专利名称：修复核酸用于改进的扩增的制作方法
背景技术：
已经报道了应用碱基切除酶修复DNA的多种方法。令人遗憾的是，这些方法以不同方式引起DNA的进一步损伤。传统的PCR技术已被改动以便在某些方面改进扩增。美国专利5,035,996描述了控制核酸扩增反应污染的方法，其在扩增反应中应用修饰的核苷酸，dUTP。这种方法应用尿嘧啶糖基化酶去除含有尿嘧啶的那些PCR产物，以防止污染随后的PCR反应。美国专利出版物2004-0067559A1也依赖于在扩增之前引物DNA中的修饰碱基和应用例如dUTP掺入到扩增子。扩增子然后可以通过加入，例如，尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)和核酸内切酶(Endo)IV被片段化。热启动核酸扩增已经被用来降低PCR期间的错误引发。一种类型的热启动扩增依赖于具有被封闭的3′末端的PCR引物的存在，以防止由PCR反应中存在的聚合酶引起的延伸(参见，例如，美国2003-0119150)。该引物通过在＞37℃时具有活性的热稳定3′-5′核酸外切酶被去封闭。因此，当该外切核酸酶在＞37℃使3′端去封闭，聚合酶才延伸PCR引物。可选地，Taq聚合酶被封闭，然后在扩增温度下被活化。Barnes，W.M.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 912216-2220(1994)描述了应用vent聚合酶和Taq聚合酶作为对在扩增中仅应用Taq聚合酶的改进。Ghadessy等人报道了不被受损位点或脱碱基位点(abasic sites)中止的突变型Taq聚合酶(Ghadessy et al.Nature Biotechnol.22(6)755-9(2004))。已经报道，如果DNA实质上受损，则传统的扩增技术变得无力(DiBemardo et al.Nucl.Acids Res.30e16(2002))。由于暴露于含DNA核酸内切酶的环境和微生物而引起的DNA降解和/或片段化是法医学、诊断测试和常规扩增中的常见问题，并且影响扩增产物的保真性和产量。此外，分析获自冷冻的、灭绝的或极为罕见的生物的DNA的研究人员也面临降解DNA的问题。Fromenty，B.，et al.Nucl.Acids Res.28(11)e50(2000)和国际出版物WO/0151656报道了核酸外切酶(Exo)III改进长PCR的产量。Fromenty也报道了＜500bp的DNA的扩增子的产量降低。与应用Exo III有关的问题之一是其降解模板和引物。Di Benardo et al.Nucl.Acids Res.30(4)e16(2002)描述了应用T4 DNA连接酶(T4连接酶)和大肠杆菌(E.coli)聚合酶扩增双链DNA交联区域之间的单链DNA的短区域。扩增受损DNA的另一方法描述于美国出版物2003-0077581中。使降解的核酸与和该降解核酸有序列同源性的未降解核酸杂交。然后将降解核酸区域填充以核苷酸前体。然后应用聚合酶和/或连接酶将片段化的链共价连接。用于改进受损DNA的扩增的制剂可以经商业途径获自Sigma，St.Louis，MO和Qbiogene，现MP Biomedicals，Irvine，CA。虽然这些制剂的组成未被提供，认为Exo III被包含在制剂中。对于长度为500个碱基对以下的DNA模板并不推荐该制剂。其它人报道了应用大肠杆菌DNA PolI和T4连接酶的组合进行扩增前修复(Pusch，et al.，Nucl.Acids Res.26857(1998))。然而，根据Pusch等人，该扩增前产物在扩增开始前被纯化。
发明概述在本发明的一个实施方式中，提供了用于增加受损多核苷酸的扩增产物的保真性和产量中的至少之一的方法，其包括步骤(a)在包含连接酶和选自NAD+或ATP的辅因子并且不包含Endo VI的反应混合物中，温育多核苷酸；(b)通过在步骤(a)期间或步骤(a)之后将扩增试剂加入到反应混合物，使得在反应混合物中发生多核苷酸扩增；和(c)与不存在步骤(a)相比，在存在步骤(a)的情况下增加扩增产物的保真性和产量中的至少之一。对于温育是以秒、分钟还是小时发生，上述方法并不是特别地时间敏感的。本方法的实施方式中应用的连接酶可以是嗜温性或嗜热性的，并且不排除在特定环境下可能有用的嗜冷性连接酶。就温度敏感性而言，对连接酶的选择取决于哪一种最适于特定组的反应条件。例如，如果扩增试剂在温育步骤(a)期间加入，则可能需要应用嗜热性连接酶以耐住扩增期间应用的温度。嗜热性连接酶的例子是Taq DNA连接酶(Taq连接酶)和9°N连接酶。Taq连接酶与NAD+辅因子一起是更加有效的，而9°N DNA连接酶(9°N连接酶)与ATP辅因子一起是更加有效。嗜温性连接酶的例子是T4连接酶(应用ATP辅因子)和大肠杆菌DNA连接酶(大肠杆菌连接酶)(应用NAD+辅因子)。反应混合物可以进一步包括AP核酸内切酶例如II型核酸内切酶、T7核酸内切酶(Endo)I或其突变体或Endo IV。反应混合物可以可选地包括或还包括聚合酶诸如Taq聚合酶、大肠杆菌聚合酶、热微菌属某种(Thermomicrobium sp.)聚合酶或古细菌聚合酶或它们的突变体，如Pfu、Vent、Deep Vent、9°N或GBD聚合酶。在本发明的实施方式中，根据多核苷酸具有的损伤的类型，可以被额外地加入到试剂混合物中的酶包括T4嘧啶二聚体糖基化酶，[fapy]-DNA糖基化酶(Fpg)，UvrA、UvrB、UvrC、UvrD、Cho、UDG、Aag、Endo III和Endo V中的至少一种的各种组合。在本发明的一个实施方式中，应用含有约1-100单位核酸内切酶、约0.05-0.25单位聚合酶和约5-500单位连接酶的反应混合物，所述酶任选地加入到1-1000ngDNA中。可能影响多核苷酸的损伤的类型包括脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点、诱变的核苷酸、修饰的核苷酸、切口(nicks)、缺口(gaps)和DNA-DNA或DNA-蛋白质交联。损伤的多核苷酸可以获自天然来源、保存的生物学材料、法医学证据、远古多核苷酸、组织活检或常规生物学操作。根据本发明的实施方式，DNA的扩增通过下列的任何之一实现PCR扩增、解旋酶依赖性扩增、转录介导的扩增、链置换扩增、滚环扩增和全基因组扩增。在多核苷酸是单链RNA的情况下，扩增可以是反转录酶依赖性扩增。在本发明的一个实施方式中，多核苷酸能够产生大小范围为50个核苷酸至100,000个核苷酸的扩增子用于PCR扩增。在本发明的一个实施方式中，提供了含有使用说明书和一种或多种酶的扩增试剂盒，其中至少一种酶是连接酶，所述一种或多种酶被配制用于加入到扩增混合物以便增强扩增或者在加入扩增混合物之前使用以增强扩增。在本发明的另一实施方式中，提供了含有有效量的连接酶、聚合酶和AP核酸内切酶但不包括EndoVI的组合物，与在不存在该组合物的情况下的多核苷酸扩增相比，所述混合物能够增强多核苷酸扩增的产量和保真性中的至少之一。例如，组合物中的试剂浓度包括AP核酸内切酶，浓度为1-100单位的核酸内切酶；聚合酶，为0.05-0.25单位；以及5-500单位的连接酶，它们被包含在例如10-100μl的反应体积中。此制剂可以应用在1-1000ng DNA，用于修复该DNA。对于更高浓度的DNA，酶量应该按比例增加。在本发明的实施方式中，根据多核苷酸具有的损伤的类型，额外的酶可以被包含在组合物中，包括T4嘧啶二聚体糖基化酶、[fapy]-DNA糖基化酶(Fpg)、UvrA、UvrB、UvrC、UvrD、Cho、UDG、Aag、EndoIII和Endo V中的一种或多种的各种组合。
图1显示了与特定的酶预温育之后，来自热损伤的λDNA的扩增子产量增加。
图1A显示了受不同程度的热损伤的DNA模板和这一损伤对λDNA的5kb片段的扩增的影响，其中在99℃先热处理0秒、30秒、60秒、90秒、120秒或180秒造成损伤之后，5ng、2ng和1ng的经热处理的λDNA被扩增。受损DNA在扩增前不接受酶处理。扩增量在电泳后测定，发现120秒热处理大大降低了扩增量。凝胶上的第一泳道和最后的泳道包含1μg 的2-log ladder大小标准(NEB#N3200，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。
图1B显示了在λDNA的5kb片段的扩增中应用Taq连接酶、大肠杆菌Endo IV和大肠杆菌PolI，来自热损伤λDNA的扩增子产量增加。DNA如图1A所述被热损伤，但是受损DNA在扩增之前接受酶处理。扩增结果是在与Taq连接酶、大肠杆菌Endo IV和大肠杆菌PolI的10分钟预处理反应后给出。扩增子产量全部增加，而对于120秒和180秒热损伤的DNA尤为明显。
图1C显示了应用Taq连接酶、Tth Endo IV和大肠杆菌PolI，来自热损伤λDNA的扩增子产量增加。扩增根据图1B所述进行，但是扩增之前的酶处理含有嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(Tth)Endo IV，其替换大肠杆菌Endo IV。扩增结果在与水生嗜热菌(Taq)连接酶、Tth Endo IV和大肠杆菌PolI的10分钟预处理反应后给出。扩增子产量全部增加，而对于120秒和180秒热损伤DNA尤为明显。仅第一泳道含有大小ladder。
图1D显示了应用大肠杆菌连接酶、大肠杆菌Endo IV和大肠杆菌DNAPolI，来自热损伤λDNA的扩增子产量增加。扩增根据图1B所述进行，但是扩增之前的酶处理含有大肠杆菌连接酶，其替换Taq连接酶。接受99℃ 180秒处理的λDNA被用作模板。应用的模板DNA量在每一泳道上方示出。通过酶预处理，对于每一模板量，扩增子的产量增加。
图2显示了模板DNA的柠檬酸盐处理对扩增子产量的影响。
图2A显示了λDNA的5kb片段的扩增结果，其中λDNA在柠檬酸盐缓冲液中被加热至70℃ 0、20、40、80、120和160分钟。50ng、10ng和5ng的每一热处理样品被扩增，得到的产物在凝胶上观察，以确定扩增程度。DNA在扩增前不用选择的酶处理。最右边的泳道含有1μg 的2-log ladder。
图2B显示了不论在酶混合物中应用哪一种聚合酶，λDNA的5kb扩增子的产量都增加。在扩增前用各种酶处理120分钟热/柠檬酸盐损伤的λDNA。
泳道11μg 2-log ladder(NEB#N3200，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。
泳道2无预处理。
泳道3用Taq连接酶、Taq DNA聚合酶和大肠杆菌Endo IV预处理。
泳道4用Taq连接酶、大肠杆菌PolI和大肠杆菌Endo IV预处理。
泳道5用Taq连接酶、Taq:VentDNA聚合酶混合物和大肠杆菌EndoIV预处理。
图3显示了磷虾基因组的200bp片段的扩增结果，所述基因组从磷虾的乙醇保存样品中提取出来并用增强扩增产量的含有多种聚合酶酶中的一种、连接酶和AP核酸内切酶的酶混合物预处理。
泳道1未用酶预处理磷虾DNA。
泳道2用Taq连接酶、大肠杆菌Endo IV和Taq聚合酶预处理磷虾DNA。
泳道3用Taq连接酶、大肠杆菌Endo IV和Vent聚合酶预处理磷虾DNA。
泳道4用Taq连接酶、大肠杆菌Endo IV和50∶1 Taq:Vent聚合酶预处理磷虾DNA。
图4显示了来自热损伤DNA的10kb扩增子的产量增加。用酶混合物预处理180秒热损伤的DNA，随后扩增。
泳道11μg的2-log ladder大小标准品(NEB#N3200，New EnglandBiolabs，Inc.，Ipswich，MA)。
泳道2用Taq连接酶、大肠杆菌Endo IV和大肠杆菌PolI预处理。
泳道3用Taq连接酶和大肠杆菌Endo IV预处理。
泳道4用Taq连接酶预处理。
泳道5对照-未处理的DNA。
图5显示了连接酶预处理增加来自环境DNA(土壤样品提取物)的扩增子产量。
泳道12-log ladder大小标准品(NEB#N3200，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。
泳道1无酶预处理。
泳道2用T4连接酶预处理。
泳道3无酶预处理。
泳道4用Taq连接酶预处理。
图6Genbank检索，其揭示了与T4连接酶具有序列同源性的蛋白质。
图7Tth Endo IV的DNA序列(SEQ ID NO11)。
图8显示了UV光对扩增子产量的影响，应用λDNA为模板，通过凝胶电泳测定。
AλDNA接受UV辐射多达50秒，显示出产生的2Kb扩增子的产量轻微降低。
BλDNA接受UV辐射多达50秒，显示出5Kb扩增子的产量降低。
C显示了在UV辐射后，加入到λDNA的各种反应混合物对5kb扩增子的产量的影响。
泳道2-7是不存在反应混合物的对照。
泳道8-13显示了加入连接酶、聚合酶和AP核酸内切酶以及10单位T4 PDG的有益的增加效应。
泳道14-19显示了加入连接酶、聚合酶和AP核酸内切酶以及80单位T4 PDG的有益的增加效应。
泳道1和202-log ladder大小标准品(NEB#N3200，New EnglandBiolabs，Inc.，Ipswich，MA)。
图9显示了，将连接酶加入到T7 Endo I扩展了该酶DNA比值的有用范围，从而有利于从扩增混合物去除异源双链体，从而增加正确序列的比例。以多个量将Taq连接酶和T7 Endo I加入到超螺旋DNA，如每一泳道所指出。
图9a是对照，其中未加入Taq连接酶，但是应用增加量的T7 Endo I。应用12.5-25单位的T7 Endo I时，超螺旋DNA主要被切割为各种大小的片段。
图9b显示了在存在T7 Endo I的情况下，100单位的Taq连接酶的加入是如何保护DNA免遭非特异性切割，以至于甚至在200单位的T7 Endo I时，也存在相应于线性DNA的清楚条带，所述条带在连接酶不存在的情况下不存在。
图10显示了修复酶处理对来自氧化损伤的DNA或未损伤的模板的扩增子产量的影响。
图10A显示了向未受损模板pWB407加入修复酶对扩增子产量没有影响。
图10B显示了，向在存在亚甲蓝的条件下被温育的受损模板质粒pWB407加入Fpg，对产量有不一致的影响。在Fpg存在或不存在的情况下，加入Taq连接酶、大肠杆菌DNA聚合酶和大肠杆菌Endo IV一致地增加扩增子产量。
图11显示了，用修复酶处理后，来自受损DNA的PCR反应精确性提高。在PCR之前对未受损的模板质粒pWB407的修复酶处理对反应精确性没有显著影响。对于用亚甲蓝温育的受损的模板质粒pWB407，单独应用Fpg处理或者应用Fpg与Taq连接酶、大肠杆菌DNA聚合酶I和大肠杆菌核酸内切酶共同处理，增加了PCR的精确性。对精确性的量度是在克隆含lacZ的扩增子之后白色菌落数与蓝色菌落数之比，如下讨论。白色菌落的百分比越高，错误率越高。
图12显示了处理具有未知损伤的DNA以增加保真性和产量中的至少一个的流程图。
发明描述 本发明的实施方式描述了用于改进受损多核苷酸的合成产量或保真性中的至少之一的方法。在多核苷酸合成导致聚合酶依赖性扩增的情形中，长度约500个碱基以下(短至如100个核苷酸)的短扩增子或者500个碱基以上或多至如约100kb的长扩增子可以被扩增(对于PCR扩增)。其它类型的多核苷酸合成包括引物延伸反应，例如扩增(例如PCR、RT-PCR和QPCR)、基因组扩增、滚环扩增(RCA)和解旋酶依赖性扩增(HDA)和DNA测序反应。本发明的实施方式在分子生物学研究中和在解决应用生物学中的问题方面具有广泛用途，例如，在法医学中、在生物考古学中，其中需要分析来自远古来源的DNA；用于分类学，其中需要分析来自环境样品的DNA，例如Barcode of Life Project所需；用于包括组织活检在内的诊断分析，以便确定疾病的易感性或状态；以及用于分子生物学研究。
损伤的来源和程度 多核苷酸分子遭受损伤是常见的，甚至在“正常的”多核苷酸中也如此，虽然在保存的组织、干燥的样品或暴露于环境的多核苷酸中，损伤更加严重。损伤可能因样品的年代或其长度、其来源或其制备而发生。此外，损伤可以在多核苷酸合成方法的应用期间发生，例如在涉及高温步骤的PCR扩增期间发生。
多核苷酸可以以多种方式遭受损伤。各种类型的损伤包括(a)脱嘌呤或脱嘧啶损伤，这例如由热、多核苷酸在乙醇中的保存和暴露于环境中的因子如H2O、pH等引起；(b)对个别核苷酸的修饰，这例如由脱氨基作用、烷基化作用、氧化作用和二聚化作用引起；(c)切口和缺口，这例如由热、多核苷酸在乙醇中的保存和暴露于环境中的因子如H2O、pH等引起；(d)交联，这例如由甲醛、环境因子和乙醇保存引起；和(e)错配DNA，这由例如聚合酶错误掺入核苷酸引起。
不同的多核苷酸制备物将经历不同类型的损伤，所述损伤由例如，保存或体外对多核苷酸制备物的操作引起，并且可取决于含有多核苷酸的原核细胞、古细菌或真核细胞被如何保存以及提取出多核苷酸的细胞的特性。
定义 术语“多核苷酸”指双链DNA、双链RNA、杂合DNA/RNA双链体、单链DNA和单链RNA。
“修复酶(repair enzyme)”是指参与多核苷酸修复过程的嗜冷性、嗜温性或嗜热性酶。例如，修复酶可以诱导多核苷酸的键断裂，从而促进多核苷酸受损区域的去除。具有合成功能的酶例如连接酶和聚合酶也是修复酶。
DNA修复酶描述于科学文献中，例如，参见Wood，R.D.，et al.Mutat.Res.577(1-2)275-83(2005)和Eisen，J.A.and Hanawalt，P.C.Mutat.Res.435(3)171-213(1999)。一些人修复酶提供在表1中。虽然在表1中未描述，但所列举的酶的同源物和其它功能上相关的酶被包括在修复酶的定义中。上述酶中的任何酶可以是天然发生的、重组的或合成的。这些酶中的任何酶可以是天然的或具有数种活性的体外创建的嵌合体。除了上述酶，本领域技术人员还知道如何检索数据库以鉴定共有保守的序列基序并且具有相似的酶活性的其它相关酶。例如，NCBI网站(www.ncbi.com)提供了保守结构域数据库。例如，如果检索数据库中的Endo IV同源物，则发现74个序列匹配(对于连接酶，也参见图6)。
用于修复受损DNA的酶混合物中使用的“多核苷酸切割酶(polynucleotide cleavage enzyme)”是一类修复酶，包括负责碱基切除修复的AP核酸内切酶、糖基化酶(glycosylases)和裂解酶(lyases)。
受损碱基可以通过水解脱氧核糖糖部分和碱基之间的N-糖苷键的DNA糖基化酶去除。此反应的产物是必须被正确填充的脱嘌呤或脱嘧啶位点(AP位点)。这可以通过切刻与AP位点相邻的糖磷酸骨架的核酸内切酶完成。脱碱基糖被移除，新的核苷酸通过聚合酶/连接酶活性被插入。本文中具有适用性的一些酶在一个分子中具有糖基化酶和AP核酸内切酶活性。这些修复酶发现于原核和真核细胞。脱碱基位点可以被AP核酸内切酶和/或AP裂解酶识别和切割。II类AP核酸内切酶在AP位点进行切割，留下可以在多核苷酸聚合中使用的3′OH。而且，AP核酸内切酶可以去除与3′OH连接的抑制多核苷酸聚合的部分。例如，3′磷酸可以由大肠杆菌Endo IV转变为3′OH。AP核酸内切酶可以与糖基化酶联合起作用。
糖基化酶专一性的例子包括尿嘧啶、次黄嘌呤、3-甲基腺嘌呤(3-mAde)、甲酰胺基嘧啶和羟甲基尿嘧啶。尿嘧啶在DNA中的存在是由于错误掺入或由硫酸氢盐、亚硝酸引起的胞嘧啶脱氨基或自发的脱氨基作用发生的。次黄嘌呤是由于亚硝酸引起的腺嘌呤脱氨基或自发的脱氨基作用而发生的。3-mAde是烷化剂的产物。大肠杆菌具有两种3-mAde糖基化酶，称为TagI和TagII。甲酰胺基嘧啶(FAPY)(7-mGua)是DNA的甲基化剂的最常见产物。γ辐射产生4.6-二氨基-5-FAPY。修复此种损伤的大肠杆菌糖基化酶是Fpg核酸内切酶。羟甲基尿嘧啶是通过离子化辐射或对胸腺嘧啶的氧化损伤而产生的。
裂解酶断裂多核苷酸中的磷酸二酯键。
AP核酸内切酶的例子属于4类。
(I)切割3′-->3′-OH+5′-P-并且具有相关的糖基化酶活性。
(II)切割5′-->3′-OH+5′-P(III)切割3′-->3′-P+5′-OH(IV)切割5′-->3′-P+5′-OH 已经分离出数种似乎具有AP核酸内切酶或裂解酶活性和糖基化酶活性的酶，所述酶活性以协同方式(即，不导致AP位点形成)或顺序地相互配合。
用于在扩增反应中增强产量和保真性中的至少之一的多核苷酸切割酶的例子包括1)AP核酸内切酶，例如大肠杆菌Endo IV、Tth Endo IV和人AP核酸内切酶；2)糖基化酶，例如UDG、大肠杆菌AlkA和人Aag；和3)糖基化酶/裂解酶，例如大肠杆菌Endo III、大肠杆菌Endo V、大肠杆菌Endo VIII、大肠杆菌Fpg、人OGG1、T4嘧啶二聚体糖基化酶(T4 pdg)和人AP核酸内切酶。
Endo VI(也称为Exo III)能够在正常反应条件下在数小时内降解多核苷酸受损区域外的大部分多核苷酸，不被包含在用于处理受损多核苷酸的酶混合物中。
在本文的酶混合物中使用的“聚合酶”是指包含聚合酶活性的酶。修复和扩增聚合酶可以是相同的或不同的。
聚合酶的例子包括热稳定细菌聚合酶，例如Taq聚合酶和古细菌聚合酶例如Vent、deep Vent和Pfu；和热不稳定酶例如Bst聚合酶、大肠杆菌PolI、thermomicrobiurn roseum聚合酶和thermomicrobiurn thermophilus、噬菌体聚合酶例如phi29聚合酶、T7聚合酶和T4聚合酶等，或其突变体、衍生物或修饰型。衍生物的例子包括PfusionTM酶(Finnzyrnes.Espoo，Finland)以及将双链结合蛋白与来自一个或数个来源的聚合酶序列组合在一起的其它聚合酶。
在本文所述的酶混合物中使用的“连接酶”是指将多核苷酸单链的5′端连接到多核苷酸另一单链的3′端的酶。这样的连接酶发现于基本上所有的真核细胞以及原核细胞、病毒和古细菌。这些连接酶中的任何酶可以用在本文所述的修复中。连接酶的例子包括9°N连接酶、大肠杆菌连接酶、T4连接酶和Taq连接酶。其它连接酶包括LIGA(NP-4169O6.1)、TthDNALGS(AAA27486.1)、LIG3(NM-013975)和LIG4(NM-002312)。
在本文中可能有用的其它连接酶或类似连接酶的蛋白通过Genbank检索揭示，其中应用T4连接酶或大肠杆菌连接酶来搜索数据库(参见图6)，其中与这些已知的连接酶共享至少6个连续氨基酸的任何酶都可以被包含在根据本发明实施方式的修复混合物中。
与已公开的连接酶在不存在任何辅因子时与Exo III的联合应用(美国出版物2005-0026147)相反，已经发现，在包含连接酶的酶混合物中需要NAD+或ATP。更具体地，Taq连接酶和大肠杆菌连接酶需要NAD+，T4连接酶和9°N连接酶需要ATP。
示范性的连接酶、聚合酶和核酸内切酶可获自New England BiolabsInc，其中2005-2006目录的第107-117页并入作为参考(第102-108页是针对连接酶)，美国临时申请号60/717,296和国际公布号WO 2005/052124。此外，在扩增前混合物(preamplification mixture)中热稳定性修复酶可以与热不稳定性修复酶互换使用。热稳定性酶在40℃以上具有活性，更特别地是在65℃或以上具有活性。
本发明的实施方式改进了由多核苷酸扩增或其它合成反应获得的产物的产量或保真性。这可以，例如，在预温育混合物(pre-incubation mixture)中和/或在扩增期间应用(一种或多种)酶的制备物处理受损多核苷酸时被实现。
可以受益于上述的预温育的扩增方案包括聚合酶链式反应(PCR)、链置换扩增(SDA)(美国专利5,455,166和5,470,723)；HDA(美国出版物2004-0058378-A1)；转录介导扩增(TMA)(Guatelli et ai，Proc.Natl.Acad.Sci.USA871874-1878(1990))；滚环扩增(RCA)，其产生多个拷贝的序列用于体外DNA扩增，改自体内滚环DNA复制(参见，例如，Fire and Xu，Proc.Natl.Acad Sci.USA924641-4645(1995)；Lui，et al.，J.Am.Chem.Soc.1181587-1594(1996)；Lizardi，etal.，Nature Genetics 19225-232(1998))，和全基因组扩增方法。
已经发现通用酶混合物(universal enzyme mixture)在反应混合物中是有用的，可用于在扩增之前或扩增期间修复受损多核苷酸，不论多核苷酸的损伤类型如何。混合物修复受损DNA而不引起进一步的损伤。
通用酶混合物含有连接酶和辅因子例如NAD+或ATP。混合物优选额外地包括如上定义的聚合酶和AP核酸内切酶，它们处在合适的缓冲液例如Thermopol(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)、AccuTaq LA DNA聚合酶缓冲液(Takara Bio Inc.，Shiga，Japan)或任何其它标准Taq缓冲液中。在多种实施方式中，通用酶混合物含有大肠杆菌PolI或Taq聚合酶和AP核酸内切酶，例如嗜温性EndoIV，例如，大肠杆菌Endo IV，或嗜热性Endo IV，例如，Tth Endo IV和选自大肠杆菌连接酶、Taq连接酶或古细菌连接酶的连接酶例如9°N连接酶。在一个特定的实施方式中，酶混合物含有1-100单位的Endo IV、0.05-0.25单位的大肠杆菌PolI和5-500单位的连接酶，适于在扩增前或在扩增期间修复1-1000ng DNA。应该理解，除上述通用酶混合物中指出的那些酶浓度之外的核酸内切酶和聚合酶浓度范围也可以随所应用的酶和反应温度而变化。然而，应用实施例中描述的试验，浓度范围可以容易地被确定。例如，根据实施例1，标准的λDNA制备物可以被热处理。DNA随后可以接受一系列含有连接酶和辅因子的酶混合物。额外的酶被滴定以便确定该酶在混合物中的优选浓度。以此方式，DNA修复可以被最优化。在扩增每一样品之后，可以通过凝胶电泳确定扩增DNA的量，凝胶电泳揭示了测试酶的优选浓度范围。
可以在多核苷酸扩增或其它合成之前或期间，应用通用酶混合物。
如实施例中所说明的，根据损伤的类型，用额外的修复酶补充该通用酶混合物可能是被期望的，这取决于DNA损伤的性质。应用实施例和图中描述的试验可以确定各个修复酶或修复酶混合物的效用，从而确定它们用于修复特定多核苷酸的适宜性。
核苷酸的一般损伤或特定损伤的修复(a)一般损伤 确定多核苷酸中损伤的性质是费时的。如果怀疑对多核苷酸有某种形式的损伤，例如，对多核苷酸的扩增差，则优选地，不必鉴定所述损伤或多个损伤。在这些情况下，可以应用如上所述的酶的通用混合物来确定是否获得改进的扩增。如果应用该通用混合物后的改进是充分的，则不需要进一步的行动。如果改进是不充分的，则可以向混合物中加入额外的酶，如本文所述，直至得到优选的结果。整个试验可以在单个反应容器例如96孔皿中实现。皿中的每一微量孔可用于不同的酶混合物，包括通用混合物加上选择用来解决下文所述的各类损伤的酶。
选择用来修复DNA的一般损伤或未知损伤的酶的方案提供在图12(流程图)和实施例描述的试验中。
(b)特定损伤 在一些情况下，多核苷酸的损伤性质可能是已知的。在这些情况下，可以对酶混合物进行选择而不采用图12的分析。
(i)AP位点 碱基丢失是最常见的自发形式的DNA损伤。聚合酶和基于聚合酶的技术受到这些脱碱基位点的存在的负面影响。引物延伸反应的有效性通过修复多核苷酸中发现的任何脱碱基位点被增强。在一个实施方式中，这是通过在脱碱基位点处切割磷酸骨架的Endo IV活性来实现。这种切割在被切割的脱碱基位点的5’的DNA片段上留下可延伸的3′OH。它也在被切割的脱碱基位点的3’的DNA片段上留下脱氧核糖-5′-磷酸(dR5P)。聚合酶可以从游离的3′OH延伸，将被切割的脱碱基位点替换为正确的核苷酸。dR5P可以由特异地靶向于dR5P的酶通过在某些聚合酶例如大肠杆菌DNA聚合酶I中存在的侧翼核酸内切酶(flap endonuclease)活性或者单独的侧翼核酸内切酶例如FENI被去除。dR5P的去除也可以通过在此基团下游经侧翼核酸内切酶活性的切割而发生。在去除dR5P和产生与3′OH相邻的5′磷酸之后，连接酶可以封闭此切口，完成修复(参见实施例1-3和7)。
(ii)修饰的核苷酸(a)胸苷二聚体 光可以通过诱导嘧啶二聚体形成而损伤DNA。嘧啶二聚体阻断DNA聚合酶例如Taq DNA聚合酶催化的DNA延伸反应，从而抑制DNA扩增(Wellinger，et al.Nucleic Acids Res.24(8)1578-79(1996))。因此，需要在扩增之前或扩增期间修复嘧啶引物。这可以通过将嘧啶二聚体糖基化酶/裂解酶(Vande Berg，et al.J.Biol.Chem.273(32)20276-20284(1998))加入到通用酶混合物中来实现。DNA骨架在嘧啶二聚体的5′端被切割，留下可由DNA聚合酶延伸的3′羟基部分。在某些实施方式中，在3′羟基处的延伸和在DNA延伸期间产生的含损伤侧翼的随后形成以及随后的切割形成了切口，其被能够封闭该切口的酶封闭。通过延伸性聚合酶例如大肠杆菌聚合酶I或通过侧翼核酸内切酶的作用，可以实现对该侧翼的切除((Xu，Y.，et al.J.Biol.Chem.275(27)20949-20955(2000)，Liu，Y.，et al.，Annu.Rev.Biochem.73589-615(2004))。
(b)氧化损伤 由于在受损碱基对面并入了不需要的核苷酸，错误可以被引入DNA扩增反应的产物(Gilbert，et al.Am.J.Hum.Gen.7248-61(2003)；Hofreiter et al.Nucl.Acids Res.294793-9(2001))。这些错误可以通过对相同的样品扩增、克隆和测序多次而发现。通过比较用酶例如UDG处理样品之前和之后的序列数据，也可以鉴定由于碱基损伤造成的错误，所述酶移除常见类型的诱变DNA损伤之一(Hofreiter，etal.Nucl.Acids Res 294793-9(2001))。然而，用UDG处理在DNA中产生脱碱基位点，这抑制通过引物延伸进行的DNA扩增。对于稀有DNA样品，这便产生了问题，UDG处理可能使得稀有DNA样品不能方便地进行扩增。
作为氧化损伤产物的修饰核苷酸可以由Fpg或hOGG从多核苷酸中去除，留下阻断的多核苷酸，其中该阻断的多核苷酸可以由AP核酸内切酶例如EndoIV修复。
在扩增前酶预处理修复多核苷酸氧化损伤的有效性在图9中说明，其中在预温育混合物中，通用酶混合物补充有Fpg。
其它修饰的核苷酸例如烷基化碱基或脱氨基碱基——其中胞嘧啶转变为尿嘧啶、鸟嘌呤转变黄嘌呤或腺嘌呤转变为次黄嘌呤——产生编码错误。去除这些修饰核苷酸是需要的。这些修饰碱基可以通过AlkA、UDG或Aag中的任一种去除，如实施例10所述，留下AP位点。此AP位点然后可以由含有连接酶，优选地也含有AP核酸内切酶和聚合酶的反应混合物修复。尿嘧啶的去除使得通常会在此位点停止的扩增反应中的聚合酶继续扩增DNA。例如，Vent聚合酶活性受插入DNA中的不正确尿嘧啶的抑制。去除尿嘧啶的能力使得聚合酶具有增强的效力。
(iii)切口和缺口 DNA骨架中的切口和缺口可以导致截短的引物延伸产物并抑制扩增反应。通用酶混合物中的连接酶和聚合酶的协同作用修复DNA中的切口和缺口，从而增强DNA扩增反应。
(iv)交联 额外的核苷酸切除修复(NER)蛋白质(Minko et al.Biochemistry443000-3009(2005)；Costa et al.Biochimie 85(11)1083-1099(2003)；Sancar Ann.Rev.Biochem 654-3-81(1996))可以被加入通用酶混合物中，以修复由于多核苷酸暴露于甲醛和大体积加合物(bulky adducts)引起的损伤以及导致形成DNA-蛋白质交联的化学修饰碱基的损伤。可以用大肠杆菌UvrA、UvrB、突变型UvrB、UvrC、UvrD或Cho中的至少一种(Moolenar et al.Proc.Natl Acad.Sci USA 991467-72(2002))在受损位点附近的5′端形成切口，并且可选地在受损位点附近的3’端形成切口。有关这些酶的性质和纯化方案的细节可获自(Zou，Y.，et al.Biochemistry434196-4205(2004))。修复过程可以通过DNA聚合酶、DNA连接酶和可选的侧翼核酸内切酶(flap endonuclease)完成。
如果NER酶切割DNA而在DNA上留下抑制引物延伸的封闭3′端，则在5′切割位点产生3′羟基可以是有用的。一个例子将是如果NER酶切割DNA并留下3′磷酸。这将不能够应用已知的DNA聚合酶延伸，除非3′磷酸通过例如大肠杆菌Endo IV被去除。
如果NER酶或多种NER酶在DNA损伤的5′和3′切割，则在新释放的寡核苷酸从DNA解离时，损伤被去除。聚合酶可以仅仅填充DNA的切除区域，留下切口，随后连接酶封闭该切口，完成修复。在某些情况下，聚合酶可以填充DNA，随后继续置换剩余的DNA链。在这些情况下，具有侧翼酶(flapase)活性的酶允许形成连接酶可以封住的切口。在NER酶或多种NER酶仅在损伤的5′进行切割的情况下，聚合酶优选地置换原始DNA链，直至它通过损伤，在此处，侧翼酶切割DNA侧翼以产生可连接的切口。侧翼酶可以在到达DNA损伤之前和之后具有活性。优选地，聚合酶和侧翼酶活性一起起作用，最终置换和除去DNA损伤，留下可连接的切口，从而修复DNA模板。上述方法的有效性的一个例子提供在实施例7中。
(v)错配的多核苷酸 在多模板PCR和同源模板PCR中，异源双链DNA可能是一个问题(Lowell，J.L.&Klein，D.A.Biotechniques 28676-681(2000)；Thompson，J.R.，et al.Nucl.Acids Res.30(9)2083-2088(2002)；Smith，J.&Modrich，P.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 946847-6850(1997))。T7 Endo I或其突变体可以与连接酶一起应用，以去除错配区域。此方法不需要对DNA定量并且避免了PCR反应后的额外步骤，所述额外步骤为Lowell，et al.Biotechniques 28676-681(2000)；和Smith，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 946847-6850(1997)所要求。应用这些酶的一个例子提供在实施例8中。通过包含DNA连接酶活性以最小化异源双链切割反应中的非特异性切割，T7核酸内切酶或突变体DNA比值的有用范围可以被扩大。
对实施例和图的讨论 实施例1和图1表明，当模板DNA的损伤超过一定的损伤阈值(例如，约90秒热处理)时，获自PCR扩增的扩增子产量基本上被负面影响(参见图1A)。通过将DNA与酶混合物在扩增之前进行温育，这种损伤对扩增的影响可以被逆转并且扩增子产量增加(参见图1B、1C和1D)。此外，通过加入所述的酶混合物，“未损伤”DNA的扩增子产量可以增加。
实施例1表明，酶混合物对DNA扩增的效应并不依赖于单一类型的AP核酸内切酶或连接酶，而是相反，可以应用来自多种可选来源的核酸内切酶或连接酶。例如，发现热稳定Tth Endo IV和大肠杆菌Endo IV一样有效，大肠杆菌连接酶和热稳定Taq连接酶一样有效。
实施例2和图2表明，另一类型的DNA损伤——脱嘌呤对扩增产量的负面影响，脱嘌呤在热和柠檬酸盐存在的情况下被诱导。而且，该实施例表明，酶混合物对DNA扩增的影响不依赖于单一类型的聚合酶，而是可以应用来自多个可选来源的聚合酶。例如，大肠杆菌PolI可以替换为Taq DNA聚合酶或Taq和VentDNA聚合酶的混合物，以产生增加的产量。
实施例3和图3表明，对于短(200bp)片段可以观察到扩增产量的增加。事实上，对从短如100个碱基至长如100kb的宽范围大小的DNA模板可以观察到扩增产量的增加，相信可以实现甚至大于100kb的DNA的扩增产量。大小的上限仅受扩增混合物中的聚合酶的限制。
图3也表明，甚至在DNA以粗制形式保存而受损时(例如，在本身被保存的生物体的细胞内)，通过在扩增前加入酶混合物，扩增产量也明显增加。虽然酶混合物在扩增前被加入到模板DNA，但在扩增期间或预扩增步骤期间将模板DNA与作为热稳定等价物的酶混合物温育时，也可见相似的产量效应。
实施例4和图4表明，单独的连接酶可以增加扩增子产量，但是加入AP核酸内切酶更加有帮助。当连接酶、AP核酸内切酶和DNA聚合酶在扩增前应用时，在此实施例中观察到最佳结果。而且，此实施例说明，修复不是DNA大小依赖性的。例如，对5kb和10kb扩增子得到类似的结果。
实施例5和图5表明，应用连接酶可以获得增加的扩增产量，并且这一效应可以在不限制为单一来源的连接酶的情况下实现。图5表明，Taq连接酶和T4连接酶在增加扩增产量中都有效，甚至在预温育混合物中没有额外的酶的情况下被应用时也如此。在将连接酶加入到扩增混合物(如果是热稳定的)时，也认为发生这一效应。图5也说明了此方法对于扩增直接获自土壤样品的已经在自然中暴露于各种损伤剂的环境DNA的益处。
本文引用的所有的参考文献以及2004年10月21日提交的美国临时申请序列号60/620,896、2005年1月24日提交的60/646,728和2005年4月22日提交的60/673,925并入本文作为参考。
实施例实施例1增加具有各种程度损伤的DNA的扩增产量 试验被开发用来优化所选试剂在扩增前修复DNA的应用。各种不同程度的热损伤的产生 通过热处理诱导出各种量的DNA损伤。这如下实现将0.5mg/ml的100μl λDNA(NEB#N3011，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)按等份加入到单独的管中，在PE2700热循环仪上在99℃分别热处理30秒、60秒、90秒、120秒和180秒。一个样品用作扩增模板而不经过预处理。
残留的损伤DNA通过如下的酶混合物预处理使受损DNA模板在室温下在下面的混合物中温育10分钟DNA(5ng、2ng和1ng)；100μM dNTPs(NEB#M0447，New England Biolabs，Ipswich，MA)；1mM NAD+(Sigma#N-7004，Sigma，St.Louis，MO)；80单位的Taq连接酶(NEB#M0208，New England Biolabs，Ipswich，MA)或40-100单位的大肠杆菌连接酶；0.1单位的大肠杆菌DNA聚合酶I(大肠杆菌pPolI)NEB#M0209，New EnglandBiolabs，Inc.，Ipswich，MA)；10单位的大肠杆菌Endo IV(NEB#M0304，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)或10单位的Tth Endo IV；1×thermopol缓冲液(NEB#B9004，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)至96μl的最终体积。
在反应结束时，将样品转移到冰上，然后扩增。
DNA扩增反应 根据Wang et al.Nucl.Acids Res.321197-1207(2004)的方法，应用下列引物对λDNA进行扩增CGAACGTCGCGCAGAGAAACAGG(L72-5R)(SEQ ID NO1)和CCTGCTCTGCCGCTTCACGC(L30350F)(SEQ ID NO2)。
将4μl扩增混合物加入到96μ上述修复混合物中。扩增混合物含有100μM dNTPs、5单位Taq DNA聚合酶、0.1单位Vent(exo+)DNA聚合酶、5×10-7M引物L72-5R和5×10-7M引物L30350F，在1×thermopol缓冲液中。
为了校正任何酶贮存缓冲液的作用，当修复酶从反应中省去时，适当体积的其贮存缓冲液被加入到反应中。在所有情况下，将扩增反应物放置在热循环仪中，应用下列参数95℃20秒，1个循环，然后94℃ 5秒，随后72℃ 5分钟，25个循环。被扩增的扩增子的大小是5kb。
DNA扩增结果(5kb)通过1％琼脂糖凝胶电泳确认。将6×上样染料(Molecular CloningA Laboratory Manual，3rded.，eds.Sambrook and Russell，ColdSpring HarborPress，Cold Spring Harbor，NY，2001，pp.5.4-5.17)加入100μl扩增反应中。随后将20μl的此溶液连同作为大小标准品的1μg 2-log ladder(NEB#N3200，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)加到琼脂糖凝胶上。
通过凝胶电泳比较每一样品的扩增DNA量，结果显示在图1A中。当在热处理之后、扩增之前用酶混合物处理样品时，实现了扩增产量的明显增加(图1B、1C和1D)。
实施例2用酶混合物预处理后，来自具有诱导出的脱碱基位点(在柠檬酸盐处理之后)的DNA的扩增子产量增加由于脱碱基位点形成的各种程度损伤的产生 为了分析受损DNA的修复程度，首先通过柠檬酸盐处理诱导出各种量的DNA损伤。这是如下实现的 如Ide，H.，et al.Biochemistry 32(32)8276-83(1993)所述对DNA脱嘌呤。对λDNA(NEB#N3011，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)进行乙醇沉淀。以0.5mg/ml的浓度将DNA重悬浮于脱嘌呤缓冲液(100mM NaCl，10mM柠檬酸盐，pH5.0)中，并于70℃温育0、20、40、80、120和160分钟。随后对样品进行乙醇沉淀并重悬浮于EB缓冲液(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)中。通过测定含DNA溶液的A260，测定DNA浓度。
用酶混合物预处理DNA 在下列混合物中，在室温下温育受损DNA 10分钟DNA(2.5ng/120分钟损伤)；100μM dNTPs；1mM NAD+；80单位的Taq连接酶；0.1单位的Taq DNA聚合酶或0.1单位的大肠杆菌PolI(NEB#M0209，New EnglandBiolabs，Inc.，Ipswich，MA))或0.1单位Taq0.002单位VentPol，(NEB#M0254，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA))；
10单位的大肠杆菌Endo IV；1×thermopol缓冲液，至最终体积96μl。
在扩增之前，在室温下温育上述混合物10分钟，随后转移到冰上。DNA扩增反应 如实施例1所述进行扩增，产生5kb的扩增子。通过用酶混合物处理含脱碱基位点的λDNA，扩增子产量比阴性对照(图2A)增加。应用不同的酶混合物的一系列预处理的结果显示在图2B中。酶混合物随聚合酶(大肠杆菌PolI或Tag:Vent)而变化。
实施例3提取自在防腐剂中贮存后的完整生物体的DNA的扩增产量改善 基因组DNA分离自Meganyctiphanes norvegica(磷虾)，如Bucklin，A.& Allen，L.D.Mol.Phylogenet Evol.30(3)879-882(2004)中所述。磷虾已经自1999年保存在乙醇中。
通过酶混合物预处理磷虾DNA，如下进行50ng的M.norvegica基因组DNA；100μM dNTPs；1mM NAD+；40单位的Taq连接酶；0.5单位的Taq DNA聚合酶、0.2单位的Vent(exo+)DNA聚合酶或含0.05单位的Taq DNA聚合酶和0.001单位的Vent(exo+)的TaqVent(exo+)混合物；10单位的大肠杆菌Endo IV；1×thermopol缓冲液，至最终体积96μl。
在进行扩增步骤之前，将此反应物在室温下温育15分钟。
DNA扩增反应 扩增引物对应于52F和233R，如Bucklin，A.&Allen，L.D.Mol.Phylogenet.Evol.30(3)879-82(2004)中所述，产生200bp的扩增子。
52FTTTTTAGCAATACACTACACAGCAA(SEQ ID NO3)233RATTACGCCAATCGATCACG(SEQ ID NO4) 加入引物至终浓度0.5μM，每种dNTP的终浓度为200μM。随后将1μl的50∶1 Taq:Vent混合物(5单位的Taq DNA聚合酶和0.1单位Vent(exo+)DNA聚合酶加入到反应的)加入每一反应物中，至终体积100μl。
对于对照反应(泳道1)，没有加入Endo IV、Taq连接酶和预处理聚合酶。相应地调整体积。在省去修复酶的反应中，加入合适体积的酶贮存缓冲液以控制缓冲液效应。
循环条件如下94℃ 30秒，52℃ 30秒，72℃ 1分钟40秒，40个循环。将25μL(反应的四分之一)加到1％琼脂糖凝胶上，如上所述地进行制备、电泳和观察。
观察到，在应用上述酶混合物预温育样品后，来自磷虾基因组DNA的扩增子产量增加(图3)。
实施例4使用热损伤DNA，10kb扩增子的产量增加 如实施例1所述制备热损伤DNA。将λDNA加热至90℃ 180秒。
通过酶混合物预处理损伤DNA，如下进行λDNA(1μg的经180秒热处理的DNA)；100μM dNTPs；1mM NAD+；80单位的Taq连接酶；0.1单位的大肠杆菌PolI；100单位的大肠杆菌Endo IV；1×thermopol缓冲液，至最终体积96μl。
在扩增之前，将混合物温育10分钟。
如实施例1所述进行DNA扩增，除了下面指明的地方。将引物加入到上述96μl预温育混合物。引物L71-10R(序列GCACAGAAGCTATTATGCGTCCCCAGG)(SEQ ID NO5)替换实施例1中的L72-5R。Icycler热循环程序是95℃ 20秒，1个循环，95℃ 5秒，72℃ 10分钟，25个循环，然后72℃ 10分钟，1个循环。扩增子大小是10kb。
如实施例1所述地观察DNA，但有下列例外。将20μl的6×上样缓冲液加入到100μl扩增反应中。用H2O和1×上样缓冲液将10μl此溶液稀释为100μl。将其中的20μl加入到每一泳道。凝胶是0.8％琼脂糖凝胶。结果在图4中示出。
实施例5提取自土壤样品的DNA的扩增产量增加 用MoBio Laboratories，Inc.，Carlsbad，CA的UltraClean Soil DNA试剂盒(目录号12800-50)从土壤中分离环境DNA。
用连接酶预处理DNA 含有分离自土壤的0.6μg环境DNA和描述于下面(a)和(b)的两种连接酶中的一种的100μl终体积形成反应混合物。此反应混合物然后在室温下温育15分钟。
(a)1×Taq连接酶缓冲液(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)和80单位Taq连接酶。
(b)1×T4连接酶缓冲液(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)和800单位T4连接酶(NEB#M0202，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。
在下面描述的扩增反应中应用1μl的反应混合物。
DNA扩增反应 应用下列引物进行DNA扩增GGGGGXAGAGTTTGATCMTGGCTCA(SEQ ID NO6)和GGGGGXTACGGYTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO7)(M＝C或A，Y＝C或T，X＝8-氧代-鸟嘌呤)。这些引物靶向于具有1.6kb扩增子大小的16S rDNA。
50μl反应混合物含有10pmol的每一引物、1μl的修复的环境DNA、200μM dNTPs、1×thermopol缓冲液和1.25单位Taq DNA聚合酶。应用下列循环参数进行扩增94℃ 5分钟，1个循环，94℃ 30秒，55℃1分钟，72℃ 1分钟40秒，32个循环，随后72℃ 5分钟，1个循环。
如实施例1所述进行凝胶电泳。结果在图5中示出。
实施例6紫外光损伤的DNA的扩增产量增加 为了确定分析DNA修复有效性的条件，将50μg λDNA(NEB#N3011，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)在TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.5)中稀释为浓度50μg/ml，用36J/m2UV光辐射0、10、21、30、40和50秒。
用酶混合物预处理受损DNA，如下进行 在下列混合物中于室温下将受损DNA温育15分钟DNA(50ng的λDNA-损伤0、10、20、30、40或50秒)；200μM dNTPs；1mM NAD+；400单位Taq连接酶；0.1单位大肠杆菌DNA聚合酶I；10单位大肠杆菌Endo IV；80单位或10单位T4 pdg(也称作T4 Endo V).(Trevigen，Gaithersburg，MD)；Thermopol缓冲液至体积50μl。
温育15分钟后，将50μl反应混合物加入到50μl扩增溶液中。扩增溶液的组成如下每种引物40pmol(如实施例1中所述的L72-5R和L30350F或L72-2R(DNA序列是CCATGATTCAGTGTGCCCGTCTGG)(SEQ ID NO8)、1×Thermopol缓冲液、1mM NAD+、200μM dNTPs、2.5单位Taq DNA聚合酶(NEB#M0267，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)和H2O，至终浓度50μl。将50μL修复反应与50μl扩增溶液合并，得到终体积100μl。
将该100μl溶液放置在热循环仪上。对于L72-5R和L30350F引物组合94℃ 5分钟，1个循环；94℃ 30秒，58℃ 60秒，72℃ 4分钟，30个循环；72℃ 5分钟，1个循环。对于L72-2R和L30350F引物组合94℃ 5分钟，1个循环；94℃ 30秒，58℃60秒，72℃ 2分钟，30个循环；72℃ 5分钟，1个循环。
应用溴化乙锭，在1.8％的琼脂糖凝胶上观察扩增产物的存在。任何条带的大小都是针对含有2-log ladder(NEB#N3200S，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)大小标准品的泳道进行比较。结果表示在图8中。
实施例7应用核苷酸切除修复蛋白，UvrA、UvrB和UvrC增加DNA的扩增产量 用含有参与核苷酸切除修复的蛋白质的酶混合物预温育样品之后，确定出来自磷虾基因组DNA的扩增子产量增加。
用酶混合物预处理贮存的DNA，如下进行 在下列混合物中于4-37℃温育贮存DNA 1-180分钟DNA50ng的M.norvegica基因组DNA；100μM dNTPs；1mM ATP；400单位Taq连接酶；0.1单位的大肠杆菌DNA聚合酶I；10nM大肠杆菌UvrA、250nM大肠杆菌UvrB(或突变UvrB*)，加上或没有50nM大肠杆菌UvrC1×Thermopol缓冲液，至终体积96μl。
*对于突变UvrB，参见Zou，Y.，et al.Biochemistry 434196-4205(2004)。
DNA扩增反应如实施例3所述进行。
实施例8通过异源双链的酶切割，增加DNA扩增反应的序列精确性试验条件 A.向T7 Endo I中加入Taq连接酶被证明可增加反应混合物中的T7Endo IDNA定量(ration)而不随机降解DNA。这一方法使得能够减少由于扩增反应中的错配形成的不需要的异源双链。
本试验依赖于应用增加量的T7 Endo I处理含有十字形结构的超螺旋DNA。
将0、1.6、3.1、6.2、12.5、25、50、100、200或400单位的T7 EndoI(NEB#M0302，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)加入到50μl的反应中，所述反应包括1μg的pUC(AT)(Guan，C，et.al.Biochemistry 434313-4322(2004))和1×NEBuffer 2(NEB#B7002S，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。质粒pAT25tetA可以替换pUC(AT)使用(Parkinson，M.J.&Lilley，D.M.J.Mol.Biol.270169-178(1997))和Bowater，R.P.，et.al.Biochemistry 339266-9275(1994))。同时建立另一组反应，应用与上述相同的组分，同时加入1mM NAD+(Sigma目录号N-7004，Sigma，St.Louis，MO)和100单位Taq连接酶(应用贮液NEB#M0208，浓度是100u/μl)。所有反应在37℃温育60分钟。
通过使反应在0.9％TBE琼脂糖凝胶上跑胶、用溴化乙锭染色和应用紫外光观察，分析结果(参见图9)。不存在T7 Endo I时，pUC(AT)质粒在凝胶上产生2个条带，其对应于超螺旋形式(下面的条带)和松弛的环状形式(上面的条带)。
T7 Endo I分解超螺旋pUC(AT)为松弛的环状形式和线性形式，所述线性形式是在超螺旋形式和松弛形式的中间。在某些T7 Endo IDNA比值处，产生模糊的片状条带(smear)，表明T7 Endo I通过非特异性酶活性降解了DNA。Taq连接酶的存在显著增加了可用的T7 Endo I比DNA的比值。通过将T7 Endo I替换为国际公布号WO 2005/052124中描述的突变型T7 Endo I，此比值被进一步改进。
B.确定T7 Endo I和连接酶混合物从PCR反应中去除异源双链的有效性的试验条件。
DNA从土壤的分离和纯化DNA的扩增如实施例5所述进行，可选地加入5单位的T7 Endo I或其突变体。当加入T7 Endo I或其突变体时，增加额外的扩增循环(37℃15分钟，1个循环)。最后的步骤允许AP核酸内切酶切割形成的任何异源双链。
如实施例1所述进行凝胶电泳。如Lowell，J.L.&Klein，D.A.Biotechniques 28676-681(2000))所述，在凝胶上观察异源双链DNA。在存在T7Endo I或其突变体的情况下不存在异源双链DNA，这说明了T7 Endo I或其突变体和连接酶的效应。
本文所述的各种酶的单位定义连同产品说明书描述于NEB目录，NewEngland Biolabs，Inc.，Ipswich，MA中。例如，对T7 Endo I或其突变体的单位定义是，在37℃，在1小时内，在50μl反应体积中，将1μg超螺旋质粒中的90％以上转变为90％以上的线性DNA所需的酶量。
在连接酶存在的情况下，T7 Endo IDNA比值可以被增加而不增加对DNA的非特异性切割。
实施例9增加氧化损伤后的DNA扩增反应的序列精确性产生具有氧化损伤的DNA 遭受氧化损伤的DNA是pWB407(Kermekchiev，M.B.et al.Nucl.Acids Res.316139-47(2003))。损伤是应用亚甲蓝(MB)和可见光的组合造成的，如前述(Sattler，et al.Arch.Biochem Biophys.376(1)26-3(2000))。将质粒DNA(200μg/ml，在蒸馏水中)点到parafilm条上(50μl的滴)。将MB加入到滴中，获得范围为0至50(0、3、6、12.5、25和50)μg/ml的终浓度(100μl终体积)。将带有这些parafilm条的平板放置在冰上，用1×100-W的灯照射8分钟。经MB-光处理的DNA被沉淀、干燥，随后重悬浮于50μl的TE缓冲液中(pH8.0)。通过在260nm处的吸光度，确定最终的DNA浓度。
DNA扩增条件 pWB407的含有lacZ基因的部分用引物316-138，TGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGC(SEQ ID NO9)和316-137，CGAAAGCTTTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGA(SEQ ID NO10)扩增。引物316-138和316-137分别基于前述引物Kfd-29和H3Bla34(Kermekchiev，M.B.et al.Nucl.Acids Res.316139-47(2003))。100μl PCR反应物含有10或50ng的模板DNA，在适当处指明，以及40皮摩的每种引物。所应用的循环条件随着用于扩增的热稳定聚合酶而变化。
应用Taq DNA聚合酶(NEB目录号M0267S，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)时的循环条件具有起始变性步骤94℃ 5分钟，1个循环，然后是94℃30秒，58℃ 60秒，72℃ 3分钟30秒，30个循环，最后是72℃ 5分钟。
应用Phusion DNA聚合酶(NEB目录号F-530S，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)时的循环条件具有起始变性步骤98℃ 30秒钟，1个循环，然后是98℃10秒，62℃ 30秒，72℃ 1分钟30秒，30个循环，最后是72℃ 5分钟。
如上所述，通过在1.6％的琼脂糖凝胶上加入25μl反应、制备、电泳和观察，分析反应结果。所应用的标记是2-log DNA ladder(NEB目录号N3200S，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。
扩增精确性测定 如Barnes，et al.Gene 11229-35(1992)和Kermekchiev，et al.Nucl.AcidsRes.316139-47(2003)所述，测定来自pWB407模板的DNA扩增的精确性。含有lacZ基因的扩增子从已经受不同量的氧化损伤的质粒pWB407生成。如上所述，应用亚甲蓝进行氧化损伤。如上所述，应用50ng模板进行PCR反应。循环之后，将10单位的限制性核酸内切酶DpnI加入每一100μl PCR反应物中，并于37℃温育2小时。这一步骤去除了原始模板质粒。随后，应用异丙醇，用酚/氯仿沉淀提取得到的扩增产物(Molecular CloningA Laboratory Manual，3rded.，eds.Sambrookand Russell，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，2001，pp.6.25，A8.12-A8.24)。将沉淀的产物重悬浮于H2O中，用限制性核酸内切酶StyI和HindIII切割，应用制造商推荐的条件进行(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。通过加热至65℃ 20分钟失活HindIII和StyI酶，终止DNA消化反应。应用microconYM-100柱(Millipore，Billerica，MA)纯化限制性消化产物，去除短的DNA片段。
总共50μl的修复反应混合物中含有10或50 ng的pWB407扩增子+/-亚甲蓝温育。修复反应含有20mM Tris-HCl(pH8.8，25℃)、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100、1mM NAD+、200μM dNTPs(dATP、dTTP、dCTP和dGTP)和多种修复酶混合物。
在50μl的总体积中单独应用或以多种组合应用的修复酶混合物是0.4单位Fpg，NEB目录号M0240S，New Englan d Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)；200单位Taq连接酶；0.1单位大肠杆菌DNA聚合酶I；10单位大肠杆菌Endo IV；1mM NAD+；100μM dNTPs；1×Thermopol缓冲液。
反应在25℃温育15分钟。温育之后，将50μl的PCR混合物(20mMTris-HCl(pH8.8，25℃)、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1％TritonX-100、1mM NAD+、200μM dNTPs(dATP、dTTP、dCTP和dGTP)、2.5单位TaqDNA聚合酶(NEB目录号M0267S，INew England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)加入到50μl修复反应物中，此新溶液经历PCR热循环条件。如对上面的其它扩增子所述地，纯化和限制性酶消化来自这些反应的扩增子。
将扩增子克隆入pWB407质粒。质粒pWB407如下制备用限制性核酸内切酶StyI和HindIII消化，随后在37℃与1单位/μg DNA的南极热敏磷酸酶(NEB目录号M0289S，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)温育30分钟。通过琼脂糖凝胶电泳纯化去磷酸化的pWB407载体骨架。用QIAquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行凝胶提取。
在30μl反应物中，应用约0.1μg载体DNA和约0.5μg扩增子，将经消化的扩增子连接到制备的pWB407质粒中。按照制造商推荐的条件，应用T4连接酶进行连接(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)。将连接产物电转入大肠杆菌菌株WB441(Barnes，W.Gene 11229-35(1992))。应用的选择性指示平板是含有50μg/ml氨苄青霉素和80ug/ml Xgal的LB平板。在铺板之前，将细菌在丰富肉汤中于37℃温育1小时，以使氨苄青霉素抗性被表达。
缺乏连接酶处理的对照转化得到0个菌落。在37℃ 1天后，以及25℃ 1天或两天后，对蓝色菌落计数。结果显示在图10和11中。
实施例10脱氨基损伤之后提高DNA扩增反应的序列精确性产生脱氨基DNA 接受脱氨基作用的DNA是pWB407(Kermekchiev，et al.Nucleic AcidsResearch，2003，Vol.31，6139-6147)。损伤是应用亚硝酸进行随机诱变引起的，如Yan，W.et al.J Virol.2003 Feb；77(4)2640-50所述。硝酸可以使DNA中的鸟嘌呤脱氨基为黄嘌呤、胞嘧啶脱氨基为尿嘧啶和腺嘌呤脱氨基为次黄嘌呤。
在pH4.6的1M乙酸盐缓冲液中，用0.7M NaNO2处理质粒DNA(2mg)。在多个时间点，通过加入4体积的冰冷的1M Tris-Cl(pH7.9，终止反应。质粒DNA被沉淀、干燥并随后重悬浮于100ml的TE缓冲液中。
修复脱氨基的碱基的预处理反应 在50ml的总体积中单独应用或以多种组合应用的修复酶混合物是(a)1单位的Human Aag，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA；2单位的Endo III(NEB目录号M0268S)，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA；2单位的Endo V(NEB目录号M0305S)，New Eng land Biolabs，Inc.，Ipswich，MA；2单位的UDG(NEB目录号M0280S)，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA；200单位的大肠杆菌Endo IV；0.1单位的大肠杆菌DNA聚合酶I；10单位的大肠杆菌Endo IV；1mM NAD+；100mM dNTPs；1×Thermopol缓冲液。
(b)2单位的Endo V(NEB目录号M0305S)，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA；2单位的UDG(NEB目录号M0280S)，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA；200单位的大肠杆菌Endo IV；0.1单位的大肠杆菌DNA聚合酶I；10单位的大肠杆菌Endo IV；1mM NAD+；100mM dNTPs；1×Thermopol缓冲液。
(c)2单位的Endo V(NEB目录号M0305S)，New Engla nd Biolabs，Inc.，Ipswich，MA；200单位的大肠杆菌Endo IV；0.1单位的大肠杆菌DNA聚合酶I；10单位的大肠杆菌Endo IV；1mM NAD+；100mM dNTPs；1×Thermopol缓冲液。
(d)1单位的Human Aag，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA；2单位的Endo III(NEB目录号M0268S)，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA；200单位的大肠杆菌Endo IV；0.1单位的大肠杆菌DNA聚合酶I；10单位的大肠杆菌Endo IV；1mM NAD+；100mM dNTPs；1×Thermopol缓冲液。
(e)1单位的Human Aag，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA；2单位的UDG(NEB目录号M0280S)，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA；200单位的大肠杆菌Endo IV；0.1单位的大肠杆菌DNA聚合酶I；10单位的大肠杆菌Endo IV；1mM NAD+；100mM dNTPs；1×Thermopol缓冲液。
(f)1单位的Human Aag，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA；2单位的Endo V(NEB目录号M0305S)，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA；200单位的大肠杆菌Endo IV；
0.1单位的大肠杆菌DNA聚合酶I；10单位的大肠杆菌Endo IV；1mM NAD+；100mM dNTPs；1×Thermopol缓冲液。
扩增反应条件和扩增精确性测定如实施例9中所述进行。
实施例11单位定义嗜热连接酶单位 1单位被定义为，在45℃，在15分钟内，在50μl的反应总体积中，使1μg的BstE II消化的λDNA的50％被连接所需的酶量。
嗜温连接酶单位 1单位被定义为，在16℃，在30分钟内，在20μl的反应总体积中，使Hind III消化的λDNA(5’DNA末端浓度是0.12μM，300μg/ml)的50％被连接所需的酶量。
AP核酸内切酶单位 1单位被定义为，在37℃，在1小时内，在10μl的反应总体积中，切割1皮摩尔的含有单个AP位点的34-mer寡核苷酸双链体所需的酶量。嗜温性聚合酶单位 1单位被定义为，在37℃，在30分钟内，在含有包括[3H]-dTTP在内的33μM dNTPs和70μg/ml变性鲱精DNA的50μl反应总体积中，使10纳摩尔dNTP掺入到酸不溶性材料的酶量。
嗜热性聚合酶单位 1单位被定义为，在75℃，在30分钟内，在含有包括[3H]-dTTP在内的200μM dNTPs和200μg/ml变性小牛胸腺DNA的50μl反应总体积中，使10纳摩尔dNTP掺入到酸不溶性材料的酶量。
对于UDG和Fpg的定义，(参见NEB catalog，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。
序 列 表<110>新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs，Inc.)T·埃文斯(Evans，Thomas)B·史雷特科(Slatko，Barton)陈立新(Chen，Lixin)R·瓦伊斯韦拉(Vaisvila，Romaldus)管楚狄(Guan，Chudi)<120>修复核酸用于改进的扩增<130>NEB-256-PCN<150>60/620,896<151>2004-10-21<150>60/646,728<151>2005-01-24<150>60/673,925<151>2005-04 22<160>11<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>23<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>1cgaacgtcgc gcagagaaac agg 23<210>2<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400> 2cctgctctgc cgcttcacgc 20<210>3<211>25<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>3tttttagcaa tacactacac agcaa 25<210>4<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>4attacgccaa tcgatcacg 19<210>5<211>27
<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>5gcacagaagc tattatgcgt ccccagg 27<210>6<211>25<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>8-氧代-鸟嘌呤<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>m＝c或a<400>6ggggggagag tttgatcmtg gctca25<210>7<211>28<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>8-氧代-鸟嘌呤<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>y＝c或t<400>7ggggggtacg gytaccttgt tacgactt 28<210>8<211>24<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>8ccatgattca gtgtgcccgt ctgg 24<210>9<211>29<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物
<400>9tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagc 29<210>10<211>33<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>10cgaaagcttt caaggatctt accgctgttg aga 33<210>11<211>813<212>DNA<213>未知<220>
<223>嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)内切核酸酶IV<400>11atgccgcgct acgggttcca cctttccatc gccgggaaaa agggcgtggc cggggcggtg 60gaggaggcca ccgccctcgg cctcaccgct ttccagatct tcgccaaaag cccgcggagc120tggcgcccaa gggccctctc cccggccgag gtggaggcct tccgcgcctt aagggaggcc180tccgggggcc tccccgccgt gatccacgcc tcctacctgg tcaacctggg ggcggagggg240gagctttggg agaagagcgt ggcgagcctg gcggacgacc tggagaaggc cgccctcctc300ggggtggagt acgtggtcgt ccaccccggc tcgggccgcc ccgagcgggt caaggaaggg360gccctcaagg ccctgcgcct cgccggcgtc cgctcccgcc ccgtcctcct cgtggagaac420accgccgggg gcggggagaa ggtgggggcg cggtttgagg agctcgcctg gctcgtggcg480gacacccccc tccaggtctg cctggacacc tgccacgcct acgccgccgg gtacgacgtg540gccgaggacc ccttgggggt cctggacgcc ctggaccggg ccgtgggcct ggagcgggtg600cccgtggtcc acctcaacga ctccgtgggc ggcctcggaa gccgcgtgga ccaccacgcc660cacctcctcc agggaaagat cggggagggg ctcaagcgcg tcttcttgga cccgaggctc720aaggaccggg tcttcatcct ggaaaccccc aggggaccgg aggaggacgc ctggaacctc780cgggtcctca gggcctggct cgaggaggcc taa 81权利要求
1.增加受损多核苷酸的扩增产物的保真性和产量中的至少一个的方法，包括(a)在包含连接酶和选自NAD+或ATP的辅因子的反应混合物中，在不存在核酸内切酶(Endo)VI的情况下，温育所述多核苷酸；(b)通过在步骤(a)期间或步骤(a)之后将扩增试剂加入到所述反应混合物，使得在所述反应混合物中发生所述多核苷酸的扩增；和(c)与不存在步骤(a)相比，在存在步骤(a)的情况下，增加所述扩增产物的保真性和产量中的至少一个。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)独立于步骤(a)中的温育时间。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述连接酶是热稳定连接酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述损伤选自脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点、诱变的核苷酸、修饰的核苷酸、切口、缺口和DNA-DNA或DNA-蛋白质交联。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸获自天然来源。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸获自保存的生物学材料。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸获自法医学证据。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸是远古多核苷酸。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸获自组织活检。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物还包括T7 Endo I或其突变体。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物还包括聚合酶和AP核酸内切酶。
12.根据权利要求2所述的方法，其中所述反应混合物还包括聚合酶和II类AP核酸内切酶。
13.根据权利要求3所述的方法，其中所述连接酶选自Taq连接酶和大肠杆菌(E.coli)连接酶，所述辅因子是NAD+。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述AP核酸内切酶包括T4核酸内切酶或大肠杆菌核酸内切酶。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述AP核酸内切酶是大肠杆菌EndoIV。
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述聚合酶包括Taq聚合酶、大肠杆菌聚合酶或古细菌聚合酶或它们的突变体。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述古细菌聚合酶选自Pfu、Vent、Deep Vent、9°North和GBD聚合酶。
18.根据权利要求11所述的方法，其中所述多核苷酸是DNA，所述反应混合物包括被加入到1-1000ng DNA的1-100单位的大肠杆菌Endo IV、0.05-0.25单位的大肠杆菌PolI和5-500单位的连接酶。
19.根据权利要求11、12或18所述的方法，其中所述反应混合物还包括T4嘧啶二聚体糖基化酶。
20.根据权利要求11、12或18所述的方法，其中所述反应混合物还包括[fapy]-DNA糖基化酶(Fpg)。
21.根据权利要求11、12或18所述的方法，其中所述反应混合物还包括UvrA、UvrB、UvrC、UvrD和Cho中的至少一种。
22.根据权利要求11、12或18所述的方法，其中所述反应混合物还包括EndoV或EndoIII。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述反应混合物还包括Endo V，以及UDG和Aag或Endo III中的至少一种，以及UDG和Aag中的至少一种。
24.根据权利要求11、12或18所述的方法，其中所述反应混合物还包括UDG和Aag。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增是PCR扩增、解旋酶依赖性扩增、转录介导的扩增、链置换扩增、滚环扩增或全基因组扩增。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸是单链RNA，所述扩增是RT-扩增。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸的扩增能够在聚合酶链式反应中产生大小范围为50个核苷酸至100,000个核苷酸的扩增子。
28.扩增试剂盒，包括使用说明书和一种或多种酶，其中所述酶中的至少-种是连接酶，所述一种或多种酶被配制用于加入到扩增混合物以便增强扩增，或在加入扩增混合物之前使用以便增强扩增。
29.组合物，包括有效量的连接酶、聚合酶和不包括Endo VI的AP核酸内切酶，与不存在所述组合物的情况下多核苷酸的扩增相比，所述混合物能够增加所述多核苷酸的扩增的产量和保真性中的至少一个。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中在用于扩增前混合物的10-100μl体积中，所述AP核酸内切酶以1-100单位的浓度存在，所述聚合酶以0.05-0.25单位存在，所述连接酶以5-500单位存在。
31.根据权利要求30所述的组合物，其适于修复1-1000ng DNA。
32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述AP核酸内切酶是II类AP核酸内切酶。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述AP核酸内切酶是大肠杆菌Endo IV。
34.根据权利要求29所述的组合物，其中所述聚合酶是大肠杆菌polI。
35.根据权利要求29所述的组合物，还包括T4嘧啶二聚体糖基化酶。
36.根据权利要求29所述的组合物，还包括[fapy]-DNA糖基化酶(Fpg)。
37.根据权利要求29所述的组合物，还包括UvrA、UvrB、UvrC、UvrD和Cho中的至少一种。
38.根据权利要求29所述的组合物，还包括Endo V或Endo III。
39.根据权利要求33所述的组合物，还包括Endo V，以及UDG和Aag或Endo III中的至少一种，以及UDG和Aag中的至少一种。
40.根据权利要求29所述的组合物，还包括UDG和Aag。
全文摘要
提供了修复多核苷酸的方法和组合物，从而可以在例如扩增反应中以改进的保真性和产量有效合成多核苷酸。这涉及应用含有连接酶和选自NAD+或ATP的辅因子的反应混合物以及在核酸内切酶VI不存在的情况下将多核苷酸与反应混合物温育。反应混合物还可以包括AP核酸内切酶和聚合酶。这些酶任选地根据其抵抗高温的能力被选择，因而它们可以被包含在扩增混合物中。反应混合物可以在多核苷酸合成反应之前被应用，在此情况下可以应用非嗜热性酶。修复反应对于在酶混合物中的温育的秒数、分钟数或小时数并不是时间敏感性的。
文档编号C12Q1/68GK101072884SQ200580041889
公开日2007年11月14日 申请日期2005年10月20日 优先权日2004年10月21日
发明者T·C·埃文斯, B·史雷特科, 陈立新, R·瓦伊斯韦拉, 管楚狄 申请人:新英格兰生物实验室公司