一种细胞分选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，特别是指一种细胞分选方法。
【背景技术】
[0002]随着细胞替代治疗的发展，干细胞移植治疗已成为临床上治疗某些疾病的重要手段，利用干细胞在体外扩增培养并诱导成所需要的细胞后移植入患者体内，用于组织损伤的修复、退行性器官的替代及改善遗传性缺陷组织器官的功能。而成体干细胞可塑性分化的发现，为细胞替代治疗提供了新的方向。尽管在细胞治疗领域已取得一些列进展，但仍存在重大挑战。要达到治疗疾病的目的就必须要获得治疗目标疾病所需的精确细胞群，一旦进行移植，要确保这些细胞达到需要它们的位点，整合到现有组织中。细胞纯度是细胞治疗面临的技术问题之一。
[0003]细胞分离(cell isolat1n)，指的是将组织分散制成细胞悬液后从中获取目的细胞的过程。而所谓细胞纯化更进一步强调从原代培养成分混杂的异质性细胞悬液中或者从培养物中获得单一类型细胞的过程。通过细胞的分离和纯化过程，是培养物成为单一类型培养物，甚至是遗传特性完全一致的培养物，后者即细胞系。分离和纯化两个概念之间没有截然的界限，许多情况下，细胞分离和纯化并不是完全彻底的，培养物种只能达到以某种细胞为主的程度，所以也称为富集(enrichment)。分离和纯化细胞的过程不仅仅在原代培养之前进行的，有时分离和纯化细胞的过程还贯穿于原代培养之和继代培养的过程中，甚至是主要依赖培养过程实现分离和纯化细胞的目的。培养物种细胞成分是否单一或者目的细胞在培养物中的比例如何，常是衡量某一培养工作是否成功的重要指标。细胞的分离纯化包括密度梯度离心技术、逆流淘析分离技术、利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法等，其中前两种方法并没有使目的细胞群相对于有核细胞发生太多的富集。细胞的可逆分选是指能够将细胞从分选载体上释放出来的细胞分选方法，近年来，虽然已有利用适配体和温敏聚合物来可逆分选癌细胞的报道，但关于干细胞的可逆分选仍属空白。
[0004]细胞治疗在机体生长、发育及器官组织修复过程中已表现出巨大的潜力，在临床应用上前景也十分广阔，因此解决细胞纯度问题将有助于细胞治疗的临床发展。
【发明内容】
[0005]本发明提出一种细胞分选方法，利用生物素与脱硫生物素竞争结合链霉亲和素的原理，将细胞与标有脱硫生物素的特异抗体和标有链霉亲和素的磁珠进行孵育，最终通过生物素竞争结合链霉亲和素和磁性富集获得目的细胞，经过大规模培养后获得数量和纯度均达到移植要求的细胞。
[0006]本发明的技术方案是这样实现的:一种细胞分选方法，包括:与细胞表面抗原特异结合的抗体，功能性磁珠，所述抗体为脱硫生物素标记的抗体，所述功能性磁珠为标记了链霉亲和素的磁珠，利用生物素与脱硫生物素竞争结合链霉亲和素，以及细胞表面标志，进行细胞的分选。
[0007]优选的，包括以下步骤:
A、所述抗体进行脱硫生物素标记；
B、标记后的所述抗体与细胞孵育；
C、经过步骤B处理后的细胞与经链霉亲和素标记的所述磁珠进行孵育；
D、生物素竞争结合链霉亲和素标记的所述磁珠；
E、去除所述磁珠，收集细胞进行后续处理。
[0008]优选的，步骤A中，包括:将所述抗体与适量活化的脱硫生物素混合，室温孵育，孵育时间为20-40min，以30min为宜。
[0009]为增强实验的效果，采用超滤管对步骤A中得到的混合液进行清洗，除去多余的脱硫生物素。
[0010]优选的，步骤B中，包括:消化细胞并计数，调整细胞悬液为I X 105-2 X 105/ml的浓度，所述抗体与细胞悬液以1:(50-150)的体积比，优选1:100的体积比室温孵育后，用PBS
将细胞清洗三次。
[0011]优选的，步骤C中，包括:将步骤B中获得的细胞沉淀重悬于80-120U1，优选10ul预冷的PBS+BSA缓冲液中，链霉亲和素标记的所述磁珠与缓冲液以1: (10-50)的体积比，优选1:25的体积比室温孵育，所述磁性富集后用PBS清洗三次。
[0012]优选的，步骤D中，包括:配置生物素溶液8-15um，优选10um，并调整为PH7，将步骤C中磁性富集得到的细胞与所述磁珠组成的复合物沉淀重悬于150-250ul，优选200ul生物素溶液中，室温孵育I小时。
[0013]优选的，所述磁珠的直径为lum。
[0014]本发明的所述细胞分选方法，利用生物素与脱硫生物素竞争结合链霉亲和素的原理，将细胞与标有脱硫生物素的特异抗体和标有链霉亲和素的磁珠进行孵育，最终通过生物素竞争结合链霉亲和素和磁性富集获得目的细胞。经过大规模培养后获得数量和纯度均达到移植要求的细胞，相比于其他技术具有以下优势:
I)本发明方法简单，所用仪器设备均为实验室常见的基本设备，如离心机、摇床、核酸分离磁架，不需要复杂仪器。
[0015]2)本发明所用抗体均为普通抗体，不需要荧光标记，成本低。
[0016]3)本发明最终能够将细胞从磁珠上释放，获得的目的细胞不含磁珠，更适用于临床。
[0017]4)本发明能够在较短时间内通过简单操作获得目的细胞，减少了细胞的污染几率。
[0018]5)所述细胞分选方法过程可逆，既能将细胞结合到所述磁珠上，又能将其释放。
[0019]6)所述细胞分选方法中，不需要流式分选仪就能将目的细胞与非目的细胞分开，只需要普通的核酸提取磁架即可将目的细胞与非目的细胞分开。
【附图说明】
[0020]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0021]图1为本发明一种细胞分选方法原理示意图。
【具体实施方式】
[0022]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
[0023]1、脱硫生物素标记抗体
将待脱硫生物素化的CD105抗体用0.1 mo I/L碳酸氢钠缓冲液稀释到I mg/ml ；NHS-脱硫生物素用DMSO溶解，配制成1mM的溶液，按照如下公式计算出标记抗体所需NHS-脱硫生物素的量:
所需脱硫生物素的量=抗体的体积X抗体的浓度/抗体的摩尔质量X需要标记的脱硫生物素倍数
按照计算出来的量将抗体与NHS-脱硫生物素混合，室温孵育30min后用30KD的超滤管将多余的脱硫生物素去除。
[0024]
2、细胞与抗体孵育
将间充质干细胞和人肺癌细胞A549细胞分别用胰酶消化后计数，1:1比例混合两种细胞调整浓度为lX 105-2X 105/ml，然后实验组按照⑶105抗体与细胞悬液以1:100的体积比室温孵育20min，对照组不加抗体同样在室温孵育20min，孵育结束后用PBS将细胞洗三次。
[0025]
3、抗体-细胞与链霉亲和素标记的磁珠孵育
将步骤2中获得的细胞沉淀重悬于100 μ I预冷的PBS+1% BSA缓冲液中，链霉亲和素标记的磁珠与缓冲液以1:25的体积比室温孵育I小时，磁性富集后用PBS清洗三次。
[0026]
4、生物素与脱硫生物素竞争结合链霉亲和素
配置浓度为10 μ M的生物素溶液，调整为ΡΗ7。将步骤3中磁性富集得到的细胞-磁珠复合物沉淀重悬于200 μ I生物素溶液中，室温孵育I小时后磁性富集除去磁珠，收集细胞进行后续培养。
[0027]根据上述步骤，最终得到的细胞不含Α549细胞，只含有间充质干细胞，且经后续培养生长无异常。
[0028]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种细胞分选方法，其特征在于，包括:与细胞表面抗原特异结合的抗体，功能性磁珠，所述抗体为脱硫生物素标记的抗体，所述功能性磁珠为标记了链霉亲和素的磁珠，利用生物素与脱硫生物素竞争结合链霉亲和素，以及细胞表面标志，进行细胞的分选。2.如权利要求1中所述细胞分选方法，其特征在于:包括以下步骤: A、所述抗体进行脱硫生物素标记； B、标记后的所述抗体与细胞孵育； C、经过步骤B处理后的细胞与经链霉亲和素标记的所述磁珠进行孵育； D、生物素竞争结合链霉亲和素标记的所述磁珠； E、去除所述磁珠，收集细胞进行后续处理。3.如权利要求2中所述细胞分选方法，其特征在于:步骤A中，包括:将所述抗体与适量活化的脱硫生物素混合，室温孵育。4.如权利要求3中所述细胞分选方法，其特征在于:步骤A中，包括:用超滤管对得到的混合液进行清洗，除去多余的脱硫生物素。5.如权利要求2中所述细胞分选方法，其特征在于:步骤B中，包括:消化细胞并计数，调整细胞悬液为lX 105-2X 105/ml的浓度，所述抗体与细胞悬液以1:(50-150)的体积比室温孵育后，用PBS将细胞清洗。6.如权利要求2中所述细胞分选方法，其特征在于:步骤C中，包括:将步骤B中获得的细胞沉淀重悬于预冷的PBS+BSA缓冲液中，链霉亲和素标记的所述磁珠与缓冲液以1:(10-50)的体积比室温孵育，所述磁性富集后用PBS清洗。7.如权利要求2中所述细胞分选方法，其特征在于:步骤D中，包括:配置生物素溶液，将步骤C中磁性富集得到的细胞与所述磁珠组成的复合物沉淀重悬于生物素溶液中，室温孵育。8.如权利要求1-7中任一所述细胞分选方法，其特征在于:所述磁珠的直径为lum。
【专利摘要】本发明提出了一种本发明的目的是利用生物素与脱硫生物素竞争结合链霉亲和素的原理，将含有特异细胞表面标志物的细胞利用免疫磁珠进行分选，最终得到目的细胞，本发明的过程包括抗体标记脱硫生物素、抗体与细胞的孵育、细胞与链霉亲和素标记的磁珠的孵育、生物素竞争结合链霉亲和素标记的磁珠四大步骤。本发明将免疫磁珠技术与生物素/脱硫生物素竞争结合链霉亲和素相结合，使得磁珠分选的优点得以发挥，细胞分选实验过程更简单、得到的细胞质量更高。
【IPC分类】C12N5/00
【公开号】CN105018411
【申请号】CN201510493571
【发明人】曾令文, 林姣, 王斗
【申请人】中国科学院广州生物医药与健康研究院
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年8月12日