一株高产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株高产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌及 其应用。
【背景技术】
[0002] 碱性蛋白酶（alkaline protease)是指在pH值偏碱性范围内水解蛋白质肽键的 酶类，其主要成分是一种内切蛋白酶，催化部位为丝氨酸，分子量约为27kDa。国内工业生 产蛋白酶的菌株多是经地衣芽孢杆菌2709选育而来，是通过深层发酵、提取及精制而成 的一种蛋白水解酶。碱性蛋白酶广泛应用于食品、医疗、酿造、丝绸、制革等行业，是工业 用酶中占据比例最大的酶类，约占全世界每年总销售量的60%左右（Mala B.R.等，1998， Microbiology and Molecular Biology Reviews)〇
[0003] 碱性蛋白酶是目前市场上畅销的洗涤添加剂，能大幅度提高洗涤剂的去污效果， 特别对血渍、汗渍、奶渍、油渍等蛋白类污垢具有独特的洗涤效果。但目前碱性蛋白酶产品 普遍被诺维信和杰能科两大酶制剂国际公司垄断，其具有酶活水平高、溶解速度快以及与 洗涤剂配伍时耐受性强的优点。国内酶制剂企业要扩大在洗涤酶领域的市场份额，除了加 速开发出发酶学性质优良的新型碱性蛋白酶外，也需要提高碱性蛋白酶的产量，从而降低 生产成本。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一株高产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌及其应用。本发明首先 通过将来源于克劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausii)的碱性蛋白酶基因转入地衣芽孢杆菌 (Bacillus Iicheniformis)中，构建得到重组表达碱性蛋白酶的基因工程菌株；然后以该 工程菌株为出发菌进行紫外诱变，进而筛选出一株碱性蛋白酶高产菌株，为低成本、规模化 生产碱性蛋白酶奠定了基础。
[0005] 本发明一方面涉及一种地衣芽孢杆菌工程菌，其携带有能表达碱性蛋白酶的表达 载体。
[0006] 所述碱性蛋白酶的氨基酸序列为SEQ ID N0:1，其编码核苷酸序列为SEQ ID N0:2〇
[0007] 本发明另一方面涉及一种地衣芽孢杆菌突变株，为地衣芽孢杆菌 BL1-43 (Bacillus licheniformis BL1-43)，已于2015年7月13日保藏于中国武汉武汉大 学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :M2015449。
[0008] 本发明还涉及上述地衣芽孢杆菌突变株的应用。
[0009] 本发明通过紫外诱变的方法获得一株高产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌突变株，其 摇瓶发酵酶活高达18000U/ml，较出发菌提高了约54. 5%，且经多次传代后，还能保持遗传 上的稳定性，取得了意料不到的技术效果，可广泛应用于碱性蛋白酶的生产，有助于降低生 产成本，提高市场竞争力。
【附图说明】
[0010] 图1为质粒pWBA-aprE的遗传图谱。
【具体实施方式】
[0011] 下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更 好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方 法步骤。
[0012] 对于本发明所涉及的术语及相关测定方法解释如下：
[0013] 1、蛋白酶酶活测定方法：采用中华人民共和国国家标准蛋白酶制剂测定方法 (GB/T 25327-2009)〇
[0014] 2、酶活单位的定义：Ig固体酶粉（或ImL液体酶），在一定温度和pH值条件下， Imin水解酪蛋白产生1 μ g酪氨酸，即为1个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。
[0015] 3、碱性蛋白酶运用福林法测定蛋白酶的活力，使用到的溶液包括：福林使用溶液 (一份市售福林溶液与两份水混合，摇匀），碳酸钠溶液（42. 4g/L)，三氯乙酸（65. 4g/L)， 梯度pH值缓冲液，酪蛋白溶液（10.0 g/L)。反应过程如下：试管中加入ImL酶液，40°C温浴 2min，加入酪蛋白溶液lmL，摇匀后40°C温浴lOmin，加入2mL三氯乙酸溶液，摇匀（空白对 照先加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液）。取出静止lOmin，慢速定性滤纸过滤。取ImL滤 液，加碳酸钠溶液5mL，加福林试剂使用溶液lmL，40°C显色20min，于680nm波长，用IOmm比 色皿测定吸光度。
[0016] 实施例1碱性蛋白酶表达载体构建
[0017] I. 1基因组DNA的提取
[0018] TIAN GEN公司的TIANamp Bacteria DNA Kit制备克劳氏芽孢杆菌基因组DNA，其 制备过程参照试剂盒的操作手册。
[0019] 1. 2基因克隆
[0020] 以1. 1中提取的基因组总DNA为模版，利用引物I : 5 ' -TTTTAGTTCATCGATCGCATCGG CTGCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATT-3 ' 和引物 2 :5 ' -GCTGAAGCTAGCTTGCATGCTTAATTTAGCGTGTTG CCGCTTCTGCATTG-3'进行PCR扩增，获得aprE基因片段。扩增条件为98°C IOmin ;98°C 10s， 58°C 20s，72°C lmin，30 个循环；72°C lOmin。利用 Ε· Ζ· N. A. Gel Extraction Kit 回收 PCR 扩增产物。
[0021] I. 3质粒的提取
[0022] TIAN GEN 公司的 TIANrep Rapid Mini Plasmid Kit 制备载体 pWB980,其制备过 程参照试剂盒的操作手册。
[0023] 1. 4表达载体构建
[0024] 以 L 3 中提取的质粒 DNA 为模板，利用引物 1 :5' -CAATGCAGAAGCGGCAACACGCTAAA TTAAGCATGCAAGCTAGCTTCAGC-3' 和引物 2 :5' -AATATTTTTCTTTTGCTTCTTCAGCAGCCGATGCGATC GATGAACTAAAA-3'进行PCR扩增，获得载体基因序列。扩增条件为98°C 10min;98°C 10s， 58°C 20s，72°C lmin，30 个循环；72°C lOmin。利用 Ε· Ζ· N. A. Gel Extraction Kit 回收 PCR 扩增产物。
[0025] 将目标片段和载体片段通过重叠延伸PCR形成多聚体，扩增体系如下： 5XPhusion HF Buffer 10 μ L，2. 5mM dNTPs 8 μ L，Insert gene (aprE 片段）4yL， Linearized vector(pWB980)6 yL，Phusion DNA Polymerase I yL，ddH20 21 yL。扩增条件 为98。(：1〇111丨11;98。(：1〇8,721€3111丨11，20个循环 ；98。(：1〇8,721€6111丨11，15个循环；72。(：1〇11^11。 将多聚体转化枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)lA751宿主菌，得到阳性转化子，测序验 证。经测序该aprE片段的核酸序列为SEQ ID NO: 2,其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。 经NCBI BLAST比对发现，SEQ ID NO: 1与克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶氨基酸序列相似性 为100%。将获得的质粒命名为pWBA-aprE，质粒图谱如图1所示。
[0026] 利用感受态方法将pWBA-aprE转化入枯草芽孢杆菌1A751宿主菌，具体转化过程 如下：将新鲜活化的枯草芽孢杆菌1A751由LB平板（胰蛋白胨1%，酵母粉0. 5%，NaCl 1%)接种到51111611(611配制方法为：1\最低盐溶液95.61111，20%葡萄糖2.51111， 5%水解酪蛋白0.4ml，10%酵母粉汁Iml ;其中IX最低盐溶液的配制方法为=K2HPO4Hg/ L，KH2P046g/L，（NH4)2S0 42g/L，柠檬酸三钠 lg/L，MgSO4 · 7H20 0. 2g/L，在蒸馏水中依次溶 解溶液，在30°C、125rpm振荡培养过夜。第二天取2ml转接到18ml GM I中，37°C、250rpm 培养3. 5h。再取IOml上一步骤的培养液转接到90ml GM II (GM II配制方法为：1 X最 低盐溶液96. 98ml，20 %葡萄糖2. 5ml，5 %水解酪蛋白0. 08ml，10 %酵母粉汁0. 04ml，IM MgCl2O. 25ml，IM CaCl20.0 5ml 中，37°C、125rpm 培养 90min 后，5