专利名称：：能在体内或体外改变卵泡生长的卵母细胞因子的核苷酸序列和氨基酸序列的制作方法
技术领域：
：本发明涉及在体内或体外改变卵泡生长的卵母细胞因子的核苷酸序列和氨基酸序列。本发明还涉及新的同二聚体多肽和异二聚体多肽以及它们在体内或体外改变哺乳动物卵泡生长的用途。具体地，本发明广泛涉及针对这些同或异二聚体多肽或其功能性片段或变体的主动或被动免疫，从而能在体内或体外改变卵泡生长。
背景技术：
：目前对负责刺激卵泡发生的早期相(即原始卵泡向初级，次级，和前囊状卵泡的生长和分化)的调节分子了解不多。另一方面，卵泡刺激素(FSH)和黄体化激素都是源自垂体的糖蛋白激素。一般被作为调节卵泡发生的晚期相的关键因素。FSH还作为刺激超正常数量的卵泡排卵的单个最重要因素，如目前在医学和兽医学中将商品化的FSH制剂广泛应用于卵巢过度刺激方案中。近期研究表明，早期的卵泡发生受到卵巢内因子的控制，其中源自粒层细胞的干细胞因子(c-kit配体)和源自卵母细胞的生长分化因子-9(GDF-9)最受重视，因为它们都很可能是哺乳动物卵泡发生的早期所必需的。GDF-9首先是在1993年，作为转化生长因子β(TGF-β)超家族中特异性表达在卵巢内的一种新成员而被描述的(McPherron和Lee，1993)。与TGF-β家族中其它成员相似，GDF-9被编码成一种前原肽，其组成为信号肽，原区，和所谓的C-末端成熟区，该成熟区可通过属于弗林蛋白酶样蛋白酶组的一种细胞内蛋白酶从前体肽上切割下来。TGF-β家族的生长因子的特征是，几乎在该家族所有成员中都有的成熟区内可以找到一种共有的半胱氨酸残基模式；这是TGF-β家族成员的单体形式中，一种被称为“半胱氨酸结(cysteineknot)”的刚性分子内结构，它由6个Cys残基组成3个特征性二硫桥(Daopin等，1992；Schlunegger和Grutter，1992和1993；Griffith等，1996；Scheufler等，1999)。TGF-β绝大多数成员都具有保守的第七Cys残基，它负责使两个相同的单体共价结合成同二聚体，或者使TGF-β家族的一种成员与该家族另一种成员形成异二聚体。在小鼠中，GDF9从卵泡发育的初期直到排卵期都在卵母细胞中表达(McGrath等，1995；Laitinen等，1998)。利用小鼠GDF-9序列作为测试序列在数据库中检索，我们从一种2-细胞小鼠胚胎库中鉴定出一种GDF-9样表达序列标签(EST)cDNA(Laitinen等，1998)。我们显示，这种新因子的转录物，GDF-9B，与GDF-9有55％同源性，它在小鼠卵巢卵母细胞中与GDF-9同时表达(Laitinen等，1998)。我们利用来自小鼠EST序列的引物，经过PCR从人的基因组DNA扩增得到相应基因片段，并将该基因定位在染色体Xp11.2，还从分离的粘粒克隆推导出人的GDF-9B的结构(Aaltonen等，1999)。有趣的是在人的卵巢中GDF-9mRNA的表达在初级卵泡中略早于GDF-9B(Aaltonen等，1999)。目前已克隆了小鼠和人的GDF-9B基因，将该基因编码的蛋白命名为骨形态发生蛋白15(BMP-15)(Dube等，1998)。GDF-9很可能是卵泡发生所必需的。从文献可知，GDF-9缺陷型小鼠(GDF-9-/-)都因卵泡发生的早期停滞而不育(Dong等，1996)。在GDF-9-/-卵巢中，在初级卵泡阶段，当一层立方形粒层细胞围绕卵母细胞时，卵泡发生停止。即使卵母细胞继续生长，但粒层细胞不能再增殖，伴随着卵泡增大也不再有膜细胞分化。Inverdale高生育力基因(FecXI)被鉴定为影响罗姆尼(Romney)羊群绵羊生育力的主要基因(Davis等，1991)。隔离分析表明，该基因位于X染色体上，携有该基因的单个拷贝(I/+)的母羊比未携带该基因的母羊(+/+)一窝多产仔大约0.6只羊羔。所生羊羔的数量增加直接与已改变的卵泡发育模式以及排卵率相对于野生型的-1.0而提高(Shackell等，1993；Davis等，1991)有关。相反，携有该基因的两个拷贝的纯合型母羊(I/I)都为不育者；因为它们的卵巢丧失了功能(Davis等，1992)。在(I/I)母羊的卵巢中，卵泡发生在初级卵泡阶段便停止，该表型与在GDF-9(-/-)小鼠中所见不同(Braw-Tal等，1993；McNatty等，1995；Smith等，1997)。第二个高产的罗姆尼羊群(Hanna，1995)也携有与Inverdale羊群表型相似的X-连锁的突变，但未发现它与Inverdale羊群有关联。将携带Inverdale的公羊与携带Hanna的母羊交配，得到无生育能力的雌性动物，由此证实，Hanna动物在与Inverdale相同的基因中包含突变(FecXH)(Davis等，1995)。这一Hanna品系在InvermayAgResearchCentre作为区别于Inverdale品系的另一个群体而被保留下来。在新西兰专利申请500844中，我们，本发明的发明人，在Inverdale绵羊中鉴定了一种位于GDF-9B基因的成熟肽加工位点远端(beyond)的核苷酸取代，它将密码子GTC(缬氨酸(V))转换为GAC(天冬氨酸(D))。我们还证实，在Hanna绵羊中，位于所述成熟肽加工位点远端的C核苷酸变成了T。这使得密码子CAG(编码谷氨酰胺(Q))转换成密码子TAG(编码终止)，从而产生截短的成熟蛋白。在Inverdale和Hanna中的这每一种突变都被认为是在纯合型Inverdale或Hanna母羊以及在Inverdale与Hanna杂交的母羊中，出现″条纹状(streak)″卵巢和不排卵情况的根本原因。此前已显示GDF-9-/-小鼠不育，表明GDF-9在某些哺乳动物中对正常生育力是很重要的。但是，随着相关的卵母细胞特异性因子GDF-9B的发现，我们又有了新的发现可以支持以下观点(1)GDF-9B在某些哺乳动物中是正常的卵泡发生所必需的；(2)GDF-9B在决定某些哺乳动物的排卵率方面起着十分关键的重要作用；(3)由于卵母细胞共表达GDF-9和GDF-9B，它们可协同促进卵泡发育和排卵率。总之，这些新假说仅因我们关于绵羊中Inverdale和HannaGDF-9B突变的发现而成为可能。本发明人首次测定了编码野生型蛋白的绵羊GDF-9B基因的全长基因结构，并显示它是在绵羊中维持正常的卵泡发生所必需的。本发明人还鉴定了Inverdale和Hanna绵羊中GDF-9B变体的全长基因结构，所述变体使得杂合型动物中排卵率高于正常水平，而纯合型动物不育。本发明涉及野生型和突变型GDF-9B全长序列和其变体，以及它们在调节哺乳动物生育力方面的应用。本说明书中引用的所有文献，包括专利或专利申请都是作为参考而引入。并非认可任何参考文献组成现有技术。这些参考文献中的讨论表明了它们的作者的观点，本申请人保留对所引用的文件的准确性和针对性进行争辩的权利。显然，尽管本文引用了多篇现有技术的出版物，但无论是在新西兰还是任何其它国家，这种引用并不意味着认可这些文件就是现有技术中公知常识的一部分。
发明内容相应地，本发明第一方面提供了一种分离的野生型GDF-9B核酸分子，它包含选自下组的核苷酸序列a)SEQIDNO1；b)能在严格条件下与a)所述分子杂交的序列；c)一种序列，其为a)所述分子的功能性变体或片段；d)与a)，b)或c)所定义的分子互补的序列；以及e)反义序列，对应于a)-d)中任一项所述分子。本发明第二方面提供了一种分离的突变的GDF-9B全长核酸分子，它包含选自下组的核苷酸序列a)SEQIDNO3或SEQIDNO5；b)能在严格条件下与a)所述分子杂交的序列；c)一种序列，其为a)所述分子的功能性变体或片段；d)与a)，b)或c)所定义的分子互补的序列；以及e)反义序列，对应于a)-d)中任一项所述分子。所述核酸分子可以是RNA，cRNA，基因组DNA或cDNA分子，而且可以是单链或双链形式。这样的核酸分子还可以选择包含一或多个人工合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基，或它们的组合。本发明第三方面提供了一种分离的全长GDF-9B多肽，它包含选自下组的氨基酸序列a)SEQIDNO2，SEQIDNO4，或SEQIDNO6；和b)按照a)所述的序列的功能性变体或片段；本发明第四方面提供了同二聚体成熟GDF-9B多肽，它具有含以下氨基酸序列的亚单位，所述序列选自SEQIDNO2或该序列的功能性片段或变体。本发明第五方面提供了异二聚体多肽，其具有选自下组的亚单位a)成熟的GDF-9B多肽，含有衍生自SEQIDNO2或该序列的功能性片段或变体的氨基酸序列；和b)成熟的GDF-9多肽或其功能性变体或片段。本发明第六方面提供了一种表达具有生物活性的经过加工的同二聚体GDF-9B多肽的方法，该方法包括以下步骤a)制备含有以下核酸分子的表达构建体，所述分子含有选自SEQIDNO1或该序列的功能性片段或变体的核酸序列；b)用上述构建体转染适当的细胞；c)选择稳定的克隆；和d)分离并纯化所表达的多肽。本发明第七方面提供了一种表达具有生物活性的经过加工的异二聚体GDF-9B和GDF-9多肽的方法，该方法包括以下步骤a)制备含有以下核酸分子的表达构建体，所述分子含有(i)选自SEQIDNO1或该序列的功能性片段或变体的核酸序列；(ii)编码GDF-9或其功能性片段或变体的核酸分子；b)用上述构建体转染适当的细胞；c)选择稳定的克隆；以及分离并纯化所表达的多肽。优选被转染的细胞是脊椎动物的细胞，但也可以使用其它类型的细胞。GDF-9的核酸和蛋白序列可以在公用数据库如GENbank和SWISS-PROT中找到。绵羊GDF-9核酸的登录号为AF078545，其蛋白登录号AAC28089。本发明还提供了一种重组表达载体，它含有本发明的DNA分子或其功能性变体，本发明还提供了用本发明的能表达本发明多肽的载体转化的宿主。本发明另一方面提供了能与本发明多肽结合的配体。最优选所述配体是一种抗体。术语“抗体”包含保留了结合本发明多肽的能力的抗体片段或类似物，包括但不限于Fv，F(ab)2片段，ScFv分子等。抗体可以是单克隆或多克隆，优选单克隆。在一些实施方案中，配体可以是针对本发明多肽的噬菌体展示分子、单个细胞表面受体或复合的细胞表面受体。所述多肽或态可以是单体，二聚体，异二聚体，多体或它们的变体。本发明第八方面提供了评估GDF-9B同二聚体和/或GDF-9B/GDF-9异二聚体的活性的方法，该方法包括以下步骤a)将有效量的GDF-9B同二聚体多肽；和/或GDF-9B/GDF-9异二聚体多肽加入到具有或不具有其它卵巢生长因子的卵巢细胞或器官培养物中，所述其它的卵巢生长因子如IGF-1和/或转化生长因子超家族的其它成员(如活化素，BMP2，TGFβ1)；和b)对上述细胞或器官培养物进行生物试验，以便评估上述同二聚体多肽和异二聚体多肽的生物活性。本发明第九方面提供了一种转基因动物模型，它可用于确定GDF-9B同二聚体和GDF-9B/GDF-9异二聚体的系统性生成(systemicproduction)对卵泡生长的影响。本发明第十方面提供了将GDF-9B表达盒或GDF-9表达盒，通过腺病毒、逆转录病毒或α病毒，转移至宿主细胞或生物，从而体内表达GDF-9B同二聚体或GDF-9B/GDF-9异二聚体的方法，该方法包括将含有表达盒的重组腺病毒转移至受者细胞、器官培养物或受体动物的步骤，其中所述表达盒含有一种核酸分子，该核酸分子具有选自SEQIDNO1或该序列的功能性片段或变体的核苷酸序列，并且该核酸分子与表达调控序列可操作地相连。本发明第十一方面提供了选自下组的制剂的用途a)一种同二聚体多肽，其具有含GDF-9B或其功能性变体或片段的亚单位，还有或不具有如下的同二聚体多肽，所述多肽具有含GDF-9多肽或其功能性变体或片段的亚单位；b)一种异二聚体多肽，其具有含GDF-9B多肽和GDF-9多肽、或者所述GDF-9B或GDF-9多肽的功能性片段或变体的亚单位；所述制剂还配有或未配有补加的促性腺激素(如FSH和/或LH)和/或其它卵巢生长因子，如IGF-1，kit配体(干细胞因子)，表皮生长因子或TGFβ超家族的成员(即，激动剂或拮抗剂)，所述用途是1)在体内或体外改变哺乳动物或其它脊椎动物卵巢中卵泡的生长；或ii)体外改变分离的卵巢细胞的生长/成熟(如卵母细胞-卵丘细胞和/或粒层细胞)。本发明第十二方面提供了一种组合物，它含有有效量的选自下组的制剂，以及可药用或兽用的载体(包括佐剂)或稀释剂；并任选包括补加的促性腺激素和/或其它相关的卵巢生长因子激动剂/拮抗剂a)一种同二聚体多肽，其具有含GDF-9B多肽或其功能性变体或片段的亚单位，还有或不具有如下的同二聚体多肽，所述多肽具有含GDF-9多肽或其功能性变体或片段的亚单位；b)一种异二聚体多肽，其具有含GDF-9B多肽和GDF-9多肽、或者所述GDF-9B或GDF-9多肽的功能性片段或变体的亚单位。本发明第十三方面提供了在体内改变雌性哺乳动物或其它雌性脊椎动物卵泡的生长的方法，该方法包括用GDF-9B和GDF-9表达盒转化哺乳动物和其它脊椎动物卵巢宿主细胞，使GDF-9B同二聚体和GDF-9B/GDF-9异二聚体过度表达。本发明第十四方面提供了在体外改变雌性哺乳动物或其它雌性脊椎动物卵泡的生长的方法，该方法包括用GDF-9B和GDF-9表达盒转化哺乳动物和其它脊椎动物卵巢宿主细胞，使GDF-9B同二聚体和GDF-9B/GDF-9异二聚体过度表达。本发明还有一方面提供了一种核酸分子，它包含选自下组的核苷酸序列SEQIDNO11，SEQIDNO13和SEQIDNO15，或所述序列的功能性片段或变体。本发明还有一方面提供了一种多肽，它包含选自下组的氨基酸序列SEQIDNO12和SEQIDNO16，或所述序列的功能性片段或变体。本发明另一方面提供了改变卵泡的生长的方法，该方法包括导入权利要求9-15中任一项所述的配体的步骤，以便ii)在体内或体外改变哺乳动物或其它脊椎动物卵巢中卵泡的生长；或iii)在体外改变分离的卵巢细胞的生长/成熟。优选地，所述哺乳动物选自绵羊、牛、山羊、鹿、猪、人、马、camelids、负鼠、猫和狗以及商业上重要的、具有基本上与本发明GDF-9B序列相同的GDF-9B基因的、其它任何物种。所述脊椎动物优选选自小鸡、鸭、鹅、鲑鱼和商业上重要的、具有基本上与本发明GDF-9B序列相同序列的、其它任何物种。具体地，本发明优选的方面将参照附图予以描述，附图中图1显示绵羊中野生型GDF-9B的核苷酸序列。图2显示图1的核苷酸序列的一部分，并指明Inverdale突变。图3显示图1的核苷酸序列的一部分，并指明Hanna突变。图4绵羊中野生型GDF-9B的推测氨基酸序列。图5显示图1的氨基酸序列的一部分，并指明Inverdale突变。图6显示图1的氨基酸序列的一部分，并指明Hanna突变。图7显示绵羊GDF-9B的信号序列多态性。图8显示绵羊中另外的上游ATG密码子。图9的照片显示卵母细胞中GDF-9B的位置。发明详述如上所述，本发明的主要焦点在于通过GDF-9B同二聚体和GDF-9B/GDF-9异二聚体的活性，在体外和体内调节卵泡的生长。术语“分离的”是指基本上从天然能产生所述核酸的细胞或生物所含的各种杂质序列中分离或纯化出来，包括经标准纯化技术纯化的核酸，通过重组技术(包括PCR技术)制备的核酸，以及化学合成的核酸。优选地，SEQIDNO1所示核酸分子分离自绵羊基因组DNA，SEQIDNO3和SEQIDNO5所示核酸分子分离自表达Inverdale或Hanna表型的绵羊的DNA。需要注意，绵羊GDF-9B的信号肽可能出现多态性(SEQIDNO7，SEQIDNO8)。预测的信号序列很可能大约有25个氨基酸长，正如用SignalP程序(SignalPV1.L，见http//genome.cbs.dtu.dk/services/SignalP)(Neilsen等，1997)预测的，在SEQIDNO7和SEQIDNO8中从ATG(Met)至ACA(Thr)。某些绵羊中发现缺失了3个碱基对，其中不含有两个CTT序列中的一个。因此，某些绵羊具有较短的信号序列，而大多数绵羊则具有全长信号序列。根据对Hanna，Hanna与Inverdale的杂交品系，Inverdale以及与Inverdale或Hanna有关或无关的野生型绵羊的研究，绝大多数绵羊是含有两个CTT的纯合子，而部分绵羊是含有一个CTT的杂合子。短型信号肽在美利奴(Merino)绵羊中较多见，而在罗姆尼绵羊中较少见，这表明，上述多态性可能与品系有关。绝大多数罗姆尼绵羊无论携带Inverdale还是Hanna，都携带较长的信号序列。尽管这种多态性还有待研究，但它不会影响或改变本发明的权利要求还需注意，在绵羊基因组DNA序列中，在GDF-9B的起始密码子ATG的上游27个核苷酸处，出现一个额外的“框内”ATG起始密码子(SEQIDNO9，SEQIDNO10)。该序列出现在所有被测序的绵羊中，不论野生型、Inverdale或Hanna携带者都有，而且显然与Inverdale和Hanna突变无关。目前尚不知，这一上游起始密码子是否用于绵羊的蛋白翻译阶段(SEQIDNO9，SEQIDNO10)。如果确实如此，它将产生另外9个氨基酸的信号序列。绵羊与其它哺乳动物在GDF-9B蛋白中的这种差异不太可能影响成熟蛋白的功能，因为上述分子的这一部分在有活性的成熟GDF-9B中被切除，但我们提到绵羊中可能存在另一蛋白翻译起始点。信号肽预测程序(Neilsen等，1997)显示，上述另外的9个氨基酸的序列可能具有信号肽的功能，而且信号肽的可能的端点仍然是SEQIDNO7和SEQIDNO8中所示的Thr(T)。本发明另一方面提供了一种分离的多肽，其选自氨基酸序列SEQIDNO2，SEQIDNO4和SEQIDNO6或其功能性变体，它们具有在雌性哺乳动物中调节卵泡生长的功能。所述多肽可以如下制备使得包含本发明核酸分子或其功能性变体的适当载体在适当的宿主细胞中表达。本领域技术人员对此能理解。本文中术语“变体”是指下述核苷酸序列和多肽序列，它们与SEQIDNOS1-6分别有至少50％同源性，优选与本发明的序列有75％同源性，更优选与本发明序列有90-95％同源性，只要这些变体具有本文所述的生物活性。变体可通过对天然核苷酸序列或氨基酸序列进行修饰而获得，也可以是天然产生的变体，所述修饰如插入、取代或缺失一或多个核苷酸或氨基酸。术语“变体”还包括能与本发明序列在本领域技术人员熟知的标准条件下，或优选在严格条件下杂交的同源序列。常用的原位杂交方法可参见(Tisdall等，1999)；(Juengel等，2000)。当需要这样的变体时，可相应地改变天然DNA的核苷酸序列。这种改变可通过选择性合成DNA或通过对天然DNA进行，例如，位点特异性诱变或盒式诱变而实现。优选地，当cDNA或基因组DNA的多个部分需要进行序列修饰时，用本领域标准技术进行位点特异性引物介导的诱变。核酸的“片段”是核酸的一部分，其比全长核酸短，并至少包含一段在下述严格条件下可与本发明核酸分子或其互补序列特异性杂交的最短序列。多肽的“片段”是多肽的一部分，其比全长多肽短，但仍然保留了本文所述的生物活性。术语“生物活性”是指本发明的能在哺乳动物或其它脊椎动物卵巢或卵巢细胞中表现出可检测的生理效应的多肽。所述生理效应可以通过诸如氚标记的胸腺嘧啶向粒层细胞中掺入的试验来测定。在一个这类试验的实例中，切出卵泡(直径1-2.5mm)，使其不带有分离自膜(theca)和卵母细胞卵丘复合体(oocytecumuluscomplexes)卵巢基质和粒层细胞。洗涤细胞，并将其重悬在新鲜培养基中，使其用于生物测定法的终浓度达到每孔100,000个活细胞，在有或没有多肽的条件下温育48小时。此时，测定氚标记的胸腺嘧啶的掺入量。术语“蛋白(或多肽)”是指由本发明核酸分子编码的蛋白，包括具有相同生物活性(即调节排卵的能力)的片段、突变体和同系物。本发明的多肽可从天然来源分离，通过重组核酸分子的表达产生，或者化学合成。术语“配体”是指能与另一分子(如多肽或肽)结合的任何分子，应包括，但不限于抗体，细胞表面分子和噬菌体展示分子。此外，与本发明的核苷酸序列和氨基酸序列基本相同的核苷酸或肽也可以应用在优选的实施方案中。这里所述的“基本相同”是指两种序列，当它们通过诸如GAP或BESTFIT(肽)程序用默认的缺口权重进行对比排列时，或者通过计算机算法BLASTX或BLASTP计算时，共享至少50％，优选75％，最优选90-95％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置是由保守氨基酸取代产生的不同。例如，具有类似的化学特性如荷电性或极性的氨基酸的取代不太可能影响蛋白的特性。非限制性实例包括用谷氨酰胺取代天冬酰胺，或者用谷氨酸取代天冬氨酸。本发明另一方面提供了适用于制备本发明多肽或肽的可复制型转移载体。这些载体可根据本领域已知技术构建，或者从本领域现有的克隆载体中筛选出来。克隆载体可以根据所使用的宿主或宿主细胞来选择。有效载体通常具备以下特征(a)自我复制的能力；(b)针对任何特定的限制性内切核酸酶具有唯一的靶点；以及(c)优选，携带编码易于筛选的标记(如抗生素抗性)的基因。具有这些特性的两种主要载体是质粒和细菌病毒(噬菌体)。目前优选的载体包括细菌载体，昆虫载体，或哺乳动物载体，如pUC，pBlueScript，pGEM，PGEX，pBK-CMV，λZAP，λGEM，pEFIRES-P，pUB6/V5/His，pBCl，pADTrack-CMV，pAdenovator，pAdEasy-1，pSFV-PD，pCA3，pBABE，pPIC9，pA0815，pET和pSP系列。但上述所列并非限制本发明的范围。优选的表达系统的实例如下1.体外细胞表达系统可以使用带有pEFIRES-P载体(HobbsS等，1998)从而赋予嘌呤霉素抗性的293T细胞系统。对两基因进行共表达时，可将上述载体的抗生素抗性基因改为博莱霉素抗性基因。或者，可通过构建三顺反子(tricistronic)表达载体，而实现两基因和上述选择基因的共表达。也可以使用相应的稳定转染型昆虫细胞系统，如使用“DES”载体表达系统的S2细胞系统；www.invitrogen.Com。2.关于在转基因动物的所有组织中表达GDF，一种方法是使用pUB6/V5-HisA载体(www.invitrogen.com)制备构建体。为了进行组织特异性表达，可以在该构建体中包含用于肝和肾的表达的大鼠PEPCK0.6kb启动子，方法是将pUB6/V5-HisA载体中的Ubi-C启动子用PEPCK启动子代替。在哺乳动物组织中表达GDF，优选使用另一启动子系统。这时，可以使用牛β-乳球蛋白基因启动子和/或牛αS1酪蛋白启动子(如pBCl载体，www.invitrogen.com)来驱动GDF表达到奶中。希望在转基因动物全身各处过度表达时，也可以使用CMV增强型β-肌动蛋白启动子(OkabeM，等；FEBSLetters407313-319，1997)或改良型EF1α-启动子(TaboitDameronF，等，TransgenicResearch8223-235，1998)。腺病毒，逆转录病毒和α病毒也是适合的哺乳动物表达系统。本领域技术人员常用的一种方法见(TCHe等，1998)。为了GDF的表达，可以使用pAdTrack-CMV载体或pAdenovator载体(www.qbiogene.com)制备构建体，然后将该构建体与pAdEasy-1腺病毒质粒共转化至大肠杆菌中，得到重组腺病毒基因组，它含有由CMV-启动子驱动的GDF表达盒。然后，将所述重组腺病毒基因组转染至293T细胞中，获得病毒原种。也可以使用其它获得腺病毒的方法实现相同的目的(如，基于PCA3质粒的基因转移(www.microbix.com)；或COS-TPC方法(MiyakeS等，1996)。3.表达GDF的非-致细胞病变塞姆利基森林病毒(SemlikiForestvirus)可以使用，例如，Lundstrom等，HistochemCellBiol1158391，2001所述的pSFV-PD载体来制备。此外，基于诸如pBABE载体的逆转录病毒表达系统可以用于在哺乳动物细胞中表达GDF(Morgenstern，JP和Land，H，1990；NucleicAcidsRes183587-3596)。4.酵母细胞(如，巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))是另一类本领域技术人员很熟悉的表达系统(CHadfield，等，1993)；(MARomanos等，1992)。例如，pPIC9载体(www.invitrogen.com)可以用在巴斯德毕赤酵母中，来表达GDF。优选用载体pA0815(www.invitrogen.com)来进行两基因的表达。5.大肠杆菌(Echerichiacoli，E.coli)是广泛应用的实验室标准表达系统。例如，pET表达系统(www.novagen.com)可以用于表达重组哺乳动物GDF-9和GDF-9B(steve.Lawrence@agresearch.co.nz)。本发明的DNA分子可通过与适当的调控序列可操作地连接在具有复制能力的表达载体中而被表达。调控序列可包括如复制起点，启动子，增强子和转录终止序列。对表达载体中包含的调控序列的选择取决于被用来表达所述DNA的宿主或宿主细胞的类型，本领域技术人员对此能理解。可用于本发明的表达载体包含至少一个表达调控序列，该调控序列与将要表达的DNA序列或片段可操作地连接。所述调控序列插入载体以便控制并调节所克隆的DNA序列的表达。可用的表达调控序列的实例如lac系统，trp系统，tac系统，trc系统，λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域，酵母酸性磷酸酶的糖酵解启动子(如Pho5)，酵母α接合因子的启动子，以及来源于多形瘤、腺病毒、反转录病毒、猿猴病毒和巨细胞病毒的启动子(如SV40的早期和晚期启动子)，以及其它已知可以控制原核和真核细胞和它们的病毒的基因表达的序列，或其组合。在载体的构建中，最好能鉴别携带插入了异源DNA的载体的细菌克隆。这类分析包括可检测的颜色变化，抗生素抗性等。一种优选的载体中使用了β-半乳糖苷酶基因，该基因通过在X-gal平板上有蓝色表型的克隆来检测。这便于进行选择。一旦选定，就可按照常规方法从培养物中分离载体。基于所使用的宿主，用适合于所述细胞的标准技术进行转化和转染。对于原核细胞或包含细胞壁实质的其它细胞，可使用钙处理方法(Cohen，SNProceedings，NationalAcademyofScience，USA692110(1972))。对于不具有这种细胞壁的哺乳动物细胞，优选Graeme和VanDerEb的磷酸钙沉淀法(Virology52546(1978))或脂质体试剂。当用合适的载体转化了选定的宿主后，通过培养宿主细胞，可产生所述被编码的多肽，它通常是融合蛋白的形式。本发明的多肽可通过上述快速分析来检测。然后根据需要回收并纯化这些多肽。回收和纯化可利用本领域任何已知方法进行，如吸附于阴离子交换树脂，并随后洗脱。这种产生本发明多肽的方法组成了本发明的另一方面。用本发明载体转化，转染或感染的宿主细胞(包括完整动物宿主)也形成本发明的又一方面。本发明还有一方面提供了能与本发明多肽或肽结合的抗体，抗体片段，细胞表面单个受体，或复合型细胞表面受体，或噬菌体展示分子。所述多肽或肽可以是它们的单体，二聚体，异二聚体，多体或变体。更具体地，本发明提供了制备抗体的方法，所述抗体针对野生型(SEQIDNO2)或突变型(SEQIDNO4和SEQIDNO6)GDF-9B多肽序列，所述多肽序列为单体，或同二聚体，或者与GDF-9组合成异二聚体。所述抗体可用于鉴定野生型内源蛋白，或肽片段以及表达的重组蛋白，或肽片段，还可用于对哺乳动物受体进行被动免疫，从而在其体内调节卵泡的生长。本发明还有一方面涉及，本发明多肽在制备用于检测其它GDF-9B-样多肽的抗血清中的用途。多克隆抗体可根据引入本文参考的(Koelle等，1991)所述方法制备。有效的抗体制备方案概述于美国专利5,514,578。单克隆抗体可通过本领域已知的方法制备。这些方法包括(Kohler和Milstein，1975)所述免疫学方法，以及(Huse等，1989)所述重组DNA方法。本发明还有一方面提供了在培养物和/或转基因动物的细胞中，操纵卵泡生长的方法。在培养的细胞或转基因动物中，通过过度表达GDF-9B同二聚体和GDF-9B/GDF-9异二聚体，可以改变特异性卵泡蛋白基因表达的时间和水平，例如，可将GDF-9B同二聚体或GDF-9B/GDF-9异二聚体的编码序列插入基因表达盒，使所述序列受控于特定启动子或者能在所有细胞类型中表达的启动子的控制之下(参见以下实施例)(组成型表达)。该表达盒还包含能稳定mRNA的3′侧翼DNA，还任选包含下游调节序列。可以将这种DNA盒引入哺乳动物基因组中，方法是将DNA显微注射至卵子的原核中(LHuillier等，1996)，然后将此受精卵重新放回受体动物体内，使它发育到足月。这种产生转基因动物的技术如(Hogan等，1996)所述。转基因动物可以如下产生转染来自胚胎，或胎儿，或成人组织的培养物中的细胞；然后通过核转移和胚胎转移而至受体动物。或者，可将上述基因盒与哺乳动物精子(sperm)结合，通过体外或体内受精而转移至卵子，由此产生非人类的转基因动物。对GDF-9B同二聚体或GDF-9B/GDF-9异二聚体的发育调节或表达水平的操纵，可用于改变卵泡蛋白的合成或生产的水平。本发明还包括基于腺病毒的基因治疗技术，用于在细胞培养物、器官培养物以及完整的实验动物中表达GDF-9B和GDF-9/GDF-9B，从而操纵卵泡蛋白的合成或生产。下面提供本发明的非限制性实施例。应理解，上述说明仅供举例，本领域技术人员已知的其它材料和方法都包括在本发明范围之内。实施例实施例1分离绵羊的野生型GDF-9BDNA并鉴定绵羊的突变型GDF-9BDNA序列将来自我们此前所克隆的人/小鼠/大鼠GDF-9B序列的寡核苷酸引物进行不同组合，用于对绵羊基因组DNA进行PCR，获得绵羊GDF-9B基因的片段，以备测序。用功能性引物对从阵列库(arrayedlibraries)中获得野生型绵羊基因组克隆，并从野生型绵羊的卵巢cDNA获得cDNA序列。通过对来自不同基因组DNA的相关PCR片段进行测序，获得了Inverdale和Hanna的全长编码区的序列。野生型GDF-9B的序列见SEQIDNO1，Inverdale的序列见SEQIDNO3，Hanna的序列见SEQIDNO5。实施例2制备特异性抗体并证实哺乳动物卵巢中的天然同二聚体GDF-9B和异二聚体GDF-9B/GDF-9蛋白。将本发明公开的核苷酸序列SEQIDNO1，SEQIDNO3，和SEQIDNO5或它们的变体，与能促使蛋白在大肠杆菌中表达的表达调控序列操作性连接，用于制备免疫哺乳动物或鸟类所需的抗原。另一种方法是，制备针对特异性肽序列的抗-肽抗体，所述肽来自SEQIDNO2，SEQIDNO4，SEQIDNO6或它们的变体。可以用标准方法(如ELISA)分析免疫反应性，和/或借此获得能识别GDF-9B同二聚体和GDF-9B/GDF-9蛋白异二聚体(来自天然来源以及过度表达各自重组蛋白的细胞/组织)的特异性IgG。发明人工作组此前的研究(如Aaltonen等(1999)和Jaatinen等，1999)表明，在啮齿动物和灵长类的前囊状(preantral)卵泡卵母细胞中存在GDF-9mRNA和蛋白。本文中，我们通过用小鼠抗体进行免疫细胞化学研究，而提供了绵羊卵巢中存在GDF-9B蛋白的证据(Fig.9)。所述免疫组织化学方法类似于Tisdall等(1999)Stemcellfactorandc-kitgeneexpressionandproteinlocalisationinthesheepovaryduringfetaldevelopment，JReprodFert116277-291所述。唯一不同之处在于本研究中还包括酪酰胺(tyramide)信号扩增步骤(TSABiotinSystem，NENLifeScienceProducts)。将大肠杆菌产生的绵羊GDF-9B成熟肽(0.2mg)在弗氏完全佐剂(FCA)中的制剂腹膜内注射(i.p.)，然后以2周的间隔，先用0.1mg抗原，随后用0.05mg抗原，i.p.加强免疫，所用抗原是在Span/Tween/油混合物中的制剂，末次加强免疫的1周后处死动物，收集血清，获得小鼠抗体M10。这些以及其它信息总体表明，GDF-9和GDF-9B的mRNA和蛋白都存在于哺乳动物的卵母细胞中(Aaltonen等，1999；Galloway等，2000)。针对特异性肽序列的抗肽抗体能影响哺乳动物卵巢的活性，相关证据见表1。表1在给予了含有针对匙孔嘁血蓝(KLH)偶联型GDF-9B肽的抗体的血浆后，绵羊的排卵率*p＜0.05(studentst-检验)在该项研究中，10只母羊用前列腺素F2α(Estrumate，125μgi.m.)使它们的发情周期(即排卵周期)同步。通过切除了输精管的公羊发现所有母羊都显示同步的发情期。在黄体期的第5天，5只母羊给药来自另一群母羊的混合血浆，所述另一群母羊已经每月一次用偶联了匙孔嘁血蓝(KLH)的15体GDF-9B肽连续免疫了7个月。这种混合血清含有高滴度的针对GDF-9B的抗体，可用大肠杆菌表达的全长GDF-9B作为抗原经过ELISA试验来测定。另外5只母羊给药针对KLH的混合血浆，该血浆来自另一个也已经每月一次、连续免疫了7个月的母羊群。来自这些动物的混合血浆不含有可以检测到的GDF-9B抗体。将上述免疫血浆稀释1∶50000后，用ELISA方法测量抗体水平。ELISA方法包括，用100ng/孔大肠杆菌表达的全长GDF-9B包被96孔板，经过适当的封闭处理和连续洗涤后，用100μl稀释的绵羊血浆和100μl试验缓冲液温育。用绵羊血浆温育并洗涤数次后，加入兔抗-绵羊-HRP，37℃温育1小时。然后洗孔，用邻苯二胺加过氧化氢显色，用硫酸终止显色反应。每只母羊静脉给予100ml无菌血浆，4天后给予第二剂前列腺素F2α以使发情期同步。在给药血浆的14天后，通过腹腔镜检来检查排卵率。我们的在先专利500844已经证实小鼠用大肠杆菌产生的成熟的绵羊GDF-9B免疫后，卵泡的发育明显波动。在此项研究中，10只雌性小鼠用大肠杆菌来源的绵羊GDF-9B成熟蛋白(0.2mg)在弗氏完全佐剂(FCA)中的制剂(0.2ml)经腹膜内(i.p.)免疫，另外10只雌性小鼠用牛α乳清蛋白(0.2mg)在FCA中的制剂(0.22ml)经腹膜内免疫作为对照。随后，以2周的间隔用相应抗原(第一次加强针为0.1mg，第2和第3次加强针为0.05mg)进行3次加强注射，所用抗原是在Span/Tween/油混合物中的制剂，末次加强注射的1周后处死动物。我们在此提供了，在这些被GDF-9B免疫的小鼠中，GDF-9和GDF-9B的外源生物活性很可能因为这些动物含有针对两种生长因子的交叉抗体而受到影响的证据(表2)。表2小鼠用牛α乳清蛋白或绵羊GDF-9B免疫后，血浆中平均(±s.e.m.)抗体水平。表中的值是490nm的吸光值，它代表了针对GDF-9B或GDF-9的抗体的水平。我们因此认为，能调节内源性GDF-9和GDF-9B的方法将改变卵巢的功能。支持我们这一观点(即调节同二聚体GDF-9B，或GDF-9与GDF-9B的同二聚体混合物或异二聚体)的进一步证据，是在我们对绵羊(3-5只/处理组)用KLH(对照)、偶联了KLH的GDF-9B肽、或偶联了KLH的GDF-9肽致敏后的新发现。使动物接受每月一次连续7个月的免疫，处死动物，回收卵巢，然后用标准的形态测定法评估卵巢体积以及1，1a和2型卵泡的数量(Smith等，1997)。此外还明示囊状卵泡的存在与否。结果见表3。表3用KLH、偶联了KLH的GDF-9B肽、或偶联了KLH的GDF-9肽免疫绵羊后的平均卵巢体积，以及1-2，3-4型卵泡和囊状卵泡的数量。这些研究中，GDF-9B肽的序列为SEVPGPSREHDGPESC(SEQIDNO17)，GDF-9肽序列为KKPLVPASVNLSEYFC(SEQIDNO18)。给罗姆尼母羊按照0.4mg/只母羊的剂量注射KLH或KLH-GDF-9B肽或KLH-GDF-9肽在弗氏完全佐剂中的制剂。随后按照每月一次再加强注射(s.c.)6次(0.2mg/只母羊/次)，所用抗原为在Span/Tween/油混合物中的制剂。结果显示与对照(KLH免疫)相比(1)GDF-9-KLH和GDF-9B-KLH免疫分别能抑制囊状卵泡的发育，从而证实，GDF-9和GDF-9B都是某些动物中正常卵泡发育所必需的。实施例3重组同二聚体GDF-9B和异二聚体GDF-9B/GDF-9蛋白在哺乳动物细胞中的体外和体内表达。将表达构建体转染/转移至哺乳动物细胞，用抗生素选择标记筛选稳定克隆，所述表达构建体在质粒载体上，该构建体含有本发明公开的核苷酸序列SEQIDNO1，SEQIDNO3，和SEQIDNO5或它们的变体，这些序列与表达调控序列(CMV，EF1，和哺乳动物特异性启动子序列)可操作地相连。为了优化对表达的重组多肽序列的加工，使弗林蛋白酶加工位点突变，导入一个辅助表达盒，它在生产型细胞中驱动弗林蛋白酶的过度表达。我们制备了用pEFIRES-P载体转化的人类293T细胞系，作为产生oGDF-9B同二聚体蛋白的有效哺乳动物表达系统的实例，这种载体含有与大鼠GDF-9B原区融合的绵羊GDF-9B成熟区序列(SEQIDNO1和NO2)(Jaatinen等，Mol细胞Endocrinol.156189-93，1999)。弗林蛋白酶加工位点已经经过改造，使其含有被有效切割的RRRR序列。选出能耐受120-150μg/ml嘌呤霉素的细胞，在不含血清的HamF12/DMEM中培养4天，以便在上清中产生绵羊GDF-9B，随后在实施例4所述的生物测定法中使用。为获得绵羊GDF-9B与GDF-9发生物理性异二聚体化的生物化学证据，使用了以下方法。一种类似上述的大鼠/绵羊嵌合型GDF-9B开放读框在C末端含有8个氨基酸的FLAG表位，将该读框克隆至pSFV-PD塞姆利基森林病毒载体，在BHK细胞中获得了SFV-PD-oGDF-9B-FLAG的高滴度原种，如Lundstrom等，HistochemcellBiol11583-91，2001所述。高滴度SFV-PD-oGDF-9B-FLAG被视为能十分有效地感染人的293T细胞，并能在这些细胞中高水平表达oGDF-9B-FLAG。感染后，在4天的培养期间，经过加工的oGDF-9B-FLAG被分泌至培养基中，在用抗-FLAGM2抗体进行的Western印迹中可以清楚地观察到，它是一条18kd的带。用包含编码前原GDF-9多肽的开放读框的pEFIRES-P载体制备另一种293T细胞系，用来共表达绵羊GDF-9B-FLAG和绵羊GDF-9。亲代293T细胞和能稳定表达oGDF-9的293T细胞用等量的SFV-PD-oGDF-9B-FLAG病毒感染，培养4天后收集上清。用1ml来自未感染细胞以及被SFV-PD-oGDF-9B-FLAG感染的细胞的上清，与1μg/ml抗FLAG-M2抗体进行免疫沉淀，用蛋白G琼脂糖回收复合物。在Western印迹中用抗-FLAG-M2抗体和抗GDF-9抗体评估洗脱物。尽管抗FLAGM2抗体不与绵羊GDF-9反应，但在已经被SFV-PDoGDF-9B-FLAG病毒感染的GDF-9表达细胞的上清液中，能观察到一种免疫反应性20kd的GDF-9成熟肽，它能与抗FLAGM2抗体发生免疫沉淀。这些共免疫沉淀实验表明，重组表达的绵羊GDF-9B与GDF-9存在直接物理性相互作用，还证实存在绵羊GDF-9/GDF-9B异二聚体。本文还描述了在转基因动物的数个卵巢外部位过度表达本发明公开的核苷酸序列SEQIDNO1，SEQIDNO3，和SEQIDNO5或它们的变体的多种方法，以便模拟重组同二聚体GDF-9B和异二聚体GDF-9B/GDF-9蛋白的系统性给药。相关的GDF编码序列可以分别表达或与表达调控序列可操作相连后共表达。GDF-9B同二聚体和GDF-9B/GDF-9异二聚体对这些转基因动物中卵泡的生长的影响，可以通过形态测定法或激素分析来评估。该途径提供了一种改变转基因动物中排卵率的通用方法。通过乳腺的过度表达而在奶中产生GDF，这提供了另一种生产大量医用或药用试剂的方法。该方法对转基因动物的健康无损，因为未观察到与其相关的禁忌症。本发明还描述了将重组腺病毒中的表达盒有效转移至受体细胞或器官培养物或受体动物，从而在体外或体内改变卵泡生长的方法，所述表达盒由本发明公开的核苷酸序列SEQIDNO1，SEQIDNO3，和SEQIDNO5或它们的变体与表达调控序列(CMV启动子)可操作地连接在重组腺病毒中而形成。例如，所述方法允许用携带GDF-9B和GDF-9表达盒的腺病毒对哺乳动物受体进行系统性感染并集中在宿主肝脏，还允许肝脏衍生的高水平重组蛋白释放至循环系统中。对卵泡生长的影响可通过以下一或多项标准来评估腹腔镜检，形态测定法，或激素分析。可以用α病毒或逆转录病毒实现GDF-9B和GDF-9序列和转录单位的类似的体内经病毒转移，并获得相应的转录单位。这些病毒性方法提供了体内检验不同的GDF-9B和GDF-9基因构建体生物活性的方式，还提供了另外的使动物被GDF-9B和GDF-9致敏的方法。实施例4测量同二聚体GDF-9B和异二聚体GDF-9B/GDF-9蛋白在卵巢细胞培养物中的生物活性。为了评估本发明公开的核苷酸序列SEQIDNO1，SEQIDNO3，和SEQIDNO5或它们的变体表达的蛋白的生物活性，使用卵巢细胞和器官培养物模型。评估同二聚体GDF-9B的生物活性的实例见下表4，它通过测定分离的绵羊粒层细胞在37℃温育48小时期间，[3H]胸腺嘧啶的掺入量，来评估部分纯化的重组(r)绵羊(o)GDF-9B提取物。结果显示，roGDF-9B使粒层细胞的氚标记胸腺嘧啶的掺入量增加1.9倍，表明roGDF-9B具有生物活性。为了获得粒层细胞，从母羊收获卵巢，剥离卵泡(1-2.5mm直径)，分离所述细胞并使之与膜和卵母细胞-卵丘复合体隔离。洗涤所述细胞，将其重悬于新鲜培养基中，使得用于生物测定法的终浓度为1×105活细胞/孔。表4绵羊(o)粒层细胞暴露于roGDF-9B或培养基对照以后，[3H]胸腺嘧啶掺入量的平均增加值±s.e.m.(每项实验的例数n＝3)RoGDF-9B由转染的293T细胞产生，通过肝素-sepharose层析进行部分纯化，用0.5MNaCl洗脱，用组织培养基透析过夜。该项实验的对照是暴露于未转染的293T细胞、并经过肝素-sepharose层析、NaCl洗脱和透析的培养基。***P＜0.001，ANOVA讨论已知的人的GDF-9B序列及其衍生的寡核苷酸引物，使得本发明人能测定绵羊GDF-9B的基因组序列和cDNA序列，并能评估在绵羊卵巢中GDF-9B转录物的表达(Galloway等，2000)。根据文献，GDF-9似乎是粒层细胞的分裂和膜细胞的分化所必需。事实上，重组大鼠GDF-9在体外刺激大鼠卵泡的生长(Hayashi等，1999)以及培养的大鼠粒层细胞的增生(Vitt等，2000)。重组GDF-9还调节小鼠和大鼠粒层细胞中胆固醇的生成和促性腺激素受体的表达(Elvin等，1999；Vitt等，2000)。此外，GDF-9刺激人类粒层细胞培养中抑制素B的生成(Vuojolainen等，inpreparation)。这些近期研究清楚表明，GDF-9同二聚体在多种动物中对卵泡的生长和分化有很明显的影响，但直到本文所述的本发明之前，对卵巢中GDF-9B可能的生物学效应一无所知。在我们的在先新西兰专利说明书500844号中，本发明人证实，Inverdale基因经过作图而定位在绵羊X-染色体上含有与人类Xp11.2-11.4同线的基因的区域(Galloway等，2000)，本发明人还测定了在这些动物中GDF-9B基因是否受到影响，结果表明，Inverdale基因事实上是绵羊GDF-9B基因的灭活形式。在Inverdale动物中，成熟肽加工位点远端(beyond)第92位的核苷酸T变成残基A，使密码子GTC变成GAC，导致缬氨酸(V)被天冬氨酸(D)取代。在TGF-β家族的所有成员中，这一特定氨基酸可以是缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，它们都有疏水残基，而天冬氨酸则带有负电荷。这种氨基酸取代导致该分子中与二聚化过程有关的特定区域的表面电荷改变，这一点可由TGF-β2，BMP-2和BMP-7的晶体结构证实(Schlunegger和Grutter，1993；Griffith等，1996；Scheufler等，1999)。新西兰专利500844还提供证据表明，在另一个绵羊群体，Hanna绵羊中鉴定了另一种GDF-9B基因突变，而这种绵羊群体与Inverdale母羊具有实质上相同的杂合型和纯合型基因携带表型。Hanna动物中，那些在成熟肽加工位点远端第67位核苷酸上具有C→T点突变的绵羊在谷氨酰胺(Q)残基的位置上导入了一个提前终止密码子。这一改变导致成熟肽区的严重截短，使蛋白产物失活。Inverdale与Hanna家族的杂交产生50％的不育母羊，这说明两种突变都显然能使GDF-9B基因的产物失活。参考文献AaltonenJ，LaitinenM，VuojolainenK，JaatinenR，Horelli-KuitunenN，SeppaL，LouhioH，TuuriT，SjobergJ，ButzowR，HovattaO，DaleL，RitvosOHumangrowthdifferentiationfactor-9(GDF-9)anditsnovelhomologGDF-9Bareexpressedduringearlyfolliculogenesis.JClinEndocrinolMetab842744-2750，1999Braw-TalR，McNattyKP，SmithP，HeathDA，HudsonNL，PhillipsDJ，McLeodBJ，DavisGHOvariesofeweshomozygousfortheX-linkedInverdalegene(FecXI)aredevoidofsecondaryandtertiaryfolliclesbutcontainmanyabnormalstructures.BiolReprod49895-907，1993.CHadfield，KKRaina，KShashi-Menon，RCMount(1993)Theexpressionandperformanceofclonedgenes.YeastMycolRes9，897-944DaopinS，PiezKA，OgawaY，DaviesDRCrystalstructureoftransforminggrowthfactor-beta2anunusualfoldforthesuperfamily.Science257369-373，1992.DavisGH，McEwanJC，FennessyPF，DoddsKG，FarquharPAEvidenceforthepresenceofamajorgeneinfluencingovulationrateontheXchromosomeofsheep.BiolReprod44620-624，1991.DavisGH，McEwanJC，FennessyPF，DoddsKG，McNattyKP，OWSInfertilityduetobilateralovarianhypoplasiainsheephonozygous(FecXIFecXI)fortheInverdaleprolificacygenelocatedontheXchromosome.BiolReprod46636-640，1992DavisGH，McEwanJC，FennessyPF，DoddsKGDiscoveryoftheInverdalegene(FecX).ProcNZSocAnimProd95289-290，1995.DongJ，AlbertiniDF，NishimoriK，KumarTR，LuN，MatzukMMGrowthdifferentiationfactor-9isrequiredduringearlyovarianfolliculogenesis，Nature383531-535，1996DubeJL，WangP，ElvinJ，LyonsKM，CelesteAJ，MatzukMMThehonemorphogeneticprotein15geneisX-linkedandexpressedinoocytes.MolEndocrinol121809-1817，1998ElvinJA，ClarkAT，WangP，WolfmanNM，MatzukMMParacrineactionsofgrowthdifferentiationfactor-9inthemammalianovary.MolEndocrinol131035-1048，1999GallowaySM，McNattyKP，CambridgeLM，LaitinenMPE，JuengelJL，JokirantaTS，McLarenRJ，LuiroK，DoddsKG，MontgomeryGW，BeattieAE，DavisGH，RitvosOMutationsinanoocyte-derivedgrowthfactorgene(BMP15)causeincreasedovulationrateandinfertilityinadosage-sensitivemanner，NatureGenetics25279-283，2000.GriffithDL，KeckPC，SampathTK，RuegerDC，CarlsonWDThree-dimensionalstructureofrecombinanthumanosteogenicprotein1structuralparadigmforthetransforminggrowtbfactorbetasuperfamily.ProcNatlAcadSciUSA93878-883，1996.HannaMMLivingwiththeInverdalegene(FecX)inaRomneyflock.ProcNZSocAnimProd55296-297，1995.HayashiM，McGeeEA，MinG，KleinC，RoseUM，vanDuinM，HsuehAJRecombinantgrowthdifferentiationfactor-9(GDF-9)enhancesgrowthanddifferentiationofculturedearlyovarianfollicles.Endocrinology1401236-1244，1999HobbsS，JitrapakdeeS，WallaceJC(1998)Developmentofabicistronicvectordrivenbythehumanpolypeptidechainelongationfactor1alphapromoterforcreationofstablemammaliancelllinesthatexpressveryhighlevelsofrecombinantproteins.BiochemBiophysResCommun252，368-372Hoganetal(1；InManipulatingthemouseembryo，ColdSpringHarborLaboratory.Press1996)Huseetal.，Science2461275-1281(1989).Koelleetal.，Cell6759-77，1991.KohlerandMilsteininNature256495-497(1975).Juetgeletal.(2000)GeneexpressioninabnormalovarianstructuresofeweshomozygousfortheInverdaleprolificacygene，BiolReprod，62，1467-1478.LaitinenM，VuojolainenK，JaatinenR，KetolaI，AaltonenJ，LehtonenE，HeikinheimoM，RitvosOAnovelgrowthdifferentiationfactor-9(GDF-9)relatedfactorisco-expressedwithGDF-9inmouseoocytesduringfolliculogenesis.MechDev78135-140，1998LHuillieretalPNAS93；6698-6703(1996)MARomanos，CAScorer，JJCIare(1992)Foreigngeneexpressioninyeastareview.Yeast8，423-488.McGrathSA，EsquelaAF，LeeSJOocyte-specificexpressionofgrowthdifferentiationfactor-9.MolEndocrinol9131-136，1995.McNattyKP，SmithP，HudsonNL，HeathDA，TisdallDJ，OWS，Braw-TalRDevelopmentofthesheepovaryduringfetalandearlyneonatallifeandtheeffectoffecunditygenes.JReprodFertilSuppl49123-135，1995.McPherronAC，LeeSJGDF-3andGDF-9twonewmembersofthetransforminggrowthfactor-betasuperfamilycontaininganovelpatternofcysteines.JBiolChem2683444-3449，1993MiyakeS，MakimuraM，KanegaeY，HaradaS，SatoY，TakamoriK，TokudaC，SaitoI.EfficientgenerationofrecombinantadenovirusesusingadenovirusDNA-terminalproteincomplexandacosmidbearingthefull-lengthvirus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atttcaatgacactcagagtgtt1575LeuAspThrValPheLeuLeuLeuTyrPheAsnAspThrGlnSerVal-40-35-30cagaagaccaaacctctccctaaaggcctgaaagagtttacagaaaaa1623GlnLysThrLysProLeuProLysGlyLeuLysGluPheThrGluLys-25-20-15gacccttctcttctcttgaggagggctcgtcaagcaggcagtattgca1671AspProSerLeuLeuLeuArgArgAlaArgGlnAlaGlySerIleAla-10-5-115tcggaagttcctggcccctccagggagcatgatgggcctgaaagtaac1719SerGluValProGlyProSerArgGluHisAspGlyProGluSerAsn101520cagtgttccctccacccttttcaagtcagcttccagcagctgggctgg1767GlnCysSerLeuHisProPheGlnValSerPheGlnGlnLeuGlyTrp253035gatcactggatcattgctccccatctctataccccaaactactgtaag1815AspHisTrpIleIleAlaProHisLeuTyrThrProAsnTyrCysLys404550ggagtatgtcctcgggtactacactatggtctcaattctcccaatcat1863GlyValCysProArgValLeuHisTyrGlyLeuAsnSerProAsnHis55606570gccatcatccagaaccttgtcagtgagctggtggatcagaatgtccct1911AlaIleIleGlnAsnLeuValSerGluLeuValAspGlnAsnValPro758085cagccttcctgtgtcccttataagtatgttcccattagcatccttctg1959GlnProSerCysValProTyrLysTyrValProIleSerIleLeuLeu9095100attgaggcaaatgggagtatcttgtacaaggagtatgagggtatgatt2007IleGluAlaAsnGlySerIleLeuTyrLysGluTyrGluGlyMetIle105110115gcccagtcctgcacatgcaggtgacggcaaaggtgca2044AlaGlnSerCysThrCysArg120125<210>2<211>393<212>PRT<213>土耳其盘羊(Ovisaries)<220><221>misc_feature<222>(235)..(237)<223>atg起始密码子<220><221>misc_feature<222>(208)..(210)<223>与5’atg密码子在同一读码框中<220><221>misc_feature<222>(784)..()<223>n代表大约5.4kb的未测序的内含子<220><221>misc_feature<222>(2029)..(2031)<223>tga终止密码子<400>2MetValLeuLeuSerIleLeuArgIleLeuLeuTrpGlyLeuVal-265-260-255LeuPheMetGluHisArgValGlnMetThrGlnValGlyGlnPro-250-245-240SerIleAlaHisLeuProGluAlaProThrLeuProLeuIleGln-235-230-225GluLeuLeuGluGluAlaProGlyLysGlnGlnArgLysProArg-220-215-210ValLeuGlyHisProLeuArgTyrMetLeuGluLeuTyrGlnArg-205-200-195SerAlaAspAlaSerGlyHisProArgGluAsnArgThrIleGly-190-185-180AlaThrMetValArgLeuValArgProLeuAlaSerValAlaArg-175-170-165ProLeuArgGlySerTrpHisIleGlnThrLeuAspPheProLeu-160-155-150ArgProAsnArgValAlaTyrGlnLeuValArgAlaThrValVal-145-140-135TyrArgHisGlnLeuHisLeuThrHisSerHisLeuSerCysHis-130-125-120ValGluProTrpValGlnLysSerProThrAsnHisPheProSer-115-110-105SerGlyArgGlySerSerLysProSerLeuLeuProLysThrTrpThr-100-95-90GluMetAspIleMetGluHisValGlyGlnLysLeuTrpAsnHisLys-85-80-75GlyArgArgValLeuArgLeuArgPheValCysGlnGlnProArgGly-70-65-60SerGluValLeuGluPheTrpTrpHisGlyThrSerSerLeuAspThr-55-50-45-40ValPheLeuLeuLeuTyrPheAsnAspThrGlnSerValGlnLysThr-35-30-25LysProLeuProLysGlyLeuLysGluPheThrGluLysAspProSer-20-15-10LeuLeuLeuArgArgAlaArgGlnAlaGlySerIleAlaSerGluVal-5-115ProGlyProSerArgGluHisAspGlyProGluSerAsnGlnCysSer10152025LeuHisProPheGlnValSerPheGlnGlnLeuGlyTrpAspHisTrp303540IleIleAlaProHisLeuTyrThrProAsnTyrCysLysGlyValCys455055ProArgValLeuHisTyrGlyLeuAsnSerProAsnHisAlaIleIle606570GlnAsnLeuValSerGluLeuValAspGlnAsnValProGlnProSer758085CysValProTyrLysTyrValProIleSerIleLeuLeuIleGluAla9095100105AsnGlySerIleLeuTyrLysGluTyrGluGlyMetIleAlaGlnSer110115120CysThrCysArg125<210>3<211>1195<212>DNA<213>土耳其盘羊(Ovisaries)<220><221>CDS<222>(1)..(1179)<220><221>misc_feature<222>(325)..(326)<223>内含子在基因组序列中的位置<220><221>misc_feature<222>(793)..(804)<223>弗林蛋白酶切割序列<220><221>mat_peptide<222>(805)..()<220><221>misc_feature<222>(896)..()<223>Inverdale突变的位置<400>3atggtcctcctgagcatccttagaatccttctttggggactggtg45MetValLeuLeuSerIleLeuArgIleLeuLeuTrpGlyLeuVal-265-260-255ctttttatggaacatagggtccaaatgacacaggtagggcagccc90LeuPheMetGluHisArgValGlnMetThrGlnValGlyGlnPro-250-245-240tctattgcccacctgcctgaggcccctaccttgcccctgattcag135SerIleAlaHisLeuProGluAlaProThrLeuProLeuIleGln-235-230-225gagctgctagaagaagcccctggcaagcagcagaggaagccgcgg180GluLeuLeuGluGluAlaProGlyLysGlnGlnArgLysProArg-220-215-210gtcttagggcatcccttacggtatatgctggagctgtaccagcgt225ValLeuGlyHisProLeuArgTyrMetLeuGluLeuTyrGlnArg-205-200-195tcagctgacgcaagtggacaccctagggaaaaccgcaccattggg270SerAlaAspAlaSerGlyHisProArgGluAsnArgThrIleGly-190-185-180gccaccatggtgaggctggtgaggccgctggctagtgtagcaagg315AlaThrMetValArgLeuValArgProLeuAlaSerValAlaArg-175-170-165cctctcagaggctcctggcacatacagaccctggactttcctctg360ProLeuArgGlySerTrpHisIleGlnThrLeuAspPheProLeu-160-155-150agaccaaaccgggtagcataccaactagtcagagccactgtggtt405ArgProAsnArgValAlaTyrGlnLeuValArgAlaThrValVal-145-140-135taccgccatcagcttcacctaactcattcccacctctcctgccat450TyrArgHisGlnLeuHisLeuThrHisSerHisLeuSerCysHis-130-125-120gtggagccctgggtccagaaaagcccaaccaatcactttccttct495ValGluProTrpValGlnLysSerProThrAsnHisPheProSer-115-110-105tcaggaagaggctcctcaaagccttccctgttgcccaaaacttggaca543SerGlyArgGlySerSerLysProSerLeuLeuProLysThrTrpThr-100-95-90gagatggatatcatggaacatgttgggcaaaagctctggaatcacaag591GluMetAspIleMetGluHisValGlyGlnLysLeuTrpAsnHisLys-85-80-75gggcgcagggttctacgactccgcttcgtgtgtcagcagccaagaggt639GlyArgArgValLeuArgLeuArgPheValCysGlnGlnProArgGly-70-65-60agtgaggttcttgagttctggtggcatggcacttcatcattggacact687SerGluValLeuGluPheTrpTrpHisGlyThrSerSerLeuAspThr-55-50-45-40gtcttcttgttactgtatttcaatgacactcagagtgttcagaagacc735ValPheLeuLeuLeuTyrPheAsnAspThrGlnSerValGlnLysThr-35-30-25aaacctctccctaaaggcctgaaagagtttacagaaaaagacccttct783LysProLeuProLysGlyLeuLysGluPheThrGluLysAspProSer-20-15-10cttctcttgaggagggctcgtcaagcaggcagtattgcatcggaagtt831LeuLeuLeuArgArgAlaArgGlnAlaGlySerIleAlaSerGl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erProAsnHisAlaIleIleGlnAsnLeuVal657075AsnGluLeuValAspGlnSerValProGlnProSerCysValProTyr808590LysTyrValProIleSerIleLeuLeuIleGluAlaAsnGlySerIle95100105LeuTyrLysGluTyrGluAspMetIleAlaGlnSerCysThr110115120<210>13<211>857<212>DNA<213>马鹿(Cervuselaphus)<220><221>CDS<222>(3)..(854)<220><221>mat_peptide<222>(480)..()<400>13gctcctggcacatacagaccctggactttcctctgagaccaaaccgg47SerTrpHisIleGlnThrLeuAspPheProLeuArgProAsnArg-155-150-145gtagcctaccaactagtcagagccactgtggtttaccgccatcaa92ValAlaTyrGlnLeuValArgAlaThrValValTyrArgHisGln-140-135-130cttcacctaactcattcccacctctcctgccatgtggagccctgg137LeuHisLeuThrHisSerHisLeuSerCysHisValGluProTrp-125-120-115atccagaaaagcccaaccagtcactttccttcttcaggaagaggc182IleGlnLysSerProThrSerHisPheProSerSerGlyArgGly-110-105-100tcctcaaagccttccctgctgcccaaagcttggacagagatggatatc230SerSerLysProSerLeuLeuProLysAlaTrpThrGluMetAspIle-95-90-85atggaacatgttggacaaaagctgtggaatcgcaaggggcgcagggtt278MetGluHisValGlyGlnLysLeuTrpAsnArgLysGlyArgArgVal-80-75-70ctacgactccgcttcatgtgtcagcagccaagaggtagtgaggttctt326LeuArgLeuArgPheMetCysGlnGlnProArgGlySerGluValLeu-65-60-55gagttctggtggcatggcacttcatcattggacactgtcttcttgtta374GluPheTrpTrpHisGlyThrSerSerLeuAspThrValPheLeuLeu-50-45-40ctgtatttcaatgacactcagagtgttcagaagaccaaacctctccct422LeuTyrPheAsnAspThrGlnSerValGlnLysThrLysProLeuPro-35-30-25-20aaaggcctgaaagagtttacagaaaaagacccttctcttctcttgagg470LysGlyLeuLysGluPheThrGluLysAspProSerLeuLeuLeuArg-15-10-5agggctcgtcaagcaggcagtatcgcatctgaagttcctggcccctcc518ArgAlaArgGlnAlaGlySerIleAlaSerGluValProGlyProSer-11510agggagcatgatgggcctgaaagtaaccagtgttccctccaccctttt566ArgGluHisAspGlyProGluSerAsnGlnCysSerLeuHisProPhe152025caagtcagcttccagcagctgggctgggatcactggatcattgctccc614GlnValSerPheGlnGlnLeuGlyTrpAspHisTrpIleIleAlaPro30354045aatctctataccccaaactactgtaagggagtgtgtcctcgggtacta662AsnLeuTyrThrProAsnTyrCysLysGlyValCysProArgValLeu505560cactatggtctcaattctcccaatcatgccatcatccagaaccttgtc710HisTyrGlyLeuAsnSerProAsnHisAlaIleIleGlnAsnLeuVal657075aatgagctggtggatcagagtgtccctcagccttcctgtgtcccttat758AsnGluLeuValAspGlnSerValProGlnProSerCysValProTyr808590aagtatgttcccattagcatcctgctgattgaggcaaatgggagtatc806LysTyrValProIleSerIleLeuLeuIleGluAlaAsnGlySerIle95100105ttgtacaaggagtatgagggtatgattgcccagtcctgcacatgcagg854LeuTyrLysGluTyrGluGlyMetIleAlaGlnSerCysThrCysArg110115120125tga857<210>14<211>284<212>PRT<213>马鹿(Cervuselaphus)<400>14SerTrpHisIleGlnThrLeuAspPheProLeuArgProAsnArg-155-150-145ValAlaTyrGlnLeuValArgAlaThrValValTyrArgHisGln-140-135-130LeuHisLeuThrHisSerHisLeuSerCysHisValGluProTrp-125-120-115IleGlnLysSerProThrSerHisPheProSerSerGlyArgGly-110-105-100SerSerLysProSerLeuLeuProLysAlaTrpThrGluMetAspIle-95-90-85MetGluHisValGlyGlnLysLeuTrpAsnArgLysGlyArgArgVal-80-75-70LeuArgLeuArgPheMetCysGlnGlnProArgGlySerGluValLeu-65-60-55GluPheTrpTrpHisGlyThrSerSerLeuAspThrValPheLeuLeu-50-45-40LeuTyrPheAsnAspThrGlnSerValGlnLysThrLysProLeuPro-35-30-25-20LysGlyLeuLysGluPheThrGluLysAspProSerLeuLeuLeuArg-15-10-5ArgAlaArgGlnAlaGlySerIleAlaSerGluValProGlyProSer-11510ArgGluHisAspGlyProGluSerAsnGlnCysSerLeuHisProPhe152025GlnValSerPheGlnGlnLeuGlyTrpAspHisTrpIleIleAlaPro30354045AsnLeuTyrThrProAsnTyrCysLysGlyValCysProArgValLeu505560HisTyrGlyLeuAsnSerProAsnHisAlaIleIleGlnAsnLeuVal657075AsnGluLeuValAspGlnSerValProGlnProSerCysValProTyr808590LysTyrValProIleSerIleLeuLeuIleGluAlaAsnGlySerIle95100105LeuTyrLysGluTyrGluGlyMetIleAlaGlnSerCysThrCysArg110115120125<210>15<211>857<212>DNA<213>家山羊(Caprahircus)<220><221>CDS<222>(3)..(854)<220><221>mat_peptide<222>(480)..()<400>15gctcctggcacatacagaccctggactttcctctgagaccaaaccgg47SerTrpHisIleGlnThrLeuAspPheProLeuArgProAsnArg-155-150-145gtagcataccaactagtcagagccactgtggtttaccgccatcag92ValAlaTyrGlnLeuValArgAlaThrValValTyrArgHisGln-140-135-130cttcacctaactcattcccacctctcctgccatgtggagccctgg137LeuHisLeuThrHisSerHisLeuSerCysHisValGluProTrp-125-120-115gggcagaaaagcccaaccaatcactttccttcttcaggaagaggc182GlyGlnLysSerProThrAsnHisPheProSerSerGlyArgGly-110-105-100tccccaaagccttccctgttgcccaaaacttggacagagatggatatc230SerProLysProSerLeuLeuProLysThrTrpThrGluMetAspIle-95-90-85atggaacatgttgggcaaaagctctggaatcacaaggggcgcagggtt278MetGluHisValGlyGlnLysLeuTrpAsnHisLysGlyArgArgVal-80-75-70ctacgactccgcttcgtatgtcagcagccaagaggtagtgaggttctt326LeuArgLeuArgPheValCysGlnGlnProArgGlySerGluValLeu-65-60-55gagttctggtggcatggcacttcatcattggacactgtcttcttgtta374GluPheTrpTrpHisGlyThrSerSerLeuAspThrValPheLeuLeu-50-45-40ctgtatttcaatgacactcagagtgttcagaaaaccaaacctctccct422LeuTyrPheAsnAspThrGlnSerValGlnLysThrLysProLeuPro-35-30-25-20aaaggcctgaaagagtttacagaaaaagacccttctcttctcttgagg470LysGlyLeuLysGluPheThrGluLysAspProSerLeuLeuLeuArg-15-10-5agggctcgtcaagcaggcagtattgcatctgaagttcctggcccctcc518ArgAlaArgGlnAlaGlySerIleAlaSerGluValProGlyProSer-11510agggagcatgatgggcctgaaagtaaccagtgttccctccaccctttt566ArgGluHisAspGlyProGluSerAsnGlnCysSerLeuHisProPhe152025caagtcagcttccagcagctgggctgggatcactggatcattgctccc614GlnValSerPheGlnGlnLeuGlyTrpAspHisTrpIleIleAlaPro30354045catctctataccccaaactactgtaagggagtatgtcctcgggtacta662HisLeuTyrThrProAsnTyrCysLysGlyValCysProArgValLeu505560tactatggtctcaattctcccaatcatgccatcatccagaaccttgtc710TyrTyrGlyLeuAsnSerProAsnHisAlaIleIleG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