一种靶向治疗用人工趋磁细菌及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种靶向治疗用人工细菌，特别是一种 靶向治疗用人工趋磁细菌及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] 自然界中存在大量能够适应并利用不同环境条件的微生物，可供我们开发利用。 其中一个特殊例子就是趋磁细菌。这类原核生物群体能够借助地球磁场的作用，使自己迀 移至低氧海水环境中。虽然这类微生物在生理、形态与系统发生上呈现多样化的特性，但它 们依然表现出一些共同特性。趋磁细菌一般出现在海洋有氧层与无氧层的交界面附近，它 们几乎都是厌氧或微耗氧细菌，或者两种特性兼而有之。这一类群细菌的最显著特征在于 它们能够向着地球磁极运动。依靠自身鞭毛的作用，北半球的趋磁细菌向着北磁极运动，而 南半球的情况则相反。趋磁性与各种趋化性相配合，可以使趋磁细菌更好地适应化学性质 存在差异的不同水体底部的微氧环境。
[0003] 这种趋磁性由细菌内部一个特殊结构一一磁小体介导。它由磷脂双分子层包裹着 的磁铁纳米晶体组成，包含四氧化三铁、四硫化三铁、硫化亚铁和八硫化七铁等物质。一般 情况下，磁小体的形态、晶体成分、尺寸和排列方式都有其种属特异性。磁小体大小一般在 35到120纳米之间，亦有报道指出在一些无法培养的菌株中存在250纳米的磁小体。其形 状包含矩形、长棱镜状和八面立方体等多种类型。各磁小体在细胞内依次排列成一条或多 条长链，组成一个"磁场感应器"，使趋磁细菌能够顺着外部磁场的方向游动。磁小体的形 成机制尚不明确，一般认为其形成应当包括以下几个环节：磁小体囊泡形成，摄入环境中的 铁，向囊泡转运铁和晶体生物矿化。
[0004] 由于磁小体有包膜结构、纳米级大小、尺寸分布窄和具有铁磁性等特点，自40年 前被发现以来，人们就对趋磁细菌及其磁小体进行了多方面的研究与开发利用。曾有学者 利用趋磁细菌在陨石和岩石中寻找磁铁矿。趋磁细菌也被用于清除污水中的放射性核素和 重金属。虽然对趋磁细菌的研究不断深入，但其苛刻的生长方式与复杂的营养要求，使得对 它的分离培养变得非常困难。因此仅有一小部分趋磁细菌能够被培养与研究。由于对它们 缺乏了解，尚无一种能够产生硫复铁矿的趋磁细菌被纯培养。这也阻碍了我们对天然趋磁 细菌应用价值的开发。
[0005] 由于认识水平与研究手段的原因，趋磁细菌的磁性内含物反而得到了更广泛的研 究利用，特别是在医疗与诊断领域，如磁共振成像、热疗、标记细胞分离和药物输送等。利用 一些多功能分子对磁颗粒表面进行修饰，可以将它的应用范围扩展至生物技术领域。如利 用多基团连接物的一端与磁颗粒外膜上的氨基酸等分子结合，另一端再与需要携带的药物 分子结合，就可以将药物固定在磁颗粒上。这一工程磁颗粒可以被施加的磁场捕获，并将药 物运输到特定部位。在DNA分离技术中，经含氨基末端的有机物修饰的磁颗粒可以显著增 加 DNA回收效率。这种工程磁颗粒有望用于肿瘤治疗中的药物运输。肿瘤化疗的一个主要 不足就是，毒性药物经过静脉注射，随着循环系统分布全身，无法被特异集聚在病灶部位。 由此带来的副作用就是药物攻击肿瘤时，也会损伤正常的组织器官。而通过开发利用药物 磁运输技术，可以明显降低抗肿瘤药物在血液循环系统中的分布。同时由于药物被靶向运 输至肿瘤部位，其治疗效果可以得到明显提高。这一结果在脑瘤和骨髓瘤等的动物模型中 得到很好的验证。
[0006] 在这类研究中，药物通常被连接到磁颗粒上，形成药物载体复合物后经静脉注射 到动物体内。然后一个外加磁场被用于将药物聚集在病灶部位。不过这些已有的靶向运输 都需要将一个永磁铁尽可能地靠近目标区域以提供靶向的外加磁场，直到释放出磁颗粒。 这对于靠近身体表面的肿瘤具有良好的靶向效果，但对深部肿瘤其效果会明显降低。同时 复杂的毛细血管网络也会降低那些单纯依靠体液运输的药物的靶向运输效果。这种靶向性 的降低也会带来一定的治疗副作用。并且通过化学修饰将药物结合在磁颗粒的方法，对药 物的种类和活性存在着明显的限制作用，特别是一些生物活性药物在修饰过程中容易被破 坏。实际上这类药物一进入人体就开始在各个部位发挥药效，只是其药效低于富集部位而 已。这类方案在时间和空间上，不易控制药物活性的发挥。
【发明内容】
[0007] 本发明提供一种能够通过鞭毛自主运动并利用磁场将治疗基因携带到靶向部位， 并在该部位进行特异表达治疗基因，以提高靶向治疗效果的人工趋磁细菌及其构建方法。 鉴于靶向治疗与基因运输在生物医药领域的重要作用，以及磁靶向运输技术在一些稳定性 或水溶性较差药物应用方面的优势，本发明将对药物与基因的靶向运输的研究与应用具有 重要的补充和促进作用。
[0008] 根据本发明的第一方面，本发明提供一种靶向治疗用人工细菌，该细菌内包含能 够在细菌表面表达出定位蛋白的基因结构，以及密度感应元件控制的治疗基因表达序列， 上述定位蛋白能够通过生物亲和作用与磁颗粒相连。
[0009] 作为本发明的优选方案，上述细菌选自能够与生物体相容的非致病性细菌，优选 大肠杆菌、沙门氏菌、乳酸菌或枯草芽孢杆菌，更优选大肠杆菌。
[0010] 作为本发明的优选方案，上述定位蛋白选自增强绿色荧光蛋白（eGFP)、黄色荧光 蛋白（YFP)、红色荧光蛋白（RFP)或蓝色荧光蛋白（BFP)，或者其它便于检测的蛋白，优选增 强绿色荧光蛋白（eGFP)。
[0011] 作为本发明的优选方案，上述生物亲和作用为生物素-亲和素系统，具体是通过 生物素化的定位蛋白抗体介导上述定位蛋白与亲和素标记的纳米磁颗粒相连。
[0012] 作为本发明的优选方案，上述治疗基因选自侵袭因子、细胞溶解素、干扰素、细胞 因子或重组疫苗的基因。
[0013] 根据本发明的第二方面，本发明提供一种靶向治疗用人工趋磁细菌，该细菌内包 含能够在细菌表面表达出定位蛋白的基因结构，以及密度感应元件控制的治疗基因表达序 列，上述细菌表面表达有上述定位蛋白，上述定位蛋白通过生物亲和作用与磁颗粒相连，形 成上述人工趋磁细菌。当上述细菌与上述磁颗粒相连后，上述细菌能够在外加磁场的作用 下富集到生物体内的靶向部位，当细菌的密度在上述靶向部位富集到上述密度感应元件感 知的临界密度时，上述密度感应元件控制上述治疗基因表达。
[0014] 本发明还提供一种人工趋磁细菌，该细菌内包含能够在大肠杆菌表面表达出增强 绿色荧光蛋白的基因结构，以及密度感应元件控制的黄色荧光蛋白报告基因表达序列，上 述细菌表面表达有上述增强绿色荧光蛋白，上述增强绿色荧光蛋白通过生物素化的增强绿 色焚光蛋白的抗体与亲和素标记的纳米磁颗粒相连，形成上述人工趋磁细菌。当上述细菌 与上述纳米磁颗粒相连后，上述细菌能够在外加磁场的作用下富集到生物体内的革El向部 位，当上述细菌的密度在上述革E向部位富集到上述密度感应元件感知的临界密度时，上述 密度感应元件控制上述黄色荧光蛋白报告基因表达。
[0015] 作为本发明的优选方案，上述能够在大肠杆菌表面表达出增强绿色荧光蛋白的基 因结构是如SEQ ID N0:1所示的Pet23a sp-eGFP-aida质粒；上述密度感应元件控制的黄 色荧光蛋白报告基因表达序列是如SEQ ID NO :2所示的JRI2YFP质粒。
[0016] 根据本发明的第三方面，本发明提供一种构建靶向治疗用人工细菌的方法，该方 法包括：将能够在细菌表面表达出定位蛋白的基因结构以及密度感应元件控制的治疗基因 表达序列导入细菌内；其中上述定位蛋白能够通过生物亲和作用与磁颗粒相连。
[0017] 根据本发明的第四方面，本发明提供一种构建靶向治疗用人工趋磁细菌的方法， 该方法包括：将能够在细菌表面表达出定位蛋白的基因结构以及密度感应元件控制的治疗 基因表达序列导入细菌内；诱导上述定位蛋白表达，并将上述定位蛋白通过生物亲和作用 与磁颗粒相连，形成上述人工趋磁细菌。当上述细菌与上述磁颗粒相连后，上述细菌能够在 外加磁场的作用下富集到生物体内的革G向部位，当上述细菌的密度在上述革El向部位富集到 上述密度感应元件感知的临界密度时，上述密度感应元件控制上述治疗基因表达。
[0018] 本发明还提供一种构建人工趋磁细菌的方法，该方法包括：将能够在大肠杆菌表 面表达出增强绿色荧光蛋白的基因结构以及密度感应元件控制的黄色荧光蛋白报告基因 表达序列导入细菌内；诱导上述增强绿色荧光蛋白表达，并将上述增强绿色荧光蛋白通过 生物素化的增强绿色荧光蛋白的抗体与亲和素标记的纳米磁颗粒相连，形成上述人工趋磁 细菌。当上述细菌与上述纳米磁颗粒相连后，上述细菌能够在外加磁场的作用下富集到生 物体内的革G向部位，当上述细菌的密度在上述革El向部位富集到上述密度感应元件感知的临 界密度时，上述密度感应元件控制上述黄色荧光蛋白报告基因表达。
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