重组乳杆菌及其用途的制作方法

专利名称：重组乳杆菌及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组乳杆菌Lactobacillus)及其用途。重组乳杆菌包括编 码螨变应原(mite allergen)的至少免疫原性片段或其免疫原性同源物的 异源核酸序列。本发明也涉及调节哺乳动物对变应原的免疫应答的方法、 药物组合物及药盒。
背景技术：
认为变应性疾病影响发达国家中25%至40%的人口 ，多于一半的美国 人对一种或更多种变应原过敏。在英国，变态反应速率以每年大约5%的 速率飞速增加(尤其是在儿童中)。变态反应如变应性鼻炎(花粉症)、哞 喘和荨麻疹是免疫系统应答(即免疫系统对各变应原的病理学应答)的过 敏感性。在易感者中， 一般无害物质如草的花粉或屋尘(house dust)导 致免疫应答的过度反应，使得各物质即变应原被视为威胁并且是攻击性的。 对螨类变应原，特别是对房尘螨变应原的敏感性是造成过敏性哮喘、鼻炎 和特应性皮炎的最重要因素之一。对螨变应原的变态反应也可引起花粉症 症状，如喷噢、流鼻涕和眼发痒、含泪眼。螨原变态反应构成了复杂的世 界性问题，具有卫生和经济意义。虽然至少45。/。的美国年轻人和15%的德 国普通人群对尘螨变应原过敏，但螨原变态反应不限于人体"内"环境中。 已经发现更多数的螨类可诱导致敏作用，其症状在职业环境中会遇到。
变应性疾病的特征在于B-淋巴细胞产生称为免疫球蛋白E (IgE)的 抗体类型的能力增强。有证据显示IgE例如在译喘中起主要作用。例如， 以改变的方式应答(其中IgG和IgG4免疫球蛋白而非IgE的水平升高) 的儿童或成人患哮喘的风险不增加。IgE的合成是T辅助细胞的亚型CD4+和B细胞合作的结果。T细胞在例如特异反应性过敏中起中枢作用，并且 由2型辅助T细胞(Th2)合成的细胞因子是疾病的主要发病机理。已假 设"变态反应-促进"Th-2细胞和"抗感染"Th-l细胞间的平衡转换可能 参与变态反应的起始。Th-l细胞产生干扰素(IF) -Y、白细胞介素(IL) -2和肿瘤坏死因子(TNF) - P ，而Th-2细胞产生IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-10 和IL-13。目前用于变态反应的疫苗设计的治疗和预防策略调整为通过促 进Th-l或T调节(Tr)细胞(其能下调Th-2效应期)的发育而进行免疫 调节恢复。
变态反应倾向个体第一次暴露于变应原时，他的或她的免疫系统产生 大量的相应IgE抗体。这些IgE分子结合到肥大细胞(组织中)或嗜碱性 细胞(循环中)表面的高亲和力Fc受体(FcsRI)上。随后暴露于变应原 引起变应原结合并与这些IgE分子交联，导致例如各肥大细胞的激活。这 引起其中组胺和新形成介质如前列腺素和白三烯的快速释放。
作为欧洲和澳大利亚及全世界室内变应原来源的最重要螨类是屋尘螨 (Dermatophagoides pteronyssinus) ( Der p )。该物种的主要变应原是蛋 白质Derp 1和Derp2。在热带和亚热带区域，最相关的螨类是热带无爪 螨(Blomia tropicalis ) ( Bt )。在这些亚热带区域，对Derpl、 Der p 2和 Blot5的螨原多致敏作用是高度盛行的。目前的治疗包括使用緩解症状的 类固醇和使用螨粗提物的免疫疗法，两者均具有关于效率和顺应性的问题。 照这样，长期需要改善并有效的治疗策略。
目前，处理螨原变态反应的最重要方面是减少对螨的暴露。这包括降 低室内温度和湿度水平、使用高度过滤真空吸尘器、经常清洗床上用品并 避免倾向于灰尘聚集的东西如墙帷、地毯、书等。目前的治疗方法包括使 用组胺H受体拮抗剂、减充血剂或两者的组合。拮抗剂和组胺H受体特 别是Hi受体的逆激动剂(因此称作"抗组胺剂") 一旦变应原结合到肥大 细胞和嗜碱性细胞的表面IgE上，即从肥大细胞和嗜碱性细胞中释放，干 扰组胺的作用。然而，抗组胺剂仅在变应原攻击前施用才有效。
减充血剂通过收缩供应鼻膜内层的血管来减轻鼻膜肿胀。它们因而减轻与变态反应(和冷)相关的症状之一:鼻子不通气，而没有解决变态反应 潜在的机理。鼻腔喷雾如局部鼻类固醇和色甘酸钠也可用于治疗变态反应 症状。免疫疗法(也称为脱敏作用或变态反应注射(allergy shot))是定期 应用少但升高量的变应原。相信其可增加免疫系统对各变应原的耐受性。 已发现免疫疗法在不同程度上有效。然而它的有用性受潜在副作用，特别 是过敏反应和可得变应原提取物的相对原始性质的限制。在克服这些问题 的尝试中，来自植物和树的变应原的天然发生的同种型显示因氨基酸替代 或缺失，其结合IgE的能力降低。
此外，已报道了乳酸产生菌对变态反应发展的抑制效应。已发现热灭 活的L. paracasi 33和嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)减少变应性鼻炎的症 状(Peng， G-C等，Pediatric Allergy and Immunology, (2005), 16， 433-438; Ishida， Y等，J. Dairy Sci. (2005)， 88， 527-533 )。已经净艮道了施用L. paracasei GM-080降低吸入纯化的Der p 5的小鼠中的IgE水平(美国专 利6,994,848 )。已经提示组合应用干酪乳杆菌(L. casei casei)和葡聚糖， 而不是单独应用干酪乳杆菌可防止花粉特异性IgE、活化调节趋化因子 (TARC)和干扰素y (IFN-Y)水平的增加(Ogawa， T.等，FEMS Immunol. Med. Microbiol. (2006)， doi: 10.1111/j.l574-695X.2006.00046.x )。 Murooka等利用编码变应原Der f 1和Der f 7的载体转化了干酪乳杆菌 K95-5和植物乳杆菌(L. plantarum) NCL21 ( JP 2002- 281966 )。 Kruisselbrink等(Clin. Exp. Immunol. [2001，126-128)还检测了鼻内施 用重组植物乳杆菌256的效应，所述重组植物乳杆菌256表达对C57BL/6 小鼠呈免疫显性的Der p 1的T细胞表位。在处理的小鼠中除了观察到Th-2 细胞因子IL-5的降低，还观察到具有一些Th-1性质的肽特异性T细胞的 诱导作用。
因此，目前螨原变态反应的治疗不令人满意，并且疾病的预防是不可 能的；因此长期需要改善并有效的治疗和预防策略。
因此，本发明的目标是提供适合于调节螨原变态反应中免疫应答的方 法。该目标通过所附独立权利要求书的主题来解决。
12发明概述
一方面，本发明提供重组乳杆菌。所述重组乳杆菌包括异源核酸序列。
该核酸序列编码Der p 1 、 Der p 2和Blo t 5中任何一种螨变应原的至少免 疫原性片段，或其免疫原性同源物。所述核酸序列因此可编码完整的螨变 应原，或其对应的免疫原性同源物。本发明也提供重组乳杆菌用于治疗的 用途。
另一方面，本发明提供药物组合物。所述药物组合物包括如上所述的 重组乳杆菌，和可药用载体或稀释剂。
另一方面，本发明提供药盒。所述药盒包括如上所述的组合物。它还 包括变应原或其免疫原性片段。
另一方面，本发明提供调节哺乳动物对变应原的免疫应答的方法。所 述方法包括施用如上所述的组合物。
另一方面，本发明涉及如上所述的重组乳杆菌在制备用于调节对变应 原的免疫应答的药物组合物和药盒中的用途。
附图简述
结合非限制性实施例以及附图的详细说明，将更好地理解本发明，在 所述图中


图1示意性描述了乳杆菌/大肠杆菌(E. coli)穿梭载体(A)和用于 产生尘螨变应原(dust mite allergen )表达构建体的中间载体。 图2示意性描述了其他乳杆菌/大肠杆菌穿梭载体。 图3显示了本发明的重组乳杆菌中包含的其他表达载体。 图4显示本发明的重组乳杆菌中包含的另一个表达载体。 图5显示蛋白质免疫印迹检测Der p 2在两个乳杆菌菌林:干酪乳杆菌 Shirota和鼠李糖乳杆菌gg中的异源表达。
图6显示干酪乳杆菌Shirota画eGFP移位到淋巴集结的T细胞和B细 胞区域中。图7通过透射电子显微术显示完整的千酪乳杆菌Shirota-eGFP移位到 淋巴集结的单形和多形细胞的液泡(vacoule)中。
图8显示在体外与干酪乳杆菌Shirota共培养的T细胞中诱导产生 TGF画p。
图9描述Der p 2特异性T细胞增殖，以及调节性CD4+CD25+ T细胞 在重组Lc/Dp2饲喂小鼠中增加。
图IO描述用于动物研究的预防方案。
图11显示Derp2特异性免疫球蛋白应答。
图12描述脾T细胞的细胞因子谱。
图13描述肠系膜淋巴结(MLN)细胞的细胞因子谱。
图14显示小鼠中细支气管(broncholalveolar)肺泡灌洗液(BALF) 的细胞因子i普。
图15描述小鼠中BALF分析和肺的组织学。
图16描述用于动物研究的治疗方案。
图17显示小鼠中Derp2特异性免疫球蛋白应答。
图18显示脾T细胞中所选细胞因子的语。
图19显示肠系膜淋巴结细胞中所选细胞因子的镨。
图20描述肺中的病理生理学变化和细支气管液体分析。
图21显示BALF的细月包因子的"i普。
图22描述用Derp2变应原预先致敏的小鼠治疗模型。
图23显示全身免疫球蛋白应答和T细胞细胞因子。
图24显示治疗模型假说。
图25显示用于分析皮下引发对小鼠的效应的实验方案原理图(未应用 佐剂)。
图26描述小鼠中Derp2特异性体液应答的动力学。
图27描述在脾CD4+T细胞的细胞因子镨上的RT-PCR分析。
图28描述培养物中淋巴结的细胞因子语。
图29显示SP培养物的细胞因子语。图30描述抗原特异性TH2细胞与CD4+CD25+细胞共培养后的增殖和 细胞因子应答。
图31描述用于使用表达Blo t 5变应原的重组干酪乳杆菌Shirota的动 物研究中的方案。
图32描述通过ELISA分析Blo 15特异性血清免疫球蛋白(也参照图
31 )。
图33描述在图34描述的方案中处死的小鼠的细胞因子分析。
图34描述表达载体pLP400中变应原Blo t 5的核酸序列和氨基酸序列。
图35描述表达载体pLP500中变应原Derp2的核酸序列和氨基M列。
表I描述通过实时PCR测定的脾CD4+ T细胞的TH2细胞因子镨。 发明详述
本发明提供重组乳杆菌。乳杆菌是众所周知的形态从长细棒状变化至 短球杆菌的革兰阳性菌，其经常形成链。本发明的重组乳杆菌可以是任何 乳杆菌。目前已知91种乳杆菌属。各乳杆菌的实例包括但不限于，干酪乳 杆菌、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus )、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum )、 力口氏享L軒菌 (Lactobacillus gasseri )、 戊糖乳才干菌
(Lactobacillus pentosus )、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum )、孢子 享L軒菌(Lactobacillus sporogenes )、短乳軒菌(Lactobacillus brevis )、德、 氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii )、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius )、 希氏乳杆菌 (Lactobacillus hilgardii )、 乳酸乳杆菌
(Lactobacillus lactis )、 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus )、 约氏 乳杆菌(Lactobacillus johnsonii )、莱氏乳杆菌(Lactobacillus leishmanis )、 唐氏乳軒菌(Lactobacillus jensenii )、路氏孚L軒菌(Lactobacillus reuteri )、 沙克乳杆菌(Lactobacillus sakei )、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus )、 纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus )、巻曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus )、 高力口索乳軒菌(Lactobacillus caucasicus )和瑞士乳才干菌 (Lactobacillus helvetieus )，以这些为例。虽然许多乳杆菌，如路氏乳杆 菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌能够在胃肠道中建群，即为"可 移植的"，但认为一些乳杆菌如保加利亚德氏乳杆菌(L. delbrueckii bulgaricus)和乳酸乳杆菌(L. lactis )是暂时非移植的菌丛。本发明适用 于本发明乳杆菌的任一菌抹，无论所述菌林是可移植的还是不可移植的。 为方便使用(参照下文)，在一些实施方案中期望选择能够移植的菌林。
可使用各乳杆菌的任何亚种和菌林。作为示例性实例，有几种已知的 干酪乳杆菌亚种，如干酪乳杆菌干酪亚种(L. casd subspecies casei)、干 酪乳杆菌副酪亚种(L. casei subspecies paracasei )。干酪乳杆菌菌林的实 例包括千酪乳杆菌菌抹KE99、干酪乳杆菌菌林CRL 431、干酪乳杆菌菌 林BL155、干酪乳杆菌菌林Shirota和干酪乳杆菌N19。鼠李糖乳杆菌菌 抹的实例包括但不限于鼠李糖乳杆菌菌林MTCC 1408、鼠李糖乳杆菌菌 抹HN001 、鼠李糖乳杆菌菌林Lcr35和鼠李糖乳杆菌菌抹GG。也称为 乳杆菌GG ( Gorbachi & Goldini)的鼠李糖乳杆菌GG最初分类于嗜酸乳 杆菌。已提示其分类为干酪乳杆菌并也已计划重分类为特殊种L.zeae。在 下文中将其称为鼠李糖乳杆菌GG。
重组乳杆菌包括异源核酸序列，其编码螨变应原的至少免疫原性片段， 或其免疫原性同源物。因此，各核酸序列对应多肽的氨基酸序列。因而，
关于变应原的"片段"指存在于各变应原的多肽中的任何氨基酸序列。在 一些实施方案中，术语"片段"指缺少翻译后修饰，如糖或糖链，其存在 于各天然发生的变应原中。在此类实施方案中，各变应原片段的氨基, 列可是为任何长度，无论是变应原的任何天然发生形式的全长或部分全长 序列(包括变体)。在其他实施方案中，术语"片段"指存在于各变应原的 多肽中的任何氨基酸序列，其比变应原的天然发生形式的全长序列短。各 变应原的天然发生形式理解为成熟的全长蛋白质，其通常来自前体蛋白质。 作为变应原Der p 1 a前酶原(preproenzyme，称为DERP1—DERPT )的示例性实例，已知其存在于体内，其为UniProtKB/Swiss-Prot登录号 P08176 (二级登录号Q24616)和NCBI登录号AAB60215的前体。该前 体为320个氨基酸，然而NCBI登录号2AS8—A和2AS8—B的成熟并完全 活化的变应原Der p 1为222个氨基酸。已知其他螨变应原的类似前体， 如UniProtKB/Swiss-Prot登录号P49278 (称为ALL2—DERPT )的变应原 Derp2前体(DerpII) (DPX)。在此类实施方案中，在各天然发生的变 应原中发现的翻译后修饰可能以任何程度存在于片段中。
在一些实施方案中，本发明乳杆菌中包括的核^列编码螨变应原片 段，其包括至少8%的天然发生的(即成熟的全长蛋白质，各螨变应原的 形式)氨基酸序列。作为示例性实例，重组乳杆菌可包括编码螨变应原Der pl的至少免疫原性片段(或其各自的免疫原性同源物)的异源核酸序列。 所述片段在该情况下可包括至少8%的Derp 1的氨基酸序列。在这些实施 方案的一些中，该片段因而可包括氨基^列的任何一个或多个部分，所 述氨基酸序列对应8-100%，如10-100%、例如15-100%，包括25-100% 的天然存在螨变应原的完整氨基酸序列。在一些实施方案中，该片段因而 可包括部分，其为天然存在螨变应原氨基酸序列各部分的免疫原性同源物 (参照下文)。
当提及核酸序列或分子时，术语"异源的，，指不是已经引入(或正在 引入)所述核酸分子的对应杆菌或细胞中天然发生的核酸序列。异源核酸 序列因而来自对应杆菌和细胞之外的来源，并可天然发生和非天然发生。 各异源核酸序列例如可整合到乳杆菌染色体中或整合到存在于乳杆菌中的 任何其他核酸分子(如载体(参照下文)或RNA分子)中。
螨变应原基于它们的生化组成、序列同源性和分子量分为特定的组。 表征的变应原的名称是属的前三个字母，种名称的第一个字母和最后的编 号。最后的编号表示分离变应原的顺序或与其同源的其他已经表征过的变 应原的编号。本发明乳杆菌中包括的异源核酸序列完整编码的螨变应原片 ,殳或各免疫原性同源物形式的螨变应原，通常为Derpl、 Derp2和Blot 5。作为示例性实例，重组乳杆菌可以是千酪乳杆菌，并且其中包括的异源核酸序列可编码螨变应原Derp2。
如上早已表明，本发明重组乳杆菌中包括的异源核酸序列编码螨变应 原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。如此处所用，术语"变应 原"指能诱导个体或动物中变态反应的分子。如上所述，变应原能诱导免 疫应答，即刺激淋巴细胞产生抗体或直接攻击变应原。因此，变应原是由 免疫系统识别的抗原，并可引起变态反应。该变态反应可通过与变应原任 何形式的直接接触如摄食(例如进食或饮水)、吸入或例如经皮肤直接接触 引起。通常，包括变应原的抗原为多肽，如蛋白质，或多糖。在本发明的 上下文中，术语抗原指任何多肽，其可包括任何j务饰，如糖或脂类。它也 指称为半抗原的短肽，其通常偶联到比半抗原大的栽体分子(例如蛋白质) 或偶联到细胞上。
如此处所用，术语"免疫原性的"指引起免疫应答的物质的能力，即 成为免疫活性的能力。因此，当在一些实施方案中用于变应原的片段时， 对应片段其自身能引起免疫应答，例如当向个体或动物施用时。然而应指 出变应原的免疫原性片段自身不需要具有引起免疫应答的能力。在一些实 施方案中具有免疫活性的能力更依赖于偶联到额外物质上的片段。在一些 实施方案中，该偶联到额外分子例如通过结合至蛋白质在体内发生。因此， 在一些实施方案中，变应原的免疫原性片段包括，或为半抗原，其需要偶 联到载体分子上或偶联到细胞上以显示其免疫原性质。当变应原的免疫原 性片段包含在异源核酸序列中时，其因而可以为任何序列长度或大小，只 要所获的肽(其在体外、离体或体内转录和翻译)无论其自身或当与额外 物质偶联时能引起免疫应答。在典型实施方案中，螨变应原或其片段能结 合至少一个IgE抗体。各抗体例如可通过个体或动物的抗体对螨类如粉尘 螨为变应性的或敏感性的。通常，变应原的各片段包括至少一个表位。然 而在一些实施方案中，可能需要组合变应原的两个或更多片段以获得各表 位，例如当偶联到相同的载体分子上时。也称为抗原决定簇的表位是抗原 分子的一部分-在该情况下抗原分子可由抗体的抗原结合位点或通过T细 胞受体识别并结合。不同的抗体和T细胞受体结合抗原的不同表位。例如
18Der p 2的两个表位是已知的，来自患有变应性鼻炎的日本患者的T细胞 能结合到所述表位上，已知其他两个表位被来自相同患者的T辅助细胞结 合。
如此处所用，当用于螨抗原或其免疫原性片段时，术语"免疫原性同 源物，，意思是与各天然存在的螨抗原具有高度同源性的多肽，并且其可被 对相应天然存在的螨抗原有活性的至少一种抗体或T细胞受体特异性识别 并结合。在典型的实施方案中，该片段与天然存在的螨抗原(包括其免疫 原性片段)的对应氨基酸序列具有至少60%的序列同一性。在一些实施方 案中，各片段与天然存在的螨抗原的对应氨基酸序列具有至少80%、如至 少85%、至少卯％或至少95%的序列同一性。"序列同一性"指测量它们 相似性或关系的序列性质。该术语指在已知螨抗原的氨基酸序列或核 列与分别正在讨论的氨基酸序列或核酸序列进行同源性比对后获得的配对 相同残基的百分比，其中所述百分比数字指两条序列中较长序列中残基的 数目。
本发明也包括的是与上文的核酸序列基本互补的核酸序列。如此处所 用，"基本互补"指这样的事实，给定的核酸序列与另一条核酸序列至少 卯％，例如至少95%，并在一些实施方案中100%互补。术语"互补"或 "互补序列"指可相互形成多个有益的相互作用的两个核苷酸。该多个有 益相互作用包括沃森-克里克碱基配对。核苷酸序列是另一条核苷酸序列的 互补序列，如果第一条序列的所有核苷酸与第二条序列的所有核苷酸互补 的话。
在一些实施方案中，重组乳杆菌还能表达螨变应原的至少免疫原性片 段，或其各免疫原性同源物。在此类实施方案中，编码变应原、片段或其 免疫原性同源物的各序列可有效连接到在宿主细胞中有效启动转录的启动 子上。重组核酸也可包含在细胞中起作用的转录起始区、与编码激酶多肽 的RNA序列互补的序列和在细胞中起作用的转录终止区。在一个实施方 案中，重组乳杆菌表达螨变应原、或其片段、或各免疫原性同源物。
可通过向其中引入异源核酸序列从天然发生的乳杆菌中获得重组乳杆菌。作为示例性实例，编码螨变应原的至少免疫原性片段或其免疫原性同 源物的序列可包括在异源序列分子(如异源多核苷酸)中。编码本发明变
应原的核酸分子和有效连接的启动子可作为非复制DNA或RNA分子引入 到乳杆菌中，所述分子可以是线性分子或闭合共价环状分子。作为示例性 实例，DNA分子可稳定整合到乳杆菌的染色体中。可使用载体，其能将期 望的基因序列整合到乳杆菌的染色体中。作为示例性实例，在美国专利 5,747,310中已公开了使用质粒pAMpi将L-乳酸脱氢酶基因整合到德氏乳 杆菌的染色体中替代D-乳酸脱氢酶。期望时，也可通过引入一个或更多标 记物来选择它们染色体中已经稳定整合有引入的DNA的乳杆菌，所述标 记物允许选择含有表达载体的宿主细胞。
如此处所用，术语"核酸分子"指任何可能构型(如单链、双链或其 组合)的任何核酸。核酸包括例如DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA )、 RNA分子(例如，mRNA )、使用核苷酸类似物或使用核酸化学产生的DNA 或RNA类似物和PNA (蛋白质核酸)。DNA或RNA可以是基因组或合 成来源，并可以是单链或双链的。在本发明中，RNA或DNA通常但不必 须包括在重组乳杆菌中。此类核酸分子可以是例如mRNA、 cRNA、合成 RNA、基因组DNA、 cDNA、合成DNA、 DNA和RNA的共聚物、寡核 苷酸等。各核酸分子可进一步含有非天然核苷酸类似物和/或连接到亲和标 签或标记物上(参照上文)。
许多核苷酸类似物为已知的并可存在于本发明乳杆菌包括的核酸序列 中。核苷酸类似物是例如在碱基、糖或磷酸部分含有修饰的核苷酸。作为 示例性实例，已知用2'F、 2'O-Me或2'H残基替代siRNA的2'-OH残基 来提高各RNA的体内稳定性。碱基部分处的修饰包括A、 C、 G和T/U、 不同噤呤或嘧咬碱基(如尿嘧啶-5-基、次黄嘌呤-9-基和2-氨基腺噤呤-9-基及非嘌呤或非嘧咬核苷酸碱基)的天然修饰及合成修饰。其他核苷酸类 似物为通用碱基。通用碱基包括3-硝基吡咯和5-硝基吲哚。通用碱基能与 任何其他碱基形成碱基对。碱基修饰经常与例如糖修饰(如2'-0-甲氧基乙 基)组合例如来实现独特性质(如提高的双链体稳定性)。在一些实施方案中，异源核酸可包括在异源核酸分子(例如质粒或载 体)中，其不整合到乳杆菌的染色体中。因此，在该情况下，重组乳杆菌 除它的染色体外还包括异源核酸分子。各载体可含有一种或更多调节序列， 如启动子、增强子、沉默子或终止子序列。此类调节序列可控制(例如便 于)载体复制或编码序列的转录和/或翻译。各载体的示例性实例是表达载 体。在一些实施方案中，变应原可处于诱导型启动子的控制下。作为示例 性实例，由抗微生物肽乳链菌肽控制的表达系统已经用于植物乳杆菌中
(Pavan， S. 等，Applied and Environmental Microbiology (2000) 66， 4427-4432)。在其他实施方案中，变应原可以以组成型活性方式表达。作 为示例性实例，保加利亚德氏乳杆菌PrtB启动子控制下的蛋白酶PrtB和 破伤风毒素模拟表位的融合蛋白在约氏乳杆菌中的組成型表达已经由 Scheppler等公开(Vaccine [200220， 2913-2920 )。
术语"载体"涉及单链或双链环状核酸分子，其可引入(例如转染) 至细胞中并在细胞基因组中复制或独立复制。可切割环状双链核酸分子， 并因而在限制性内切酶处理后将其线性化。本领域^支术人员可容易地获得
多种核酸载体、限制性内切酶和限制性内切酶切割的核苷酸序列的知识。 可通过用限制性内切酶切割并连接两段将编码变应原或其片段的核酸分子 插入到载体中。例如已基于来自乳酸产生细菌的隐蔽性质粒发展了 ^艮多载 体(对于综述参照Shareck等，Critical Reviews in Biotechnology (2004)， 24,155-208)。隐蔽性质粒为染色体外DNA元件，其除了它们的复制功能 外不具有任何明显功能，即不编码可辨别表型。a复制和e复制质粒是乳 酸产生细菌中最常见质粒。
起源于植物乳杆菌的隐蔽性质粒的实例包括但不限于pcaT、 pAl、 pLPl、 p8014-l、 pC30il、 pLB4、 pLP2000、 pLP卯00、 pLKL、 pLKS和 pMD5057。起源于发酵乳杆菌的载体的实例包括但不限于pLY2、 pLY4、 pLEM3、 pLF1311和pKC5b。起源于嗜酸乳杆菌的隐蔽性质粒的实例包 括但不限于pl、 p3、 pPM4、 pLA103、 pLA105和pLJ106。来自其他乳 杆菌种的许多其他隐蔽性质粒为本领域已知(参照例如Shareck等，上文)。
21任何上述质粒可用于产生载体(包括表达载体)以获得本发明的乳杆菌。
来源于植物乳杆菌的隐蔽性质粒的实例包括但不限于pcaT、 pAl、 pULP8、 pULP9、 pLP825、 pLP82H、 pLPC37、 pPSCl、 pPSCll、 pPSC22、 pLPV106、 pLPIII、 pLEM5、 pLEM7和pLFVM2，仅以这些为例。起源于发酵乳杆 菌的隐蔽性质粒的实例包括但不限于pLY2、 pLY4、 pLEM5、 pLEM7、 pLFVM2和pSPl。
如上述实例之一的隐蔽性质粒，例如可用于构建穿梭载体，所述穿梭 载体可用于获得本发明的重组乳杆菌。作为示例性实例，从干酪乳杆菌中 分离的隐蔽性质粒pLC494已经用于使用分离的质粒pLC494和分离的产 气荚膜杆菌/大肠杆菌质粒pJIR418通过遗传改造技术构建乳杆菌/大肠扞 菌穿梭载体(pJLE4941 ) (An， H-Y， Miyamoto, T" Plasmid (2006) 55， 128-134)。各穿梭载体可在各自的宿主物种，即大肠杆菌和乳杆菌中复制。 乳杆菌/大肠杆菌穿梭载体的另一个示例性实例是从保加利亚德氏乳杆菌 质粒pLB10和大肠杆菌质粒pBR328构建的质粒pLE16。起源于隐蔽性质 粒的表达载体的两个其他示例性实例是pLP400和pLP500，其为两个其他 乳杆菌/大肠杆菌穿梭载体。作为另一个实例，大肠杆菌表达载体pLF22 通过包括来自发酵乳杆菌的隐蔽性质粒pLF1311的复制子已经适用于乳 杆菌中。
作为获得本发明重组乳杆菌的示例性实例，螨变应原基因Der p 2可 经遗传改造并克隆至pL500乳杆菌/大肠杆菌穿梭载体(参照图1和以下实 施例)或对应的载体pL400中。pLP400和pLP500穿梭载体含有来自乳 杆菌DNA序列的表达信号和复制元件。携带Der p 2基因的这些重组栽体 pLP400和pLP500可引入乳杆菌中。将核酸引入乳杆菌的多种方法为本 领域技术人员已知，如转化、转染、注射或电穿孔。各载体例如经电穿孔 进入乳杆菌如干酪乳杆菌Shirota (L.c)或鼠李糖乳杆菌gg ( L. gg )中。 图5显示检测了通过蛋白质免疫印迹，电穿孔后Der p 2在这两个菌抹中 的细胞内表达(图5)。
作为另 一个示例性实例，从质粒pSIP300获得的载体乳杆菌表达载体pSIP308或从质粒pSIP401获得的载体乳杆菌表达载体pSIP412也可经遗 传改造并引入乳杆菌中(参照图3和图4 )。 S0rvig等(Microbiology (2005) 151, 2439-2449 )近期已公开了这些及其他相关表达载体的产生及它们在植 物乳杆菌和沙克乳杆菌中的用途。本领域的技术人员将注意到这样的事实， 可能需要一些修饰以使用这些载体用于其他乳杆菌如干酪乳杆菌或发酵乳 杆菌。
通常，螨变应原是Derpl、 Derp2或Blot5 (也参照下文)。变应原 Der p 1例如可以由NCBI登录号U11695的1099个碱基对序列编码。它 也可以由NCm登录号AY947536的650个碱基对序列或NCBI登录号 AF276239的591个碱基对序列或包括NCBI登录号AY947536的650个碱 基对序列或NCBI登录号AF276239的591个碱基对序列的序列编码。
在螨变应原是Derp2的一些实施方案中，该变应原由SEQ ID NO: 1 的序列编码(参照图35)。在螨变应原是Blot5的一些实施方案中，该变 应原由NCBI登录号U59102的537个碱基对序列或包括NCBI登录号 U59102的537个碱基对序列的序列编码。在螨变应原是Blo t 5的一些实 施方案中，螨变应原的至少免疫原性片段由SEQIDNO:2的序列编码(参 照图34 )。 SEQ ID NO: 2的序列编码UniProtKB/Swiss-Prot登录号096870 (二级登录号Q17283;对应NCBI登录号096870和AAD10850 )的134 个氨基酸序列的117个氨基酸的C末端片段。在一个别的实施方案中，异 源核酸分别包括SEQ ID NO: 1或SEQ ID NQ: 2的序列。在其他实施方案 中，异源核酸包括SEQIDNO:l或SEQIDNQ:2的功能等同物。遗传密 码子的简并性允许某些密码子被定义相同氨基酸的其他密码子替代，并因 此生成相同的蛋白质。核,列大体上可进行变化，因为除曱硫氨酸和色 氨酸外，已知氨基酸可由多于一个密码子来编码。因此，从SEQIDNO:l 或SEQ ID NO: 2的核酸序列获得的部分或完整氨基酸序列可由显著不同 于SEQIDNO: 1或SEQIDNO: 2中显示的核酸序列转录。然而，其编码 的氨基酸序列是保守的。
此外，核酸序列可包括核苷酸序列，其起因于SEQ ID NO: 1和SEQ IDNO: 2的核酸序列5'末端和/或3'末端添加、缺失或替代至少一个核苷酸， 或其衍生物。任何核苷酸或多核苷酸可用于该方面，只要其添加、缺失或 替代不破坏各转录多肽的免疫原性质。作为示例性实例，编码螨变应原的 至少免疫原性片段或其克疫原性同源物的核酸分子必要时具有添加到其5， 末端和/或3'末端的限制性内切酶识别位点。
在一些实施方案中，螨变应原是Derp2，并且异源核酸序列编码Der p2的免疫原性同源物。该异源核酸序列例如可具有与SEQIDNO: 1的核 酸序列具有至少80%同一性的核酸序列(参照上文)。在一些这些实施方 案中，所述异源核酸序列可具有与SEQ ID NO: 1的核酸序列具有至少 卯％同一性(如至少95%的同一性)的核酸序列。相应地，在一些实施方 案中，所述螨变应原是Blot5，并且异源核酸序列编码Blot5的免疫原性 同源物。该异源核酸序列例如可具有与SEQ ID NO: 2的核酸序列具有至 少80%同一性的核酸序列(参照上文)。在一些这些实施方案中，所述异 源核酸序列可具有与SEQ ID NO: 2的核酸序列具有至少卯％同一性(如 至少95%的同一性)的核酸序列。
本发明也展示了如上所述用于治疗的重组乳杆菌。各治疗的示例性实 例是如下详细描述的调节对变应原的免疫应答。在用于治疗的实施方案中， 所述重组乳杆菌以适合于向生物体(例如哺乳动物，如人)施用的形式提 供。作为示例性实例，所述重组乳杆菌可包括在食物中来提供。包括重组 乳杆菌的食物各形式的实例包括但不限于酸乳、酸菜、泡菜、韩国泡菜 (Korean kimchi )、乳酪、酵母酪乳面包和青1^祠料。
适合于施用的各形式的其他实例是药物组合物。本发明的药物组合物 包括如上所述的重组乳杆菌。所述重组乳杆菌可以是任何活性状态。它例 如可以是活的并完全活跃的，进行新陈代谢并复制的(例如参照图25和图 26)。作为其他实例，所述重组乳杆菌至少在一定程度上是例如通过热处理 而灭活的。例如期望热灭活以破坏不耐热的补体蛋白质。在一些实施方案 中，所述重组乳杆菌可以是死的。在一些这些实施方案中，所述重组乳杆 菌因此可以是完整的，无论是活的还是死的。在其他实施方案中，其可以
24是正在分解的或已经分解的。重组乳杆菌的结构例如可以是部分或完全瓦 解的，包括存在任何程度的细胞碎片。
在一些实施方案中，药物组合物包括治疗有效量的重组乳杆菌。如此 处所用，短语"治疗有效量，，指在必要剂量和时期达到期望的治疗结果的 重组乳杆菌的量。施用时，它例如完全或至少一定程度上緩解或减轻正在 治疗的变应性疾病的 一种或更多症状。重组乳杆菌的精确治疗有效量将依 赖于许多因素，包括但不局限于，疾病状态、治疗的受试者年龄、性别和 体重、受试者对各变应原的敏感程度、和变态反应的严重程度、制剂的性 质、和给药途径，并将最终由主治医师或兽医决定。可调整剂量方案以提
供最佳的治疗反应。通常，重组乳杆菌将以每个受体(动物)每天约109 至约10" CFU (菌落形成单位)的范围(如每天约5 x 101() CFU的范围) 给出用于治疗。可接受的每日剂量为每个受体(动物)/天约109 CFU至约 10" CFU，并例如特别约5 x 1010 CFU至约5 x 10" CFU/天。当然，可施 用不同量的药物组合物以实现有效量的施用，或者具有适应相对量的乳杆 菌的药物组合物可用于施用。作为示例性实例，当施用时，药物组合物可 包括适合于达到约5 x 101() CFU至约5 x 1011 CFU重组乳杆菌的每日剂量 范围内的量作为治疗有效量。
在一些实施方案中，药物组合物包括预防有效量的重组乳杆菌。如此 处所用，短语"预防有效量"指在必要剂量和时期达到期望的预防结果(如 当施用时，其完全或至少一定程度上预防正在治疗的变应性疾病的一种或 更多症状)的重组乳杆菌的量。可如上对确定治疗有效量所述来确定预防 有效量。对于任何特定受试者，可根据个体需要和施用或监督组合物施用 的人的专业判断在一定时期内调整特定的剂量方案。对于预防，重组乳杆 菌例如将以每个受体(动物)每天约109 CFU至约101。 CFU的范围(如 每天约5xl(^CFU的范围)给出。作为示例性实例，当施用时，药物组合 物可包括适合于达到约109 CFU至约10" CFU重组乳杆菌的每日剂量范 围内的量作为预防有效量。
药物组合物还包括可药用载体、稀释剂或赋形剂。可使用任何载体或稀释剂，其不消除重组乳杆菌的免疫调节活性。如果需要，可选择载体或 稀释剂，其丝毫不影响重组乳杆菌的免疫调节活性。载体可以是例如包含 水(例如生理盐水)、羧甲基纤维素钠水溶液或聚乙烯吡咯烷酮溶液、乙醇、 多元醇如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇、其合适混合物和植物油的溶剂或 分散介质。合适载体的示例性实例是脂质体。合适赋形剂的实例包括但不 局限于，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸 钙、藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钓、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、 纤维素、水、糖浆和曱基纤维素。药物组合物可额外包括，例如润滑剂(如 滑石、硬脂酸镁和矿物油)、湿润剂、乳化剂和悬浮剂、防腐剂(如苯甲酸 曱酯和羟基苯甲酸丙酯)、甜味剂和调味剂。稳定剂也可包括在药物组合物 中。合适稳定剂的实例包括但不局限于，碱土金属磷酸氢盐、谷氨酸、血 清白蛋白、明胶或酪蛋白。佐剂也可包括在药物组合物中，例如表面活性 物质如十六烷胺、十八胺、十八烷基氨基酸酯、溶血卵磷脂、溴化二曱基
双十八烷基铵、甲氧基十六烷基甘油、和pluronic多元醇、多胺如吡喃、 硫酸葡聚糖、多IC、聚羧乙烯；肽如胞壁酰二肽、二曱基甘氨酸、促吞噬 肽、油乳剂，和矿物凝胶如氢氧化铝、磷酸铝。佐剂可以为，例如铝或含 有植物油的组合物、单油酸异二缩甘露醇酯和单硬脂酸铝的组合物。佐剂 的其他实例包括生物相容基质材料的微粒或珠子。药物组合物可进一步包 括防腐剂，如抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、 苯酚、山梨酸或硫柳汞。
药物组合物可以例如为固体形式(如片剂或丸剂)，或为液体形式。作 为液体形式的示例性实例，包括用于口服施用或通过注射施用的重组乳杆 菌的组合物可以是水溶液、合适的香味糖浆剂、水性混悬剂或油性混悬剂、 或具有食用油如芝麻油、椰子油、棉子油、或花生油的香味乳剂、或酏剂。
在一些实施方案中，药物组合物还包括皮质类固醇、抗组胺剂、白三 烯调节剂、肥大细胞脱粒抑制剂(肥大细胞稳定剂)、减充血剂和P2肾上 腺素受体激动剂的至少 一种。
皮质类固醇通常能降低或清除变应性炎症。将皮质类固醇包括进本发明的药物组合物例如可以靶定呼吸道重塑的预防及哮喘中正常肺功能的实 现。合适皮质类固醇的实例包括但不限于皮质醇、氢化可的松、醋酸氢化 可的松、皮质酮、地塞米松、强的松、曱基强的松龙、氯氟美松酮、曱基 强的松龙、泼尼卡酯、二氟美松、氟轻松、莫米松、倍他米松、氟考龙、
氟轻松、amdnoid、 fluocinoid、 halcinoid、 氟地松和去炎松。
抗组胺剂如Hl-抗组胺剂、H2-抗组胺剂或H4-抗组胺剂是能通过结合 组胺受体阻断组胺效应的分子。组胺通常在免疫应答过程中例如从肥大细 胞释放。已发现一些分子如H2-抗组胺剂甲腈咪胍和硫替丁为反向激动剂 (在H2-受体处)。然而，目前认为大多数抗组胺剂为受体拮抗剂。Hl-抗 组胺剂的实例包括但不限于乙二胺如美吡拉敏(新安替根)或安他唑啉， 乙醇胺如可他敏、卡比沙明、多西拉敏、克立马丁或茶苯海明，烷基胺如 phenirarnine、 氣笨刃卩敏(氣苯刃卩敏)、dexchlorphenamine、 溴苯吡胺或 苯丙烯啶，哌噪如赛克利溱、羟溱、或氯苯甲溱和三环Hr抗组胺剂如普 鲁本近、阿利马嚷(阿利马嗪)、赛庚啶、阿扎他定或氯雷他定。H,-抗组 胺剂的其他实例包括但不限于二曱茚定、新敏乐、阿司咪唑、西替立溱、 左西替利嗪、氯雷他定、咪唑斯汀、特非那定、氯雷他定、地氯雷他定、 非索非那定、氮卓斯汀、左卡巴司汀和奥洛他定。
H2-抗组胺剂的实例包括甲腈咪胍、硫替丁、拉呋替丁、法莫替丁和雷
尼替丁。认为是H4-受体拮抗剂的H4-抗组胺剂的示例性实例是瘗普酰胺。
白三烯是由组织中血液炎症细胞响应变态反应和炎性刺激物而释放的 分子。白三烯调节剂(也称作抗白三烯)通过干扰它们的生物合成或各自 的受体降低白三烯的效果。白三烯调节剂具有细支气管舒张作用和抗炎作 用。合适的白三烯受体拮抗剂的实例包括但不限于孟鲁司特和扎鲁司特。 干扰白三烯生物合成的白三烯调节剂的示例性实例为脂加氧酶抑制剂弃白通。
肥大细胞脱粒抑制剂阻断了组胺和其他调节剂从肥大细胞的释放。合 适的肥大细胞抑制剂的两个示例性实例为色甘酸钠和萘多罗米。
减充血剂(上文)的示例性实例是曱基黄噤呤衍生物，如咖啡因、茶碱、可可碱、氨茶碱、多索茶碱、己酮可可豆碱。两个其他示例性实例为 麻黄碱和假麻黄碱。
|32肾上腺素受体激动剂是强细支气管舒张剂。它们尤其用于治疗哮 喘。卩2肾上腺素受体激动剂的实例包括但不限于叔丁喘宁、奥西那林、 soprenaline、 fenoterole、沙丁胺醇和福莫特罗。
在一些实施方案中，药物组合物还包括变应原、变应原的免疫原性片 段(包括下文进一步详细描述的各自的免疫原性同源物)。各变应原例如可 以是昆虫变应原、螨变应原(如尘螨变应原，包括仓储螨变应原)、植物变 应原或引起哺乳动物(包括人)变态反应的任何其他化合物。在一些实施 方案中，所述变应原与重组乳杆菌的异源核酸序列编码的螨变应原交叉反 应。通常，此类交叉反应性变应原包括与螨变应原的至少免疫原性片段或 其免疫原性同源物(由重组乳杆菌中包括的各序列编码，例如由乳杆菌表 达(也参照下文))的至少一个共同表位。作为示例性实例，已知其他无脊 推动物的i午多变应原与螨变应原3口蟑螂变应原、衣鱼(Lepisma saccharina) 和摇蚊变应原、奸变应原和蜗牛变应原交叉反应。
本发明还展示了包括上述药物组合物的药盒。所述药盒除了包括本发 明重组乳杆菌的药物组合物，还包括变应原的至少免疫原性片段，或其免 疫原性同源物。通常，药盒中包括的各变应原或其免疫原性片段(包括各 免疫原性同源物)包括在药物组合物中。变应原或变应原片段(包括其免 疫原性片段)和乳杆菌以任何组合包括在药盒中。它们例如可以是相同药 盒中包括的相同药物组合物的部分或两种单独药物组合物的部分。
变应原可以是药物组合物的部分或单独包括在药盒中。药盒例如可以 是多部分药物包装，其中变应原或变应原片段(包括各免疫原性同源物) 保持独立于药物组合物之外(其可能包括本发明的重组乳杆菌)。然后在施 用前将其混合或旨在与药物组合物分别施用。变应原可以是具有变应原性 质的任何物质，通常为蛋白质、多肽或多糖。通常，所述变应原为参与变 应性疾病的变应原。所述变应性疾病可以是任何形式的免疫系统过度敏感。 所述变应性疾病可以在如下症状中表现自己:如搔痒、皮渗或荨麻渗、湿瘆、
28皮炎(特应性皮炎或接触性皮炎)、鼻子或眼的排液、窦压迫、咽喉痛、喘 鸣、咳嗽、呼吸急促、嘴、唇或咽喉肺胀、或消化问题症状。其可以是皮 肤变态反应或呼吸道变态反应(如哮喘)。变应性疾病可以是对任何特定变 应原的应答。在一些实施方案中，所述变应性疾病是螨变态反应，如尘螨 变态反应，包括房尘螨变态反应。
在一些实施方案中，包括治疗有效量或预防有效量的如上述药盒或药 物组合物中包括的变应原。与重组乳杆菌类似，重组乳杆菌精确的治疗或 预防有效量将依赖于许多因素，如变应原的类型和上文中同样指出的因素。
通常，变应原的量在约l- 1000Mg范围内。当然，在一些实施方案中，所 述变应原每周施用一次，而在一些实施方案中每月施用一次。在其他实施 方案中，所述变应原在治疗开始时每周施用一次，然后递减至每月施用一 次用于维持。因此，变应原的剂量依赖于递送的类型和方式。作为示例性 实例，对于注射，日剂量可以在约0.1至约10nig范围内。对于舌下或经 口递送，日剂量例如可以在约10至100pg/递送范围内。药盒例如可以包 括药物组合物，其包括适合达到约lug至约lOOjug变应原的剂量的范围 的量作为有效量。
在一些实施方案中，药盒中包括的变应原为螨变应原。在一些实施方 案中，该螨变应原是住家螨的变应原。在一些实施方案中，核酸序列编码 尘螨变应原，如房尘螨变应原或仓储螨变应原。如此处所用，术语"尘螨" 指灰尘中存在的螨。因此，术语"房尘螨，，理解为房尘中存在的螨。房尘 螨因而包括但不限于无气门目(Astigmata)和蚍螨科(Pyroglyphidae )。 迄今在房尘中已鉴定了 13种螨。如上文中部分指出，它们中的三种，粉尘
(Dermatophagoides farinae)、屋尘竭(Dermatophagoides pteronyssinus)
和宇尘螨(Euroglyphus maynei)(其均发现于温带气候)是世界范围内家庭 常见的并且是螨变应原的主要来源。热带气候中房尘螨的示例性实例是仓 储螨热带无爪螨(Blomia tropicalis) ( Echymyopodidae科)。许多其他仓储 螨可见于家庭中并为变应原的潜在来源。其他种的实例包括在，但不局限 于甜食螨科(家甜食螨和害鳞嗜螨)、螨科(腐食酸螨和粗脚粉螨)，和嗜渣螨科(Chortoglyphus ancutatus )。例如已经发现害鳞嗜螨是瑞士哥特兰 岛农田灰尘(干草灰尘和室尘)中最主要的变应原。室尘中存在的螨的其 他实例包括捕食螨(例如Cheyletus )和寄生的太平洋革螨，包括植物的2 点革螨(叶蟎和似虱螨)。
在其他实施方案中，所述螨例如可以是水螨，如水螨亚股、耳螨(犬 耳痒螨)、犬的脂螨(犬脂螨)、桔全爪螨(柑桔全爪螨)、住宅小鼠螨
(Liponyssoides sanuineus )、热带大鼠螨(热带鼠螨)、鸟螨(嚢形刺脂螨)、 鸡螨(鸡皮刺螨)、林禽刺螨(北方刺脂螨)、兽疥螨(齊螨)、羊痂螨(羊 痒螨)、谷痒螨(麦蒲螨)、竹螨(Stigmaeopsis longus )、欧洲恙螨
(Panonychus ulmi )、小麦巻叶竭(Aceria tosichella )、麦长腿掩蛛(麦长 腿掩蛛)、草地螨(Oligonychus pratensis )、 草莓革螨(Tetranychus turkestani )、三叶草螨(Bryobia praetiosa Koch )或蜜蜂的瓦螨(大蜂螨)， 仅以这些为例。许多这些螨例如也可以存在于室尘中。药盒中包括的螨变 应原也可以是起源于家畜，例如家畜(如绵羊、猪和猫)的螨的变应原， 或其免疫原性片段。实例包括但不限于牛足螨、羊痒螨、猪疥螨和猫耳螨。 螨变应原是来自螨，特别是螨身体或螨粪便的蛋白质或蛋白质部分。例如 表皮螨的l、 3、 4、 6、 8和9组变应原为酶，然而IO、 11和13组变应原 已知分别为原肌球蛋白、副肌球蛋白和脂肪酸结合蛋白。大多数螨变应原
(包括尘螨变应原)来自螨的消化道并因此以高水平见于螨粪便中。螨变 应原的典型实例是来自螨消化道的酶。作为示例性实例，来自屋尘螨的变 应原Der p 6在底物亲和力方面已经表征为螨胰凝乳蛋白酶。作为其他示 例性实例，来自屋尘螨的变应原Der p l是半胱氨酸蛋白酶。螨变应原的 其他示例性实例是与螨从一个生活阶段变化到下一个阶段时发生的蜕皮过 程相关的酶。作为示例性实例，已经发现来自屋尘螨的变应原Der p 2与 esrl6连续同源，所述esrl6是蛾在蜕皮的同时表达的蛋白质。螨变应原的 另 一示例性实例是螨食用的食物基质环境中残留的螨唾液成分。
螨变应原的实例包括^旦不限于Derpl、 proDerpl、 Derp2、 Derp3、 Derp4、 Derp5、 Derp7、 Derp8、 Derp9、 DerplO、 Derpll、 Derp
3014、 Derpl5、 Derpl8、 Derfl、 Derf2、 Derf3、 Derf4、 Derf5、 Der f6、 Derf7、 DerflO、 Derfll、 Derfl5、 Derfl6、 Derfl8、 Derml、 Eurml、 Eurm2、 Herf2、 Blotl、 Blot 3、 Blot 5、 Blot 12、 Feldl、 Magl、 Mag 3、 Tyrp2、 Lepdl、 Lepd2、 Lepd5、 Lep d 7、 Lep d 10 和Lepdl3。在一些实施方案中，药盒中包括的螨变应原(包括其片段或 各同源物)包括至少一种常见表位(参照上文)，所述表位具有重组乳杆菌 表达的螨变应原(包括其片段或各同源物)。在该方面，应当指出一些变应 原是不同的螨种类共有的，而其他变应原是所选螨种类独有的。作为实例， 粉尘螨与屋尘螨和腐食酸螨共有若干变应原。虽然任何螨变应原可用于本 发明，但在一些实施方案中因而期望选择例如与仅很少数螨类共有或除目 的螨类外无其他螨类共有的抗原。在一个实施方案中，螨变应原因而例如 是与重组乳杆菌表达的变应原的至少免疫原性片段或其免疫原性同源物交 叉反应的螨变应原。在另一个实施方案中，药盒中包括的螨变应原是重组 乳杆菌表达的螨变应原、螨变应原片段，或各自的同源物。
可从任何来源获得各变应原或其片段，包括免疫原性同源物。其例如 来自天然来源或是已经合成的。例如从已知或怀疑含有变应原的来源中富 集、纯化或分离它。在尘螨变应原的情况下，例如可收集灰尘、螨的唾液 或螨的粪便来富集、纯化或分离变应原或其变应原片段。也可从天然产生 多肽的生物、組织或细胞中富集、纯化或分离变应原或片段。或者，变应 原或其片段可以在任何生物中表达为多肽，通常为重组或转基因形式。在 一些实施方案中，通过富集、纯化或分离的任何一种从重组生物中(如重 组微生物)获得变应原(包括其免疫原性同源物)或变应原的免疫原性片 段(包括其免疫原性同源物)。在期望获得具有天然发生变应原中存在的翻 译后修饰的变应原或片段时，选择表达翻译后修饰所必需酶的真核生物或 原核生物是有益的。富集变应原的示例性实例是各变应原的提取物，例如 供应为旨在皮下、皮内或舌下施用的无菌溶液。此类变应原提取物是可通 过商业途径获得的，例如来自Hollister-Stier实验室的"PMG Mite Mix / G33G3805"、来自Stallergenes的"Staloral"(用于舌下递送)、来自Greer的变应原提取物标准话螨(Allergenic Extract Standardized Mite)或来自 ALK Abello Inc的RX混合房尘霉吸入注射剂(RX mix house dust mold inhalant injection )。
关于分子如变应原或变应原片段的术语"富集的"指特定分子在目的
子的显著更高的部分(如2-5倍)。此处术语"显著的，，用于表明水平的增 加对造成该增加的个人是有用的，并且通常指相对于其他物质(例如氨基 酸序列)约至少2倍，如至少5至10倍或甚至更高的增加。该术语也不排 除存在其他来源的变应原。该其他来源的变应原例如包括来自环境或由酵
母或细菌基因組或克隆载体编码的变应原。可以理解该术语意为仅涵盖那 些情况，其中人类已经介入以增加期望物质(例如期望的变应原)的比例。
富集例如包括从细胞提取物中获取级分，如细胞核级分、质膜级分或 微粒体级分。其可通过标准技术(如离心)来获得。其他富集手段的实例 为过滤或透析(例如旨在去除低于特定分子量的分子)，或使用有机溶剂或 硫酸铵进行沉淀。关于物质如变应原的术语"纯化的"理解为相比于物质 的原始环境的相对指征，因而代表例如变应原或变应原片段比在自然环境 中的变应原或变应原片段相对更纯。因而其并非指绝对纯度(如均一制剂) 意义上的绝对值。相比于天然水平，纯化的变应原或变应原片段的水平应 该高至少2-5倍(例如，在ug/ml方面)。清楚地预期至少一个数量级，如 两个或三个数量级的纯化。纯化的变应原或变应原片段(或其免疫原性同 源物)通常基本上没有显示重叠或类似免疫原活性(如所谓的交叉反应) 的污染物质，例如90%、 95%或99%纯。
纯化例如包括层析4支术，例如凝胶过滤、离子交换层析、亲和纯化、 疏水性相互作用层析或疏水性电荷诱导层析。纯化也可包括多种此类技术 和其他方法的组合。纯化的另一个示例性实例为电泳技术，如制备性毛细 管电泳。分离可包括类似方法的组合。术语"分离的"表明天然发生的物 质或天然发生的序列已经从其正常细胞(例如细胞内)环境中去除。因此， 物质或序列可以处于无细胞溶液中或悬浮液中等，或处于不同的细胞环境中。该术语并非暗示物质或序列是仅仅存在的物质或序列，也指基本上没
有(通常至少约卯-95%纯)与其天然相关的其他物质。
可通过本领域熟知的方法从天然来源中分离变应原或变应原片段。天 然来源例如可以是哺乳动物(例如人)血液、精液或组织。在一些实施方
通过本领域良好建立的遗传操作技术，可改造细胞或生物以产生其正常不 产生或细胞正常以较低水平产生的蛋白质。示例性实例为重组真核或原核 宿主细胞或转基因生物。
在另一个实施方案中，例如可通过以氨基酸开始的化学或酶促方法在 体外合成多肽。化学方法为本领域所熟知并包括连续步骤:涉及的氨基酸及 生长的肽链的活性官能团的保护、活化、偶联和选择性脱保护。酶促策略 例如包括通过蛋白酶分别产生的合成片段的blockwise偶联。期望时，可 使用市售自动多肽合成仪。
可用如上指出的合适载体和/或稀释剂提供变应原(包括其片段或各自 的同源物)。变应原例如可经化学偶联到适当载体蛋白上。作为其他实例， 其可掺合到脂质体中，或缀合到用于疫苗配制的多糖和/或其他聚合物。
通常进行调节哺乳动物中对变应原的免疫应答以完全或至少一定程度减轻 或緩和变应性疾病的一种或更多种症状，或完全或至少一定程度预防变应 性疾病的一种或更多种症状。哺乳动物例如为小鼠、大鼠、仓鼠、狗、猫、 狨猴、猿或人。在典型实施方案中，本发明的方法是，或包括在治疗变应 性疾病的方法中。如此处所用，术语"治疗"包括緩和、基本抑制、降低、 减緩、消除或逆转变应性疾病的进程，至少基本上或一定程度上改善变应 性疾病的临床或审美症状，至少基本上或一定程度上预防该疾病临床或审 美症状的出现，或一定程度上预防或延迟先前受折磨的受试者中状况的重 现。
方法包括施用如上所述的组合物。在该方面，本发明也涉及如上所述 的重组乳杆菌在制备用于调节(包括控制)对变应原免疫应答的药盒中的用途。在该方面，本发明也涉及各乳杆菌在调节对变应原免疫应答中的用 途。所述用途及方法例如在变态反应，例如螨原变态反应(如粉尘螨原变 态反应，例如房尘螨原变态反应)的治疗或预防中。所述变应原通常为螨 变应原，例如尘螨变应原(例如参照上文)，如房尘螨变应原。在一些实施 方案中，螨变应原(各乳杆菌用于调节对所述螨变应原的应答)包括与由 重组乳杆菌表达的螨变应原的至少一个共同表位(参照上文)。在一个实施 方案中，所述螨变应原是由重组乳杆菌表达的螨变应原。各变态反应的实 例包括(对于症状实例，也参照上文)，但不局限于哮喘、鼻炎(花粉症)、 特应性皮炎(湿瘆)和荨麻瘆(荨麻渗)。各变态反应也与症状如咳嗽、喷 嚷、鼻充血、咽喉痛、后鼻滴流、面红和恶心相关。
重组乳杆菌可通过任何手段向宿主施用，只要所述乳杆菌可用于调节 对变应原的免疫应答。而且，完整的药盒可通过任何手段施用。通常，当 向哺乳动物施用时，所述重组乳杆菌包括在药物组合物中。如果乳杆菌包 括在药盒中，相同的药物组合物通常应用于抗原。通常也应期望使用对宿 主无害的施用形式。技术人员因此将理解本发明允许例如经口或舌下施用 重组乳杆菌。在一些实施方案中，可经口或舌下施用完整的药盒。
为了能跟踪经口施用的乳杆菌，在一些实施方案中期望标记乳杆菌或 标记伴随施用的相应乳杆菌。示例性实例是与变应原在相同载体中使用增
强绿色焚光蛋白(eGFP )，其与变应原一起或在独立载体中。图6显示eGFP 在干酪乳杆菌Shirota中pL500载体中的表达和经口施用的活重组乳杆菌 在小鼠肠胃道中的监测。实例显示当向小鼠经口施用活的重组干酪乳杆菌 Shirota-eGFP时，其能移位到肠内淋巴集结的T细胞区和B细胞区中，如 通过共聚焦显微术测定(参照图6)。这进一步通过透射电子显微镜技术证 实，所述透射电子显微镜技术显示了淋巴集结中单形细胞和多形细胞的泡 (vacoules)中完整的干酪乳杆菌Shirota-eGFP(参照图7)。
使用用于预防或治疗目的的乳杆菌(参照下文)具有若干优点。首先， 乳杆菌在奶制品中的常规使用是"公认为是安全的，，(GRAS)情况。它们 用于专门标准化的食品如酸乳酪、乳酪和酪乳中。乳杆菌的致病潜力非常们例如可以预防肠内感染，降低血清胆固 醇水平并显示抗癌活性。术语"益生菌"指当摄取时对健康具有有益影响 的活的或灭活的生物。其次，目前不同的乳杆菌菌林用于消费者食物套药 包(例如婴儿奶粉)中并且照这样重组乳杆菌可发展成为稳定且便利的食 物级套药包。当与肠胃外途径(其为侵袭性且疼痛的)比较时，除在工业 欠发达国家中具有经济且重要的多剂量和大规模/群体免疫的可能性外，消 耗例如食物级疫苗药盒是便利且高度适应的。第三，虽然乳杆菌具有低的 固有免疫原性，乳杆菌的细胞壁组分(例如肽聚糖)不仅能赋予任何表达 或偶联到细菌上的外源抗原/变应原佐剂性质，还能赋予免疫应答免疫调节 作用。通过安全、非^l袭性手段如乳杆菌将抗原/变应原递送至儿科和免疫 受损人群的粘膜相关淋巴样组织中代表了流行疫苗选项的关键改善。
在一些实施方案中，所述方法包括重复施用各乳杆菌，无论所述乳杆 菌在用于重复施用相同乳杆菌的药物組合物或药盒中，或在其中分别包括 的药物组合物中。对应地，在一些实施方案中，在用于重复施用各乳杆菌 的药物组合物或药盒中使用重组乳杆菌。在一些实施方案中，完整的药物 组合物或药盒用于重复施用。
调节。作为示例性实例，可监测参与免疫应答，特别是参与变应性免疫应 答的那些因子(例如多肽或蛋白质)的水平。附图和实施例阐明了各监测
的方式。图8例如显示与干酪乳杆菌Shirota体外共培养的来自首次用于 实验的小鼠脾和肠系膜淋巴结的T细胞介导调节性T细胞细胞因子TGF-p 的分泌。Der p 2特异性T细胞引发(参照下文)由来自重组干酪乳杆菌 Shirota/Der p 2 ( Lc/Dp2 )而非NaHCOs喂饲小鼠淋巴集结的细胞的Der p 2特异性增殖来显示(参照图9 )。各图还显示用干酪乳杆菌/pLP500( Lc/V) 或Lc/Dp2经口施用连续4天的小鼠与用NaHC03喂饲的小鼠比较，肠系 膜淋巴结(MLN)中的CD3+CD4+D25+T细胞亚群增加(图9B)。这表明 益生菌干酪乳杆菌喂饲的小鼠Tr细胞群的诱导作用。
本发明的方法还展示了任何天然发生的乳杆菌与变应原的组合施用
35(例如参照上文)。在一些实施方案中，所述乳杆菌选自干酪乳杆菌、嗜酸 乳杆菌、发酵乳杆菌、加氏乳杆菌、戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、孢子乳杆 菌、短乳杆菌、德氏乳杆菌、唾液乳杆菌、希氏乳杆菌、乳酸乳杆菌、鼠
李糖乳杆菌、约氏乳杆菌、Lactobacillus leishmanis、詹氏乳杆菌、路氏乳 杆菌、沙克乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、巻曲乳杆菌、弯曲乳杆菌、高加索 乳杆菌和瑞士乳杆菌。在一些实施方案中，天然发生的乳杆菌还与本发明 的重组乳杆菌组合施用。在一些这些实施方案中，所述天然发生的乳杆菌 是与重组乳杆菌相同的种类。在其他实施方案中，天然发生的乳杆菌与另 一种细菌，例如另一种益生菌如粪链球菌(Streptococcusfaecalis)、酪酸梭 状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)或肠系膜芽孑包杆菌(Bacillus mesentericus)组合施用。在一些实施方案中，各乳杆菌可包括在与各变应 原相同的药物组合物中。在其他实施方案中，乳杆菌和变应原可分别提供。 它们例如可以包括在分别的药物组合物中。此类药物组合物可包括在常见 药盒中。
在一些实施方案中，本发明的方法包括组合施用本发明的重组乳杆菌 和变应原或变应原的免疫原性同源物(参照下文)。在一些实施方案中，重 组乳杆菌可与变应原的免疫原性片段或其免疫原性同源物组合施用。如上 解释，例如可通过富集、纯化和分离的任何一种从重组生物中获得该螨变 应原、其免疫原性片段或各免疫原性同源物。在一些实施方案中，其因此 例如与变应原或其同源物伴随共同施用。作为示例性实例，乳杆菌可用于 制备也包括变应原的药盒。乳杆菌因而与变应原一起成为药盒的部分。乳 杆菌和变应原例如可以是药盒中包括的药物组合物的部分。在其他实施方 案中，乳杆菌可以是药物组合物的部分，而变应原是独立成份或包括在药 盒的独立成份(如其他药物组合物)中。
药盒或包括乳杆菌的药物组合物中包括的各变应原、变应原片段或各 自的同源物通常是螨变应原，例如尘螨变应原(例如参照上文)，如房尘螨 变应原。在一些实施方案中，螨变应原(使用各乳杆菌用于调节对所述螨 变应原的应答)包括与重组乳杆菌表达的螨变应原、螨变应原片段或各同源物的至少一个共同表位(参照上文)。螨变应原(包括其片段或各自的同 源物)例如可与乳杆菌表达的变应原(包括其片段或各自的同源物)交叉 反应。在一个实施方案中，螨变应原、其片段或各自的同源物是由重组乳 杆菌表达的螨变应原、其片段或各自的同源物。可通过任何途径和方法来
应用变应原。例力口可经舌下、皮下、皮内、经皮、表皮(印icutaneously) 或其任何组合来应用变应原(包括其片段或各自的同源物)。作为示例性实 例，变应原或变应原片段或其免疫原性同源物(例如药物组合物中包括的) 可经皮下施用，并且乳杆菌(例如药物组合物中包括的)可经口施用。与 乳杆菌类似，变应原或变应原片段例如在所选时间间隔内应用一次或几次。 在一些实施方案中，其因而可重复施用。
技术人员将不仅理解使用乳杆菌的优点(上文)，还理解本发明人的惊 人发现:组合应用乳杆菌和各变应原导致治疗和预防变态反应的协同效应， 其也在以下实施例中得以阐明。 一方面，本发明因此也提供用于变态反应 的有效治疗和预防策略的双重模式方法。
乳杆菌和变应原、变应原片段或各自的同源物可彼此独立按独立剂量 施用。因此，乳杆菌及变应原(包括同源物)或其片段的许多应用例如可 在一段时间内同时或连续进行。乳杆菌因此例如可用作佐剂，当与变应原 同时给出时，其可以调节(例如增强)免疫应答。在一些实施方案中，顺 序使用乳杆菌和变应原、变应原片段或各同源物。在所选的时间间隔内， 在例如剂量方案中仅可施用变应原(包括其片段或各同源物)、仅乳杆菌或 仅变应原。作为示例性实例，施用乳杆菌几次时，可在两次应用乳杆菌间 或终止应用乳杆菌后提前施用变应原，反之亦然。在一些实施方案中，重 复施用乳杆菌，例如每天一次。然后在一段时间一次或更多次应用乳杆菌 后施用变应原。随后仅进一步重复施用乳杆菌。可以理解在该情况下乳杆 菌和/或变应原的施用形式可变化，例如在图10或图16中描述。在一些实 施方案中，可如下文描述首先应用乳杆菌。在其他实施方案中，可如图22 显示首先应用变应原。
因此，可按一个或更多独立个体剂量形式(如预防或治疗方式的所谓的"引发加强"方案或方法)来进行变应原(包括其片段或各同源物)及 乳杆菌的施用。在该方案(或方法)中，乳杆菌例如可按"引发"步骤递 送，并且随后变应原可按"加强"步骤递送，或反之亦然。例如首先施用 乳杆菌时，其可称为"引发剂"，随后施用的变应原可称作"加强剂"。例 如首先施用变应原时，其可称为"引发剂"，随后施用的乳杆菌然后可称作 "加强剂"。可以理解术语"引发"和"加强"指抗原和乳杆菌对宿主生物 的影响，而不是指它们的施用顺序。因此，引发剂可在加强剂之前、与其 同时或在其之后施用。如果期望加强組合物需要更长时间来起作用，那么 例如需要在加强组合物之后施用。
该"引发加强，，方案例如可用于预防，即用于提前降低、减少或预防 对变应原的免疫应答。在该情况下，也期望降低或预防宿主免疫系统对相 应变应原的过度敏感性效应。在此类实施方案中，"引发"也指方法，其中 首次施用(例如抗原)为免疫作用，其允许利用相同抗原(例如乳杆菌的 抗原)进行第二次施用后产生免疫应答，其中第二次免疫应答比未提供首 次免疫达到的应答高。在一些实施方案中，各预防方案可用于保护动物或 个体免于变应原致敏。
在一些实施方案中，控制对哺乳动物(例如人类)中变应原的免疫应
答的方法包括
(a )提供本发明的重组乳杆菌或包括如上所述的重组乳杆菌的药物组
合物，
(b )施用本发明的重組乳杆菌或包括重组乳杆菌的药物組合物，
(c) 提供变应原的至少免疫原性片段(或其各免疫原性同源物)或包 括如上所述的变应原的至少免疫原性片段(或其各免疫原性同源物)的药 物组合物，和
(d) 施用变应原的至少免疫原性片段(或其各免疫原性同源物)或 包括变应原的至少免疫原性片段(或其各免疫原性同源物)的药物组合物。
作为示例性实例，所述方法可包括以下步骤 (a)用治疗有效量的本发明的重组乳杆菌或本发明的药物组合物引发哺乳动物，
(b) 在一天至约一周后任选地重复步骤a) —次至三次；
(c) 用治疗有效量的变应原加强动物；和
(d) 在约一周至约一个月的后续时期后，任选地重复步骤c) 一次至五次。
如上指出，变应原在一些实施方案中可以是由本发明的重组乳杆菌表 达的变应原或对应于由本发明的重组乳杆菌表达的变应原。
因此，在一些实施方案中，施用乳杆菌在引发中起作用，而施用抗原 (包括其片段或各同源物)在加强中起作用。各实例描述于图10中。在该 实例中，经口施用的表达Derp2的重组干酪乳杆菌Shirota在预防方案中 与Der p 2的皮下加强组合使用。使用无效的NaHC03而非乳杆菌的比较 显示单独施用表达Derp2的重组干酪乳杆菌Shirota甚至在呼吸道攻击后 可抑制IgE的产生(参照图11 )。与其相反，Der p 2特异血清IgGl的水 平未受影响。而且，通过T淋巴细胞产生Th-2细胞因子和促炎性细胞因 子被下调(图12 )。
在该实例中，施用表达Derp2的重组干酪乳杆菌Shirota引发了 Th-2 和Der p 2特异性Tr细胞的混合物(也参照下文)。这些Der p 2特异性 Tr细胞通过调节性细胞因子如TGF-pi对现有的Th-2细胞产生抑制或耐 受原性作用。此外观察到呼吸道攻击后获得的已经施用了表达Der p 2的 重组干酪乳杆菌Shirota的小鼠血清中循环白细胞介素-10 (IL-10)细胞因 子水平相比于对照组显著降低。IL-10是多效细胞因子，由Th2细胞或T 调节型淋巴细胞产生。先前在特异反应性过敏和哞喘中已观察到白细胞介 素-10的表达升高。由T调节细胞产生的IL-10是抗炎性的并能调节Thl 类型细胞因子和/或Th2的产生。Th-2细胞因子进一步减少。嗜酸细胞活 化趋化因子的水平也降低。嗜酸细胞活化趋化因子是调节过敏性炎症的重 要趋化因子，并且先前已发现嗜酸细胞活化趋化因子的血清浓度在例如哮 喘中升高。也观察到了转化生长因子pl (TGF-pi)水平的显著降低(参 照图14)。用于Tr细胞存活和功能的常见已知细胞因子TGF-(31由肺中的嗜酸性粒细胞产生并已知可调节Th-2细胞因子诱导的嗜酸细胞活化趋化 因子的释放。其也作为成纤维细胞的生长因子起作用，因而已经报道了肺 的粘膜相关淋巴样组织中TGF-pi升高来增进或加剧呼吸道重塑。
同时，这些小鼠也显示细支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞数目 减少(图15A)，其水平与Ac组(即仅用各变应原和气溶胶攻击处理的小 鼠组)的水平相似。嗜中性粒细胞(其为对抗原的炎症应答的部分并且其 已知可通过IgE受体而激活)的数目在已经施用了表达Der p 2的重组干 酪乳杆菌Shirota的小鼠中也显著减少(图15B)。嗜酸性粒细胞(其已知 在变应性疾病中增加)的数目是低的。呼吸道攻击24小时后所获肺切片的 组织学分析显示已经施用了阴性对照(NaHC03或具有不编码螨变应原的 载体的乳杆菌)的小鼠中呼吸道病理的不同程度(中等至严重)。此外，炎 症渗入包围了这些小鼠的细支气管肺泡空间。与之相反，已经施用了表达 Derp2的重组干酪乳杆菌Shirota的小鼠的肺切片显示肺部炎症的重大降 低并具有与Ac小鼠相似的镨(参照图15C)。如可从该实例推断，重组乳 杆菌引发与变应原加强组合在下调过敏反应中有效。
作为其他实例，对变应原的过敏性免疫应答的治疗或预防可以是免疫 疗法。免疫疗法中用变应原免疫的组合例如可以与用于治疗目的的乳杆菌 施用组合(参照下文所附实施例)。该组合可大体上提高效率并也可缩短免 疫疗法所需要的持续时间。例如抗原特异性IgE的血清水平显著降低(参 照图17A和图23A)。为了基于传统的免疫疗法单独使用各变应原来达到 该效果，如图25和图26中描述，需要高剂量的抗原。仅50lig抗原的皮 下剂量(即高剂量)降低IgE水平，而10iag抗原的剂量(即低剂量)引 起IgE水平的升高(参照图26A)。因此，乳杆菌和各抗原的组合减少传 统免疫疗法的不便，降低了其中治疗的频率和持续时间，并可能降低过敏 反应的风险，提高效率。本发明的重组乳杆菌在用于开发基于食物千预策 略(用于预防和治疗变应性疾病)的引发加强策略中的潜力和功效也通过 所附实施例来阐明。
如从上文显而易见的是，本发明重组乳杆菌的使用相比于目前用于变
40态反应治疗和变态反应预防的方法是有利的。此外，各乳杆菌和抗原在例 如免疫疗法中的组合应用极大提高了基于重组变应原的免疫疗法的效率。 各双重模式方法产生了有效治疗变应性疾病的协同效应。在该方面，也可 通过本发明重组乳杆菌和变应原的组合应用来通过接种预防变态反应。表 达变应原或其片段的重组乳杆菌例如可用作基于食物的抗原特异性预防疫 苗以引发免疫系统，随后是施用变应原蛋白质的加强效应。此外，该双重 方式方法产生了用于预防后继变应性过敏的协同效应。
为了方^^理解本发明并使其生效，特定实施方案现在将通过以下示例 性实施方案和非限制性实施例来描述。
本发明的示例性实施方案
本发明重组乳杆菌的示例性实施方案、本发明的药盒及它们的用途示 于附图中。
图1A示意性描述了用于表达螨变应原(HDM)基因的常规乳杆菌/ 大肠杆菌穿梭载体pL500。指出了限制性内切酶的位点。由BamHI和Nhe I位点定义的区段由编码Der p 2抗原的序列替换(参照下文)。"ldh，，表 示乳酸脱氢酶，"Pldh"表示干酪乳杆菌ldh基因的启动子序列。"Tcbh，， 表示植物乳杆菌cbh基因的转录终止子序列。
图1B示意性描述了用于产生乳杆菌中Der p 2/螨变应原表达构建体的 中间pTUAT载体。指出了限制性内切酶的位点。
图1C示意性描述了在组成型乳酸脱氢酶(ldh)启动子控制下的 pLP500-HDM表达构建体。"Pldh"表示干酪乳杆菌ldh基因的启动子序 列。"锚"(Anchor)表示编码117个氨基酸的肽的区段，其为干酪乳杆菌 的锚定序列。
图2示意性描述了同样用于表达螨变应原(HDM)基因的另 一个常规 乳杆菌/大肠杆菌穿梭载体pL400。指出了限制性内切酶的位点。由BamHI 和Nhel位点(加下划线的)定义的区段由编码Blo t 5抗原的序列替换(参 照下文)。图3示意性描述了乳杆菌表达载体pSIP308，其为本发明的重组乳杆 菌中包括的载体的其他实例。报道基因可用于通过各限制性内切酶包括编 码螨变应原或其片段的序列。
图4示意性描述了乳杆菌表达载体pSIP412，其为本发明的重组乳杆 菌中包括的载体的另一个实例。可再次在报告基因的位点处引入编码螨变 应原或其片段的序列。
图5显示了通过蛋白质免疫印迹检测Der p 2在乳杆菌的两种菌林干 酪乳杆菌Shirota和鼠李糖乳杆菌gg中的异源表达。在lmL裂解緩冲液 中通过超声处理来裂解总计3xl(^个细胞。细胞裂解物(lOyL)在10% Tris-tricine SDS-PAGE凝胶上进行分离并进行蛋白质免疫印迹检测。使用 针对Derp2的单克隆免疫球蛋白(稀释度1:10,000 )、生物素化的抗小鼠 免疫》艮蛋白(稀释度1:10,000)和过氧化物酶缀合的ExtrAvidin (Sigma， 稀释度1:5，000)。信号在Superigna隨West Pico化学发光底物中显影。泳 道为"M，，预染/生物素蛋白质分子量标记(BioRad); (1 )来自L.gg/pL500 的总裂解物，(2 )来自L.gg/Der p 2的总裂解物，(3 )来自干酪乳杆菌/pL500 的总裂解物，(4)来自干酪乳杆菌/Derp2的总裂解物，和泳道(5 )酵母 中产生的重组Derp2蛋白质(200 ng)。箭头指出Der p 2锚定融合蛋白 的位置。其存在于重组干酪乳杆菌Shirota和鼠李糖乳杆菌gg中，但不存 在于用作对照的野生型中。
图6显示干酪乳杆菌Shirota-eGFP怎样移位到淋巴集结的T和B细 胞区域。图像描述了共聚焦显微镜下的视野。所示为(A)活的千酪乳杆 菌Shirota-eGFP和(B )来自连续4天用干酪乳杆菌Shirota-eGFP喂饲小 鼠的淋巴集结的冷冻切片。左边显示的是(B)各淋巴集结切片中干酪乳 杆菌Shirota-eGFP细菌的定位，右边描述了用缀合APC的抗小鼠THY-1.2 与相同视野的缀合PE的抗小鼠CD-19 (分别染色T细胞和B细胞区域) 组合进行免疫组织化学染色并将所有三种颜色叠加，其显示了细菌在T细 胞和B细胞区中的定位。共聚焦显微镜分析显示了干酪乳杆菌 Shirota-eGFP (参照左边图片)在T细胞和B细胞区域(右)，特别是在区域接合处的分布。
图7显示通过透射电子显微镜观察到完整干酪乳杆菌Shirota-eGFP移 位到淋巴集结中的单形细胞(A)和多态细胞(B)的泡(vacoules)中。 箭头指向干酪乳杆菌Shirota-eGFP的位置。
图8显示在与干酪乳杆菌Shirota进行体外共培养的T细胞中诱导产 生TGF-P。 (A)来自与干酪乳杆菌以1:0.5的比例进行共培养的首次用于 实验的小鼠的总肠系膜淋巴结(MLN)细胞或脾细胞与只有细胞的对照相 比显示TGF-p细胞因子的产生显著增加。(B)来自与干酪乳杆菌以1:0.5 或1:1的比例进行共培养的首次用于实验的小鼠的脾的分选CD3+ T细胞 也诱导TGF-p产生的上调。
图9描述了用重組Lc/Dp2喂铜的小鼠中Der p 2特异性T细胞增殖与 调节性CD4+CD25+ T细胞的增加。(A)用lxl09cfu/+鼠的重组Lc/Dp2 或野生型L.c/V或NaHC03对照经口向C56BL/6小鼠施用一个月(每周 连续三天)。喂饲结束时处死小鼠并从淋巴集结中分离T细胞，用于在缺 少或存在5 M g/ml或10 M g/ml重组酵母Der p 2的情况下使用113-标记的 胸苷掺入进行增殖测定。(B ) FACS分析来自Lc/Dp2 ( n=5 )、野生型Lc/V (n=5)或NaHC03 ( n=6 )喂祠的小鼠的肠系膜淋巴结的细胞。如所示， 肠系膜淋巴结中的CD4+D25+细胞的亚群在Lc/Dp2和Lc/V组中相比于 NaHC03组有显著增加。
图IO描述了所用的预防方案。确定了三组C57BL/6小鼠，在整个实 验中，其由用NaHC03緩冲液、热灭活的Lc/V和Lc/Dp2喂詞的C57BL/6 小鼠(每组11=5)组成。喂饲由时间线下实心三角形"▲"指示。 一周连 续三天，每天喂饲一剂量。在第11天与第18天，所有小鼠经皮下免疫重 組Derp2 (50pg/小鼠)来进行加强。随后，所有小鼠通it^皮贴片(在 第22、 36和50天)致敏三次并通过具有Der p 2的气溶胶攻击所述小鼠 两次。最后一次攻击后大约24小时，处死小鼠并获得细支气管肺泡灌洗液 (BALF )用于分类细胞计数和细胞因子分析，并获得肺用于苏木精&曙红 (H&E)染色。此外，获得来自肠系膜淋巴结(MLN)和脾的细胞用于原代和继代T细胞培养和细胞因子分析。
图11显示Der p 2特异性免疫球蛋白应答。接受Der p 2皮下加强的 小鼠的Der p 2特异性血清lgE的动力学显示三组中没有显著差异，然而 未接受皮下加强但用Lc/Dp2喂饲的小鼠比NaHC03 ( p=0.042 )和Lc/V (p=0.004)喂饲的小鼠其IgE显示出显著的衰减。第85天即最后一次气 溶胶攻击后IgE的效价(参照图11的右图)显示对于NaHCX)3应用(参 照A相对于A )和Lc/v应用(画相对于口)，接受皮下加强的小鼠相比于 未接受皮下加强的小鼠其IgE水平显著较低。仅Lc/Dp2喂饲的小鼠( 相对于O)显示了同等水平。该结果表明用Lc/Dp2喂饲的小鼠在有或没 有皮下加强的情况下可减緩IgE的产生。
图12描述了脾T细胞的细胞因子谱。脾细胞在存在Der p 2( 10 ju g/ml) 的情况下培养3天，随后在存在IL-2的情况下培养另外4天。在培养的第 9天，通过Ficoll密度离心纯化T细胞。大约lx105细胞/孔在存在3 x105 APC/孔和Der p 2 (10 ju g/ml)的情况下培养48小时。对照孔由无Derp 2的细胞组成。获得培养基用于通过ELISA形成细胞因子谱。来自Lc/Dp2 喂饲小鼠的Der p 2特异性脾T细胞相比于NaHC03和Lc/V产生更低水 平的Th-2 (IL-4、 IL-5、 IL-13 )和促炎性细胞因子(TNF-(x、 IFN-Y )。 然而，Lc/Dp2喂祠的d、鼠相比于Lc/V组产生更高水平的T调节性细胞因 子(TGF-p和IL-10 )(也参照图24 )。
图13描述了 MLN细胞的细胞因子镨。来自小鼠MLN的总细胞在存 在抗CD3和CD28的情况下在96孔板中(3 x 105细胞/孔)培养48小时。 如所示，L.c/V和Lc/Dp2组相比于NaHC03对照组(A、 B、 C和D)产 生显著更低水平的IL-13,并且IL-4、 IL-5、 IFN-Y和IL-10未有显著降 低(水平与Ac小鼠类似)。此外，来自Lc/Dp2喂铜小鼠的MLN细胞相 比于对照组(D)产生增加水平的TGF-(5。
图14显示了 BALF的细胞因子镨。用Lc/V或Lc/Derp2喂饲的小鼠 的BALF细胞因子谱相比于NaHC03对照显示效应Th2细胞因子(IL-13、 IL-5)、促炎性细胞因子(TNF-a)、 TGF-卩和趋化因子嗜酸细胞活化趋化因子减少。
图15描述了 BALF分析和肺的组织学。气溶胶攻击后24小时获得 BALF和肺，用于分析和组织学H&E染色。Lc/Dp2组相比于NaHC03 和Lc/V对照组BALF细胞计数减少，其与接受仅气溶胶攻击(Ac)的小 鼠类似(A )。此外，仅Lc/Dp2喂祠的小鼠显示嗜中性粒细胞募集减少(B )。 所有组的BALF中均显示相似百分比的巨噬细胞、单核细胞和嗜酸性粒细 胞。显示了每一组中两只代表性小鼠的肺组织。两只气溶胶对照小鼠(G 和H)的肺切片的H&E染色显示了肺实质中最低限度的呼吸道炎症背景， 并且最低限度的炎症渗入细支气管空间。然而，来自NaHC03 (A和B) 和Lc/V ( C和D )組的小鼠的肺组织显示了呼吸道和细支气管空间周围不 同程度(中等至严重)的呼吸道渗入炎性细胞。比较起来，Lc/Dp2喂饲的 小鼠(E和F)显示炎症渗入有更高降低，其具有与Ac组相似的谱。
图16描述了治疗方案。在治疗方案中，在第0、 14和28天用Derp2 变应原通过表皮贴片使C57BL/6小鼠预先致敏。在第33天，通过ELISA 测定所有小鼠Derp2特异性血清IgE和IgGl的水平，并随后基于IgE的 水平将小鼠分为三组(n=6)。在第35天，用NaHC03緩冲液、Lc/V或 Lc/Dp2经口喂饲小鼠5周，每天一剂量， 一周连续三天。在第55和62 天，小鼠接受两次Der p 2 ( 50 p g/小鼠)皮下免疫，并且一周后用具有 Derp2的气溶月交(10mlPBS中1 mg )攻击小鼠两次。喂饲由所绘时间线 下实心三角形"A"指示。最后一次攻击后大约24小时，处死小鼠并获得 BALF用于分类细胞计数和细胞因子分析，并获得肺用于H&E染色。此 外，获得肠系膜淋巴结(MLN)和脾的细胞用于原代和继代T细胞培养和 细胞因子分析。
图17描述了 Derp2特异性免疫球蛋白应答。所有三组小鼠的Derp2 特异性血清IgE、 IgGl和lgG2a的动力学示于图17 (A、 C和E )。所有 三组中的小鼠在喂饲开始一周后其Derp2特异性IgE减少(A)。 Lc/V和 Lc/Dp2喂饲小鼠中的IgE水平在连续两次气溶胶攻击前和攻击后(在第 69天和第77天)相比于对照小鼠显著下降(B)。这两组中Der p 2特异性血清IgGl在第62天和69天相比于对照小鼠显著升高并且甚至在呼吸 道受攻击后保持不变(C和D)。
图18显示脾T细胞的所选细胞因子的谱。脾细胞在存在Derp2 (10 jag/ml)的情况下培养3天，并随后在存在IL-2下培养另外4天。在培养 的第9天，通过Ficoll密度离心纯化T细胞，并在存在3 x105 APC/孔和 Derp2变应原(10 jLig/ml)的情况下以大约lx105细胞/孔培养48小时。 对照孔由没有Der p 2的细胞组成。获得培养基用于通过ELISA形成细胞 因子镨。Lc/Dp2和Lc/V组相比于NaHC03组(A-E)均显示Th-2细胞 因子(IL-5、 IL-13、 IL-10)产生显著降低，并且IL-4和TNF-a无显著降 低。TGF-卩l的产生也降低了 (F)。在所有三组中未检测到IFN-Y的产生。
图19显示肠系膜淋巴结细胞的所选细胞因子的谦。来自肠系膜淋巴结 (MLN )的总细胞在存在抗CD3和CD28的情况下在96孔板中(3 x 105细 胞/孔)培养48小时。来自Lc/Dp2和Lc/V组的MLN细胞相比于NaHC03 组显示细胞因子镨，显示Th-2和促炎性细胞因子(IL-5、 IL-4、 IL-13、 IL-10和TNF-a)没有显著降低(A-E)。此外，TGF-pl的产生相比于对 照组，在来自Lc/Dp2和Lc/V组的细胞中是升高的。
图20显示BALF的细胞因子i普。最后的气溶胶攻击后24小时处死小 鼠并获得BALF用于细胞因子分析。Lc/V和Lc/Dp2组相比于NaHC03 组，Th-2和促炎性细胞因子(IL-5、 IL-13、 IL-4、 IFN-Y 、 TNF画a、 TGF-P )和趋化因子(嗜酸细胞活化趋化因子)均没有显著减少。两组均与Ac 对照组具有相似的水平。
图21描述了肺中病理生理学变化和细支气管肺泡流体分析。BALF的 分析表明Lc/V和Lc/Dp2均与气溶胶对照组(Ac)具有相似的总渗入细胞 数目并且并不显著低于NaHC03组中观察到的数目(A)。差异细胞分析表 明这两组中的嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞减少，、淋巴细胞和巨噬细胞计 数没有变化(B )。仅Lc/Dp2组相比于其他组其BALF中的单核细胞计数 显示有少量减少。显示了每一组中两只代表性小鼠的肺组织。两只气溶胶 对照小鼠(G和H)的肺切片的H&E染色显示了肺实质中最低限度的呼吸道炎症背景，并且最低限度的炎症渗入细支气管空间。然而，来自
NaHC03组的小鼠的肺组织显示了呼吸道和细支气管空间周围不同程度 (中等至严重)的呼吸道渗入炎性细胞(A和B)。比较起来，Lc/V (C 和D)和Lc/Dp2 (E和F)喂詞的小鼠均显示炎症渗入有更大的降低，与 Ac小鼠具有相似的谱。
图22描述了使用活的重组乳杆菌的治疗方案。在治疗方案中，在第1、 14和28天用重组酵母衍生的Der p 2变应原通过表皮贴片使两组C57BL/6 小鼠预先致敏。休息14天后，仅将IgE应答者平分成两组(Lb相对于緩 冲液，n-6)用于治疗研究。向Lb组喂饲活的重组Derp2 (Lc/Drp2)。 在第42天至第70天间每天喂饲小鼠，共喂飼4周(H)。在第80天，通 过含有Der p 2的气溶胶(10 ml PBS中含1 mg )来攻击两组。对细支气 管收缩的指示器-增强停顿(enhanced pause) ( pEnh )读数大约24小时。 在第82天处死小鼠用于原代和继代T细胞培养。
图23显示全身免疫球蛋白应答。7天积极喂饲后，在干酪乳杆菌 Shirota/Dp2组中观察到Der p 2特异性血清IgE (A) 41%的减弱，相比 NaHC03对照组仅为27%。此外，14天积极喂饲后，干酪乳杆菌/Dp2组 中Der p 2特异性血清IgGl ( B )显著减弱，而NaHCO:j对照组在21天喂 饲后仅显示IgGl减弱。在来自(C)中继代培养物的脾细胞因子谱中，白 色条形代表5只对照小鼠的数据均值。黑色条形代表从6只喂饲小鼠的混 合细胞中获得的数据均值。来自緩冲液喂饲小鼠和重组乳杆菌喂饲小鼠的 混合细胞(混合细胞显示弱增殖，为T调节性细胞的标记)的脾脏T细胞 的细胞因子谱在TH1 (IFNy )和TH2 (IL-5和IL-13)细胞因子形成中 未显示有差异。然而，用干酪乳杆菌Shirota/Dp2喂饲的小鼠显示T调节 性细胞因子(IL-10和TGF-P)的产生增加。緩冲液喂饲小鼠(n=6)相对 于重组乳杆菌喂饲的小鼠的混合细胞。
图24描述了治疗模型假说，其不理解为指在任何方面局限于本发明方 法潜在的效应。表皮贴片可能导致来自TH2细胞的IL-5水平降低。然而， 重组乳杆菌可引起Tr细胞的细胞因子的水平增加。
47图25显示用于分析皮下引发对小鼠的影响的实验方案示意图。在第0、 4、 8天，用低剂量(LD, lOjag)或高剂量(HD, 50 ju g )的Der p 2经 皮下注射引发小鼠，然后在第28天用Derp2对小鼠进行加强。在笫56、 58、 60和62天用PBS中0.1 mg/ml的Der p 2对小鼠进行气溶胶吸入30 分钟，并在第64天处死小鼠用于T细胞细胞因子分析。单独对对照小鼠 进行气溶胶吸入。
图26描述了小鼠中Derp2特异性体液应答的动力学。用低剂量(白 色正方形，10jug)或高剂量(黑色正方形，50|ig)的Der p 2经皮下注 射引发小鼠，然后用低剂量的Der p 2对小鼠进行加强和气溶胶吸入。通 过ELISA测定低剂量或高剂量Der p 2引发的小鼠的Der p 2特异性IgE (A )、 IgGl ( B)和IgG2a ( C)的效价。数据表示为均值± SEM ( n = 8 )。 *:p<0.05,用于独立样品的双尾斯氏t检验。
图27描述了脾CD4+ T细胞的细胞因子谗的RT-PCR分析(也参照表 1)。用低剂量(LD，参照图的上部)和高剂量(HD) Derp2引发的小鼠 和对照小鼠(C)暴露于气溶胶化的Derp2中并在第64天处死。用Derp 2培养脾细胞10天。用抗CD3和抗CD28刺激Der p 2培养的脾细胞的纯 化CD4+T细胞24小时，并分离总RNA用于分析细胞因子表达。包括来 自年龄匹配的首次接受试验的小鼠(N)的纯化CD4+T细胞用于比较。每 一条带显示来自8只小鼠的混合脾的扩增细胞因子药盒。(*:未进行)。
图28描述了培养物中淋巴结的细胞因子i普。在第0、 4、 8天用低剂量 (LD， 10ng)或高剂量(HD， 50pg) Derp2蛋白质或PBS引发小鼠， 并在第IO天处死小鼠。收集淋巴结并在存在rDer p 2蛋白质的情况下培 养3至5天。收集培养物上清液并通过ELISA分析IFN- Y (A )、 IL-4( B )、 IL-9 (C)、 IL-10 (D)和TGF-卩(E)的形成。显示的结果代表2次独立 实验。均值± s.e.m. ( n = 4 )。分与PBS的比较，弁与HD的比较，p<0.05， 独立样品的双尾斯氏t检验。
图29显示SP培养物的细胞因子i普。在第0、 4和8天用低剂量(LD， lO"g)或高剂量(HD， 50|ig) Derp2或PBS经皮下注射引发小鼠。在第10天收集SP并用10 ju g/ml的rDer p 2蛋白质进行培养。在笫3-5天 收集上清液并通过ELISA分析IFN-Y (A)、 IL-4(B)、 IL-9 ( C )、 IL画IO (D)、 IL-13(E)和TGF-p(F)的形成。显示的结果代表2次独立实验， 均值± s.e.m. ( n = 4 )。 *与PBS的比较，p〈0.05; #与HD的比较，p<0.05，
双尾斯氏t检-验。
图30描述了与CD4+CD25+细胞共培养的抗原特异性TH2细胞的增殖 和细胞因子应答。抗原特异性TH2细胞来自小鼠的脾细胞培养物，用50 Mg的rDer p 2蛋白质进行贴片。TH2细胞与小鼠(所述小鼠用LD (LDTH2)或HD ( HD+TH2 )的rDerp2蛋白质，或仅rDerp2蛋白质 (仅TH2 )引发)的脾CD4+CD25+ T细胞在存在rDer p 2蛋白质的情况 下培养5天并测定增殖应答。增殖比率表示为仅TH2细胞的指数(a)。在 t=72小时收集上清液并测定IL-4、 IL-5和IL-13的产生(b、 c、 d)。结果 显示3次独立实验的平均值，均值± s.e.m.。六与HD的比较；弁与仅TH2 的比较。斯氏t检-验，p<0.05。
图31描述了用于动物研究的方案，所述动物研究使用表达Blo t 5变 应原的重组干酪乳杆菌Shirota。检查了三组Balbc/J小鼠:NaHC03( n=4 )、 干酪乳杆菌/pL400 (n=4)和千酪乳杆菌Shirota/Blo t 5 (干酪乳杆菌/Bt 5; n=4)。每周连续四天，每天用lxl0、fu/小鼠喂饲小鼠(由箭头指出)。每 只小鼠接受的总喂祠为20剂量的lxl09cfu。每周一次从小鼠中取血长达7 周并通过ELISA测定Blo t 5特异性血清免疫球蛋白。在第198天处死小 鼠并获得、淋巴集结和脾的T细胞用于细胞因子分析。
图32描述了通过ELISA获得的Bio t 5特异性血清免疫球蛋白的数 据。检测到Blot5特异性IgGl的显著水平，然而未检测到IgE和IgG2a 的显著水平。
图33描述了处死的小鼠的细胞因子分析(参照图34)。仅在来自干酪 乳杆菌Shirota/ Blo t 5喂祠小鼠的淋巴集结的T细胞中检测到了调节性细 胞因子TGF-p的显著水平，说明活的重组干酪乳杆菌Shirota/Blo t 5通过 淋巴集结中的T细胞活跃地诱导了 T调节性细胞因子的产生。图34描述了表达载体pLP400中用于实施例中阐明本发明的变应原 Blot5的核酸序列(上面的行)和氨基酸序列(下面的行，单字母密码子)。 在5'末端(反向)引入额外的碱基"A"以改变具有载体天然起始密码子 的基因读框。
图35描述了表达载体pLP500中用于实施例中阐明本发明的变应原 Der p 2的核酸序列(上面的行)和氨基酸序列(下面的行，单字母密码子)。 在5'末端(反向)引入额外的碱基"A"以改变具有载体天然起始密码子 的基因读框。所述序列包括干酪乳杆菌的锚定序列("锚")。
表1描述的是通过实时PCR得到的脾CD4+ T细胞的TH2细胞因子 谱。用低剂量和高剂量Der p 2引发小鼠，并且对照小鼠暴露于气溶胶化 的Der p 2中并在第64天处死。用Der p 2培养脾细胞10天。用抗CD3 和抗CD28刺激Der p 2培养的脾细胞的纯化CD4+ T细胞24小时，并分 离总RNA用于分析细胞因子表达。包括来自年龄匹配的首次接受试验的 小鼠(N)的纯化CD4+T细胞用于比较。显示了一式两份实验的代表性数 据。*:通过除以实验组(样品)和首次用于试验的组(校准)的细胞因子 /HPRT的值来确定细胞因子的比率。
实施例
用于下面示例性实施例中的小鼠是3-4周龄的C57BL/6小鼠，购买并 饲养于新加坡国立大学(National University of Singapore )的动物保持单 元(Animal Holding Unit )。关于动物福利的IACUC批准了用于该项研究 的所有动物方案。用于以下实施例的野生型和重组干酪乳杆菌Shirota菌 林或鼠李糖乳杆菌GG原种在含有50%甘油的等分试样中保持并保存于 國70。C。
使用斯氏t检验通过均值分析进行统计比较。所有值示为均值±标准 差(SD )。认为p<0.05的值是显著的。
实施例l:表达增强绿色焚光蛋白(eGFP)的重组干酪乳杆菌的构建使用延伸高保真DNA聚合斷Boehringer )和合成引物BamHI-eGFP/f [5'-CCC CCG GAT CCA gtg agc aag ggc gag gag ctg-3'， SEQ ID NO: 3和 eGFP- xhoSac/r [5'-CCC CCC etc gag CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG-3'， SEQ ID NO: 4通过聚合酶链式反应(PCR)来扩增eGFP 基因。5 '末端含有Bam HI位点并且3 '末端含有Xho I/Sac I位点的所获 PCR产物(kits )随后亚克隆至pTUAT的Bam HI和Sac I处(参照图1 )。 用pLP500的Bam HI /Nhe I片段表达-分泌载体交换含有eGFP-uidA-Tbch 的BamHI/Nhel片段(参照图1)。
然后通过用Xho I消化去除uidA基因，生成表达构建体 pLP500-eGFP。
实施例2:将Der p 2基因和Bio t 5基因克隆至乳杆菌/大肠杆菌穿梭载
体
使用延伸高保真DNA聚合敏Boehringer )和合成引物，Dp2Bam/f [5，-CCCCCGGATCCAGATCAAGTCGATGTCAAAGATTGTGC國3'， SEQ ID NO: 5
和 Dp2xhoSac/r或高剂量(HD) [50 Mg/小鼠I的酵母重组Derp2蛋白质(rDerp2)通过皮下注射(皮下)来 引发小鼠。在第28天给予LD的Der p 2加强并通过ELISA测定Der p 2 特异的免疫应答。在另一项研究中，在第21天处死rDerp2引发的小鼠。 获得淋巴结和脾用于T细胞培养物的细胞因子谱分析。用lOOjul的PBS 皮下注射对照小鼠。如先前描述来产生rDer p 2表皮贴片的小鼠(Wang LF 等1996)。简单而言，先将含50 jug rDer p2的100 jJlPBS应用于贴片上 的1 cm4少布，该贴片随后应用于剃毛的皮肤并用弹性绷带固定。在第0 天和14天进行贴片。每一贴片应用4天后去除。在第21天处死小鼠并确 立抗原特异性TH2细胞。
仅接受Der p 2气溶胶攻击的对照小鼠产生高表达水平的Ag特异性 TH2细胞因子，尤其是IL-5、 IL-10和IL-13。然而当与用LD引发的小鼠 或对照组比较时，HD引发的小鼠显示其IL-5、 IL-10和IL-13的表达受到 显著抑制。此外，LD引发的小鼠与HD引发小鼠及对照相比仅具有高表 达的IL-9。因此，初期HD引发通过抑制TH2相关细胞因子的表达减轻 吸入Derp2的效应。
(f) CD4+CD25+调节性T细胞的富集
通过使用CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec， Bergisch Gladbach，德国)富集脾的调节性T细胞并根据生产商的说明书 使用AutoMacs ( Becton Dickinson )进行分选。部分分离细胞与FITC缀 合的抗小鼠CD4抗体、Per-CP缀合的抗小鼠CD3 s抗体，和PE缀合的 抗小鼠CD25温育用于纯度检查。使用FACScan流式细胞仪和CellQuest 软件(Becton Dickinson )通过流式细胞术分析来测定细胞纯度，并且至少95%的分离细胞为CD4+CD25+T细胞。
(g) 脾细胞培养物和抗原呈递细胞(APC)制备
在补加10%热灭活小牛血清(StemCell Technologies )、 1 mM丙酮酸 钠(Hyclone Laboratories )、 2 mM L-谷氨酰胺、抗生素(100 U/ml青霉 素和100 ju g/ml链霉素)和5.5 x 102 mM 2- P巯基乙醇(Life technology) 的完全RPMI-1640培养基中培养脾细胞并维持在37X: 5%C02培养箱中。 在含10 ja g/ml的Der p 2蛋白质的96孑L ( 4xl05细胞/孔)中培养脾细胞 3-5天并将收集的上清液冰冻于-20。C。通过在含rDer p 2的6孔板(2 x 107 细胞/孔)中培养脾细胞从表皮贴片小鼠中建立抗原特异性TH2细胞。在 笫3、 5和7天，用含有10 U/ml重组小鼠IL-2 ( rIL-2 ) ( R & D systems ) 的新鲜培养基补充细胞。在第10天，收集并通过菲可帕克加(Amersham Biosciences)离心纯化TH2细胞。APC来自首次接受试验的小鼠经丝裂 霉素C处理的脾细胞。简单而言，丝裂霉素C (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim，德国)以50 M g/ml的终浓度加入到细胞中并在黑暗中37。C温 育20分钟。用30 ml的IX HBSS洗涤细胞3次并将其悬浮于RPMI-1640
培养基中。
(h) 细胞因子谱形成和细胞增殖测定
抗原特异性TH2细胞和CD4+CD25+ T细胞在含或不含10 M g/ml rDer p 2的情况下以1x10s细胞/孔进行培养。APC以3xl()5细胞/孔使用。在第 3天收集上清液并测定IL-4、 IL-5和IL- 13的产生。在增殖研究中，温育 细胞5天并在最后18小时用1 ju Ci的[3H-胸苷(NEN Life Science, Boston, MA )进行脉冲。收集细胞至玻璃纤维滤器(Skatron instruments AS， Lier， 挪威)中。力口入闪烁液(Amersham Biosciences Corp)后,通过液体闪烁 计数器(Beckman Coulter, Inc. Fullerton， CA )测定增殖。增殖指数表示 为^又TH2细力包的比例。
(i) 细胞因子ELISA
针对小鼠IFN画y (RA-6A2)、 IL-4 (BVD4-1D11 )、 IL-5(TRFK5)、 IL-9 ( D8402E8 )、 IL-10 ( JES052A5 ) (R & D systems, Minneapolis, MN，美国)、IL-13 ( 38213) (R&D systems )的纯化抗体和TGF画P ( A75-2.1) 抗体以2Mg/ml包被于96孔板上。按照建议使用针对小鼠IFN-Y (XMG1.2 )、 IL-4 ( BVD6- 24G2 )、 IL-5 ( TRFK4 )、 IL-9 ( D9302C12 )、 IL-10 (R&D systems )、 IL-13 (R&D systems )和TGF- P ( A75-3.1 ) 抗体的生物素化的多克隆抗体。重组小鼠细胞因子用作ELISA测定中的标 准。除非另作说明，所有抗体和重组细胞因子来自BD Biosciences PharMingen ( San Diago， CA )。
图27描述了在用气溶胶化的Derp2攻击的Derp2引发的小鼠中细 胞因子mRNA表达的定量。未检测到IL-12并且小鼠组间IL-4和IFN画y 的表达水平没有差异。然而，其他TH2细胞因子，尤其是效应细胞因子的 表达中有差异。
使用实时PCR进一步评估这些细胞因子的表达水平(参照表1)。每 一扩增药盒的解链曲线分析显示出在水对照中未观察到的特征尖峰(数据 未显示)。表I表明了校准器(未处理的)-归一化的扩增细胞因子产物/HPRT 比例。在所有组的小鼠中IL-4的表达没有明显差异。进行气溶胶Derp2 吸入的对照小鼠产生高表达水平的Ag特异性TH2细胞因子，尤其是IL-5、 IL-10和IL-13。当与用LD引发的小鼠或对照组比较时，HD引发的小鼠 显示IL-13的表达(至少低100倍)、IL-5和IL-10的表达(—氐7倍)受 到显著抑制。这暗示初期HD引发通过抑制TH2相关细胞因子的表达改善 吸入Derp2的效应。LD引发的小鼠相比于HD引发小鼠和对照仅具有高 表达的IL-9 (> 100倍)。因此，TH2细胞因子与变应原剂量免疫相关。
图27和28显示了来自用高剂量或低剂量rDer p 2蛋白质引发的小鼠 的淋巴结和脾的细胞因子谦。在第0、 4和8天，用低剂量(LD， 10|ag) 或高剂量(HD， 10jag)的rDerp2蛋白质或PBS引发小鼠并在第10天 处死(上文)。收集淋巴结和脾并在rDer p 2蛋白质存在的情况下将其培 养3至5天。相比于高剂量引发的小鼠，来自低剂量引发小鼠的淋巴结和 脾均显示TH2细胞因子(IL-4、IL-13和IL-9 )增加和TH1细胞因子(IFN-Y )产生的降低。另一方面，高剂量引发的小鼠在淋巴结和脾中都显示更
69高的TGF-P产生。
图30描述了用高剂量rDer p 2蛋白质引发的小鼠的CD4+CD25+调节 性T细胞的抑制作用。用LD或HD的rDer p 2蛋白质引发的小鼠的脾 CD4+CD25+ T细胞在rDer p 2蛋白质存在的情况下与抗原特异性TH2细 胞共培养5天并测定增殖和细胞因子应答。如图30 (A-D)所示，用HD 的rDer p 2蛋白质引发的小鼠的脾CD4+CD25+ T细胞能在TH2细胞增殖 和TH2细胞因子IL-4、 IL-5和IL-13的产生上施以抑制作用。用LD的 rDerp2蛋白质引发的小鼠的脾CD4+CD25+T细胞不能产生相似的抑制作 用。
实施例16:小鼠中重组干酪乳杆菌Shirota/Blo 15引发的免疫应答的研
咒
每周连续4天每天以1 x 10 cfu/小鼠喂祠小鼠(图31 )。每只小鼠接受 的总喂饲为20剂量的lx109 cfu。每周对小鼠抽血直至7周并通过ELISA 测定Blo t 5特异性血清免疫球蛋白。检测到Blo 15特异性IgGl的显著水 平，但未检测到IgE和IgG2a的显著水平(图32 )。在第198天处死小鼠 并获得来自淋巴集结和脾的T细胞用于细胞因子分析。仅在来自干酪乳杆 菌Shirota/Blo t 5喂饲小鼠的淋巴集结的T细胞中检测调节性细胞因子 TGF- P的显著水平，表明活的重组干酪乳杆菌Shirota/Blo t 5通过、淋巴集 结中的T细胞活跃诱导T调节性细胞因子的产生(参照图33)。
本说明书中先前公布的文件中的列表或讨论不应必须认为是承认所述 文件是现有4支术的部分或是普通一般知识。因此所有列出的文件此处引入 作为参考。
种元素、限制或多种限制的情况下适当地实施，而非此处明确公开的。因 此，例如，术语"包含"、"包括"、"含有"等，应作广义理解并不受限制。 此外，此处使用的术语和表达已用作说明书的术语并非限制，并且不旨在 使用此类术语和表达排除显示和描述的特征的任何等同物或其部分，而认
70为在本发明要求的范围内多种修改是可能的。因此，应理解虽然本发明已 经通过优选实施方案明确公开，本领域技术人员可做出此处公开的本发明 的修改和变型，并且认为此类修改和变型在本发明范围内。
在此已广泛和一般性描述了本发明。
一般性公开范围内的每一较窄的 种类和次一般的分組也形成了发明的部分。这包括本发明的一般性描述， 其限制性条款或负面限制为从类中去除任何主题，不管去除的主题是否在 此处明确引用。
其他实施方案在以下权利要求书中。此外，按照马库什组描述了本发 明的特征或方面，技术人员将承认本发明因此在马库什组的任何个体成员 或亚组成员方面也有描述。
权利要求
1. 重组乳杆菌，其包含异源核酸序列，所述核酸序列编码螨变应原Der p 2或Blo t 5的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。
2. 重组乳杆菌，其包含异源核酸序列，所述核酸序列编码螨变应原 Der p 1的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物，其中所述片段包含 Derpl的成熟全长蛋白质的至少8%的氨基酸序列。
3. 权利要求1或权利要求2的重组乳杆菌，其中所述乳杆菌选自干酪 乳杆菌、嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、加氏乳杆菌、戊糖乳杆菌、植物乳杆 菌、孢子乳杆菌、短乳杆菌、德氏乳杆菌、唾液乳杆菌、希氏乳杆菌、乳 酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、约氏乳杆菌、莱氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、路氏 乳杆菌、沙克乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、巻曲乳杆菌、弯曲乳杆菌、高加 索乳杆菌和瑞士乳杆菌。
4. 权利要求3的重组乳杆菌，其中所述乳杆菌是鼠李糖乳杆菌GG 或干酪乳杆菌Shirota。
5. 权利要求l-4任一项的重组乳杆菌，其中由所述异源核酸序列编码 的所述免疫原性同源物与所述螨变应原各自的至少免疫原性片段的氨基酸 序列具有至少80%的序列同一性。
6. 权利要求l-5任一项的重组乳杆菌，其中所述螨变应原是Der p 2 或Blo t 5，并且所述乳杆菌是干酪乳杆菌Shirota。
7. 权利要求l-6任一项的重组乳杆菌，其中所述螨变应原是Der p 2 并且其中所述螨变应原由SEQIDNO: 1的序列编码。
8. 权利要求l-7任一项的重组乳杆菌，其中所述螨变应原是Der p 2 并且其中所述异源核酸序列编码Der p 2的免疫原性同源物，或其免疫原 性片段，所述免疫原性同源物具有与SEQ ID NO: 1的核酸序列至少70% 同一性的核酸序列。
9. 权利要求l-6任一项的重组乳杆菌，其中所述螨变应原是Blo t 5 并且其中所述螨变应原的所述至少免疫原性片段由SEQ ID NO: 2的序列编码。
10. 权利要求l-6任一项或权利要求9的重组乳杆菌，其中所述螨变 应原是Blo t 5并且其中所述异源核酸序列编码Blo t 5的免疫原性同源物， 或其免疫原性片段，所述免疫原性同源物具有与SEQ ID NO: 2的核^ 列至少70%同一性的核酸序列。
11. 权利要求1-10任一项的重组乳杆菌，其中编码所述螨变应原的至
12. 权利要求ll的重组乳杆菌，其中所述异源核酸分子是表达载体。
13. 权利要求12的重组乳杆菌，其中所述表达载体选自pLP400、 pLP500、 pSIP308和pSIP412。
14. 药物组合物，其包含权利要求1-13任一项的重组乳杆菌。
15. 权利要求14的药物组合物，还包含可药用载体或稀释剂。
16，权利要求14或15的药物组合物，还包含皮质类固醇、抗组胺剂、 白三烯调节剂、肥大细胞稳定剂、减充血剂和P2肾上腺素受体激动剂的 至少一种。
17. 斥又利要求14-16任一项的药物组合物，还包含变应原的至少免疫 原性片段，或其免疫原性同源物。
18. 权利要求17的药物组合物，其中所述变应原为螨变应原。
19. 权利要求18的药物组合物，其中所述螨变应原为尘螨变应原。
20. 权利要求18或19的药物组合物，其中所述螨变应原选自Derpl、 proDerpl、 Derp2、 Derp3、 Derp4、 Derp5、 Derp7、 Derp8、 Der p9、 Derp10、 Derpll、 Derpl4、 Derpl5、 Derpl8、 Derfl、 Derf2、 Derf3、 Derf4、 Derf5、 Derf6、 Derf7、 Derf10、 Derfll、 Derfl5、 Derfl6、 Derfl8、 Derml、 Eurml、 Eurm2、 Herf2、 Blotl、 Blot 3、 Blot 5、 Blot 12、 Fddl、 Magl、 Mag 3、 Tyrp2、 L印dl、 Lepd2、 Lepd5、 Lepd7、 Lep d 10和Lep d 13。
21. 权利要求18-20任一项的药物组合物，其中所述螨变应原包含与 所述重组乳杆菌表达的螨变应原的至少免疫原性片段或其免疫原性同源物的至少一个共同表位。
22. 权利要求21的药物组合物，其中螨变应原的至少免疫原性片段， 或其免疫原性同源物是所迷重组乳杆菌表达的螨变应原的至少免疫原性片 段，或其免疫原性同源物。
23. 药盒，其包含(a) 如权利要求14-16任一项中定义的药物组合物，和(b) 包含变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物的药物 组合物。
24. 权利要求23的所述药盒，其中(b)的药物组合物中包含的所述 变应原为螨变应原。
25. 权利要求24的药盒，其中(b)的药物组合物中包含的所述螨变 应原为尘螨变应原。
26. 权利要求24或25的药盒，其中(b)的药物组合物中包含的所述 螨变应原选白Derpl、 proDerpl、 Derp2、 Derp3、 Derp4、 Derp5、 Derp7、 Derp8、 Derp9、 DerplO、 Derpll、 Derpl4、 Derpl5、 Der p18、 Derfl、 Derf2、 Derf3、 Derf4、 Derf5、 Derf6、 Derf7、 Der f 10、 Derfll、 Derfl5、 Derfl6、 Derfl8、 Derml、 Eurml、 Eurm2、 Herf2、 Blotl、 Blot 3、 Blot 5、 Blot 12、 Feldl、 Magl、 Mag 3、 Tyr p2、 Lepdl、 Lepd2、 Lepd5、 Lep d 7、 Lep d 10和Lep d 13。
27. 权利要求24-26的药盒，其中(b)的药物组合物中包含的螨变应 原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物包含与(a)的药物组合物中 包含的所述重组乳杆菌表达的螨变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原 性同源物的至少一个共同表位。
28. 权利要求27的药盒，其中(b)的药物组合物中包含的螨变应原 的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物为(a)的药物组合物中包含的 所述重组乳杆菌表达的螨变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源 物。
29. 权利要求23-28任一项的药盒，其中(b)的药物组合物中包含的变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物通过富集、纯化和分离 的任何一种从重组生物中获得。
30. 权利要求1-13任一项的所述重组乳杆菌，其用于治疗。
31. 权利要求30的重组乳杆菌，其中所述治疗是调节对变应原的免疫 应答。
32. 权利要求30或31的重组乳杆菌，其用于经口施用。
33. 权利要求30-32任一项的重组乳杆菌，用于与变应原的至少免疫 原性片段，或其免疫原性同源物组合施用。
34. 权利要求33的重组乳杆菌，用于舌下、皮下、皮内、经皮或表皮 施用变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。
35. 权利要求33或34的重组乳杆菌，其中所述变应原为螨变应原。
36. 权利要求30-35任一项的重组乳杆菌，其中所述重组乳杆菌包含 在药盒中，所述药盒还包含变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同 源物。
37. 权利要求33-36任一项的重组乳杆菌，用于顺序施用重组乳杆菌 和变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。
38. 权利要求37的重组乳杆菌，其中所述顺序施用包括第一步施用变 应原的所述至少免疫原性片段和第二步施用所述重组乳杆菌。
39. 调节哺乳动物中对变应原的免疫应答的方法，所述方法包括施用 权利要求14的药物组合物。
40. 权利要求39的方法，其中所述哺乳动物为人。
41. 权利要求39的方法，其中所述变应原为螨变应原。
42. 权利要求41的方法，其中所述螨变应原为尘螨变应原。
43. ;f又利要求39的方法，用于治疗变应性疾病。
44. 权利要求43的方法，其中所述变应性疾病为螨变态反应。
45. 权利要求43的方法，其中所述变应性疾病选自哮喘、鼻炎、特应 性皮炎和荨麻渗。
46. 权利要求39的方法，用于预防变应性疾病。
47. ^5L利要求46的方法，其中所述变应性疾病为螨变态反应。
48. 权利要求46的方法，其中所述变应性疾病选自哮喘、鼻炎、特应 性皮炎和荨麻渗。
49. 权利要求39的方法，其中权利要求14的药物组合物经口或舌下 施用。
50. 权利要求39的方法，其包括重复施用包含重组乳杆菌的药物组合物。
51. 权利要求39的方法，其中所述药物组合物还包含变应原的至少免 疫原性片段，或其免疫原性同源物。
52. 权利要求39的方法，还包括施用药物组合物，所述药物组合物包 含变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。
53. 权利要求52的方法，其中包含重组乳杆菌的药物组合物和包含变 应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物的药物组合物包含在药盒 中。
54. 权利要求52的方法，其中所述变应原为螨变应原，所述变应原的 至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物包含在所述药物组合物中。
55. 权利要求52的方法，其中变应原的所述至少免疫原性片段，或其 免疫原性同源物包含与所述重组乳杆菌表达的变应原的至少免疫原性片 段，或其免疫原性同源物的至少一个共同表位。
56. 权利要求55的方法，其中变应原的所述至少免疫原性片段，或其 免疫原性同源物是所述重组乳杆菌表达的变应原的至少免疫原性片段，或 其免疫原性同源物。
57. 权利要求52的方法，其中变应原的所述至少免疫原性片段，或其 免疫原性同源物通过富集、纯化和分离的任何一种从重组生物中获得。
58. 权利要求52的方法，其中包含变应原的所述至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物的所述药物组合物以选自舌下、皮下、皮内、经皮、 表皮和其任何组合的方式施用。
59. 权利要求52的方法，其中包含变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物的所述药物组合物经皮下施用，并且其中权利要求14的药 物組合物经口施用。
60. 权利要求52的方法，其中顺序施用包含所述重组乳杆菌的药物组 合物和包含变应原的所述至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物的药物 组合物。
61. 权利要求60的方法，其包括(a )提供权利要求14的药物组合物， (b )施用权利要求14的药物组合物，(c) 提供包含变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物的药 物组合物，和(d) 施用包含变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物的 药物组合物。
62. 权利要求52的方法，其中首先施用包含变应原的至少免疫原性片 段的药物组合物，其后施用权利要求14的药物组合物。
63. 权利要求52的方法，其中所述方法为免疫疗法。
64. 权利要求52的方法，其中重复施用包含变应原的所述至少免疫原 性片段，或其免疫原性同源物的药物组合物。
65. 权利要求l-13任一项的重组乳杆菌在制备用于调节对变应原的免 疫应答的药物组合物中的用途。
66. 权利要求65的用途，其中所述变应原为螨变应原。
67. 权利要求66的用途，其中所述螨变应原为尘螨变应原。
68. 权利要求65至67任一项的用途，用于治疗或预防变态反应。
69. 权利要求68的用途，其中所述变态反应为螨变态反应。
70. 权利要求65-69任一项的用途，用于经口或舌下施用所述重组乳
71. 权利要求65-70任一项的用途，用于重复施用所述重组乳杆菌。
72. 权利要求65-71任一项的用途，其中所述药物组合物还包含皮质 类固醇、抗组胺剂、白三烯调节剂、肥大细胞稳定剂、减充血剂和P2肾上腺素受体激动剂的至少一种。
73. 权利要求65-72任一项的用途，用于与变应原的至少免疫原性片 段，或其免疫原性同源物組合施用。
74. 权利要求73的用途，其中所述药物组合物包含变应原的所迷至少 免疫原性片段，或其免疫原性同源物。
75. 权利要求65-73任一项的用途，用于制备药盒，其中所述药盒还 包含药物组合物，所述药物组合物包含变应原的至少免疫原性片段，或其 免疫原性同源物。
76. 权利要求73-75任一项的用途，其中所述变应原为螨变应原。
77. 片又利要求73-76任一项的用途，其中变应原的所述至少免疫原性 片段，或其免疫原性同源物包含与所述重组乳杆菌表达的变应原的至少免 疫原性片段，或其免疫原性同源物的至少一个共同表位。
78. 权利要求77的用途，其中变应原的所述至少免疫原性片段，或其 免疫原性同源物为所述重组乳杆菌表达的变应原的至少免疫原性片段，或 其免疫原性同源物。
79. 权利要求73-78任一项的用途，其中变应原的所述至少免疫原性 片段，或其免疫原性同源物通过富集、纯化和分离的任何一种从重组生物 中获得。
80. 权利要求73-79任一项的用途，用于顺序施用所述重組乳杆菌和 变应原的所述至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。
81. 权利要求80的用途，用于免疫疗法。
82. 权利要求80或81的用途，其中首先施用变应原的所述至少免疫 原性片段，其后施用变应原的至少免疫原性片段或其免疫原性同源物。
83. 权利要求73-82任一项的用途，其中变应原的所述至少免疫原性 片段，或其免疫原性同源物以选自舌下、皮下、皮内、经皮、表皮和其任 何组合的方式施用。
84. 权利要求83的用途，其中所述重组乳杆菌经口施用，并且包含变 应原的至少免疫原性片段或其免疫原性同源物的所述药物组合物皮下施用。
85.权利要求73-84任一项的用途，其中重复施用变应原的所述至少 免疫原性片段或其免疫原性同源物。
全文摘要
本发明涉及重组乳杆菌、其用途和包括该重组乳杆菌的药物组合物。所述重组乳杆菌包括异源核酸序列。所述异源核酸序列编码螨变应原Der p1、Der p2和Blo t5的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。Der p1的各片段包括螨变应原的至少8％的氨基酸序列。也公开了调节哺乳动物中对变应原的免疫应答的方法及药物组合物和药盒。
文档编号C12N1/21GK101473028SQ200780022935
公开日2009年7月1日 申请日期2007年4月4日 优先权日2006年4月20日
发明者林丽芳, 蔡考圆, 陈丽娟 申请人:新加坡国立大学