含Endothelin-1的人类卵母细胞体外成熟培养液和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生殖医学的生物医学技术领域，涉及一种含有Endothelin-I(ET-I)的 人类卵母细胞体外成熟培养液，以及在进行人类未成熟卵母细胞体外成熟培养中的应用。
【背景技术】
[0002] 人卵母细胞体外成熟（in vitro maturation, IVM)是指通过体外培养，使卵泡内 的未成熟卵母细胞发育成为成熟的第二次减数分裂中期（Μ II )卵母细胞，受精分裂成胚胎 并移植获得妊娠的技术。与常规的体外授精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer)相比，IVM可以降低大剂量促排卵药物费用，节约就医时间，更重要的是可以避免 药物刺激卵巢带来的副作用。而在生殖医学的某些领域，IVM更是有不可替代的作用，如： 对有卵巢过度刺激综合症风险的病人进行IVM可最大程度避免卵巢过度刺激综合症的发 生；在更安全的条件下，实现肿瘤患者的生育能力保存；为卵子捐赠提供无需刺激的捐赠 途径等。虽然IVM技术有着广泛的应用前景，但由于体外成熟的卵母细胞进行体外受精后， 其受精，分裂和囊胚形成率均显著低于IVF技术，所以IVM技术的成功率仍不能与常规IVF 技术相比。
[0003] 在人类卵母细胞体内成熟环境中，卵子处在完整的卵泡中，卵细胞和卵丘细胞、颗 粒细胞、卵泡膜细胞等形成了一个复杂精细的微环境调节系统，使细胞质和细胞核高度同 步化发育。只有模仿卵泡的微环境才能提高体外成熟卵细胞的成熟率、受精率和发育潜能。 目前IVM技术虽然已经有很大提高，但因对卵母细胞发育成熟机制及所需环境条件认识有 限，IVM仍有许多问题亟待解决。
[0004] 在目前已经推广应用人类的ART技术中，IVM成功率最不稳定。其中突出的问题 是细胞核与细胞质成熟的不同步。IVM将未成熟的卵母细胞从中等大小的卵泡中分离出来， 致使卵母细胞成熟环境受到影响和干扰。体外培养虽可以获得一定比例的自发细胞核成 熟，但是细胞质成熟常不能同步完成，致使卵母细胞缺乏某些支持胚胎发育的关键细胞质 成分，出现部分生长因子的表达和印记改变，发生染色体和纺锤体结构异常，进而导致IVM 卵母细胞受精和胚胎发育能力下降。
[0005] ET-I是内皮素（endothelin，ET)家族的一个重要成员，具有重要的生理功能。 ET-I以及EDNRA基因敲除小鼠在出生后不久死去。ET-I在呼吸、心血管、泌尿各系统起调 节作用并能影响肿瘤的发生、发展、转移。此外，ET-I在生殖激素调节、妊娠、分娩等生殖过 程中也起着重要作用。我们前期研究发现hCG可以刺激卵巢的颗粒细胞和卵丘细胞产生 ET-1，并与卵丘细胞上的ET-I A受体（endothelin receptor type A, EDNRA)结合，从而 突破次黄嘌呤维持的减数分裂阻滞，使减数分裂重启，促进卵母细胞的成熟。
[0006] 到目前为止，尚未见有关ET-I应用于人类卵母细胞体外成熟技术领域的报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种含有ET-I的人类卵母细胞体外成熟培养液，所述人卵 母细胞体外成熟培养液组成如下：A液：ET-I 100ng/ml，0. 075IU/ml r-FSH，体积分数10% 人血清替代物（Serum Substitute Supplement, SSS)，溶剂为常规基础培养液；B液：ET-I 100ng/ml，0. 075IU/ml r-FSH，0. 5IU/ml hCG，体积分数10%SSS，溶剂为常规基础培养液。基 础培养液是指G-IVF。
[0008] 为实现上述目的，本发明将卵母细胞-卵丘复合体（Oocyte cumulus complexes, 0CC)置于含有ET-I的体外成熟培养液A液中进行培养，含有ET-I和r-FSH且不含hCG的 A液有助于维持卵丘细胞持续供给卵母细胞cAMP，保持减数分裂阻滞，有助于细胞浆的发 育成熟。在培养一段时间后将OCC转入体外成熟培养液B液中进行培养，含有ET-I，r-FSH 和hCG的B液有助于卵母细胞核浆同步发育，促进卵母细胞成熟。
[0009] ET-I购自英国TOCRIS公司，r-FSH (果那芬）购自瑞士 Serono公司，HCG (艾泽） 购自瑞士 Serono公司。SSS购自美国Irvine公司。G-IVF购自瑞典vitrolife公司。
[0010] 本发明所述血清替代物不仅仅指SSS，还包括其他可以用于人类辅助生殖领域的 血清替代物。
[0011] 本发明的另一个目的是提供所述的含有ET-I的人类卵母细胞体外成熟培养液在 体外进行人卵母细胞培养中的应用，通过以下步骤实现： 1、配制人类卵母细胞体外成熟培养液，组成如下：A液：ET-I 100ng/ml，0.075IU/ ml r-FSH，体积分数10%SSS，溶剂为常规基础培养液；B液：ET-I 100ng/ml，0. 075IU/ml r-FSH，0. 5IU/ml hCG，体积分数10%SSS，溶剂为常规基础培养液。基础培养液是指G-IVF。
[0012] 2、在四孔培养皿中加入含有ET-I的人类卵母细胞体外成熟培养液(A液与B液） 各两孔，每孔750 μ 1，并放置于含6%C02, 37°C，饱和湿度的恒温培养箱中平衡6小时以上。
[0013] 3、使用双腔取卵针以较低的负压(约90mmHg)在B超引导下吸取卵泡中的0CC，将 已经吸取在试管中的未成熟OCC在体式显微镜下仔细找出，并使用斜面转动法初步鉴定卵 母细胞是否成熟，一切操作都需要在37°c的热台上完成。
[0014] 所述斜面转动法是指在体式显微镜下，将培养皿倾斜约10-15 °，并将OCC沿培养 皿外缘小心转动，由于外缘在转动的过程中液体量减少，可以使OCC充分展开，进而较容易 鉴别含有生殖泡（GV)的未成熟卵母细胞。
[0015] 4、将卵泡穿刺取卵术中取出的未成熟OCC在卵母细胞体外成熟培养液A液中漂洗 两遍，随后将OCC转移入新的卵母细胞体外成熟培养液A液中培养10小时。
[0016] 10小时后，将未成熟OCC转移入卵母细胞体外成熟培养液B液中漂洗两遍，随后将 OCC转移入新的卵母细胞体外成熟培养液B液中培养14小时。
[0017] 5、体外培养24小时后，将未成熟OCC转移至透明质酸酶溶液中使用灭菌巴氏吸管 吹打数次，使卵丘细胞疏松易剥离，再用140 μm 口径剥卵针将卵母细胞周围的卵丘细胞小 心剥除。
[0018] 所用的透明质酸酶（HYASE-10X)购自瑞典vitrolife公司，使用前稀释10倍。
[0019] 6、在倒置显微镜下确认明显排出极体的Mil (Meiosis II)卵母细胞为成熟的卵 母细胞，将成熟的卵母细胞使用玻璃吸管小心转移至G-I培养液中，并置于含6%C02, 37°C， 饱和湿度的恒温培养箱中，即完成细胞培养。择时以ICSI方式进行体外授精。
[0020] 本发明通过研究证明该培养液和培养方法具有促进人卵母细胞体外成熟，尤其是 胞质成熟的能力，并可提高卵母细胞体外受精后的胚胎发育潜能。本发明所涉及的人未成 熟卵母细胞体外成熟培养液和培养方法是根据人未成熟卵母细胞体外培养（IVM)时胞质与 细胞核发育不平衡影响胚胎体外发育潜能的现状，结合ET-I在卵丘细胞中的生物学功能 和作用研制而成。含有ET-I成分的培养液通过序贯加入性激素（r-FSH/hCG)进行培养可 以使卵母细胞核浆发育趋于同步，提高胚胎的受精率和发育潜能，有助于优化IVM过程，值 得推广应用。
【具体实施方式】
[0021] 本发明结合具体实施例做进一步说明，本发明的保护范围并不仅限于此。
[0022] 实施例一:配制含有ET-I的人类卵母细胞体外成熟培养液 A 液：称取 ET-I 10yg，7.5IUr