA是被修饰为与靶序列完全互补的植物miRNA。
49.权利要求48的方法，其中所述植物miRNA得自选自Arabidopsis、番茄、大豆、水稻和玉米的植物。
50.权利要求49的方法，其中所述修饰的miRNA是被修饰为除了使用GU碱基配对之外与靶序列完全互补的植物miRNA。
51.权利要求50的方法，其中所述植物miRNA得自选自Arabidopsis、番茄、大豆、水稻和玉米的植物。
52.权利要求43-51任一项的方法，其中所述核酸构建体是杂聚的前体miRNA或者同聚的前体miRNA。
53.权利要求52的方法，其中所述靶序列是植物病原体的RNA。
54.权利要求53的方法，其中所述启动子是病原体诱导型启动子。
55.权利要求53或54的方法，其中包含靶序列的植物病原体是植物病毒或植物类病毒。
56.权利要求55的方法，其中所述靶序列选自由一种病毒关键区域的序列、一个病毒科的保守序列及不同病毒科的成员中的保守序列组成的组。
57.权利要求43-51任一项的方法，其中所述靶序列是RNA的非编码区。
58.权利要求43-51任一项的方法，其中所述靶序列是RNA的编码区。
59.权利要求43-51任一项的方法，其中所述靶序列含有RNA剪接位点。
60.权利要求43的方法，其中所述核酸构建体被插入细胞的基因或转基因的内含子中。
61.一种分离的核酸，其包含可操纵地连接在一起的两或多个多核苷酸，每个多核苷酸均编码能形成双链RNA或发夹结构的修饰的miRNA前体，其中每个修饰的miRNA前体均包含修饰的miRNA及与所述修饰的miRNA互补的序列，其中每个修饰的miRNA被修饰为(i)与靶序列完全互补，(ii)除了GU碱基配对之外与靶序列完全互补，或者(iii)从所述miRNA的5’末端计数的头10个核苷酸与靶序列完全互补的miRNA。
62.权利要求61的分离的核酸，其进一步包含与所述多核苷酸可操纵地连接的启动子。
63.权利要求61或62的分离的核酸，其中修饰的miRNA是被修饰为与靶序列完全互补的植物miRNA。
64.权利要求63的分离的核酸，其中所述植物miRNA得自选自Arabidopsis、番茄、大豆、水稻和玉米的植物。
65.权利要求64的分离的核酸，其中修饰的miRNA是被修饰为除了使用GU碱基配对之外与靶序列完全互补的植物miRNA。
66.权利要求65的分离的核酸，其中所述植物miRNA得自选自Arabidopsis、番茄、大豆、水稻和玉米的植物。
67.权利要求61-66任一项的分离的核酸，其中所述核酸构建体是杂聚的前体miRNA或者同聚的前体miRNA。
68.权利要求67的分离的核酸，其中所述靶序列是植物病原体的RNA。
69.权利要求68的分离的核酸，其中所述启动子是病原体诱导型启动子。
70.权利要求67或68的分离的核酸，其中包含靶序列的植物病原体是植物病毒或植物类病毒。
71.权利要求70的分离的核酸，其中所述靶序列选自由一种病毒关键区域的序列、一个病毒科的保守序列及不同病毒科的成员中的保守序列组成的组。
72.权利要求61-66任一项的分离的核酸，其中所述靶序列在RNA的非编码区中。
73.权利要求61-66任一项的分离的核酸，其中所述靶序列在RNA的编码区中。
74.权利要求61-66任一项的分离的核酸，其中所述靶序列含有RNA剪接位点。
75.包含权利要求61-74任一项的分离的核酸的细胞。
76.权利要求75的细胞，其中所述细胞是植物细胞。
77.权利要求76的细胞，其中所述植物选自玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、高粱、粟、向日葵、红花、棉花、大豆、canola、苜蓿、Arabidopsis和烟草。
78.权利要求75-77任一项的细胞，其中分离的核酸被插入细胞的基因或转基因的内含子中。
79.包含权利要求61-74任一项的分离的核酸的转基因植物。
80.权利要求79的转基因植物，其中所述植物选自玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、高粱、粟、向日葵、红花、棉花、大豆、canola、苜蓿、Arabidopsis和烟草。
81.权利要求79或80的转基因植物，其中所述分离的核酸被插入转基因植物的基因或转基因的内含子中。
82.权利要求79-81任一项的转基因植物的种子。
83.权利要求10的方法，其中包含靶序列的RNA编码病毒基因沉默阻抑物。
84.权利要求83的方法，其中包含靶序列的RNA编码选自HC-Pro和P69的多肽。
85.权利要求26的分离的核酸，其中包含靶序列的RNA编码病毒基因沉默阻抑物。
86.权利要求85的分离的核酸，其中包含靶序列的RNA编码选自HC-Pro和P69的多肽。
87.权利要求53的方法，其中包含靶序列的RNA编码病毒基因沉默阻抑物。
88.权利要求87的方法，其中包含靶序列的RNA编码选自HC-Pro和P69的多肽。
89.权利要求68的分离的核酸，其中包含靶序列的RNA编码病毒基因沉默阻抑物。
全文摘要
本发明提供了可用于靶序列抑制、靶序列确认和靶序列减量调节的方法和组合物。本发明提供了可用于基因沉默或RNA减量调节的多核苷酸构建体，以及包含所述多核苷酸的细胞、植物和种子。本发明还提供了使用microRNA沉默靶序列或减量调节RNA的方法。
文档编号C12N5/10GK101076592SQ200580042547
公开日2007年11月21日 申请日期2005年10月12日 优先权日2004年10月12日
发明者J·R·托伯达, 张秀任, 征矢野敬, 蔡南海, 牛其文, 林诗舜 申请人:洛克菲勒大学