体外培养卵泡的方法

专利名称：体外培养卵泡的方法
技术领域：
本发明涉及一种体外培养卵泡的方法。更具体而言，本发明涉及从哺乳动物卵巢组织中产生大量成熟或半成熟的卵泡和/或卵母细胞的方法。
背景技术：
在研究卵泡发生时以及人和非人哺乳动物的卵母细胞成熟领域中发现了几个问题。
随着广为接受和使用卵母细胞成熟来进行动物繁殖和进行人类的体外授精，通常收集并积存大量的精子以备将来之用，这基本上实现精子的无限供应。但是，直到现在尚没有切实可行的方法从雌性动物身上收集并贮存大量的可受精的卵细胞。其原因涉及雌性动物的生殖生物学。在雌性哺乳动物中，卵巢中仅有某些细胞能成熟为卵细胞。这些生殖细胞在所有哺乳动物出生时就以一定数量存在，它们存在于卵巢中，停滞在减数分裂的早期，在此阶段不能被受精和发育成正常的后代。在正常环境下，许多这些细胞在卵巢内开始周期性发育，转向动物的生殖周期。在周期的适当时间，一个或少数这些细胞从卵巢中释放，这一过程叫排卵。单个生殖细胞发育到排卵发生这一复杂的过程被称为卵泡发生(folliculogenesis)。卵泡发生涉及几个主要的步骤以及与卵巢里其他的细胞及垂体和卵巢激素协同活性。然而，在体内的卵泡发生是一个低效的过程。
卵泡培养是一种为分离完整卵泡以避免系统的影响以使卵泡的新陈代谢得到科学的检测而设计的实验技术。利用卵泡培养，可以摸拟或优化卵泡发生。然而，至今尚不知道能有效提供从原卵泡到成熟卵泡和卵母细胞的所有卵泡全部发育阶段的卵泡培养方法。G.M.Hartshorne的文章“卵泡的体外培养”，繁殖综述杂志(Reviews ofReproduction)(1997)2，94-104描述了一个可用的方法。
此外，直到现在几乎所有成功的卵泡培养方法都是用油做为屏障来保护培养免受外界的影响。这一实践限制了检测化学物质(通常是异生素)对卵泡发生影响的可能性，更具体而言是亲脂性的化合物。所述的化学物质可能是破坏性的(对卵泡发生有负面影响)或有益的(正面影响，可能用于治疗人或非人哺乳动物有缺陷的卵泡发生的药物检测)。这种检测也能够被设计用于检测物理因素如电磁或电离辐射、超声波对卵泡发生的影响，例如如放射学/放射治疗。现有技术不能检测卵泡发生的任何一个不连续阶段，通常不可能评价外部影响对在某一特定发育阶段的卵泡细胞的影响，因为通常卵泡培养是尽力去模仿卵泡发育不同阶段的自然条件。
另一个需要就是保存卵泡，例如当一个女人不得不进行化疗或放射治疗或卵巢切除术后，用所述来自保存卵泡的卵母细胞的体外受精或者移植仍可使这名妇女拥有来自她自己卵母细胞的孩子，否则这是不可能的。
进一步清楚这种保存卵泡的方法与人工授精结合使卵泡发生更为有效，其将有益于几个稀有和濒危物种的存活机会。
换句话说，需要新的方法从哺乳动物卵巢组织中产生大量成熟或半成熟的卵泡和/或卵母细胞。
本发明的目的本发明的目的是提供从哺乳动物卵巢组织中产生成熟或半成熟的卵泡或卵母细胞的新方法。更具体而言，本发明的目的是提供从哺乳动物卵巢组织中分离出的初级或次级卵泡产生成熟或半成熟的卵泡或卵母细胞的方法。
另一目的是提供检测外部影响的生物鉴定环境，例如对卵泡发生和卵子发生、更具体而言是对卵泡发生或卵子发生各自所包括的所有步骤、或者对特定的发育阶段的和从正常系统影响中分离出来的卵泡或卵母细胞的化学或物理影响(例如电磁或电离辐射，超声波，...)。
发明概述本发明涉及一种体外培养哺乳动物卵泡的方法，其特征在于包含以下连续步骤-为体外培养提供了适宜的容器；-从哺乳动物的卵巢中选择卵泡，所述的卵泡至少包含-卵泡膜细胞或前膜细胞，-颗粒细胞和-卵母细胞，-可选的第一个培养步骤，在这一步骤中使用抑制附着的无油的第一培养基，-第二个培养步骤，这一步骤使用促进附着的无油的第二培养基，以及-得到成熟的卵泡。
所述的卵泡可以是初级或次级卵泡。再者，所述的卵泡可以是冻融的卵泡，来自于贮存的卵泡或来自于卵巢组织。
在优选的实施方案中，本发明的方法进一步包含在第二个培养步骤后的第三个培养步骤，它是用诱导成熟的无油的第三培养基，形成粘液化的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complex)。所述的第三培养步骤优选包含卵母细胞的成熟和所述的卵母细胞类排卵的排出。
可选的第一个培养步骤优选包含初级卵泡到次级卵泡的分化。
第二个培养步骤优选包含卵泡附着到适宜容器表面和卵泡分化为排卵前或类排卵前卵泡。
所述的适宜容器优选是减少面积的(reduced area)96孔平底培养板。
本发明的另一个方面是检测化学或物理影响对卵泡发生的作用的方法，它包括以下步骤·在至少一个细胞发育阶段，在所述的化学或物理影响下进行本发明的卵泡培养，并且·检测这些作用。
仅在卵泡培养特定的短期内应用化学或物理影响，以检测卵泡分化的临界点的影响(例如前卵泡腔期(preantral)、卵泡腔期(antralphase)，排卵诱导，...)。所述的化学或物理影响也可持续存在整个卵泡培养过程。
所述的作用能够通过确认方法验证卵母细胞的质量来方便地检测，该确认方法选自IVF分级(IVF rating)，受精和移植后发育能力的分级、纺锤体染色、细胞器分析、染色体分析或其组合，或者通过确认方法来分析卵泡发生的质量来方便地检测，该确认方法选自增殖分析、分化分析、类固醇的产生、粘液化或者其组合。然而，这些方法检测卵母细胞和卵泡发生的质量的应用跟本发明无关。
附图简述

图1表示根据本发明从哺乳动物卵巢组织产生大量成熟或半成熟卵泡和/或卵母细胞的方法示意图。
图2a和2b分别表示在发育的初级和在前卵泡腔早期(次级)阶段的卵泡。
图3a和3b表示进行本发明方法优选的培养板设置。
图4a至4e描述了根据本发明方法所培养的卵泡的发育。
发明详述本发明涉及从哺乳动物卵巢组织产生大量成熟或半成熟卵泡和/或卵母细胞的方法。更具体而言，它涉及将从哺乳动物卵巢组织收集的生殖细胞体外发育和成熟成成熟或半成熟的卵泡和/或卵母细胞的方法。
本发明将用几个非限制性的实施例来说明。
本发明的方法概述见图1，其中表示了从分离自哺乳动物卵巢组织分离的卵泡得到成熟卵泡和卵母细胞的所有必需步骤。
所有的步骤将在下列实施例中进一步详细说明实施例1次级卵泡的分离和预培养(图1中的步骤1)从12到14日龄的F1代C57B1/j6XCBAca杂交小鼠中分离卵巢组织，并把它放在含有GlutaMAXITM的Leibovitz’s L15培养基(GibcoBRL 31415-029)的培养皿中，这种培养基中含有10％HIA FBS(热灭活的胎牛血清)和0.1％青霉素-链霉素混合物(Gibco BRL 3032908)。卵巢要除去输卵管和脂肪。
用一根针划破卵巢表面，把卵泡释放于L15培养基悬浮液中。在正常条件下，用这种分离方法从每个卵巢可以得到30到40个合适的卵泡。
如要要分离初级卵泡，可用7到8日龄的小鼠。在这种情况下从每个卵巢可以得到10到15个合适的卵泡。
实施例2本发明的方法选择卵泡(图1中的步骤2)不是所有实施例1悬浮液中的卵泡都适合卵泡培养。为了确保所有的卵泡以几乎相同的速率生长，那么所选择的卵泡都应该有相似的直径。在这个特定的情况下，直径在100到130微米之间的卵泡是适合的，这时的卵泡发育到前卵泡腔早期(次级)阶段。在这种情况下，图2b中能够看到卵泡11应有两层粒膜细胞13和一个圆形的卵母细胞15。所述的卵泡还包括膜间质细胞17，基底膜19和透明带(Zonapellucida)21。卵泡可以在立体显微镜下观察到和在倒置显微镜下测量。用合适配置的巴斯德吸管挑出合适的卵泡并转移到冷冻管(用于贮存，见实施例3)或培养板(用于卵泡培养，见实施例4)中。
处于次级之前发育阶段的卵泡也能用于实践本发明。确定卵泡是否充分分化的最重要的因素是卵泡膜细胞17或前膜细胞23的存在，如图2a中可以看到，它们存在于初级阶段卵泡的外表面。卵泡前膜细胞表面不表达LH受体。在本实施例所用的小鼠模型中，该初级阶段卵泡的大小在70到100微米之间。然而这个大小是特定于小鼠系统的，其它物种的合适大小能由本领域技术人员通过联系上述细胞发育阶段来确定。
实施例3卵泡贮存的建立和应用(图1中的步骤3)使用本领域技术人员已知的冷冻保存技术可以贮存卵泡。下一段描述这一技术的实施例。
把实施例2中得到的卵泡收集到塑料冷冻管(Simport，Quebec，Canada)中。将每个小管中25个卵泡悬浮在150微升L15培养基中，这种培养基中加有10％热灭活的FCS和1.5M的DMSO。用可以控制的编程冷冻机(Cell Freezer R204，Planer，Sunbury-on-Thames，UK)缓慢冷冻。卵泡在4℃冷冻混合物中平衡15分钟，然后以2℃/min的速度冷却至-7℃。手工接种后，以-0.3℃/min的速度将温度降到-40℃。在贮存到液氮之前，卵泡要以-50℃/min的速度快速冷却到-110℃。
通过加热冷冻管到37℃把卵泡超快速解冻。在室温15分钟内用三个步骤稀释冷冻保护剂(cyoprotectant)(把DMSO的浓度从1.5M降到1M，然后再降到0.5M)。在培养前，要在37℃把卵泡在分离培养基中平衡15分钟。从这以后，卵泡就可以象新鲜获得的卵泡一样处理了。
实施例4卵泡培养(图1中的步骤4)卵泡培养包括至少一个能提供分化的卵泡的培养步骤。用合适的培养基来激发分化。在本发明的方法中，培养基可以分为三组第一培养基、第二培养基和第三培养基。在合适的分化阶段用合适的培养基对成功地实施本发明的方法是至关重要的。
两个实施例来说明怎么在卵泡的不同分化阶段使用本发明的方法。
当涉及孵育阶段时，除非另有说明，使用以下条件·温度37℃·空气混合物空气中含5％二氧化碳·湿度100％饱和另外，当用小鼠以外的其它品种时，可以改变孵育期得到相同的结果。针对小鼠系统对本实施例进行最优化。
特定培养基功能和它们组成的实例的概述见下表

FCS＝胎牛血清，ITS＝胰岛素-转铁蛋白亚硒酸钠(5μg/5μg/5ng/ml)，FSH＝促卵泡激素(10mIU/ml-100mIU/ml)，LH＝黄体生成素(0-10mIU/ML)，HCG＝人绒毛膜促性腺激素(1.5IU/ml)，和EGF＝表皮生长因子(10ng/ml)，α-mem可以用任何适宜的基础细胞培养基代替，例如Waymouth培养基。
4.A.使用初级卵泡的实施例在使用初级卵泡(例如带有还没有完全分化成膜细胞、它们的表面不能表达LH受体的前膜细胞的卵泡)的情况下，使用第一培养基的第一个培养步骤是必须的。
在这一步中要用前面提到的第一培养基。该培养基将使前膜细胞生长并进一步分化成膜细胞。例如把卵泡在75微升培养基中培养4天。4天以后，起始大小在90到100微米之间的卵泡通常就达到了它们发育的次级阶段(前卵泡腔阶段)(更小的初级卵泡将需要8天达到前卵泡腔阶段)。然后卵泡大小约在100到130微米之间，大小的增加主要是由于粒膜细胞增殖和卵母细胞的生长造成的。从那以后的进一步步骤与从次级卵泡开始的相同。
4.B.使用次级卵泡的实施例当从次级卵泡开始时，可以马上使用第二培养基开始。该培养基可以促进粘附到培养容器表面。每4天更新一次培养基。在第12天，用第三培养基取代第二培养基更新培养基。该培养基可以使粘液化的卵母细胞丘复合体从过夜的卵泡中释放出来，而卵母细胞最终成熟。
优选地，用减小表面积的96孔板(A2，Costar)来进行本发明的方法。在75微升的培养基中培养。更新培养基时，弃去30微升用过的培养基并加入30微升新鲜培养基。这两个步骤总结如下
表

优选的设置如图3所示。使用减小面积的96孔平底培养板(Costar)，图3a表示第一种可能的设置。黑圈表示培养孔，白圈表示加水的孔。
图3b表示另一种可能的设置。在这里，E行用于培养，所有其他的孔加水。所加的水是为了在培养板水平上创造一个适宜的微环境(100％湿度)。
图4表示使用本发明的方法时的卵泡发育。培养初级和次级卵泡(a)。当在第二培养基中培养时，促进粘附到培养容器表面。促进膜间质细胞增殖(31)，这将导致粘附到容器表面(b，c)。在12天的培养中，卵泡进一步发育和生长(b，c，d)，卵泡生长导致结构破裂并形成卵泡内腔(d)(33)。所述的腔和破裂提供了好的培养基循环，由此增加了卵母细胞的成活机会，因为其会有充足的营养和氧气供应。第三培养基的加入将导致卵母细胞丘复合体(e)(35)的释放。
实施例5
利用本发明得到的卵泡检测紫杉醇的化学影响利用实施例4中相同的方法使用次级卵泡。利用10块在E行有卵泡培养的96孔板来检测紫杉醇对卵泡产生的影响(每孔75微升)。用于培养步骤的所有培养基组成如下

每4天更新1次培养基，方法是去除30微升培养基并加入30微升新鲜的培养基。
13天以后，就存活、粘液化、极体(PB)出现情况、卵母细胞直径对卵泡进行评分。带有标准差(sd)的平均值如下

用这种方法可以检测一种化合物对卵泡产生和卵母细胞成熟的影响。
实施例6
利用本发明得到的卵母细胞进行体外授精(IVF)和胚胎移植(ET)用于体外授精(IVF)的培养基包含KSOM，其包含以下溶于水的成分

KSOM培养基中补加3％非结晶的牛血清白蛋白(BSA)。
选择如实施例4中获得的包含丘形成的完全成熟的卵母细胞。通过去除附睾(epididymus)和解剖来收集精子。然后精子通过在KSOM培养基中(+3％BSA)孵育2个小时而获能，计数并对运动性进行评分。如果需要的话，可把浓度调整到靶浓度2·106/ml。
把所选择的卵母细胞丘复合体转移到30微升KSOM+3％BSA中，加入10微升获能的精子，随后进行2个小时30分钟的孵育。
孵育后，把卵母细胞转移到胚胎培养皿中(KSOM+0.5％BSA)。首先用20微升移液管反复吹吸对卵母细胞进行清洗，使细胞丘和精子细胞与卵母细胞分离。
经过24小时的进一步孵育后，通过检测双细胞胚胎期来评估卵母细胞受精情况。
用本发明的方法提供的卵母细胞获得高达72％的受精率，和高达90％的囊胚发育率。
权利要求
1.一种体外培养哺乳动物卵泡的方法，其特征在于包含以下连续的步骤-提供用于体外培养的一种适宜的容器，-从哺乳动物的卵巢中选择卵泡，所述卵泡至少包括-卵泡膜细胞或卵泡前膜细胞，-粒膜细胞和-卵母细胞，-第二个培养步骤，其使用附着物促进无油的第二培养基，和-获得成熟的卵泡。
2.权利要求1的方法，其特征在于该方法包含在第二个培养基步骤前进行的初级培养步骤，其使用附着物抑制无油的第一培养基。
3.权利要求1的方法，其特征在于所述的卵泡是次级卵泡。
4.权利要求2的方法，其特征在于所述的卵泡是初级卵泡。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其特征在于所述的卵泡是冷冻的卵泡或解冻的卵泡。
6.权利要求1至5中任何一项的方法，其特征在于它包含第二个培养步骤后进行的第三个培养步骤，是用诱导成熟的无油的第三培养基，从而产生粘液化的卵母细胞丘复合体。
7.权利要求2、4或5中任何一项的方法，其特征在于初级培养步骤包含初级卵泡至次级卵泡的分化。
8.权利要求1至7中任何一项的方法，其特征在于第二个培养步骤包含卵泡附着到适宜容器表面，以及卵泡分化为排卵前卵泡或类排卵前卵泡。
9.权利要求6的方法，其特征在于第三个培养步骤包含卵母细胞的成熟和所述的卵母细胞类排卵的排出。
10.权利要求1的方法，进一步的特征在于所述的适宜容器是一种减小面积的96孔平底培养板。
11.一种检测化学或物理影响对卵泡产生的作用的方法，包含以下步骤·在至少一个细胞发育阶段，在所述的化学或物理影响存在下，进行权利要求1所述的卵泡培养，和·检测这些作用。
12.权利要求9的方法，其特征在于通过确认方法，确认卵母细胞质量，来检测所述的作用，确认方法选自IVF分级、受精后和移植后发育能力的分级、纺锤体染色、细胞器分析、染色体分析或其组合。
13.权利要求9的方法，其特征在于通过确认方法分析卵泡发生的质量，来检测所述的作用，确认方法选自增殖分析、分化分析、类固醇的产生、粘液化或其组名。
14.权利要求11至13中任何一项的方法，其进一步特征在于所存在的所述化学或物理影响于整个卵泡培养期间是连续或不连续的。
全文摘要
本发明涉及体外培养用于生物测定的哺乳动物卵泡的方法，它包括以下连续的步骤提供了用于体外培养的一种适宜的容器；从哺乳动物的卵巢中选择卵泡，所述的卵泡至少包含卵泡膜细胞或卵泡前膜细胞，粒膜细胞和卵母细胞；可选的第一个培养步骤，在这一步骤中使用附着物抑制无油的第一培养基；第二个培养步骤，这一步骤使用附着物促进无油的第二培养基；以及回收成熟的卵泡。
文档编号G01N33/53GK1916165SQ20061009080
公开日2007年2月21日 申请日期2001年12月11日 优先权日2000年12月13日
发明者R·库特夫林特, J·史密兹 申请人:Vrije布鲁塞尔大学