专利名称：低后酸化乳酸菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有低的或降低的后酸化特性的乳酸菌，以及制备这样的 细菌的方法。此外，本发明涉及这样的细菌在制备发酵的乳制品上的应用， 以及含有所述细菌的乳制品。
背景技术：
德、氏乳才干菌寸呆力口利亚亚种(丄acto6ac/〃ws (ie/6raecA:" subsp. 6w/gan'cz^) 菌种的菌抹是用于生产发酵乳和特别地酸乳的细菌培养物的基本成分。这 样的菌林通常在乳制品保质期期间产生乳酸，所述乳制品用细菌培养物 ——该菌林是此细菌培养物的一种成分——进行发酵。这种现象常常被称 为"后酸化"。这样的细菌通常不会有助于乳制品提高的质地，所述乳制品 用细菌培养物——该菌林是此细菌培养物的一种成分——发醉获得的。
根据大部分欧盟(EU)国家的法规，要用于生产酸乳的引子培养物必 须由保加利亚乳杆菌(toc/〃ws Zm/gw/cw )型菌抹和嗜热链球菌 (5^eptococa^ Awmop/n/^ )型菌抹组成。此外，当引子培养物是由这两 个型的菌抹组成而不是仅仅由单一一个型的菌抹组成时，乳的酸化发生得 更快。
发酵乳市场上的趋势是这样的产品其在保质期期间具有轻度至不存 在酸化发展(低后酸化)，并且具有高的质地(或粘度)。当选择德氏乳杆 菌保加利亚亚种型的菌林单独或作为培养物的成分用于发酵乳和酸乳的 生产时，产品开发者必须在具有下列特性组合的已知菌4朱之间选择
>低后酸化和低质地形成能力；或
>高后酸化和低质地形成能力；或
>高后酸化和高质地形成能力，因为，没有这样的德氏乳杆菌保加利亚亚种的菌林可以得到所述菌
林以令人满意的方式将低后酸化特征和高质地形成特征相结合。
采用任何上述已知菌林，发酵乳制品由于使用细菌培养物将导致高程
度的后酸化或者低质地。乳品业经常选择用这样的培养物加工在该培养 物中德氏乳杆菌保加利亚亚种菌林结合了低后酸化和低质地。为了增加发 酵乳制品的质地，它们在发酵发生之前向乳基质中添加增稠剂(一种或多 种)。
发明概述
技术人员所面临的问题是提供可选的将低后酸化特征和高质地形成 特征相结合的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌林，从而使增稠剂的加入变得多 余。几个科学家已经试图获得这样的菌抹，但没有任何的成功。Mdller爭 人.(2001)，为了获得具有较少后酸化的突变体，对德氏乳杆菌保加利亚亚 种菌抹(Visby菌林231)进行化学诱变(用诱变剂MNNG (N-甲基-N-亚硝基 -N-硝基胍))。诱变的菌林被手工铺板并且菌落被手工转移至含有乳的微量 滴定板上。温育后，通过使用微电极对大约2000个分离物每个孔每个孔 地测量pH。分离出了四个最终pH高于母菌抹的突变体。所述诱变和筛选 没有得到任何具有高质地和低后酸化的突变体。
本发明人已经令人惊讶地表明提供这样的菌抹的确是可能的，并且他 们已经研发出提供这样的菌林的方法，所述方法不同于M6ller等(2001)的 方法，原因在于本发明人使用高质地菌抹作为母菌林并且使用的是弱诱变 剂。通过实施本发明的方法，本发明人已经令人惊讶地鉴别出相对于其母 菌抹具有提高的质地特性的菌抹。因此，本发明人已经设计了开发这样的 德氏乳杆菌保加利亚亚种菌抹的方法，所述菌抹基本上有助于提高通过用 本发明的菌林或者本发明的菌抹作为其成分的细菌培养物发酵所获得的
乳制品的质:l也。
所得乳制品的特征在于具有比先前已知的产品具有好闻的温和的、更 少的酸味。
具体实施例方式
在第一方面，本发明涉及这样的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌抹，其特
征在于
a) 当存在于发酵乳制品(例如在储存期)时比其它同种高质地的菌抹 产生更少的酸；和/或
b) 用该茼株发酵的釓制品的质地比同种低后酸化的菌抹增加至更高 的水平。
这样的菌抹令人感兴趣的实施方式是这样的菌抹，其
a)在储存14天后和/或21天后和/或28天后在标准试验(测定后酸 化特性的试验)中测量的pH在4.25-4.55的范围内(例如在4.30-4.55的范 围内；或者在4.35-4.55的范围内)；并且
b )采用测定粘度的试验以Pa计测量的质地形成特性不小于25 (例如 不小于30;不小于35;不小于39;不小于42;不小于44;不小于45; 不小于46;不小于47;不小于48;或者不小于50);
或者这样的菌^f朱，其
a) 在储存14天后使在标准试验(测定后酸化特性的试验)中测量的 pH降低小于0.30 pH单位(例如小于0.20 pH单位);并且
b )采用测定粘度的试验以Pa计测量的质地形成特性不小于25 (例如 不小于30;不小于35;不小于39;不小于42;不小于44;不小于45; 不小于46;不小于47;不小于48;或者不小于50);
或者这样的菌抹，其
a )在8摄氏度下在储存7天后使在标准试验(测定后酸化特性的试验) 中测量的pH降低小于0.20pH单位(例如小于0.15;小于0.11;小于0.08; 小于0.07;小于0.06;小于0.05;小于0.04;小于0.03;或者甚至小于0.02pH 单位；)；并且
b) 采用测定粘度的试验以Pa计测量的质地形成特性不小于25 (例如 不小于30;不小于35;不小于39;不小于42;不小于44;不小于45; 不小于46;不小于47;不小于48;或者不小于50)。术语"使pH降低"应当理解为相对于起始点即pH4.55， pH的降低。例 如降低0.30 pH单位意味着最终pH为4.25。
在两种令人感兴趣的实施方式中，降低的酸产生不是由于(3-半乳糖苷 酶活性显著或完全的失活；和/或不是由于乳酸脱氢酶活性显著或完全的失 活。术语"不是由于显著失活"被理解为小于30%的活性降低(例如小于20% 或者甚至小于10%)。
目前优选的是这样的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌林，其选自 CHCC10019; CHCC8535;和CHCC7159;以及这些菌抹中任一种的突变 体(例如功能相当的突变体，如具有基本上相同的后酸化和质地形成特性 的突变体)，并且最优选的是菌抹CHCC7159或其突变体，例如功能相当 的突变体，如具有基本上相同的后酸化和质地形成特性的突变体。
在本上下文中，术语"其突变体"应当被理解为通过例如基因工程、辐 射和/或化学处理从本发明的菌林中衍生的菌林。优选的是该突变体是功能 相当的突变体，如与母菌抹具有基本上相同的后酸化和质地形成特性的突 变体。这样的突变体是本发明的一部分。特别地，术语"其突变体"是指通 过使本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌林(例如CHCC10019; CHCC8535; CHCC7159; CHCC3984; CHCC3606或CHCC5713 )经历任 何常规使用的诱变处理获得的菌抹或自发的突变体，所述常规使用的诱变 处理包括用化学诱变剂例如甲磺酸乙酯(EMS )或者N-甲基-N'-亚硝基-N-硝基胍(NTG)、 UV光。突变体菌抹应当优选地满足上述a)和b)组合 中至少一种。尽管目前优选的是通过随机突变或者通过对自发的突变体进 行选择而提供该菌林，即没有使用重组DNA技术，但是应当料想到德氏 乳杆菌保加利亚亚种的突变体可以通过这样的技术提供，所述技术包括位 点定向诱变和PCR技术以及其它DNA序列的体外或体内修饰。术语"基 本上相同的后酸化特性，，应当优选地被理解为所述pH值相对于母菌抹可以 变化高达+/-0.1 pH单位(例如0.05、 0.01或0.00单位)，并且术语"基本上 相同的质地形成特性"应当优选地被理解为所述Pa值相对于母菌株可以变 化高达20% (例如高达10%或者高达5°/。)和/或+10/-2单位(例如+5、 +3、 +/醫2、 +/-1.0、 +/-0.5或0.0单位)。在第二方面，本发明涉及提供这样的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌抹的 方法，所述菌抹与母菌抹相比当存在于发酵乳制品(例如在终产品的储存 过程中)时产生更少的酸，所述方法包括用诱变剂(优选地温和或弱诱变 剂)或者辐射处理德氏乳杆菌保加利亚亚种菌林(母菌抹)，所述诱变剂
例如选自下列的诱变剂曱磺酸乙酯(例如1%);亚硝酸(例如0.05 M); 曱磺酸甲酯(例如20 mM);亚硝基胍(例如25M);和ICR-170吖啶 芥(acrine mustard)(例如5g/ml )，所述辐射例如X射线(例如2000 r/min); 或UV射线(例如每分钟600 erg/mm2 )。目前优选的是诱变剂EMS (甲磺 酸乙酯)。
目前优选的是，该母菌抹是这样的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌抹，其 在乳中生长后具有高的质地形成，而且具有高的后酸化，这样的菌抹选自 具有下列特性的菌^f朱
a) 高的质地形成特性，例如用测定粘度的试验测量的Pa不小于25(例 如不小于30;不小于35;不小于39;不小于42;不小于44;不小于45; 不小于46;不小于47;不小于48;或者不小于50)的菌抹；和
b) 高后酸化特性，例如在储存7天后使在标准试验(测定后酸化特 性的试4全)中测量的pH降低大于0.20 (例如大于0.30或0.40,或者甚至 大于0.50) pH单位。
这样的菌抹的实例是CHCC3984、 CHCC3606和CHCC5713以及这些 中任意一种的突变体(例如功能相当的突变体，如具有基本上相同的后酸 化和质地形成特性的突变体)。这些菌抹以及通过本发明的方法可获得的 德氏乳杆菌保加利亚亚种菌林都是本发明的 一部分。
在令人感兴趣的实施方式中，本发明的方法进一步包括
誦在培养基中(例如在pH指示剂板上；在含有例如补充有pH指示剂 的培养基的微量滴定板中；或者在含有例如补充有pH指示剂的培养基的 试管中)温育单个突变体；并且
-选择温育后培养基的最终pH比母菌林显著高的突变体。
便利地，pH通过pH电极或者通过使用pH指示剂例如溴苯酚紫或溴 苯酚绿进行测量，并且培养基是乳，例如标准培养基。在进一步的方面，本发明涉及根据本发明所述的德氏乳杆菌保加利亚 亚种菌林在制备发酵乳制品例如酸乳上的应用。
本发明还涉及制备乳制品的方法，其包括将根据本发明的菌抹与乳混 合，以及通过所述方法可获得的乳制品。所得乳制品的特征在于具有比先 前已知的产品具有好闻的温和的、更少的酸味。
在仍是进一步的方面，本发明涉及德氏乳杆菌保加利亚亚种菌林的繁 殖方法，其包括将本发明的菌林或者包含所述菌抹的组合物与生长培养基 例如乳(如标准培养基)混合。
在最后一方面，本发明涉及可用于使乳发酵的组合物，其包括根据本 发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌抹。这样的组合物的一个实例是引子培 养物，其除了本发明的菌林外进一步包含用于保藏的菌林或添加剂。该组 合物可以是千燥、冻干、冷冻或液体形式。
定义
在本上下文中，术语"乳(milk)"包括无脂乳、低脂乳、全脂乳、无 乳糖乳(通过用乳糖酶使乳糖水解成葡萄糖和半乳糖或者其它方法而生产 的)、浓缩乳或者奶粉。无脂乳是无脂的(non-fat)或者脱脂(skim)乳制 品。低脂乳典型地被定义为含有大约1%至大约2%脂肪的乳。全脂乳经常 含有2%或更多的脂肪。如本文所用，术语"乳"也意图包括来自动物和植物 来源的乳。动物来源的乳包括但不限于人、牛、绵羊、山羊、水牛、骆驼、 美洲驼、母马和鹿。植物来源的乳包括但不限于从大豆和燕麦中提取的乳。 此外，术语"乳"不但是指全乳，而且指脱脂乳或从中得到的任何液体成分。
术语"高质地形成菌林"应当理解为这样的菌抹，其当被用于在43°C的 温育温度下以lxlO5- lxlO、fu/g的比值给标准培养基接种直至pH4.55时， 导致发酵乳的剪切应力高于25Pa，其是在发酵/凝固结束后20小时用仪器 测定的，如"测定粘度试验"中所述。相反，术语"低质地形成菌林"应当理 解为这样的菌林，其当被用于在43。C的温育温度下以lxlO5- lxlO、fU/g的 比值给标准培养基接种直至pH 4.55时，导致发酵乳的剪切应力低于25 Pa， 其是在发酵/凝固结束后20小时用仪器测定的，如"测定粘度试验"中所述。术语"高后酸化菌抹，，应当理解为这样的菌抹，其当按照"测定后酸化特
性的试验"生长时在储存7天后使所述pH降低多于0.2 pH单位(所述pH 从4.55降至4.35或更低)。相反，术语"低后酸化菌林"应当理解为这样的 菌抹，其当按照"测定后酸化特性的试验"生长时在储存7天后使所述pH 降低不多于0.20 pH单位(所述pH从4.55降至4.35或4.55-4.35范围内的 某一pH值，两个端点都包括在内)。
术语"标准培养基"应当被理解为从脱脂乳粉中再造的乳，其具有9.5% 的干物质含量，并且在成批处理中已经被加热处理至99摄氏度保持15分 钟。
"a ( — )，，和"an ( — )，，和"the(所述)"以及类似的指示物的使用应当被解释 为包括单数和复数，除非本文另外指明或者上下文明显矛盾。术语"包括 (comprising)，，、"具有(having)，，、"包才舌(including)"和"containing (含 有)"应当被解释为开放式术语(即，意指"包括但不限于")，除非另外指 示。本文数值范围的引用仅仅意图作为单独引用落入本范围内的各个单独 的值的一种筒写方法，除非本文另外指明，并且每个单独的值被引入到说 明书中，似乎它在本文中^^皮单独引用一样。本文所述的所有方法可以以任 何合适的顺序实施，除非本文另外指明或者上下文明显矛盾。本文所提供 的任何及全部实例或者示例性语言的使用仅仅意图更好地阐明本发明并 且没有对本发明的范围施加限制，除非另外要求保护。本说明书中的语言 不应当解释为指示了对本发明的实施来说必要的任何非要求保护的元素。
图1描述了在43。C下突变体菌抹CHCC8535和母菌抹CHCC5713的 pH-时间图。参考实施例1。
图2描述了在43。C下突变体菌林CHCC7159和母菌抹CHCC3606的 pH-时间图。参考实施例1。
图3描述了对用德氏乳杆菌保加利亚亚种品种的不同菌林生产的三个 独立的样品测量所得的剪切应力的平均值。误差线跨过平均值附近的2个标准偏差。参考实施例1。
图4描述了在43°C下突变体菌林CHCC10019和母菌林CHCC3984的 pH-时间图。参考实施例2。
图5描述了对用突变体菌抹CHCC10019和母菌林CHCC3984生产的 三个独立的样品测量所得的剪切应力的平均值。误差线跨过平均值附近的 2个标准偏差。参考实施例2。
实施例
常规方法
根据本发明的方法，具有高质地形成特性和高后酸化特性的德氏乳杆 菌保加利亚亚种的母菌林用化学诱变剂进行处理。从所得菌林中筛选出具 有低后酸化特性的突变体，并且随后篩选出具有高质地形成特性的期望突 变体。所述方法在下面更详细地描述
测定粘度(质地形成特性)的试验
该菌林的冷冻浓缩物被用于给200 mL从脱脂乳粉(标准培养基)中 再造的乳接种。该乳具有9.5%的干物质含量并且在大气压力下在成批处理 中已经—皮热处理至99。C保持15分钟。保加利亚乳杆菌的冷冻浓缩物典型 地呈现细胞数在1,109与1.10^cfu/g之间。接种率为每IOL乳1 g浓缩物， 因此在l-105与1.106 cfu/mL乳之间。在43。C下进行温育直至pH达到4.55， 此时该乳已经发生凝固。发酵的乳然后在定期搅拌下冷却至5°C (通过力文 在冰浴中20分钟，然后放在冰箱中)。
达到pH 4.55后20小时，发酵的乳升温至13。C并且通过配有带孔圓 盘(直径二3cm)的棒轻轻搅拌直至样品均匀。搅拌由棒在样品进行20个 上下运动组成。样品的流变特性是在13。C下在安装有转子^皮子(CC25) 同轴测量系统的流变4义(StressTech, Reologica Instruments, Sweden)上进
行确定。
粘度测定是用21步从0.27变至300 1/s的剪切速率进行的。剪切速率 先增加后降低，并且记录了剪切应力的向上和向下曲线以及表观粘度。延
ii迟、积分和平衡时间分别为5 s、 10s和5min。选择300 s-l下的剪切应力 进行进一步分析。
剪切应力以Pa为单位进行测量。通过定义，粘度等于剪切应力除以 剪切速率。因此粘度和剪切应力成正比，并且^R定剪切应力是在固定剪切 速率300 1/s下测定的，它们则表示相同的特性。
测定后酸化特性的试验
该菌抹的冷冻浓缩物被用于给200 mL从脱脂乳粉(标准培养基)中 再造的乳接种。该乳具有9.5%的干物质含量并且在成批处理中已经被热处 理至99。C保持15分钟。
保加利亚乳杆菌的冷冻浓缩物典型地呈现细胞数在1.109与3.1010 cfu/g之间。接种率为每10 L乳1 g浓缩物，因此在1.105与3.106 cfu/mL 乳之间。在43。C下进行温育直至pH达到4.55，此时该乳已经发生凝固。 发酵的乳然后在定期搅拌下冷却至5°C (通过放在冰浴中20分钟，然后放 在冰箱中)。在大约储存l; 7; 14; 21天后，用pH电极测量冷却的发酵 乳的pH。
制备标准培养基的方法
将脱脂乳粉(Aria Ingredients, Denmark - Milex 240中温奶粉)溶解在 水中不多于30min。制备乳的目标是9.5% (w/w)的干物质。
该乳应当通过下列温度分布进行灭菌
温度(。C) 时间(min)
力口^fe -〉99±1 <20
灭菌 99±1 15±1
冷却 99±1->40±5 <40
随后，该乳应当被储存在〈7。C下。该乳在第二天前不应当被使用。 细菌的繁殖
增加发酵乳中的质地并且后酸化的德氏乳杆菌保加利亚亚种品种的 菌林是众所周知的。这样的菌抹优选地被用作母菌株。乳酸菌菌抹通常作 为液体溶液、作为冻干粉末或者作为冷冻颗粒加入到乳中以使其发酵。釆用标准细胞计数技术，该液体、粉末和颗粒的细菌数可以在每克化6至1E12 个菌落形成单位(1.106至1.1012cfu/g)之间变化。该液体、粉末和颗粒以 大约0.0005至1%的水平加入到乳中。
诱变
细菌例如德氏乳杆菌保加利亚亚种菌抹——其在乳中生长后产生高 的质地而且具有高后酸化——优选地用温和诱变剂例如用EMS(甲磺酸乙 酯)进行化学诱变。EMS导致诱变细菌的基因材料(染色体和质粒)上随 机的碱基对取代。诱变后诱变的培养物在培养基上铺板。
优选的方案将冷冻储存物中的母菌4朱接种在在MRS培养液中在厌 氧下于37。C培养24小时。为了诱变，将过夜的培养物在最大速度下涡旋 1分钟以分开可能的细胞链，并且用EMS (10 ml/ml)在37。C下处理2小 时。EMs导致杀死多于99%的细胞。EMS处理的培养物在-80。C下在20% 甘油中进行冷冻并且该储存物用于篩选。
筛选
几千个菌落被菌落挑选机器人挑选到含有200微升添加有例如pH指 示剂(溴苯酚紫/溴苯酚绿)的乳的微量滴定板中。微量滴定板中每个孔然 后相应着进行模型乳发酵。含有突变体的孔中乳的pH与含有野生型菌抹 (德氏乳杆菌保加利亚亚种菌抹，其在乳中生长后产生高的质地而且具有 高后酸化，例如德氏乳杆菌保加利亚亚种菌抹CHCC3984、 CHCC3606和 CHCC5713 )的相应孔进行比较。例如通过比色分析评定(使用pH指示剂) 或者使用pH电极鉴别出在43。C酸化后乳具有比野生型菌林显著更高的最 终pH的突变体。为了证实突变体导致更低的后酸化，通过在带有标准pH 电极的记录器系统中记录pH进行较大规才莫(200ral)的酸化。
为了控制所获得的突变体具有与母菌抹相同的质地形成潜力，乳样品 用突变体和母菌才朱发酵至相同的最终pH值并且通过标准技术评定和比较 所获得的发酵乳的流变学特性。
实施例1: LB菌抹CHCC7159和CH8535的制备和特性
CHCC7159和CHCC8535是保加利亚乳杆菌(LB)型的乳酸菌。这 些菌林能在工业上相应的条件下使乳酸化并且特征在于低后酸化。菌林CHCC7159是从CHCC3606中获得并与之比较的突变体。CHCC8535是 CHCC5713的并与之比较的突变体。如上所述进行诱变(优选的方案)和 筛选。
CHCC7159、 CHCC8535、 CHCC3606和CHCC5713的冷冻浓缩物祐二 用于给200 mL从脱脂乳粉中再造的乳接种。该乳具有9.5%的干物质含量 并且已在成批处理中被热处理至99。C保持15分钟。保加利亚乳杆菌的冷 冻浓缩物典型地呈现细胞数在1.109与3.101Q cfu/g之间。接种率为每10 L 乳1 g浓缩物，因此在1.105与3.106 cfu/mL乳之间。在43。C下进行温育直 至pH达到4.55，此时该乳已经发生凝固。发酵的乳然后被冷却至5。C。
pH-时间图表明CHCC8535在小于20小时中达到pH 4.60，这证明该 菌抹能在工业上相应的接种和温育条件下使乳酸化(图1)。
pH-时间图表明CHCC7159在大约21小时中达到pH 4.60，这证明该 菌林能在工业上相应的接种和温育条件下使乳酸化(图2)。
CHCC7159和CHCC8535在整个发酵期间比其各自母菌抹酸化得低。 CHCC8535显示20小时后pH为4.17，其比母菌林高0.32 pH单位。 CHCC7159显示20小时后pH为4.64,其比母菌抹高0.50 pH单位。
CHCC7159和CHCC8535能在发酵乳中产生提高的质地
温育后的那天，发酵的乳升温至13。C并且通过带有孔的圆盘的棒轻轻 搅拌直至样品均匀。样品的流变特性是在在安装有C25同轴测量系统的流 变4义(StressTech, Reologica Instruments, Sweden)上进4亍确定。粘度测定 是用剪切速率在21步幅0.27变至300 1/s进行的。剪切速率先增加后降低， 并且记录了剪切应力的向上和向下曲线以及表》见粘度。延迟和积分时间分 别为5 s和10 s。选择300 s-l下的剪切应力进行进一步分析。用CHCC7159 和CHCC8535的浓缩物温育的发酵乳比用其各自母菌^^生产的发酵乳具有 更好的质地(图3)。对于这两种突变体菌抹记录的剪切应力值平均为45 和55 Pa，而它们的母菌林的剪切应力值大约在40 Pa或以下。
结论
菌抹CHCC7159和CHCC8535结合了下列特性*能在发酵乳中产生高的质地——在测试实验条件下比40 Pa高
能在小于24小时中使乳酸化至pH4.60。
*在测试实验条件下20小时后达到比4.15高的pH。
实施例2: LB菌株CHCC10019的制备和特性
CHCC10019是保加利亚乳杆菌型的乳酸菌。CHCC10019能在工业上 相应的条件下使乳酸化并且特征在于低后酸化。菌林CHCC10019是从 CHCC3984中获得的并与其比较的突变体。如上所述("优选的方案")进 行诱变和筛选。所用的诱变剂是EMS。
CHCC10019和CHCC3984的过夜培养物是通过给10 mL从脱脂乳粉 再造的乳接种制备的。该乳具有9.5%的干物质含量并且在成批处理中已经 被热处理至99。C保持15分钟。生物材料是从各自菌林的冷冻安瓿中取出 的。在37。C下温育24小时。
CHCC10019和CHCC3984的过夜培养物被用于给200 mL从脱脂乳粉 再造的乳(标准培养基)接种。所用的乳与上述相同。转接的量为1%。 对于每个菌林两瓶乳被温育。 一瓶用于获得酸化曲线；第二瓶用于获得用 于测定流变学特性的产品。
保加利亚乳杆菌的过夜培养物典型地呈现细胞数在1.106与1.108 cfU/g 之间。接种率为每100 g乳1 g过夜培养物，因此在1.104与1.106 cfu/mL 乳之间。
在43。C下温育20小时。在相同条件下制备的第二瓶在43。C下温育直 至pH达到4.55，此时该乳已经发生凝固。该瓶-敗冷却至5。C直至第二天进 行流变学特性分析。
pH-时间图表明CHCC10019在大约7小时30分钟中达到pH4.50,这 证明该菌林能在工业上相应的接种和温育条件下能使乳酸化，参见图4。
CHCC10019在整个发酵期间比其母菌抹酸化得低。CHCC10019显示 20小时后pH为4.22，其比母菌抹高0.64pH单位。
CHCC10019能在发酵乳中产生提高的质地
温育后的那天，发酵的乳升温至13。C并且通过带孔的圓盘的棒轻轻搅
15拌直至样品均匀。该样品的流变学特性如实施例1中所述进行评定。对于
结果参见图5。用CHCC10019温育的发酵乳比用CHCC3984生产的发酵 乳具有更好的质地。对于该突变体菌林记录的剪切应力值平均地为45Pa， 而它们对于母菌林为大约35Pa。
CHCC7159在2006年2月8日被保藏在Deutsche Samml皿g von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM)并给予了保藏编号DSM 17959。 CHCC3606、 CHCC5713和CHCC8535在2006年3月30日被保藏 在DSM，并且分別给予了保藏编号DSM 18142、DSM 18143和DSM 18144。 CHCC10019和CHCC3984在2007年4月03日被保藏，并且分别给予了 保藏编号DSM 19252和DSM 19251。所有的保藏都是根据国际承认用于 专利程序的微生物保存布达佩斯条约进行的。
本文描述了本发明优选的实施方式，包括发明人已知的实施本发明最 好的方式。阅读前面的说明书后，那些优选实施方式的变化对本领域技术 人员来说可能变得显而易见。本发明人预期到技术人员会应用这样的合适 的变化，并且本发明人意图本发明以本文所特别描述的之外的方式进行实 施。因此，如可适用法律所允许，本发明包括在附在此处的权利要求书中 所引用的主题的所有变化和等价物。而且，在其所有可能的变化中上述元 素的任意组合都^fe本发明所包括，除非本文另外指明或者上下文另外清楚 地相矛盾。
参考文献
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WO2006/063142 EP518096A1EP638642A US5545554A
Guide To Short-Term Tests For Detecting Mutagenic And Carcinogenic Chemicals. Prepared for the IPCS by the International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens. WHO, 1985.
http:〃www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc51 .htm 在本专利中引用的所有参考文献在此引入其全部作为参考。
权利要求
1. 提供德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)菌株的方法，当存在于发酵乳制品时所述菌株比母菌株产生更少的酸，所述方法包括用诱变剂(例如EMS)处理德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株(母菌株)，其中所述母菌株选自具有下列特性的菌株a)高的质地形成特性；和b)高的后酸化特性
2. 权利要求1所述的方法，其中所述诱变剂是温和(或弱)诱变剂。
3. 权利要求1或2所述的方法，其中所述母菌抹选自具有下列特性的 菌林a) 高的质地形成特性，即所述菌林采用测定粘度的试验测量，具有不 小于25的Pa;和b) 高的后酸化特性，即所述菌^MM诸存7天后在标准试验(测定后 酸化特性的试验)中测量的pH降低多于0.20 pH单位。
4. 德氏乳杆菌保加利亚亚种菌林，其可通过任何前述权利要求的方法获得。
5. 德氏乳杆菌保加利亚亚种菌抹，其a) 当存在于发酵乳制品(例如在储存期间)时产生比其它同种高质地 的菌抹更少的酸；和/或b) 将用所述菌林发酵的乳制品的质地增加至比同种低后酸化的菌抹 更高的水平。
6. 根据任何前述权利要求所述的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌林，其a) 在储存14天后在标准试验(测定后酸化特性的试验)中测量的pH 在4.25-4.55的范围内;并且b) 具有不小于25的釆用测定粘度试验以Pa测量的质地形成特性。
7. 根据任何前述权利要求所述的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌林，其 a)在储存14天后使在标准试验(测定后酸化特性的试验)中测量的pH降低小于0.30 pH单位；并且b)具有不小于25的采用测定粘度试验以Pa测量的质地形成特性。
8. 根据任何前述权利要求所述的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌林，其a)在8摄氏度下储存7天后使在标准试验(测定后酸化特性的试验) 中测量的pH降低小于0.20 pH单位；并且b )具有不小于25的采用测定粘度试验以Pa测量的质地形成特性。
9. 德氏乳杆菌保加利亚亚种菌抹，其选自由以下组成的组 CHCC10019 (DSM19252 ); CHCC8535 (DSM18144);和CHCC7159(DSM17959);以及这些菌林中任一种的突变体，例如功能相当的突变体， 如具有基本上/本质上相同的后酸化和质地形成特性的突变体。
10. 德氏乳杆菌保加利亚亚种菌抹，其选自由以下组成的组 CHCC10019 (DSM9252 ); CHCC8535 (DSM18144);和CHCC7159(DSM17959 );以及这些菌抹中任一种的突变体，其a) 在8摄氏度下储存7天后在标准试验(测定后酸化特性的试验)中 测量的pH降低小于0.20 pH单位；并且b) 具有不小于25的采用测定粘度试验以Pa测量的质地形成特性。
11. 德氏乳杆菌保加利亚亚种菌林CHCC7159或它的具有基本上/本质 上相同的后酸化和质地形成特性的突变体。
12. 德氏乳杆菌保加利亚亚种菌抹，其选自由以下组成的组 CHCC3984 (DSM19251); CHCC3606 (DSM 18142)和CHCC5713 (DSM 18143);以及这些菌林中任一种的突变体，例如功能相当的突变体，如具 有基本上/本质上相同的后酸化和质地形成特性的突变体。
13. 德氏乳杆菌保加利亚亚种菌抹，其选自由以下组成的组 CHCC3984 (DSM19251); CHCC3606 (DSM 18142)和CHCC5713 (DSM 18143);以及这些菌林中任一种的突变体，所述突变体具有不小于25的采 用测定粘度试验以Pa测量的质地形成特性。
14. 通过包括将根据任何前述权利要求所述的菌林与乳混合的方法获 得的乳制品。
全文摘要
本发明涉及具有低的或降低的后酸化特性的乳酸菌，以及制备这样的细菌的方法。此外，本发明涉及这样的细菌在制备发酵的乳制品上的应用，以及含有所述细菌的乳制品。
文档编号A23C9/123GK101472481SQ200780022740
公开日2009年7月1日 申请日期2007年6月22日 优先权日2006年6月23日
发明者安妮特·希勒·约翰森, 尼尔斯·班·斯姆森·詹森 申请人:科.汉森有限公司